CN113862303A - 利用体细胞克隆制备克隆马胚胎的方法 - Google Patents

利用体细胞克隆制备克隆马胚胎的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113862303A
CN113862303A CN202110975206.6A CN202110975206A CN113862303A CN 113862303 A CN113862303 A CN 113862303A CN 202110975206 A CN202110975206 A CN 202110975206A CN 113862303 A CN113862303 A CN 113862303A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
embryo
cloned
oocyte
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110975206.6A
Other languages
English (en)
Inventor
米继东
赵建平
郑敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Sinogene Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Sinogene Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Sinogene Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Sinogene Biotechnology Co ltd
Publication of CN113862303A publication Critical patent/CN113862303A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
    • C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种利用体细胞克隆制备克隆马胚胎的方法，所述方法包括：体细胞的分离培养；马卵母细胞成熟培养；制备去核的卵母细胞；脱去卵母细胞的透明带，将供体细胞和无透明带的胞质体粘在一起；将供体细胞核导入去核卵母细胞的细胞质中；激活融合的重构胚；将克隆胚胎体外培养至囊胚；将囊胚冷冻保存。本发明提供的方法可以构建稳定成熟的克隆马胚胎生产和保存技术平台，为克隆马商业化生产奠定基础。

Description

利用体细胞克隆制备克隆马胚胎的方法
技术领域
本发明涉及利用体细胞克隆的方法，尤其涉及体细胞克隆马胚胎的方法。
背景技术
动物克隆技术通过体细胞核移植将供体细胞的细胞核转移至受体卵母细胞内，生产与供体细胞具有相同遗传物质的动物个体。因此采用克隆技术可以复制动物，可应用于转基因动物生产、优良家畜扩繁、濒危动物资源保存、进行治疗性克隆等。自1997年，克隆羊多利诞生以来，已经有几十种克隆动物相继出生。
首例马属动物克隆成功是克隆骡子，由美国犹他州立大学的Gordon L Woods团队于2003年完成；首例体细胞克隆马也于2003年成功，由意大利的科学家Cesare Galli团队完成：Cesare Galli等首次以供体母马皮肤成纤维细胞为核供体，成功获得存活的克隆马。2006年，美国德州农工的科学家K Hinrichs等，利用成纤维细胞获得了克隆马；2012年，阿根廷的科学家通过聚合的方法，获得了聚合囊胚，胚胎移植后得到了克隆马；2015年，韩国的科学家获得了韩国第一匹克隆马。2019年，澳大利亚的科学家与阿根廷的科学家合作获得了澳大利亚第一匹克隆马。2020年，我国科学家获得了我国第一匹克隆马。
现有的克隆马胚胎制备技术中，卵母细胞去核之后将体细胞注入透明带下，将去核的卵母细胞和供体细胞融合在一起，融合效率非常低，通常在50％以下。且通过传统方法去核，用piezo将细胞破膜之后注入去核的卵母细胞，设备需求高，操作难度大，对技术人员的要求高。此外，现有技术胚胎体外培养囊胚率低，通常低于15％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种体细胞克隆马胚胎的方法。本发明提供的方法操作简便，可以提高融合效率以及胚胎体外培养的囊胚率。
本发明提供了一种利用体细胞克隆制备克隆马胚胎的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)卵母细胞成熟培养；(3)制备去核的卵母细胞；(4)脱去卵母细胞的透明带，将供体细胞和无透明带的胞质体粘在一起；(5)将供体细胞核导入去核卵母细胞的细胞质中；(6)激活融合的重构胚；(7)将步骤(6)获得的克隆胚胎体外培养至囊胚；(8)将步骤(7)获得的克隆囊胚冷冻保存。
