JP5058166B2 - 細胞核移入 - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
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Description
本発明は、哺乳動物における細胞核移入の方法に、そしてこの方法によって得られた遺伝子操作された動物か、またはこの方法によって得ることができる遺伝子操作された動物に関する。さらに、本発明は、卵母細胞、接合体、胚盤胞を含む胚を透化する方法に関する。
ドナー細胞を遺伝子操作して、それらを核移入に用いる能力によって、重篤なヒト疾患および薬物試験の研究のための疾患モデルとして例えば用いられ得る遺伝子操作動物の生成のためのツールが得られる。
Vajtaら、2001 Cloning 3,89−95 Vajtaら、2003 Biol.Reprod.68,571−578 Vajtaら、2005 Reprod.Fertil.Dev.17,1−16 Boothら、2001 Cloning Stem Cells 3,139−150 Obackら、Cloning Stem Cells 5,3−12 Boothら、2001 Cloning Stem Cells 3,191−197 Kraghら、2004 Reproduction,Fertility and Development 16,315−318 Esakiら、2004 Biol Reprod.71,432−6
本発明は、1局面では、細胞核移入の方法に関しており、この方法は、a)操作された透明帯の少なくとも一部を有する少なくとも1つの卵母細胞を樹立する工程と、b)この卵母細胞を少なくとも2つの部分に分けて、少なくとも1つの細胞質体を得る工程と、c)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞または細胞核を樹立する工程と、d)少なくとも1つの細胞質体とドナー細胞または膜に囲まれる細胞核とを融合させる工程と、e)再構成された胚を得る工程と、を包含する。
本発明は、核DNAの全補完物を1つの細胞から除核された細胞へ導入することを指す核移入による哺乳動物のクローニングのための改良手順を提供する。
クローニングでは、それ自体の核が除去(脱核または除核)された卵細胞(卵母細胞)への体(身体の)細胞の核または体細胞の移入は、体細胞核移入と呼ばれる。新規な個体はこの再構成された胚から発達して、体細胞のドナーと遺伝的に同一である。本発明では、体細胞核移入の方法は、細胞核移入の方法であって、この方法は、a)操作された透明帯の少なくとも一部を有する少なくとも1つの卵母細胞を樹立する工程と、b)この卵母細胞を少なくとも2つの部分に分けて、少なくとも1つの細胞質体を得る工程と、c)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞または細胞核を樹立する工程と、d)少なくとも1つの細胞質体とドナー細胞または膜に囲まれる細胞核とを融合させる工程と、e)再構成された胚を得る工程と、を包含する。しかし、本発明はまた、細胞核移入の方法に関しており、この方法は、a)少なくとも1つの卵母細胞を樹立する工程と、b)この卵母細胞を少なくとも3つの部分に分けて、少なくとも2つの細胞質体を得る工程と、c)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞または細胞核を樹立する工程と、d)少なくとも1つの細胞質体とドナー細胞または膜に囲まれる細胞核とを融合させる工程と、e)再構成された胚を得る工程と、を包含する。
「卵母細胞(oocyte)」という用語は、本明細書によれば、未成熟な雌性生殖細胞であって、成熟過程を終わらせておらず、卵細胞(配偶子)を形成する細胞をいう。本発明では、除核卵母細胞とは、核移入プロセスにおけるレシピエント細胞である。
本発明による細胞核移入方法に関与するドナー(体細胞または体細胞の核)およびレシピエント(細胞質体)は、非ヒト哺乳動物である。同様に、再構成された胚が本発明によって移植され得る動物は非ヒト哺乳動物である。哺乳動物は、ウシ科(vovidae)、ウシ亜科(ovids)、シカ類(cervids)、イノシシ類(suids)、ウマ類(equids)、およびラクダ類(camelids)の家畜または野生の代表物からなる郡より選択される有蹄動物であってもよい。特定の実施形態では、この哺乳動物は、雌ウシまたは雄ウシ、バイソン、バッファロー、ヒツジ、オオツノヒツジ、ウマ、ポニー、ロバ、ラバ、シカ、エルク、カリブー、ヤギ、スイギュウ、ラクダ、ラマ、アルパカまたはブタである。本発明の特定の実施形態では、哺乳動物はブタである。1実施形態では、ブタは、野ブタである。別の実施形態では、このブタは、家畜のブタ、Sus scrofa、またはS.domesticusである。さらに別の実施形態では、本発明は、ミニブタに関するが、また近交系のブタにも関する。
本発明によれば、再構築された胚(すなわち、単一細胞胚)は、ドナー細胞の遺伝物質を含む。引き続き、この再構築された胚は、有糸分裂の発生後に多細胞の胚に徐々に分裂する。インビトロでは有糸分裂の発生は代表的には、本明細書に記載されるような活性化によって誘導される。
核が取り除かれている、卵母細胞または卵母細胞の一部。
本発明の「ドナー細胞(donor cell)」という用語は、体細胞および/または生殖系列由来の細胞を意味する。
卵母細胞の除核の方法は、吸引、物理的除去、DNA特異的蛍光色素の使用、紫外光に対する曝露および/または化学補助除核(chemically assisted enucleation)からなる方法の群より選択され得る。1実施形態では、本発明は、DNA特異的な蛍光色素の使用に関する。しかし、除核は、紫外光での曝露によって行われてもよい。特定の実施形態では、除核は、核の物理的除去の前に化学的に補助される。例えば、抗悪性腫瘍薬、例えば、デメコルチン(N−デアセチル−N−メチル1コルヒチン)、および/または例えば、エトポシド、もしくは関連の因子を用いる化学補助除核は、透明帯の酵素的改変の前に行われ得る。化学補助除核は、特定の期間にわたって、デメコルチンを補充された、本明細書のいずれかに記載されたような成熟培地において成熟COCを培養する工程を包含する。0.1μg/ml〜10μg/mlのデメコルチンの範囲、例えば0.2μg/ml〜10μg/ml、例えば0.3μg/ml〜10μg/ml、例えば0.25μg/ml〜5μg/ml、例えば0.3μg/ml〜1μg/ml、例えば0.25μg/ml〜0.5μg/ml、例えば0.4μg/mlのデメコルチンが、成熟培地に補充されてもよい。同様に、成熟培地は、例えば、0.1μg/ml〜10μg/mlのエトポシドの範囲、例えば0.2μg/ml〜10μg/ml、例えば0.3μg/ml〜10μg/ml、例えば0.25μg/ml〜5μg/ml、例えば0.3μg/ml〜1μg/ml、例えば0.25μg/ml〜0.5μg/mlのエトポシドを補充されてもよく、例えば0.4μg/mlのエトポシドが成熟培地に補充されてもよい。抗悪性腫瘍薬の存在下でCOCを培養するための時間は、10分〜5時間、例えば30分〜5時間、例えば10分〜2時間、例えば30分〜2時間、例えば10分〜1.5時間、例えば20分〜3時間、例えば10分〜3時間、例えば30分〜1.5時間、例えば45分におよぶ。特定の実施形態では、化学補助除核は、成熟培地に添加した0.45μg/mlのデメコルチンおよび/またはエトポシドを用いて、45分間行った。
透明帯(zona pellucida)は、卵母細胞を囲む均一な厚みの薄く、透明で、細胞のない層またはエンベロープである。
「再構成された胚(reconstructed embryo)」という用語は、接合体(正常な受精)に相当する除核卵母細胞へのドナー細胞またはドナー細胞の核の挿入によって形成される細胞を意味する。しかし、「再構成された胚」という用語はまた、「再構成された胚(reconstructed embryo)」とも呼ばれる。本発明では、ドナー細胞は、体細胞である。しかし、ドナー細胞はまた、生殖系列細胞に由来してもよい。
ドナー細胞またはドナー細胞由来の膜に囲まれた核の少なくとも細胞質体への移入は、本発明に従って融合によって行われる。下に記載されるシナリオでは、「ドナー細胞(donor cell)」という用語はまた、ドナー細胞由来の膜に囲まれた核をいう。融合は、多数の方法によって達成され得る。
好ましい実施形態では、この再構築された胚は、ドナー細胞の核がそのゲノムをリセットして、除核された細胞質体の新規な周囲での分化全能性を得ることができるように、活性化の前に一定期間休止させられてもよい。この再構成された胚は、例えば、活性化の前に1時間休止し得る。
ドナー細胞は、当該分野で公知の任意の標準的な方法によって遺伝子操作され得る。この遺伝子操作は、欠失、挿入、複製、および/または、ポイントミューテーションを含む他の形態の変異による、ゲノムDNAの改変であってもよい。この改変は、コード配列および/または非コード配列で行われ得る。挿入のためのDNA構築物は、目的の遺伝子および/または制御配列、例えば、プロモーター、インシュレイター、エンハンサー、リプレッサーまたはリボソーム進入部位を保有し得る。いくつかの実施形態では、遺伝子改変が1つだけゲノムに導入される。しかし、他の実施形態では、ゲノムは、2つ以上の部位で改変されてもよい。哺乳動物細胞、例えば、線維芽細胞の遺伝子操作に適切な技術としては、非相同組み換えによる遺伝子付加、相同組み換えによる遺伝子置換、および遺伝子編集のような技術が挙げられる。これは、レトロウイルス挿入、トランスポゾン移入および/または人工的染色体技術の使用を挙げることができる。非相同的なDNA組み換えは、例えば、Kraghら(2004)Reprod.Fert.Dev.16:290、またはKraghら、(2004)Reprod.Fert.Dev.16:315に記載されるとおり行われてもよく、トランスポゾンベースの遺伝子移入は、Izsvakら、(1997)Cell 91:501に記載されるように行われてもよい。相同組み換えによる遺伝子置換は、例えば、Urnowら、(2005)Nature 435:646に記載される技術を包含し得る。遺伝子編集の技術は、Andersenら、(2002)J.Mol.Med.80:770、Liuら、(2002)Gene Ther.9:118、およびSoerensenら、(2005)J.MoI.Med.83:39に記載されている。
本発明の1局面は、胚盤胞の割合が25.3%に増大した胚をインビトロで培養する方法に関する。従って、再構築された胚を培養する方法は、本発明の範囲内であって、この方法は、a)透明帯の少なくとも一部を有する少なくとも1つの卵母細胞を樹立する工程と、b)この卵母細胞を少なくとも2つの部分に分けて、核および少なくとも1つの細胞質体を有する卵母細胞を得る工程と、c)所望の遺伝的特性を有するドナー細胞または細胞核を樹立する工程と、d)少なくとも1つの細胞質体とドナー細胞または膜に囲まれる細胞核とを融合させる工程と、e)再構成された胚を得る工程と、f)この再構成された胚を活性化して胚を形成させる工程と、e)この胚を培養する工程とを包含する。
本発明の1実施形態によれば、所望の遺伝子型を有する遺伝子操作動物またはトランスジェニック動物が提供される。
1実施形態では、本発明の動物は、ヒトまたは他の動物、同じ種の動物または他の種の動物のいずれかの動物のための器官または組織贈与のための供給源として用いられてもよい。種の間の移入は通常、異種移植と呼ばれる。移植され得る全体的な器官としては、心臓、腎臓、肝臓、膵臓または肺が挙げられる。あるいは、器官の一部、例えば、特異的な器官組織は、ヒトまたは他の動物に移植されても、または移入されてもよい。なおさらなる実施形態では、本発明の動物の個体細胞または個体細胞の集団は、治療目的のためにヒトにまたは別の動物に移入されてもよい。
本発明はまた、本発明の方法による非ヒト哺乳動物をクローニングするための方法に関する。従って、本発明の1局面は、非ヒト哺乳動物をクローニングするための方法に関しており、この方法は、a)本発明に記載されるような胚盤胞を樹立して、必要に応じて胚を解凍する工程と、b)この培養された胚を宿主哺乳動物に移入して、その結果この胚を遺伝子操作された胎児に発達させる工程と、を包含する。遺伝子操作された胎児は、非ヒト哺乳動物に発達され得る。
凍結保存という用語は、生きている細胞の凍結、保存および解凍のプロセスに関与する種々の細胞凍結技術に用いられる。透化は、凍結保存の形態であって、生きている細胞は急速に冷却されて、その結果細胞の液体は、氷を形成しない。従って、透化とは、細胞または組織全体が、低い0℃未満の温度、例えば、(代表的には)−80℃または−196℃(液体窒素の沸点)まで冷却されることによって保存される冷却のプロセスに関する。これらの低温では、細胞死をもたらす生化学的反応を含む任意の生物学的活性が効率的に停止される。しかし、透化とは、氷形成が培地中で、そしてこの保存された細胞または組織において行われない特別なアプローチをいう。この氷なしの冷却は、高濃度の凍結保護物質溶液および極めて高速の冷却速度の適用によって達成され得る。加温はまた、温度の急速な増大で行われるべきである。
本発明の方法によって獲得可能である、遺伝子操作された非ヒト哺乳動物の組織の細胞および/または非ヒト胚は、種々の母体由来のミトコンドリアを保有し得る。好ましい実施形態では、この非ヒト哺乳動物および/または非ヒト胚は、唯一の母体由来のミトコンドリアを保有してもよいが、別の好ましい実施形態では、この非ヒト哺乳動物および/または非ヒト胚は、少なくとも2つの母体供由来、例えば、3つの哺乳動物由来、例えば、4つの哺乳動物由来、例えば、5つの哺乳動物由来、例えば、6つの哺乳動物由来、例えば、7つの哺乳動物由来、例えば、8つの哺乳動物由来、例えば、9つの哺乳動物由来、例えば、10の哺乳動物由来のミトコンドリアを保有してもよい。特定の数の哺乳動物起源を有する可能性は、観察されたタイプのミトコンドリアに基づいて算出され得る。
卵丘・卵母細胞複合体(cumulus−oocyte complexes)(COC)を、食肉処理場由来のメスブタ(sowまたはgilt)の卵巣由来の2〜6mmの濾胞から吸引した。COCは、50の群で、10%(v/v)のウシ血清(CS)、10%(v/v)ブタ卵胞液、10IU/mlのeCG、5IU/mlのhCG(Suigonan Vet;Skovlunde,Denmark)を補充した、400μlの炭酸水素塩緩衝化TCM−199(GIBCO BRL)中で、38.5℃において、「Submarine Incubation System」(SIS;Vajtaら、1997)中で、5%のCO2で加湿空気中において、41〜44時間成熟させた。
IVF実験は、インビトロ成熟させた卵母細胞を用いて3つの同一の複製で行った。成熟後、COCを、2mMのカフェインを含有するmTBM(mTBMfert)を用いて2回洗浄して、50の群で400μlのmTBMfertに移した。新しく射精された精液を以前に記載されたとおり(Boothら、印刷中)処理した。38.5℃での受精能獲得および5%CO2において加湿空気中で2時間後、精液を卵母細胞に加えて1mlあたり1×105個の精子という最終濃度に調節した。受精は、38.5℃で、そして5%CO2において加湿空気中でSIS中で3時間行った。媒精後、推定の接合体をmTBMfertにボルテックスして、卵丘細胞を取り除き、その後に、IVC培地中で洗浄して、培養皿に置いた(Embryo culture and evaluationを参照のこと)。
適用されたHMC方法は、ウシおよびブタでの本発明者らの以前の研究に基づいた(Kraghら、2004;Peura and Vajta,2003;Vajtaら、2003)が、大きな改変をともなっていた。
単為生殖的に活性化した卵母細胞を、HMCを用いて別々にまたは平行して生成した。卵母細胞を、プロナーゼ中のより長いインキュベーションを用いて、完全に透明帯を除去したこと以外は、上記と同じ方法で裸出させた。次いで、帯なし(zona free)(ZF)の卵母細胞を活性化培地(0.3Mのマンニトール、0.1mMのMgSO4、0.1mMのCaCl2および0.01%のPVA)中で10秒間平衡化して、融合チャンバ(BTXマイクロスライド0.5mm融合チャンバ,モデル450;BTX,SanDiego,CA,USA)に移した。80μs間の0.85KV/cmの単一のDCパルスを、BLS CF−150/B細胞融合マシン(BLS,Budapest,Hungary)で生成して、ZF卵母細胞に加えた。帯のインタクトな(zona intact)(ZI)卵母細胞については、1.25KV/cmの単一のDCパルスを80μs間用いて(本発明者らの未公開の予備実験によれば、これらのパラメーターは、最高の活性、ならびにそれぞれZIおよびZF卵母細胞について引き続くインビトロの発達を生じた)。電気的パルス後の手順は、HMC再構築胚と同じであった。
上記の処置によって生成される全てのブタ胚は、4mg/mlのBSAを含有する改変NCSU37培地(Kikuchiら、2002)中で、38.5℃で、5%のO2、5%のCO2および90%のN2の中で、最大湿度で培養した。この培養培地には、0日目(受精および活性化の日)から2日目まで0.17mmのピルビン酸ナトリウムおよび2.73mmの乳酸ナトリウムを供給し、次いで、乳酸ナトリウムおよびピルビン酸ナトリウムを2日目〜7日目に5.5mmのグルコースで置換した。全てのZF胚をWOW系(Vajtaら、2000)において、上記と同じ培養培地およびガス混合物中で培養し、2日目に、WOWから胚を取り外すことなく注意深く培地を交換した。胚盤胞の率は、7日目に記録した。総細胞数を決定するために、胚盤胞を固定して、20μg/μlのHoechst33342蛍光色素を含有するグリセロール中でガラス顕微鏡スライドにマウントした。24時間の染色後、胚を落射蛍光アタッチメントおよびUV−2Aフィルターを装着したDiaphot 200倒立顕微鏡(Nikon,Tokyo,Japan)下で観察した。
成体メスブタ(sow)(2.5歳、体重170Kg)由来の卵母細胞と、仔メスブタ(gilt)(5.5〜6ヶ月、体重75Kg)由来の卵母細胞の間の発育能力における相違を、44時間のインビトロの成熟後に、ZFおよびZIのPAを通じて検討した。4つの合わせた群を3つの同一の複製中で検討した:(1)メスブタ(sow)由来のZF卵母細胞、(2)メスブタ(sow)由来のZI卵母細胞、(3)メスブタ(gilt)由来のZF卵母細胞、(4)メスブタ(gilt)由来のZI卵母細胞。ZF活性化のために、80μs間の0.85KV/cmの単一のDCパルスを加え、一方では、単一の1.25KV/cmパルスを用いてZI卵母細胞を活性化した。上記のような7日の培養後、活性化された1つの胚あたりの胚盤胞の割合を決定した。
c,d異なる添え字は有意差を意味する(p<0.05)。
*胚盤胞に発達した胚の割合(平均±S.E.M.)
成体メスブタ(sow)と仔メスブタ(gilt)との間の卵母細胞発達能力の相違は、インビトロ生成(in vitro production)(IVP)および体細胞核移入(somatic cell nuclear transfer)(SCNT)胚で別々に検査しており、他の研究グループの初期の公開(Sherrerら、2004;Hyun,ら、2003)と同様の結果が得られており、すなわち、成体メスブタ由来の卵母細胞由来の胚は、胚盤胞発達を支持するのにおいて仔メスブタ由来の卵母細胞由来の胚よりも優れている。本発明者らの研究で用いられる仔メスブタ(gilt)は、成熟の境界線にあるが、PA後の7日目の胚盤胞の率の間の相違は有意であって、成体メスブタ(sow)卵母細胞の優れた発達能力を示している。
改変ブタHMCの実現可能性は、6つの同一複製で検討し、ここでIVFおよび平行にZF PAをコントロールとして用いた。よりコンピテントな成体メスブタ(sow)の卵母細胞(実施例1に従う)を実施例2に用いた。再構築および/または活性化の7日後、再構成された胚1つあたりの胚盤胞の数および無作為に選択された胚盤胞の総細胞数を決定した。
ANOVA分析は、SPSS 11.0を用いて行った。P<0.05という確率を統計学的に有意とみなした。
脱脂したインビトロ成熟の卵母細胞から生成した、ハンド・メイドクローニングしたブタ胚盤胞の透化。
脱脂された卵母細胞を、HMCのために5つの複製で用いた。HMCのために非脱脂卵母細胞の4つの同一の複製物をコントロールの系として用いた。再構成の7日後、両方の群から生成した胚盤胞を、Cryotopで透化した。再増殖した胚盤胞の生存率および細胞数は、PAによって生成された胚盤胞について記載されたとおり決定した。
化学補助ハンドメイド除核(chemically assisted handmade enucleation)(CAHE)および既存の方法との比較
インビトロでの41〜42時間の成熟後、COCを、0.4μg/mlのデメコルチンを補充した同じ溶液中でさらに45分間培養した。次いで、卵丘細胞をHepes−緩衝化TCM−199に溶解された1mg/mlのヒアルロニダーゼ中におけるピペッティングによって取り出した。このポイントから(他に示す場合を除き)、全ての操作は、39℃に調節した加熱ステージ上で行った。卵母細胞を取り扱うために用いた全ての液滴は、20μlの容積であって、鉱油でカバーした。
全ての工程は、前に記載の手順と同様であったが、デメコルチンのプレインキュベーションは適用しなかった。
デメコルチンのプレインキュベーションは、同様に、この群の前処理から省いた。卵丘細胞の除去後、透明帯を上記のようにプロナーゼで部分的に消化した。ランダムハンドメイドの等分二分法を、2.5μg/mlのCBを補充されたT2の液滴に適用した。全ての半卵母細胞(demi−oocytes)を選択して、10μg/mlのHoechst33342が含有されるT2液滴で10分間染色し、次いで、鉱油でカバーされたT2培地の1μlの液滴(各々の液滴に3つの半卵母細胞)に入れた。倒立顕微鏡およびUV光を用いて、クロマチンなしの半卵母細胞、すなわち細胞質体の位置を記録した。これらの細胞質体は後に、立体顕微鏡下で収集して、さらなる操作の前にT2液中で保管した。
ブタ胎性線維芽細胞は、以前に記載のとおり調製した(Kraghら、2005,Duら、2005)。融合は、2工程で行い、この第二工程は、同様に活性化の開始を含んだ。第一工程については、微細吸引かつ先端熱加工したガラスピペットを用いて、約100個の体細胞を、T2液滴に入れ、そして20〜30個の細胞質体を、T10液滴に入れた。短時間の平衡化後、3つの細胞質体の群を、1mg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA)に2〜3秒間移し、次いで単一の線維芽細胞の上に迅速に滴下した。接着後、細胞質体−線維芽細胞の対を再度拾い上げて、融合培地(0.01%のPVAを補充した0.3Mのマンニトール)中に移した。0.6KV/cmおよび700KHzの交流(AC)を用いることによって、平衡化した対を、体細胞がワイアから最も遠位であるように、融合チャンバ(BTX microslide 0.5mm融合チャンバ,モデル450;BTX1 San Diego,CA)の1ワイアに整列させ、次いで2.0KV/cmの単一直流(DC)インパルスで9μsの間融合させた。次いで、対をワイアからT10液滴中に注意深く取り除いて、インキュベートして、さらに融合が生じたかどうかを観察した。
マイクロマニピュレーションは、前に記載のように(Chen ら、1999;Zhangら,2005)、Diaphot 200倒立顕微鏡(Nikon,Tokyo,Japan)を用いて行った。要するに、42〜44時間のインビトロ成熟後、卵丘細胞を上記で記載のとおり取り出した。全ての操作は、39℃に調節した加熱ステージで行った。単一の50μlのマイクロマニピュレーション溶液の液滴を、60mmの培養皿のフタ上の中央領域に作成して、鉱油でカバーした。20〜30個の卵母細胞および胎性線維芽細胞の群を、同じ液滴に入れた。15〜30分のインキュベーション後、卵母細胞を保持ピペット(内径=25〜35μmそして外径=80〜100μm)で確保した。5〜6時の位置に置いた後、最初の極体および中期板をおそらく含む隣接細胞質(卵母細胞の総容積の約10%)を吸引して、勾配注入ピペット(beveled injection pipette)(内径=20μm)で取り出した。次いで、胚性線維芽細胞を同じスリットを通じて空間に注入した。核移入(NT)後、再構成された対を、融合および活性化が行われるまで1〜1.5時間回復のために鉱油でカバーした培地の液滴に移した。この回復培地は、4mg/mLのBSAおよび7.5μg/mLのCBを補充したNCSU−23であった。再構成された対を、融合培地中で4分間インキュベートした。対を、繊細に吸引かつ研磨したガラスキャピラリーを用いて、手技的に配列して、電極に平行な接触面を作成した。次いで、2.0kV/cmの単一の30μ秒の直流パルスを加えた。7.5μg/mLのCBを補充したIVC0−2(「Embryo culture and evaluation」で特定される)の液滴中での30〜60分間の培養後、融合の結果を立体顕微鏡下で検査した。融合した対を活性化溶液中で第二のパルスに供した。T10中での30分のインキュベーション後、それらをIVC0−2に移して、インビトロの発達を評価した。
活性化インパルスの後、全ての再構成された胚を5μg/mlのCBおよび10μg/mlのシクロヘキシミドを補充したIVC0−2中で、38.5℃で、5%のCO2、5%のO2および90%のN2の中で、最大湿度でインキュベートした。
4時間後、全ての再構成されたおよび活性化された胚を、洗浄して、Nunc4ウェル皿において、鉱油でカバーされた400μlのIVCO−2中で、38.5℃で、5%のCO2、5%のO2および90%のN2の中で、最大湿度で培養した。IVCO−2は、4mg/mlのBSA、0.17mMのピルビン酸ナトリウム、および2.73mMの乳酸ナトリウムを含有する改変NCSU37培地(Kikuchiら、1999)で、0日目(活性化の日)〜2日までであった。ピルビン酸ナトリウムおよび乳酸ナトリウムを、2日目から7日目まで5.5mMのグルコースで置き換えた(IVC2−7)。全ての帯なし胚を、ウェル−ウェル(Well of the Well)(WOW)システム(Vajtaら、2000)において、同じ培養培地中で培養して、ガス混合物を上記のように用い、WOWから胚を外すことなく2日目に注意深く培地交換した。TC胚を、同じ培地量および組成物を用いることによって、4ウェル皿のウェル中で15〜30の群で培養した。分割および胚盤胞の率をそれぞれ2日目および7日目に記録した。総細胞数を決定するために、胚盤胞を固定して、10μg/mlのHoechst33342を含有する少量(<2μl)のグリセロール中でガラス顕微鏡スライドにマウントした。室温で数時間後、落射蛍光アタッチメントおよびUV−2Aフィルターを装備したDiaphot 200倒立顕微鏡(Nikon,Tokyo,Japan)下で胚を観察した。
CAHEの効率および信頼度は、全部で620個の卵母細胞を用いることによって12の同一の複製で試験した。41〜42時間の成熟後、卵母細胞を、デメコルチンインキュベーションに供した。指向性の二分割を卵母細胞で行い、押出錐体および/または強力に結合したPBを、部分的なプロナーゼ消化の後に検出した。二分割卵母細胞対総卵母細胞および生存している卵母細胞対二分割された卵母細胞の割合を記録した。引き続き推定の細胞質体および核質の両方を別々に収集して、Hoechst 33342(10μg/mlをT2に含有、10分間)で染色した。クロマチンの有無を倒立蛍光顕微鏡で検出した(図4)。
8つの複製で、全部で468個のインビトロ成熟卵母細胞を無作為に分布させて、上記の除核手順の3つに供した。細胞質体とドナー線維芽細胞との間の融合率を記録した。再構成された胚を前に記載のとおり活性化して培養した。分割および胚盤胞の率をそれぞれ、2日目および7日目に決定した。発達した胚盤胞の立体顕微鏡的な特徴を群間で比較した。
AVEDEVは、Microsoft XP Excelソフトウェアによって行い、そしてANOVAは、SASシステムによって行った。P<0.05の確率を有意差とみなした。
(仔ブタの産生)
(ハンドメイドクローニング(handmade cloning)(HMC))
インビトロ成熟の開始の41時間後、COCの卵丘外皮を、1mg/mlのヒアルロニダーゼを含有するHepes−緩衝化TCM199中での反復ピペッティングによって除去した。このポイントから(他に示す場合を除き)、全ての操作は、39℃に調節した加熱ステージ上で行い、そして卵母細胞を処理するために用いた全ての液滴は、鉱油でカバーした20μlの容積であった。卵母細胞を、短時間、T33(Hepes−緩衝化TCM199培地のTであって;この数は、仔ウシ血清(CS)補充の割合(v/v)を意味し、ここでは33%)に溶解された3.3mg/mlのプロナーゼ中で20秒間インキュベートし、次いで、T2およびT20の液滴中で迅速に洗浄した。卵母細胞は部分的に消化されたが、依然として可視の帯が、2.5μg/mlのサイトカラシンB(CB)を補充されたT2液滴に位置した。微細吸引かつ先端熱加工したガラスピペットを用いて、卵母細胞を回転させて、表面上に極体(PB)を見出し、そして指向性の二分割をマイクロブレード(AB Technology,Pullman,WA,USA)を用いる立体顕微鏡的な制御下で手技的に行った。これによって、卵母細胞の細胞質の半分未満(押出しまたはPBの近く)を残りの推定の細胞質体から除いた。細胞質体をT2液滴中で2回洗浄して、T10液滴中に収集した。
マイクロマニピュレーションは、Diaphot 200倒立顕微鏡(Nikon,Tokyo,Japan)を用いて行った。上記のように42〜44時間の成熟後卵丘細胞を取り出した。全ての操作は、39℃に調節した加熱ステージ上で行った。単一の50μlのマイクロマニピュレーション溶液の液滴(4mg/mLのBSAおよび7.5μg/mLのCBを補充したNCSU−23)を、60mmの培養皿のフタ上の中央領域に作成して、鉱油でカバーした。20〜30個の卵母細胞および胎性線維芽細胞の群を、同じ液滴に入れた。15〜30分のインキュベーション後、1つの卵母細胞を保持ピペット(内径=25〜35μmそして外径=80〜100μm)で確保した。5〜6時の位置に置いた後、最初の極体および中期板をおそらく含む隣接細胞質(卵母細胞の総容積の約10%)を吸引して、勾配注入ピペット(beveled injection pipette)(内径=20μm)で取り出した。次いで、胚性線維芽細胞を同じスロットを通じて空間に注入した。核移入(NT)後、再構成された対を、融合および活性化が行われるまで1〜1.5時間回復のために鉱油でカバーした培地の液滴に移した。再構成された対を、融合培地中で4分間インキュベートした。対を、繊細に吸引かつ研磨したガラスキャピラリーを用いて、手技的に配列して、電極に平行な接触面を作成した。次に、2.0kV/cmの単一の30μ秒の直流パルスを加えた。7.5μg/mLのCBを補充したPZM−3培地の液滴中での30〜60分間の培養後、融合の結果を立体顕微鏡下で検査した。融合した対を活性化溶液中で第二のパルスに供した。T10中での30分のインキュベーション後、それらをPZM−3培地に移して、インビトロの発達を評価した。
再構築された胚を、4mg/mlのBSAを補充したPZM−3培地(Dobrinsky,J.Tら、Biol Reprod 55,1069〜1074(1996)中で培養した。HMCから生成した帯なしの胚を、改変WOWシステム(Feltrin,C.ら、Reprod Fertil Dev 18,126(2006)中で培養した。2つの異なる細胞株(HMCについてはLW1−2、TCについてはLW2)をHMCおよびTCについての核ドナー細胞として用いて、2つの手順に由来する子孫の同定を可能にした。LW1−2およびLW2は、それぞれ、交雑(Durocと)、および純粋なDanish landrace由来の胎児に由来する。
*:平均±S.E.M.
HMCおよびTCの両方から生成された混合胚盤胞を、発情周期の4日目または5日目に11頭の自然に同調した成体メスブタ(sow)に外科手術的に移した。6つ(55%)のレシピエントを超音波検査によって妊娠診断して、2つを流産させて、記載の時点までに2匹がそれぞれ3匹および10匹の仔ブタを出産した。10匹のクローニングされた仔ブタの産子数は、本発明者らの知識によれば、ブタのクローニングでこれまでに達成された最大産子数である。それらの全てが健康であって、1つの前肢の遠位関節の硬直屈曲を示す以外は正常に挙動する。%)。
10の異なるブタマイクロサテライトマーカーを用いる親の分析によって、核移入に用いたクローニングされた仔ブタおよびドナー細胞の同一の遺伝子型が確認された。識別は、新生仔ブタ、代理メスブタ、ならびにそれぞれDanish landraceおよびDurocを示す2匹の胎児に由来するドナー皮膚線維芽細胞LW1−2およびLW2の各々に由来するゲノムDNAのマイクロサテライト分析によって行った。異なるブタの染色体に位置する10の多形性のマイクロサテライト遺伝子座(SW886、SW58、SW2116、SW1989、SW152、SW378、KS139、SO167、SW1987、SW957)を、3色マルチプレックス(multiplex)PCRによって増幅して、生成物を、プログラムGene Mapper 3.7を用いるGenetic Analyzer 3130 X1(Applied Biosystems)で分析した。
実験群の間の相違を、SPSS11.5による独立サンプルt検定を用いて評価した。P<0.05を有意とみなした。
単純型表皮水疱症の疾患モデルとしてトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成するために用いられ得る導入遺伝子の1例は、下に太字で示されるような変異を含むヒトケラチン14遺伝子である。
Claims (36)
- 細胞核移入の方法であって、以下の工程
a.部分的消化によって部分的に除去された透明帯を有する少なくとも1つのブタ卵母細胞を樹立する工程と、
b.該ブタ卵母細胞を少なくとも2つの部分に分けて、少なくとも1つの細胞質体を得る工程と、
c.所望の遺伝的特性を有するドナーブタ細胞またはブタ細胞核を樹立する工程と、
d.少なくとも1つの細胞質体と該ドナーブタ細胞または膜に囲まれるブタ細胞核とを融合させる工程と、
e.再構成されたブタ胚を得る工程と、
を包含する、方法。 - 前記透明帯が酵素的に部分的に除去される、請求項1に記載の方法。
- 前記ブタ卵母細胞が、少なくとも3つの部分に分けられて、少なくとも2つの細胞質体が得られる、請求項1〜2のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜3のいずれかに記載の方法であって、前記ドナーブタ細胞またはブタ細胞核の所望の遺伝的特性が、変異、欠失および/または挿入によって所望の遺伝子(単数または複数)を改変することによって得られている、方法。
- 前記融合の方法が、化学融合、電気融合および生体融合から選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記融合が、少なくとも1つの工程で行われる、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 前記融合が、少なくとも2つの工程で行われる、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 融合の第一工程が、少なくとも1つの細胞質体とドナーブタ細胞または膜に囲まれるブタ細胞核との間である、請求項5に記載の方法。
- 融合の第二工程が請求項6の少なくとも1つの融合対と少なくとも1つの細胞質体との間である、請求項5に記載の方法。
- 前記ドナーブタ細胞がブタ体細胞である、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記ブタ体細胞が、上皮細胞、神経系細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン形成細胞、軟骨細胞、リンパ球(Bリンパ球およびTリンパ球)、赤血球、マクロファージ、単球、単核球、線維芽細胞、心筋細胞および他の筋細胞からなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記ブタ体細胞が、皮膚細胞、肺細胞、膵臓細胞、肝細胞、胃細胞、腸細胞、心臓細胞、生殖器細胞、膀胱細胞、腎臓細胞、尿道細胞および他の泌尿器官細胞からなる群より得られる、請求項10に記載の方法。
- 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 前記ドナーブタ細胞が、生殖系列細胞に由来する、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 遺伝子操作されるか、またはトランスジェニックブタを生成するための方法であって:
a.部分的消化によって部分的に除去された透明帯を有する少なくとも1つのブタ卵母細胞を樹立する工程と、
b.該ブタ卵母細胞を少なくとも2つの部分に分けて、核および少なくとも1つの細胞質体を有する卵母細胞を得る工程と、
c.所望の遺伝的特性を有するドナーブタ細胞またはブタ細胞核を樹立する工程と、
d.少なくとも1つの細胞質体とドナーブタ細胞または膜に囲まれるブタ細胞核とを融合させる工程と、
e.再構成されたブタ胚を得る工程と、
f.該再構成されたブタ胚を活性化してブタ胚を形成させる工程と;
g.該ブタ胚を培養する工程と;
h.該培養されたブタ胚を宿主ブタに移入して、その結果そのブタ胚を遺伝子操作されたブタ胎児に発達させる工程と、
を包含する、方法。 - 工程b)の前記ブタ卵母細胞が、少なくとも3つの部分に分けられて、少なくとも2つの細胞質体が得られる、請求項15に記載の方法。
- 請求項15または16に記載の方法であって、該方法が、請求項1〜16のいずれかに規定されるような特徴のうちの1つ以上を含み、前記再構成されたブタ胚の活性化のための方法が、電気パルス、化学誘導ショック、二価陽イオンの細胞内レベル増大、およびリン酸化の軽減からなる方法群より選択される、方法。
- 請求項15または16に記載の方法であって、該方法が、請求項1〜17のいずれかに規定されるような特徴のうちの1つ以上を含み、工程d)およびf)が、連続的にまたは同時に行われる、方法。
- 請求項15または16に記載の方法であって、該方法が、請求項1〜18のいずれかに規定されるような特徴のうちの1つ以上を含み、前記ブタ胚がインビトロで培養される、方法。
- 前記ブタ胚が、連続培養で培養される、請求項19に記載の方法。
- 請求項15または16に記載の方法であって、該方法が、請求項1〜20のいずれかに規定されるような特徴のうちの1つ以上を含み、前記ブタ胚が、宿主ブタへの移入の前に凍結保存される、方法。
- 前記ブタ胚が、胞胚期である、請求項21に記載の方法。
- ブタ胚の凍結保存のための方法であって、
a)部分的消化によって部分的に除去された透明帯を有する少なくとも1つのブタ卵母細胞を樹立する工程と、
b)該ブタ卵母細胞を脱脂する工程と、
c)再構成された該ブタ胚を活性化してブタ胚を形成する工程と、
d)該ブタ胚を培養する工程と、
e)該ブタ胚を透化させる工程と、
を包含する、方法。 - 前記脱脂されたブタ卵母細胞が、少なくとも2つの部分に分けられて、核および少なくとも1つの細胞質体を有するブタ卵母細胞を得る、請求項23に記載の方法。
- 請求項23または24に記載の方法であって、該方法が、請求項1〜24のいずれかに規定されるような特徴の1つ以上を含み、前記ブタ胚が、透化の前に胞胚期まで培養される、方法。
- ブタをクローニングするための方法であって、
a.請求項1〜25のいずれかで得られるようなブタ胚を樹立して、必要に応じてブタ胚を解凍する工程と、
b.該ブタ胚を宿主ブタに移入して、その結果該ブタ胚を遺伝子操作されたブタ胎児に発達させる工程と、
を包含する、方法。 - 請求項1〜26のいずれかに規定されるような方法によって獲得可能である遺伝子操作されたブタ。
- 請求項1〜26のいずれかに規定されるような方法によって獲得可能である遺伝子操作されたブタ胚。
- 請求項1〜26のいずれかに規定されるような方法によって獲得可能な遺伝子操作されたブタであって、その組織細胞中に、少なくとも3つの異なる母体供給源由来のミトコンドリアを有する、ブタ。
- 請求項27または28に記載の遺伝子操作されたブタまたは遺伝子操作されたブタ胚であって、その組織細胞中に、少なくとも3つの異なる母体供給源由来のミトコンドリアを有する、ブタまたはブタ胚。
- 請求項27、28または29に記載の遺伝子操作されたブタまたは遺伝子操作されたブタ胚であって、その組織細胞中に、少なくとも4つの異なる母体供給源由来のミトコンドリアを有する、ブタまたはブタ胚。
- 請求項27、または28に記載の遺伝子操作されたブタまたは遺伝子操作されたブタ胚であって、その組織細胞中に、唯一の母体供給源由来のミトコンドリアを有する、ブタまたはブタ胚。
- 請求項27または28に記載の遺伝子操作されたブタまたは遺伝子操作されたブタ胚であって、その組織細胞中に、少なくとも2つの母体供給源由来のミトコンドリアを有する、ブタまたはブタ胚。
- 再構成されたブタ胚(ブタ胚)を培養する方法であって、
a.部分的消化によって部分的に除去された透明帯を有する少なくとも1つのブタ卵母細胞を樹立する工程と、
b.該ブタ卵母細胞を少なくとも2つの部分に分けて、核および少なくとも1つの細胞質体を有するブタ卵母細胞を得る工程と、
c.所望の遺伝的特性を有するドナーブタ細胞またはブタ細胞核を樹立する工程と、
d.少なくとも1つの細胞質体と該ドナーブタ細胞または膜に囲まれるブタ細胞核とを融合させる工程と、
e.再構成されたブタ胚を得る工程と、
f.該再構成されたブタ胚を活性化してブタ胚を形成させる工程と;
g.該ブタ胚を培養する工程と;
を包含する、方法。 - 前記ブタ胚が、連続培地で培養される、請求項34に記載の方法。
- 前記方法が、動物身体で行われる外科的工程を包含しない、請求項1〜26のいずれかに記載の方法。
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