CN103409367A - 一种提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的方法 - Google Patents

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汪立芹
杨楠
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吴阳升
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Abstract

本发明提供了一种提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的方法，涉及曲古抑菌素TrichostatinA（TSA）对绵羊卵母细胞进行处理，能显著提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的方法，采用TSA提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的方法，168h后获取的囊胚率和囊胚细胞数都显著高于对照组，具有较强的科学性与实用性。

Description

一种提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的方法
技术领域
本发明涉及曲古抑菌素Trichostatin A（TSA）对绵羊卵母细胞进行处理，能显著提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的方法。 
背景技术
曲古抑菌素A(Trichostatin A，TSA)是一种组蛋白去乙酰化转移酶(Histone deacetylase，HDACs)抑制剂。DNA与组蛋白是染色质的主要成分。染色质结构与基因活性密切相关，通过组蛋白乙酰化和去乙酰化来修饰染色质的结构，在DNA复制、基因转录及细胞周期的调控等方面有重要作用。TSA目前主要应用于提高克隆胚胎的发育能力的研究，在哺乳动物体外胚胎发育方面的应用只有在牛、小鼠上有报道，还没有在绵羊卵母细胞上应用的报道。同时，囊胚细胞数也在一定程度上反应了胚胎的质量。 
文献检索披露：①CLONING AND STEM CELLS，10,3（2008），371-378，作者：A.E.Lager等发表的《TSA提高牛体细胞核移植早期胚胎组蛋白乙酰化水平》，研究了脱乙酰基酶和TSA在牛植入前克隆胚胎中组蛋白乙酰化的作用，得出经过50nMol/L浓度的TSA处理后的牛体细胞核移植获得的胚胎发育能力及组蛋白乙酰化水平与体外受精获得的胚胎相近。②Zygote，17(2009),209–215，作者：S.Ikeda等发表的《增强组蛋白乙酰化作用的曲古抑菌素A提高了牛卵母细胞体外受精所得囊胚的内细胞数》，通过在牛体外受精液中添加不同浓度的TSA，得出了能提高牛卵母细胞体外受精所得囊胚内细胞团细胞数的TSA浓度。③Zygote,1（2011），1-5，作者：C.S.Oliveira等发表的《组蛋白脱乙酰基酶抑制剂TSA在牛胚胎体外培养中的作用》中，得出TSA对牛8细胞期的胚胎发育能力没有显著的提高作用。④2008年39卷11期《畜牧兽医学报》上刘晓等人发表的《曲古抑菌素(Trichostatin)A对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的影响》、⑤2011年19卷4期《农业生物技术学报》上章美玲等人发表的《供体细胞和曲古抑菌素(TSA)对奶牛克隆胚胎发育的影响》等等。上述已有方法用于牛、猪、鼠体细胞核移植和体外受精胚胎培养上，但很少有用于提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的报道。 
本发明涉及曲古抑菌素Trichostatin A（TSA）对绵羊卵母细胞进行处理，能显著提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的方法，该方法具有较强的科学性与实用性。 
发明内容
本发明的目在于：采用TSA提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的方法，168h后获取的囊胚率和囊胚细胞数都显著高于对照组。 
本发明的目的是这样实现的：一种提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的方法，分步骤实施; 
步骤1获取卵母细胞： 
摘取宰杀30min内的绵羊卵巢，在30-35℃置入含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中清洗，3h内用生理盐水清洗3次；然后用吸有1ml抽卵液，带有9号针头的10ml注射器，抽吸卵巢表面2-8mm的卵泡，并将其卵泡液打在35-60mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞； 
步骤2细胞培养： 
将步骤1中捡出的卵母细胞，用抽卵液洗涤2-4次，用体外成熟液洗涤2-4次，移入平衡好的成熟培养液内，置于5%CO2、95%空气、温度38.6℃、CO2箱内培养24-30h； 
步骤3体外受精： 
将步骤2培养的卵母细胞，用含有TSA的体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入2h前平衡好的50-70μl的含有TSA的体外受精液滴内;用水浴解冻精液，移入2h前平衡好的含有TSA的体外受精液的试管内，放入CO2箱，上游20-25min，取上清，以1500rpm离心，离心4-5min，弃去上清液，将沉淀的精子，按2-4×106个/ml的密度加入含有TSA的已放入处理好卵母细胞的体外受精液滴内，与卵母细胞共同孵育10-12h； 
步骤4囊胚细胞数计数： 
将步骤3受精卵取出，移至平衡好的体外培养液内，洗涤3次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔体外培养液的四孔培养板内培养；24-26h统计卵裂率，168-170h统计囊胚率，将囊胚放在Hochest33342中平衡10min，载玻片上压片，在紫外光激发器作用下统计囊胚细胞数； 
其中实验液体的配制： 
抽卵液：TCM199-hepes+2%FBS+0.7mg／ml肝素钠； 
体外成熟液：TCM199-HCO3＋10%FBS＋0.05IU/ml FSH＋0.05IU/ml LH＋1μg/ml雌二醇＋24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素； 
SOF：6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O； 
体外受精液：SOF+20%FBS+200nMol/L TSA+6IU/ml肝素钠+100IU/ml硫酸庆大霉素； 
体外培养液：SOF+3mg/mlBSA； 
Hochest33342：抽卵液+10μg/mLHoechst33342。 
本发明原理与作用：胚胎发育过程包含染色体的浓缩与去浓缩、同源染色体分离、基因组重新程序化等复杂过程，与DNA非特异性结合的组蛋白修饰在这一过程中发挥着重要的作用。TSA是一种HDACs抑制剂，对胚胎发育及胚胎质量产生影响，具有重要的应用价值，彰显技术进步。 
具体实施方式
本发明将结合实施例作进一步说明。 
实施例 
1）摘取宰杀30min内的绵羊卵巢，置入温度在32℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3h内用生理盐水清洗3次；在吸有1ml抽卵液，带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液打在45mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞，用抽卵液洗涤3次，再用成熟液洗涤3次，放置于CO2箱内培养24h，CO2箱的条件为5%CO2，95%空气，温度为38.6℃；培养结束，用含有TSA的体外受精液洗涤3次，按30枚/滴的密度加入2h前平衡好的70μl的含有TSA的体外受精液滴内; 
2）用水浴解冻精液，移入2h前平衡好的含有TSA的体外受精液的试管内，放入CO2箱，上游25min，取上清，以1500rpm，离心5min，弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按4×106个/ml的密度加入含有TSA的体外受精液滴，与卵母细胞共同孵育； 
3）将受精12h的卵取出，移至平衡好的体外培养液内，洗涤3次，按60枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔体外培养液的四孔培养板内培养，25h统计卵裂率，170h统计囊胚率，将囊胚放在Hochest33342中平衡10min，用甘油石蜡混合液在载玻片做4个小柱，尺寸为2cm×2cm，将囊胚放在4角中间，尽量少带液体，然后将盖玻片放在4个液柱上，用玻璃小棒轻压盖玻片，在显微镜下观察，至囊胚被压开为止，在紫外光激发器作用下统计囊胚细胞数。 
4）实验液体的配置： 
抽卵液：TCM199-hepes+2%FBS+0.7mg／ml肝素钠； 
体外成熟液：TCM199-HCO3+10%FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1μg/ml 雌二醇＋24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素； 
SOF：6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O； 
体外受精液：SOF+20%FBS+200nMol/L TSA+6IU/ml肝素钠+100IU/ml硫酸庆大霉素； 
体外培养液：SOF+3mg/mlBSA; 
Hochest33342：抽卵液+10μg/mLHoechst33342。 
5）实验结果及数据验证： 
表 
Figure 2013102711944100002DEST_PATH_IMAGE001
由上表得知，经方差分析统计软件分析后（每列中不同大写字母表示差异极显著），使用100-500nMol/L浓度的TSA对绵羊卵母细胞体外受精后的卵裂率都没有影响，但使用添加100nMol/L和200nMol/L TSA的受精液，能极显著提高受精后的胚胎发育能力即囊胚率（P＜0.01），而200nMol/L的浓度比100nMol/L更能提高囊胚的质量即囊胚细胞总数（P＜0.01），而使用高浓度的TSA（500nM）,则没有效果，因此，200nMol/L浓度的TSA是最佳实验组。 
本发明配制抽卵液、体外成熟液、体外受精液、体外培养液、Hochest33342的所用制剂皆购自Sigma公司。 

Claims (1)

1.一种提高绵羊卵母细胞体外受精胚胎质量的方法，其特征在于：分步骤实施;
步骤1获取卵母细胞：
摘取宰杀30min内的绵羊卵巢，在30-35℃置入含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中清洗，3h内用生理盐水清洗3次；然后用吸有1ml抽卵液，带有9号针头的10ml注射器，抽吸卵巢表面2-8mm的卵泡，并将其卵泡液打在35-60mm的皿内，在显微镜下捡出卵母细胞；
步骤2细胞培养：
将步骤1中捡出的卵母细胞，用抽卵液洗涤2-4次，用体外成熟液洗涤2-4次，移入平衡好的成熟培养液内，置于5%CO2、95%空气、温度38.6℃、CO2箱内培养24-30h；
步骤3体外受精：
将步骤2培养的卵母细胞，用含有TSA的体外受精液洗涤2-4次，按25-30枚/滴的密度加入2h前平衡好的50-70μl的含有TSA的体外受精液滴内;用水浴解冻精液，移入2h前平衡好的含有TSA的体外受精液的试管内，放入CO2箱，上游20-25min，取上清，以1500rpm离心，离心4-5min，弃去上清液，将沉淀的精子，按2-4×106个/ml的密度加入含有TSA的已放入处理好卵母细胞的体外受精液滴内，与卵母细胞共同孵育10-12h；
步骤4囊胚细胞数计数：
将步骤3受精卵取出，移至平衡好的体外培养液内，洗涤3次，按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500μl/孔体外培养液的四孔培养板内培养；24-26h统计卵裂率，168-170h统计囊胚率，将囊胚放在Hochest33342中平衡10min，载玻片上压片，在紫外光激发器作用下统计囊胚细胞数；
其中实验液体的配制：
抽卵液：TCM199-hepes+2%FBS+0.7mg／ml肝素钠；
体外成熟液：TCM199-HCO3＋10%FBS＋0.05IU/ml FSH＋0.05IU/ml LH＋1μg/ml雌二醇＋24.2μg/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素；
SOF：6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6ul/ml乳酸钠+0.089mg/mlMgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL2·2H2O；
体外受精液：SOF+20%FBS+200nMol/L TSA+6IU/ml肝素钠+100IU/ml硫酸庆大霉素；
体外培养液：SOF+3mg/mlBSA；
Hochest33342：抽卵液+10μg/mLHoechst33342。
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