优选地，在所述步骤(1)中，体细胞可以是来自各种组织和器官，例如皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢等的细胞。可用于本发明方法的体细胞的例子包括但并不限于：皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞、成骨细胞等。
优选地，在所述步骤(2)中，所述卵母细胞可以是体内成熟的，也可以是体外成熟的。所述体外成熟将卵丘-卵母细胞复合体在成熟液中培养18～24小时。
优选地，在所述步骤(4)中，可以采用链霉蛋白酶(pronase)消化去掉去核卵母细胞的透明带。并且，可以采用植物凝集素将供体细胞和无透明带的胞质体粘在一起。
优选地，在所述步骤(5)中，通过电融合的方法将供体细胞核导入去核卵母细胞的细胞质中。所述电融合的电压优选为1～3KV/cm。
优选地，在所述步骤(6)中，将经步骤(5)的重构胚通过5～10uM的肌霉素(inomycin)激活。优选地，所述激活后可以进一步放入胚胎培养液中进行辅助激活；所述胚胎培养液中优选含有1mM6-DMAP和5-10ug CHX。
优选地，在所述步骤(7)中，胚胎体外培养分为两个阶段，第一阶段为激活后3～4天，培养基为G1 plus、G1或者Global+5-8mg/ml BSA；第二阶段的培养基为DMEM/F12+(5％-10％)FBS。胚胎培养过程中气相条件优选为5％CO2+5％O2+90％N2。胚胎培养过程中的温度优选为38～38.5℃。
优选地，在所述步骤(7)中，将克隆胚胎在体外培养7-8天后获得克隆囊胚。
优选地，在所述步骤(8)中，冷冻胚胎早期囊胚或扩张囊胚。
本发明提供的方法将去核卵母细胞的透明带脱去，通过植物凝集素将受体胞质和供体细胞粘在一起，然后通过电融合的方法完成核移植。核移植完成之后将重构胚激活，进行克隆胚胎的培养，培养至合适阶段的克隆胚胎进行冷冻保存。
对本发明得到的冷冻的克隆囊胚进行复苏，复苏率可达100％。作为一种具体实施方式，所述复苏包括：将含胚胎部分迅速浸入0.25MSU中并将胚胎吹出，1分钟后转入0.15MSU中处理5分钟，结束后移入DMEM/F12+10％FBS培养。
与现有技术相比，本发明提供的方法卵母细胞和供体细胞融合率高，可达到100％。本发明通过体细胞核移植技术制备了马的克隆胚胎，囊胚率达到25％；将克隆囊胚冷冻后复苏，复苏率可达100％。此外，本发明提供的方法操作容易，只有去核过程需要显微操作，后续步骤均不需要，难度大大降低。
附图说明
图1为在成熟培养24小时后卵母细胞的成熟情况统计图；
图2为供体细胞和无透明带的胞质体粘合图；
图3为冷冻胚胎复苏后重新扩张图片。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1、体细胞的分离培养
(1)采样：固定马匹，选好采样部位，剃毛消毒，用镊子轻轻提起皮肤，用剪刀剪去一块皮肤放入采样液带回实验室进行建系。
(2)体细胞的分离：取出样品在酒精里浸泡5-10秒(若是耳朵，可延长消毒时间，1-2分钟)，将样品放入含有7mL DMEM(国产gibico)的60mm培养皿中，再用剪子、镊子、手术刀刮毛，尽可能的剔除软骨，肌肉等组织(至少5个皿)；在一个干的35mm培养皿中，沾取少许DMEM(国产，保证湿度)，尽可能剪碎仅剩的上皮组织，剪碎后加少许血清(1-2ml)，反复吹打使组织块互相变粘易于贴壁。用钝性1ml枪头吸取混合液接种到T25培养瓶，再用移液器将组织推匀铺在瓶底，并吸掉多余液体，(直立瓶，但防止沾到瓶上层)反转培养瓶，在瓶上层加细胞培养液(DMEM(进口，GIBICO)+20％FBS+5X双抗)5ml。倒置培养瓶在培养箱培养6小时后，翻瓶，将培养瓶正置继续培养。原代培养，每两天换一次液，所有液体都是5倍双抗，倒掉瓶中的所有旧培养液，加入新鲜培养液继续培养(5-6天可能出现细胞，可观察)。
(3)细胞冻存：轻晃培养瓶，倒掉原培养液，用DPBS清洗一次细胞，加入0.25％Trypsin-EDTA(1X)1mL，放入培养箱消化2分钟。然后用5mL细胞培养液(DMEM+20％FBS)终止消化，轻轻敲打培养瓶底部，使细胞与培养瓶脱离，可轻轻吹打，但要注意防止组织块脱落。将细胞悬液吸出转移至15mL离心管中，1000转/min(～300g)，离心5min。离心后弃掉上清液，按照每50万细胞加入1mL冻存液重悬细胞，冻存液为DMSO：FBS：DMEM＝1：3：6配制。然后放入4度冰箱30min，再放入-80度过夜冷冻(大于8小时)，最后投入液氮长期保存。
(4)细胞解冻：从液氮中取出冻存管，在空中晃动，使液氮尽快挥发，并尽快将冻存管投入37度水浴，在水中晃动使冻存液尽快融化成液体。在冷冻管上喷洒酒精消毒，拿到超净台。用酒精棉擦拭冷冻管口，将细胞液转置15ml离心管，再加5ml细胞培养液(DMEM+20％FBS)，切记：前2ml逐滴加入，且加一滴晃动离心管数次，以使细胞逐渐复苏。后3ml慢速加入即可，混匀。1000转/分(～300g)离心5min，弃上清，加入5ml培养液重悬后接种培养瓶或皿培养，第二天换液，后隔天换液。
2、成熟卵母细胞的获得
马卵巢从当地屠宰场收集，置于装有20-25℃生理盐水的保温瓶中4-6小时运回实验室，用剪刀去除卵巢上系膜和脂肪，生理盐水清洗三遍待用。采用切割法回收卵母细胞，将卵巢置于冲卵液(DMEM(gibco,11995500BT)+1mM丙酮酸钠+10ug/mL肝素(3149))中，用手术刀切开卵巢上所有可见卵泡，并用药匙刮擦卵泡壁，在体视镜下回收卵丘-卵母细胞复合体(COCs)。根据卵丘扩展程度将其分为松散型和紧密型：全部或部分卵丘扩展为松散型，无卵丘扩散为紧密型。
两种类型COCs分开培养，成熟液(M199(11150)+0.01IU/mL FSH(F4021)+100uMCys+1uL/mL ITS+1mM丙酮酸钠+10％FBS+2％P/S(Gibco,15150-122))洗三遍，放入预平衡4小时的成熟液中成熟24小时，成熟条件为10-15个/100uL,38.5℃,5％CO2,100％湿度。
卵母细胞的成熟情况如图1所示。
3、卵母细胞去核
成熟24小时的COCs放入0.05％胰酶中吹打2分钟去除卵丘，挑选胞膜完整有光泽、极体透亮的成熟卵母细胞进行去核。卵母细胞在含5ug/mL CB和5ug/mLHeochst33342的台式液(TALP-H,Tyrode’s+10mM乳酸钠+0.1mM丙酮酸钠+10mM Hepes+1ul/mL酚红+1％P/S+3mg/mL BSA)中处理10min，在含5ug/mL CB台式液(TALP-H)中进行去核操作。
4、供体细胞准备
细胞在核移植前经过2天的接触抑制，使用时先把准备好的细胞在高倍显微镜下观察细胞的生长状态和密度，选好要的孔进行消化。用1mL DPBS把细胞洗一遍，使孔内没有血清，减少对胰酶的中和，然后加入新配的0.25％的胰酶200ul左右，放入培养箱中定时2分钟，然后马上用1mL细胞培养液(DMEM+10％FBS)终止消化，用枪头吹打细胞，收集全部的细胞到15mL无菌离心管中，1000转/分钟(～300g)离心5min。弃去上清，加100-200uL台式液备用。
5、注核、融合及激活
去核的卵母细胞在含1.5mg/mL链酶蛋白酶(P8811)的台式液中处理3-6min去除透明带，之后台式液洗三遍，然后用含1mg/mL植物凝集素(L8754)的台式液处理2秒，在台式液中从挑选好的细胞(挑选细胞在显微操作仪上操作，细胞大小适中、圆滑、折光性好)上滚落粘取供体细胞。细胞-胞质体在融合液(0.3M甘露醇+0.05mM CaCl2.2H2O+0.1mM MgCl2.6H2O+0.5mg/mL BSA)中处理2min，放入融合槽中，将细胞-胞质体垂直于两电极，融合条件为1.2kv/cm，30us，2次，电击后放入G1 Plus(vitrolife)(备选1：G1+8mg/mL BSA；备选2：Global(Global，LGGGG-020)+8mg/mLBSA)中，2min后检查融合情况，未融合的进行2次电击。
供体细胞和无透明带的胞质体粘合图如图2所示。
6、化学辅助激活及胚胎培养
融合的胚胎在G1H(备选1：G1+8mg/mL BSA；备选2：Global+8mg/mL BSA)中培养2-3小时后进行激活，先用含8.7uM ION的台式液处理5分钟，之后转入含1mM 6-DMAP+5mg/mLCHX的G1H(备选1：G1+8mg/mL BSA；备选2：Global+8mg/mL BSA)培养4小时，培养条件为38.5℃,5％CO2,100％湿度。胚胎培养采用WOW培养，前三天用G1 plus(备选1：G1+8mg/mL BSA；备选2：Global+8mg/mLBSA)培养，之后换成DMEM/F12(gibco,11320-033)+10％FBS培养。密度2-5ul/个，培养条件38.5℃,5％CO2,5％O2,90％N2,100％湿度。
克隆胚胎的生产情况如表1所示。
表1克隆胚胎生产情况
Figure BDA0003227041170000071
7、胚胎冷冻及复苏
7-8天囊胚冷冻采用OPS法进行。OPS由O.25mLFrance细管拉制，细端保留3-5cm，内径150-200um。在含10％EG(v/v)+10％DMSO(v/v)的PBS中处理1分钟，之后转入EDFS30(15％EG(v/v)+15％DMSO(v/v)+70％FS,FS:PBS+300g/L Ficol+0.5M SU+3mg/mL BSA)，在EDFS30中平衡后吸入OPS细端投入液氮，EDFS30中共25秒。
解冻：OPS从液氮中取出，将细管含胚胎部分迅速浸入0.25M SU中并将胚胎吹出，1分钟后转入0.15M SU中处理5分钟，结束后移入DMEM/F12+10％FBS培养。
冷冻胚胎复苏后重新扩张的示意图如图3所示。
本发明提供的方法提供了一种体细胞克隆马胚胎的制作和长期保存的方法，实现了克隆马胚胎的简易高效制备。此外，本发明提供的方法可以构建稳定成熟的克隆马技术平台，完成克隆马商业化生产。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种利用体细胞克隆制备克隆马胚胎的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)卵母细胞成熟培养；(3)制备去核的卵母细胞；(4)脱去卵母细胞的透明带，将供体细胞和无透明带的胞质体粘在一起；(5)将供体细胞核导入去核卵母细胞的细胞质中；(6)激活融合的重构胚；(7)将步骤(6)获得的克隆胚胎体外培养至囊胚；(8)将步骤(7)获得的克隆囊胚冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，体细胞来自皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管或卵巢；
优选地，所述体细胞为皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞或成骨细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，卵母细胞是体内成熟的或是体外成熟的；
优选地，所述步骤(2)具体为：将卵丘-卵母细胞复合体在成熟液中培养18-24小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用链霉蛋白酶消化去掉去核卵母细胞的透明带。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，采用植物凝集素将供体细胞和无透明带的胞质体粘在一起。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，通过电融合的方法将供体细胞核导入去核卵母细胞的细胞质中；
优选地，所述电融合的电压为1～3KV/cm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，将经步骤(5)融合的卵母细胞通过5～10uM的肌霉素激活。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用肌霉素激活后，再将卵母细胞放入胚胎培养液中进行辅助激活；所述胚胎培养液中优选含有1mM 6-DMAP和5-10ug CHX。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，胚胎体外培养包括两个阶段；第一阶段为激活后3～4天，培养基为G1 plus、G1或者Global+5-8mg/ml BSA；第二阶段的培养基为DMEM/F12+(5％-10％)FBS；
优选地，所述步骤(7)中，将克隆胚胎体外培养7-8天后获得克隆囊胚。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(8)中，冷冻胚胎早期囊胚或扩张囊胚。
CN202110975206.6A 2020-08-24 2021-08-24 利用体细胞克隆制备克隆马胚胎的方法 Pending CN113862303A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010858753 2020-08-24
CN2020108587531 2020-08-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113862303A true CN113862303A (zh) 2021-12-31

Family

ID=78988191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110975206.6A Pending CN113862303A (zh) 2020-08-24 2021-08-24 利用体细胞克隆制备克隆马胚胎的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113862303A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154198A (zh) * 2010-12-16 2011-08-17 西北农林科技大学 一种简易的卵母细胞体外成熟培养方法
CN103103160A (zh) * 2013-01-25 2013-05-15 内蒙古民族大学 牛体外胚胎两段培养方法
CN107460208A (zh) * 2017-09-08 2017-12-12 英科博雅基因科技（天津）有限公司 哺乳动物体细胞克隆方法和使用的培养液
CN109536581A (zh) * 2018-12-29 2019-03-29 序康医疗科技（苏州）有限公司 一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法和产品

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154198A (zh) * 2010-12-16 2011-08-17 西北农林科技大学 一种简易的卵母细胞体外成熟培养方法
CN103103160A (zh) * 2013-01-25 2013-05-15 内蒙古民族大学 牛体外胚胎两段培养方法
CN107460208A (zh) * 2017-09-08 2017-12-12 英科博雅基因科技（天津）有限公司 哺乳动物体细胞克隆方法和使用的培养液
CN109536581A (zh) * 2018-12-29 2019-03-29 序康医疗科技（苏州）有限公司 一种利用囊胚培养液检测胚胎健康状况的方法和产品

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张志鹏: "马胚胎移植及克隆胚体外构建技术", 中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑, pages 2 *
朱化彬: "马-牛无透明带卵异种克隆的研究", 中国农业科学, vol. 44, no. 16, pages 1 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU694126B2 (en) Embryonic stem cells for making chimeric and transgenic ungulates
JP5058166B2 (ja) 細胞核移入
KR20080036549A (ko) 포유류 배아 유래의 줄기 세포 또는 줄기 세포 유사 세포의제조 방법
CN107937445B (zh) 利用体细胞克隆技术制备基因敲除犬的方法
CN113862303A (zh) 利用体细胞克隆制备克隆马胚胎的方法
Liu et al. Embryo production and possible species preservation by nuclear transfer of somatic cells isolated from bovine semen
Vassiliev et al. Isolation and culture of porcine embryonic stem cells
Talluri et al. Generation of murine induced pluripotent stem cells through transposon-mediated reprogramming
KR20100124891A (ko) 돼지 체세포 복제 배반포 유래의 배아줄기유사세포의 확립과 특성 분석
KR100862297B1 (ko) 이중 피펫, 이를 이용한 수핵난자의 탈핵 및 핵이식 방법및 체세포 복제동물의 생산방법
KR100767289B1 (ko) 배아줄기세포 배양방법
KR102004958B1 (ko) 고대 멸종 생물 사체 또는 화석으로부터 살아있는 세포를 분리 및 배양하는 방법
CN109456938B (zh) 一种小鼠精原干细胞体外向精子高效分化的方法
CN116769700A (zh) 一种手工克隆绵羊胚胎的方法及其应用
KR101316594B1 (ko) 돼지 난포액을 포함하는 공여 세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 복제동물 생산 방법
JP3955931B2 (ja) クローンウシの生産方法
KR20080077779A (ko) 돼지 배아의 체외배양 방법
AU747070B2 (en) Efficient nuclear transfer using primordial germ cells
KR100342438B1 (ko) 체세포 복제동물 생산을 위한 융합세포의 활성화 방법
RU2352637C1 (ru) Способ получения гибридной стволовой клетки человека
Tasripoo Somatic cell nuclear transfer for production of bovine embryos derived from adult ear fibroblast cells and muscle cells
Fertilization StemCells, Medicine’s New Frontier
Brem et al. Nuclear transfer in cattle
Zhou et al. Heterogeneous nuclear transfer embryos reconstructed by bovine oocytes and camel (Camelus bactrianus) skin fibroblasts and their subsequent development
CN116287004A (zh) 一种成纤维细胞基因转染方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination