CN103103160B - 牛体外胚胎两段培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了牛体外胚胎两段培养方法，该方法首先将牛受精卵在含0.12～0.16mM葡萄糖的SOF液中培养2～3天，然后在含1.8～2.2mM葡萄糖的SOF液中培养4～5天。本发明还提供了一种用于牛体外胚胎培养的试剂，其包括A液：含0.12～0.16mM葡萄糖的SOF液；和，B液：1.8～2.2mM葡萄糖的SOF液。本发明在传统的SOF液的基础上，通过调整葡萄糖的浓度和培养时间提高了囊胚发育率，能够成为体外胚胎培养液在畜牧业生产上推广应用。

Description

牛体外胚胎两段培养方法
技术领域
本发明涉及一种新型的体外胚胎培养方法，具体地说，涉及合成输卵管液（SOF）在牛胚胎体外培养中的应用，可用于利用超排的或屠宰场卵巢获取的卵母细胞生产转基因克隆家畜、家畜育种及濒危物种的保护。属于应用型胚胎生物技术领域。
背景技术
体外胚胎培养技术是胚胎移植技术中重要的环节。采用超排卵或屠宰场来源的卵巢卵母细胞体外受精后进行体外胚胎培养，充分发挥优良母畜的繁殖潜力，为胚胎移植提供充足的胚源。该项技术的应用使得优良后代数量成倍增长，加快了优良品种扩繁和动物育种的步伐。基于该项技术的优势，目前已广泛应用于畜牧业生产，其中在牛单胎动物生产方面尤为突出。牛卵母细胞体外受精后进行胚胎培养，同时结合胚胎移植集成的MOET技术，加速了优良牛品种扩繁，缩短了世代间隔，提高了畜牧业生产效率，获得了巨大的经济及社会效益。
目前畜牧业生产中广泛使用SOF液进行牛体外胚胎生产，SOF液培养方法为胚胎全程培养7d。在培养7d后将获取的囊胚进行胚胎移植。尽管牛附植胚胎发育期间能够利用葡萄糖，但是许多研究发现SOF液内添加葡萄糖对早期胚胎发育有毒害作用，且一些研究表明体外培养期间葡萄糖降低了囊胚率。但是不添加葡萄糖或者葡萄糖浓度过低，同样不利于牛胚胎的发育。因此，体外培养期间如何通过合理的使用葡萄糖作为能源提高胚胎发育能力是目前亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛体外胚胎两段培养的方法；
本发明的另一个目的在于提供用于牛体外胚胎两段培养的培养试剂。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
牛体外胚胎两段培养方法，该方法首先将牛受精卵在含0.12～0.16mM葡萄糖的SOF液中培养2～3天，然后在含1.8～2.2mM葡萄糖的SOF液中培养4～5天。
优选地，该方法首先将牛受精卵在含0.15mM葡萄糖的SOF液中培养2天，然后在含2mM葡萄糖的SOF液中培养5天。
上述培养条件优选为含5%CO2的空气，温度39℃，饱和湿度。
本发明还包括在牛受精卵培养前进行牛卵母细胞体外成熟和体外受精的步骤。
其中，卵母细胞体外成熟的方法是：将挑选出的A、B级卵丘卵母细胞复合体在洗卵液中清洗3次，成熟液清洗2次，然后放入预先在CO2培养箱中平衡2h以上的成熟培养液中培养，培养条件为含5%CO2的空气，温度39℃，饱和湿度，培养时间为24h。
其中，体外受精的方法是：采用培养皿微滴法，首先将成熟的卵母细胞在受精液中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中；然后采用上浮法处理冷冻精液，精子在洗精液上浮20-30min，然后取上清600-800μl放入1.5ml离心管离心2次，离心后除去上清加入洗精液最终体积为250μl，取50μl处理后的精液加入已放入卵母细胞的受精液中，精子终浓度为1×106精子/ml，培养条件为5%CO2的空气，温度39℃，饱和湿度，受精时间为8h。
本发明还提供一种用于牛体外胚胎培养的试剂，其包括A液：含0.12～0.16mM葡萄糖的SOF液；和，B液：1.8～2.2mM葡萄糖的SOF液。
优选地，所述A液为含0.15mM葡萄糖的SOF液。所述B液为含2mM葡萄糖的SOF液。
本发明研究人员经过研究发现，在传统的SOF液的基础上，通过调整葡萄糖的浓度和培养时间提高了囊胚发育率，能够成为体外胚胎培养液在畜牧业生产上推广应用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1牛胚胎体外培养
本发明通过采用两种含有不同浓度葡萄糖的SOF培养液培养牛胚胎建立新型的牛胚胎体外培养体系。主要采用两段培养方法：首先在胚胎含有0.15mM浓度的SOF液内培养5天，然后在含有2mM浓度的SOF液内培养2天后计数囊胚率，同时以含有0.15mM低浓度和2mM高浓度葡萄糖的SOF液标准一段培养为对照，培养7天计数囊胚率。
具体地说，使用本发明SOF液的牛胚胎体外培养方案：
（1）卵母细胞体外成熟：将挑选出的A、B级卵丘卵母细胞复合体（COCs）在洗卵液（TCM199-Hepes）中清洗3次，成熟液（含FSH10μg/ml，LH1μg/ml，E21μg/ml，EGF10ng/ml，10%FBS的TCM199培养液）清洗2次，然后放入预先在CO2培养箱中平衡2h以上的成熟培养液（含FSH10μg/ml，LH1μg/ml，E21μg/ml，EGF10ng/ml，10%FBS的TCM199培养液）中培养（四孔板培养，500ul体积成熟液，50枚左右卵母）培养条件为含5%CO2的空气，温度39℃，饱和湿度，培养时间为24h。
（2）体外受精
采用培养皿微滴法，首先将成熟的卵母细胞在受精液中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中（50ul受精液，15枚卵母细胞）；然后采用上浮法处理冷冻精液，精子在洗精液上浮20-30min，然后取上清600-800μl放入1.5ml离心管离心（1500转，离心5min）2次，离心后除去上清加入洗精液最终体积为250μl，取50μl处理后的精液加入已放入卵母细胞的受精液中，精子终浓度为1×106精子/ml，培养条件为5%CO2的空气，温度39℃，饱和湿度，受精时间为8h。
（3）体外胚胎生产
受精后的合子在前期发育液洗涤3次（发育液2ml）后采用四孔板两步法培养：首先在500μl前期发育液（含0.15mM葡萄糖的SOF液）（50枚左右合子）培养2d，计数卵裂胚胎后移入500ul后期发育液（含2mM葡萄糖的SOF液）培养5d，间隔2d半量换液，胚胎发育第2天计数卵裂胚胎，7天计数囊胚。培养条件为5%CO2的空气，温度39℃，饱和湿度。一段SOF培养计数卵裂和囊胚同两段法。实验结果表明（表1），两段SOF胚胎培养方法相对一段SOF液含有低浓度（0.15mM）和高浓度葡萄糖（2mM）培养方法显著提高了囊胚率（P<0.05）。
表1不同的SOF液对牛卵母细胞体外发育的影响(平均数±标准误)
注:同列不同字母表示差异显著（P<0.05）
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
附表：
表2洗精液（BO液）的组成成分
药品 浓度
NaCl 11.20mM
KCl 0.40mM
NaH2PO4.H2O 0.083mM
MgCl2·6H2O 0.052mM
CaCl2·2H2O 0.225mM
Glucose 0.139mM
NaHCO3 36.9mM
丙酮酸钠 1.25mM
咖啡因 10mM
BSA 3mg/ml
Antibiotic-Antimycotic 20.0μl/ml
酚红 0.2mg/ml
表3受精液（BO液）的组成成分
药品 浓度
NaCl 11.20mM
KCl 0.40mM
NaH2PO4·H2O 0.083mM
MgCl2·6H2O 0.052mM
CaCl2·2H2O 0.23mM
NaHCO3 36.9mM
丙酮酸钠 1.25mM
肝素钠 20μg/ml
BSA 6mg/ml
Antibiotic-Antimycotic 20.0μl/ml
酚红 0.2mg/ml
表4SOF培养液的组成成分
药品 浓度
NaCl 107.63mM
KCl 7.16mM
KH2PO4 1.19mM
MgSO4 1.51mM
CaCl2·2H2O 1.78mM
NaHCO3 25.00mM
乳酸钠 5.35mM
丙酮酸钠 7.27mM
谷氨酰胺 0.20mM
必需氨基酸 20.0μL/mL
非必需氨基酸 10.0μL/mL
柠檬酸钠 0.34mM
肌醇 2.77mM
Antibiotic-Antimycotic 20.0μl/ml
酚红 0.2mg/ml

Claims (6)

1.牛体外胚胎两段培养方法，该方法首先将牛受精卵在含0.15mM葡萄糖的SOF液中培养2天，然后在含2mM葡萄糖的SOF液中培养5天，所述SOF液由以下浓度的成分组成：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养条件均为含5％CO2的空气，温度39℃，饱和湿度。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，该方法还包括在牛受精卵培养前进行牛卵母细胞体外成熟和体外受精的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，卵母细胞体外成熟的方法是：将挑选出的A、B级卵丘卵母细胞复合体在洗卵液中清洗3次，成熟液清洗2次，然后放入预先在CO2培养箱中平衡2h以上的成熟培养液中培养，培养条件为含5％CO2的空气，温度39℃，饱和湿度，培养时间为24h，所述洗卵液为TCM199-Hepes；所述成熟液为含FSH 10μg/ml，LH 1μg/ml，E2 1μg/ml，EGF 10ng/ml，10％FBS的TCM199培养液；所述成熟培养液为含FSH 10μg/ml，LH 1μg/ml，E2 1μg/ml，EGF 10ng/ml，10％FBS的TCM199培养液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，体外受精的方法是：采用培养皿微滴法，首先将成熟的卵母细胞在受精液中清洗2-3次后放入平衡好的受精液中；然后采用上浮法处理冷冻精液，精子在洗精液上浮20-30min，然后取上清600-800μl放入1.5ml离心管离心2次，离心后除去上清加入洗精液最终体积为250μl，取50μl处理后的精液加入已放入卵母细胞的受精液中，精子终浓度为1×106精子/ml，培养条件为5％CO2的空气，温度39℃，饱和湿度，受精时间为8h；
所述受精液的组成成分为：
所述洗精液的组成成分为：
6.一种用于牛体外胚胎培养的试剂，其包括A液：含0.15mM葡萄糖的SOF液；和，B液：2.0mM葡萄糖的SOF液，所述SOF液由以下浓度的成分组成：
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110747160B (zh) * 2019-11-27 2020-10-30 浙江大学 一种胚胎体外培养用高存活率的羊受精卵培养方法
CN113862303A (zh) * 2020-08-24 2021-12-31 北京希诺谷生物科技有限公司 利用体细胞克隆制备克隆马胚胎的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1304443A (zh) * 1999-06-30 2001-07-18 黄禹锡 一种生产克隆牛的方法
CN102093978A (zh) * 2010-12-17 2011-06-15 上海市农业科学院 猪早期胚胎发育前期培养液及后期培养液

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1304443A (zh) * 1999-06-30 2001-07-18 黄禹锡 一种生产克隆牛的方法
CN102093978A (zh) * 2010-12-17 2011-06-15 上海市农业科学院 猪早期胚胎发育前期培养液及后期培养液

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.P.GANDHI et al..A single medium supports development of bovine embryos throughout maturation,fertilization and culture.《HUMAN REPRODUCTION》.2000,395-401. *
IN VITRO DEVELOPMENT OF BOVINE ONE-CELL EMBRYOS:INFLUENCE OF GLUCOSE, LACTATE, PYRUVATE,AMINO ACIDS AND VLTAMINS;Y. Takahashi et al.;《Theriogenology》;19921231;963-978 *
动物胚胎体外培养研究进展;张靖飞等;《动物科学与动物医学》;20020225;19-22 *
牛体外受精技术体系的优化研究;胡林勇;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20081115;第20-21页,第36-37页第4.1.2节，试验二,第37-38页第4.2节，第40页第4.4节 *
牛体细胞核移植胚和孤雌激活胚的两步法体外培养;李裕强等;《农业生物技术学报》;20041226;653-657 *
碳水化合物对牛体外受精胚胎体外发育的影响;刘东军等;《中国实验动物学报》;20030330;38-41 *
胰岛素和葡萄糖对水牛体外受精早期胚胎发育的影响;叶丹娜等;《广西农业生物科学》;20060930;50-55 *

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