CN103146643A - 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法 - Google Patents

一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103146643A
CN103146643A CN2013100921172A CN201310092117A CN103146643A CN 103146643 A CN103146643 A CN 103146643A CN 2013100921172 A CN2013100921172 A CN 2013100921172A CN 201310092117 A CN201310092117 A CN 201310092117A CN 103146643 A CN103146643 A CN 103146643A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vitro human
ovocyte
fsh
culture method
follicles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2013100921172A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103146643B (zh
Inventor
孔凡锋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201310092117.2A priority Critical patent/CN103146643B/zh
Publication of CN103146643A publication Critical patent/CN103146643A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103146643B publication Critical patent/CN103146643B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其特征在于培养方法的具体步骤包括：1)将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵母细胞解冻后复苏培养；2)将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液中进行腔前培养。体外人卵母细胞腔前卵泡培养需要FSH的支持，FSH不仅能促进卵泡的生长，增加其存活天数，还能促进颗粒细胞增殖，促进卵母细胞成熟，是卵泡生长发育调控的重要因子。曲古柳菌素A可有效抑制肿瘤细胞增殖，可为调控细胞周期进程进而诱导肿瘤细胞凋亡，从而保证细胞成活质量，该方法对于试管婴儿方面的研究具有重要意义。

Description

一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，为一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法。
背景技术
近年来，随着有关胚胎工程技术尤其是试管婴儿技术的的不断发展，对卵母细胞的需求日益增加，单纯利用体内成熟的卵母细胞已不能满足医学需求，人们开始着眼于研究具有巨大卵母细胞来源潜力的腔前卵泡的开发和利用。但常规的腔前卵泡培养时颗粒细胞增生分化不足从而导致卵泡发育存在缺陷，卵泡在营养液中的存活天数很短，培养难度大、成功率低且不稳定，使得腔前卵泡培养达不到预期的效果而影响其进一步的研究。
发明内容
本发明的目的是这样实现的：一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其具体步骤包括：1)将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵母细胞解冻后复苏培养；2)将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液中进行腔前培养。在在进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素A(TSA)。步骤2)的具体方法是：配置营养液，在基本营养液Ham‘sF-10中加入青霉素110IU/ml，链霉素60μg/ml，并添加17％的脐带血清FCS，并加入浓度为2.3IU/ml的卵泡雌激素FSH；将获取的体外人卵母细胞在含17％的FCS的Ham‘sF-10清洗后移入营养液微滴中，微滴上覆矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，并每24小时换液一次。加入的曲古柳菌素A(TSA)在营养液中的浓度为200μg/1。
通过低温贮存能够提高体外人卵母细胞冻存后的存活率及减数分裂等各项功能的恢复，提高复速率。而卵泡刺激素(FSH)是垂体分泌的一种糖蛋白激素，其主要作用是促进颗粒细胞增生分化，调节卵泡的发育。体外人卵母细胞腔前卵泡培养需要FSH的支持，FSH不仅能促进卵泡的生长，增加其存活天数，能促进颗粒细胞增殖，促进卵母细胞成熟，是卵泡生长发育调控的重要因子。曲古柳菌素A可有效抑制肿瘤细胞增殖，可为调控细胞周期进程进而诱导肿瘤细胞凋亡，从而保证细胞成活质量，该方法对于试管婴儿方面的研究具有重要意义。
附图说明
图1是贮体外人卵母细胞贮存方法流程示意图；
图中，1为：冷冻浸泡预处理；2为程序降温冷冻和低温贮存；3为快速升温解冻；4为复苏后培养；
图2是体外人卵母细胞腔前培养图；
图3是加入曲古柳菌素A(TSA)的细胞分组柱状图。
具体实施方式
实施例1
一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其特征在于培养方法的具体步骤包括：
1)将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵母细胞解冻后复苏培养；
2)将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液中进行腔前培养。
优选地，进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素A(TSA)。
优选地，步骤2)的具体方法是：配置营养液，在基本营养液Ham‘sF-10中加入青霉素110IU/ml，链霉素60μg/ml，并添加17％的脐带血清FCS，并加入浓度为2.3IU/ml的卵泡雌激素FSH；将获取的体外人卵母细胞在含17％的FCS的Ham‘sF-10清洗后移入营养液微滴中，微滴上覆矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，并每24小时换液一次。
优选地，加入的曲古柳菌素A(TSA)在营养液中的浓度为200μg/1。
参见图1，本发明是一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，首先是将体外人卵母细胞贮存在含蔗糖和丙二醇的冷冻液里进行浸泡冷冻预处理1，再进行程序化的缓慢降温冷冻，然后低温贮存于液氮中，即降温冷冻和低温贮存2；在需要使用时，先使该体外人卵母细胞快速升温解冻3，使之复苏，再将已解冻复苏的该体外人卵母细胞放入序贯培养液中，置于37±0.2℃、5％～6％CO2浓度的孵箱进行培养4，以供体外受精。
将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液中进行腔前培养。配置营养液，在基本营养液Ham‘sF-10中加入青霉素110IU/ml，链霉素60μg/ml，并添加17％的脐带血清FCS，并加入浓度为2.3IU/ml的卵泡雌激素FSH；在进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素A(TSA)，曲古柳菌素A(TSA)在营养液中的浓度为200μg/1。将获取的体外人卵母细胞在含17％的FCS的Ham’sF-10清洗后移入营养液微滴中，微滴上覆矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，并每24小时换液一次。
实施例2
贮存方法同实施例1。将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液中进行腔前培养。配置营养液，在基本营养液Ham’sF-10中加入青霉素100IU/ml，链霉素50μg/ml，并添加15％的脐带血清FCS，并加入浓度为1IU/ml的卵泡雌激素FSH；在进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素A(TSA)，曲古柳菌素A(TSA)在营养液中的浓度为100μg/1。将获取的体外人卵母细胞在含15％的FCS的Ham’sF-10清洗后移入营养液微滴中，微滴上覆矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，并每24小时换液一次。试验结果如下：
不同浓度FSH对人腔前卵泡体外生长天数的影响，见表1：
表1
组别 例数 生产天数(平均天数x±s)
对照组 10 2.80±1.69a
I组 14 5.36±0.63b
II组 15 5.47±2.50c
III组 16 8.13±4.19d
注：经t检验a与dp＜0.001；a与cp＜0.01；a与b、b与d、d与cp＜0.05；b与cp＞0.05
不同浓度曲古柳菌素A(TSA)对细胞周期的影响，见表2：
表2
细胞周期 对照组 50μg/L 100μg/L 200μg/L 400μg/L
G1/G0 35.75±1.84 36.84±2.23 41.13±2.15 26.94±2.45 22.61±3.62
S 28.87±3.12 19.61±3.58 25.23±3.42 14.21±2.46 22.82±4.24
G2/M 20.13±2.56 18.56±2.76 18.49±2.28 20.70±2.64 21.59±1.83
Sub-G1 2.03±0.21 3.04±1.20 2.28±1.02 14.74±2.04 17.63±1.25
由此可见，根据实施例1得出的结果表面试验效果最佳。根据本发明所述的体外人卵母细胞腔前培养方法可促进颗粒细胞增生分化，调节卵泡的发育，增加其存活天数，可有效抑制肿瘤细胞增殖，可为调控细胞周期进程进而诱导肿瘤细胞凋亡，从而保证细胞成活质量，该方法对于试管婴儿方面的研究具有重要意义。
在此说明的是实施例中涉及的数值范围均是经过多次实验所得，每一个点都可以实现，不局限在端点或者终点，篇幅所限，在此不进行一一列举。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (4)

1.一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其特征在于培养方法的具体步骤包括：
1)将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵母细胞解冻后复苏培养。
2)将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素FSH的营养液中进行腔前培养。
2.根据权利要求1所述的体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其特征在于在进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素A(TSA)。
3.根据权利要求1或2所述的体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其特征在于步骤2)的具体方法是：配置营养液，在基本营养液Ham‘sF～10中加入青霉素110IU/ml，链霉素60μg/ml，并添加17％的脐带血清FCS，并加入浓度为2.3IU/ml的卵泡雌激素FSH；将获取的体外人卵母细胞在含17％的FCS的Ham‘sF～10清洗后移入营养液微滴中，微滴上覆矿物油，在37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，并每24小时换液一次。
4.根据权利要求1-3所述的体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法，其特征在于加入的曲古柳菌素A(TSA)在营养液中的浓度为200μg/1。
CN201310092117.2A 2013-03-22 2013-03-22 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法 Expired - Fee Related CN103146643B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310092117.2A CN103146643B (zh) 2013-03-22 2013-03-22 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310092117.2A CN103146643B (zh) 2013-03-22 2013-03-22 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103146643A true CN103146643A (zh) 2013-06-12
CN103146643B CN103146643B (zh) 2015-01-21

Family

ID=48544965

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310092117.2A Expired - Fee Related CN103146643B (zh) 2013-03-22 2013-03-22 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103146643B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468639A (zh) * 2013-08-31 2013-12-25 内蒙古大学 组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用
CN112646771A (zh) * 2021-01-22 2021-04-13 艾尔斯（浙江）医学科技有限公司 人类卵泡卵丘细胞或/和颗粒细胞的细胞系及其制备方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250831A (zh) * 2011-07-12 2011-11-23 中国农业大学 一种提高牛腔前卵泡体外发育的培养基及其应用
CN102335162A (zh) * 2011-07-13 2012-02-01 南京农业大学 曲古抑菌素a在制备抑制猪卵巢颗粒细胞活性的药物中的应用
CN102363765A (zh) * 2011-11-02 2012-02-29 青岛农业大学 ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102250831A (zh) * 2011-07-12 2011-11-23 中国农业大学 一种提高牛腔前卵泡体外发育的培养基及其应用
CN102335162A (zh) * 2011-07-13 2012-02-01 南京农业大学 曲古抑菌素a在制备抑制猪卵巢颗粒细胞活性的药物中的应用
CN102363765A (zh) * 2011-11-02 2012-02-29 青岛农业大学 ActA促进减数分裂前雌性生殖细胞体外发育的技术方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI-HONG SHI ET AL.: "Trichostatin A (TSA) Improves the Development of Rabbit-Rabbit Intraspecies Cloned Embryos, But Not Rabbit-Human Interspecies Cloned Embryos", 《DEVELOPMENTAL DYNAMICS》, vol. 237, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 640 - 648 *
RALUCA RUSOVICI ET AL.: "Epidermal Growth Factor-Mediated Inhibition of Follicle-Stimulating Hormone-Stimulated StAR Gene Expression in Porcine Granulosa Cells Is Associated with Reduced Histone H3 Acetylation", 《BIOLOGY OF REPRODUCTION》, vol. 72, 8 December 2004 (2004-12-08), pages 862 - 871 *
TOMOHIKO AKIYAMA ET AL.: "Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice", 《PNAS》, vol. 103, no. 19, 9 May 2006 (2006-05-09), pages 7339 - 7344 *
TSUTOMU ENDO ET AL.: "Changes in histone modifications during in vitro maturation of porcine oocytes", 《MOLECULAR REPRODUCTION AND DEVELOPMENT》, vol. 71, no. 1, 30 May 2005 (2005-05-30), pages 123 - 128 *
YONG FAN ET AL.: "Derivation of Cloned Human Blastocysts by Histone Deacetylase Inhibitor Treatment After Somatic Cell Nuclear Transfer with b-Thalassemia Fibroblasts", 《STEM CELLS AND DEVELOPMENT》, vol. 20, no. 11, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 1951 - 1959 *
刘晓 等: "曲古抑菌素(Trichostatin）A对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的影响", 《畜牧兽医学报》, vol. 39, no. 11, 31 December 2008 (2008-12-31), pages 1493 - 1498 *
施旭东 等: "FSH对人腔前卵泡体外生长的影响", 《南京师大学报》, vol. 24, no. 1, 31 December 2001 (2001-12-31), pages 95 - 100 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103468639A (zh) * 2013-08-31 2013-12-25 内蒙古大学 组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理卵母细胞的方法及其应用
CN112646771A (zh) * 2021-01-22 2021-04-13 艾尔斯（浙江）医学科技有限公司 人类卵泡卵丘细胞或/和颗粒细胞的细胞系及其制备方法
CN112646771B (zh) * 2021-01-22 2023-04-14 艾尔斯（浙江）医学科技有限公司 人类卵泡卵丘细胞或/和颗粒细胞的细胞系及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN103146643B (zh) 2015-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101429492B (zh) 一种猪卵母细胞体外培养成熟方法
CN109221081B (zh) 一种多组织玻璃化原位保存装置
CN104688380B (zh) 一种提高羊超数排卵数量与质量的方法
CN101037666B (zh) 一种动物细胞的低温保存溶液及保存方法
CN107142241B (zh) 一种提高猪卵母细胞体外成熟质量和发育潜力的培养液及其培养方法
CN102899286A (zh) C型钠肽在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用
AR086200A1 (es) Hongos filamentosos que tienen un fenotipo de viscosidad alterado
CN102296090B (zh) 一种基于体细胞核移植构建的牛体细胞克隆胚的处理方法
CN103146643B (zh) 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法
CN1916165A (zh) 体外培养卵泡的方法
CN104342400A (zh) 一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法
CN103409367A (zh) 一种提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的方法
CN203985778U (zh) 一种胚胎玻璃化冷冻装置
CN110408585A (zh) 一种利用耳后皮肤培养成纤维细胞的方法
CN102703383B (zh) 正辛醇在延缓哺乳动物卵子体外老化中的应用
CN112877280B (zh) 一种大周龄雌鼠卵细胞体外受精营养液及其应用
CN201789875U (zh) 大规模干细胞玻璃化冻存管
CN1810967A (zh) 一种生产体细胞克隆猪的方法
CN111657270B (zh) 一种家畜精液常温保存剂及其制备方法和使用方法
CN106047799B (zh) 辛酰化Ghrelin在促进牛卵母细胞体外成熟中的应用
CN106591374A (zh) 一种提高猪体细胞核移植胚胎发育效率的方法
CN103461323B (zh) 一种可用于体外延时保存卵母细胞生物活性的方法
CN203985779U (zh) 细胞组织玻璃化冷冻载体套件
CN103141431B (zh) 一种诱导非洲爪蟾自然产卵及孵化的人工方法
Xiao et al. Effects of hormonal administration and locality influence on superovulatory responses in goats

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150121

Termination date: 20160322

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee