CN104789523A - 简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，包括收集猪卵巢、挑选卵母细胞、卵母细胞成熟、供体细胞分离培养、挑选成熟卵母细胞、克隆胚胎构建、克隆胚胎培养、克隆胚胎移植等步骤，将3-D摇床成熟培养产生的卵母细胞孤雌激活后，猪孤雌激活胚胎的囊胚发育率超过70%，达到了国内领先水平，可以完全替代传统的C02培养箱成熟方法。本发明对于哺乳动物卵母细胞体外成熟和胚胎培养的优化等提供了具体策略和方法，对于整个哺乳动物的胚胎工程产业化和相关发育生物学研究具有很大的应用价值和借鉴意义。
Description
技术领域：
本发明涉及一种简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，属于细胞生物学技术领域。
背景技术：
传统的动物卵母细胞体外成熟体系依赖于C02培养箱和细胞培养皿、培养板、石蜡油等耗材，基本上都依赖进口，价格昂贵，实验结果的稳定严重依赖经过严格训练有素的技术人员。进行胚胎工程技术的大规模工程化生产，要求必须建立操作简便、便宜、可操作性较强的技术体系。通过本发明研究，成功建立了卵母细胞3-D摇床成熟体系，很好的解决了服务于胚胎工厂化生产的卵母细胞体外成熟的问题，必将对相关胚胎工程技术的应用产生巨大的推动和促进作用。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：提供一种简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，经3-D摇床成熟的卵母细胞获得的猪孤雌激活胚胎的囊胚发育率超过70% 。
本发明为解决就技术问题所采取的技术方案是：
一种简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，其具体操作步骤如下：
①收集猪卵巢：从屠宰场收集普通商品猪卵巢,置于 30～37 ℃的0.9%生理盐水中，5 h内运回实验室 ,并用生理盐水冲洗3～5 次；
②挑选卵母细胞：用带 12 号针头的 10 ml注射器抽取卵巢表面上直径为 2～6 ml 卵泡的卵母细胞 ,然后在实体显微镜下用胚胎移液器吸取带有2层卵丘细胞以上、胞质均匀的卵母细胞，在洗卵液中洗3 次，再在成熟液中洗 2次；
③卵母细胞成熟：将挑选好的卵母细胞放入含有卵母细胞成熟液的离心管中，用3-D摇床成熟45 h ,培养条件为39 ℃；
④供体细胞分离培养：无菌获取成年猪耳部组织样本，并于低温条件下及时运送到实验室；将其剪碎离心洗涤后，加入适量供体细胞培养液，并将组织碎块接种到培养瓶中；待供体细胞爬出并长到70～80%汇合度时，进行传代培养或冷冻保存；
⑤挑选成熟卵母细胞：将成熟42～46 h的猪卵母细胞在0.1～0.3 %的透明质酸酶中涡旋震荡，去除卵丘细胞，挑选排出第一极体的成熟卵母细胞，通过盲吸去核法进行去核；
⑥克隆胚胎构建：吸取中等大小、圆形、细胞膜折光度较好的供体细胞注射到透明带下方，并轻点透明带使供体细胞与去核的卵母细胞细胞膜良好接触，形成重构卵；
⑦克隆胚胎培养：将重构卵在洗涤液中洗涤3遍后，分批移到融合槽的融合液中进行融合；将融合过的重构胚，分批移入激活液中激活3h，然后再移入胚胎培养液中，在39℃的培养箱中培养直至移植；
⑧克隆胚胎移植：选用自然发情或诱导发情的母猪作为受体母猪，发情当天至第2天手术进行克隆胚胎移植，手术前停喂饲料12h；将培养好的克隆胚胎置入37℃的便携式培养箱中带入猪场手术室；
⑨克隆胚胎移植后28～30天通过B超检查受体母猪怀孕情况。
在步骤③中，所述的卵母细胞成熟液为10%的卵泡液 + 1μg/ml 的促卵泡素FSH + 1μg/ml的促黄体素LH + 5.9g/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes + 5-15mM 的NaHCO3 + 10～20 ng/ml的表皮细胞生长因子EGF + 0.57mM的半胱氨酸L-Cysteine + 75 μg/ml 的青霉素 + 50 μg/ml 的链霉素 + 2～8 mM 的维他命BT + 20 μM 的维他命E 。
在步骤④中，所述的供体细胞培养液为 66 mg/L的青霉素 + 100 mg/L的硫酸链霉素 + 10～15%的胎牛血清FBS 。
在步骤⑤中，所述盲吸去核法如下：用固定针固定卵母细胞，用外径为18～20μm的去核针吸取第一极体及其周围的少量细胞质，然后用去核针轻压透明带切口再挤出些许胞质；或用5～10μg/ml的Hoechest 33342（一种活细胞染料，其与细胞DNA可逆性结合，在紫外光照射下，可以发出荧光）染色15～20min后，在紫外光下直接对卵母细胞进行去核处理。
在步骤⑦中，所述融合液为0.25 M的甘露醇 + 0.05 mmol/L的 CaCl2 + 0.1 mmol/L的 MgS04 + 0.01%聚乙烯醇；所述激活液为0.25 M的甘露醇 + 0.1 mmol/L的 CaCl2 + 0.l mmol/L的 MgS04 + 0.01%的聚乙烯醇；所述激活液为改良猪合子培养液mPZM+0.4%牛血清白蛋白BSA + 7.5 μg/ml的细胞松弛素CB；所述胚胎培养液为猪合子培养液mPZM + 0.4%牛血清白蛋白BSA 。
在步骤⑧中，所述受体母猪在手术前要由兽医对其健康状况进行检查，然后用无菌生理盐水配制0.025 g/ml的戊巴比妥钠，按猪体重20～25 mg/kg的用量进行麻醉后绑定；再分别用1%的高锰酸钾溶液、3%的碘酊和75%的酒精消毒需要手术部位；手术时，在侧腹部表皮做5～7cm左右的切口，然后依次钝性分离肌肉、脂肪、腹膜，快速、轻柔地取出输卵管和卵巢，并观察卵巢上排卵情况，准备移植；整个过程中要不断用保温生理盐水冲洗保留组织，保持其湿度；将胚胎移植管从输卵管伞部插入5～10cm，然后将克隆胚胎缓缓注入、撤出、快速缝合创口，并作好创面保护；手术后连续两天注射青霉素或链霉素消炎防止感染，单独隔离受体母猪。
经3-D摇床成熟的卵母细胞获得的猪孤雌激活胚胎的囊胚发育率超过70%。
本发明将市售的适宜大小的3-D摇床放置于恒温箱中，装有卵母细胞的离心管放于摇床之上，构成卵母细胞的3-D摇床成熟培养体系，可以替代昂贵的C02培养箱成熟，经3-D摇床成熟的卵母细胞获得的猪孤雌激活胚胎的囊胚发育率超过70%，达到国内领先水平。
本发明建立了操作简便、便宜、可操作性较强的卵母细胞3-D摇床成熟技术体系，可以完全替代传统的卵母细胞体外成熟方法。该体系对于哺乳动物卵母细胞体外成熟和胚胎培养的优化等提供了具体策略和方法，对于整个哺乳动物的胚胎工程产业化和相关发育生物学研究具有很大的应用价值和借鉴意义。
本发明的试验数据如下：
一、实验材料与方法：
1.1 猪卵母细胞的收集和体外成熟
从屠宰场收集普通商品猪卵巢,置于 30～37 ℃的0.9%生理盐水中5 h内运回实验室 ,并用生理盐水冲洗3～5 次。用带 12 号针头的 10 ml注射器抽取卵巢表面上直径 2～6 ml 卵泡的卵母细胞 ,在实体显微镜下用胚胎移液器吸取带有2层卵丘细胞以上、 胞质均匀的卵母细胞(COCs) ,在洗卵液中洗3 次 ,再在成熟液中洗 2次后成熟。
成熟方法一：将卵母细胞移入在培养箱平衡至少 4 h 的成熟液滴mTCM199成熟液（ 10%的卵泡液、0.57 mM的半胱氨酸、10-20ng/ml 的表皮生长因子EGF、75 μg/ml 青霉素、50 μg/ml的链霉素,1 μg/ml的促卵泡素FSH 、 1 μg /ml的促黄体素LH）中 ,用胚胎级矿物油覆盖 ,成熟 45 h ,培养箱条件为：5 % CO2的空气、最大相对饱和湿度、 39 ℃。
成熟方法二：挑选好的卵母细胞放入含有成熟液mTCM199 （10%的卵泡液 + 1μg/ml 的促卵泡素FSH + 1μg/ml的促黄体素LH + 5.9g/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes + 5-15mM 的NaHCO3 + 10～20 ng/ml的表皮细胞生长因子EGF+ 0.57mM的半胱氨酸L-Cysteine + 75 μg/ml 的青霉素 + 50 μg/ml 的链霉素 + 2～8 mM 的维他命BT + 20 μM 的维他命E）的离心管中，用3-D摇床成熟 45 h ,培养条件为39 ℃。
该实验将市售的适宜大小的3-D摇床放置于恒温箱中，装有卵母细胞的离心管则放于摇床之上，构成卵母细胞的3-D摇床成熟培养体系。
1.2 供体细胞分离培养 ：
无菌获取成年猪耳部组织样本，并于低温条件下及时运送到实验室。分别采用手术刀和用眼科剪将其剪碎，并离心洗涤；加入供体细胞DMEM培养液（66 mg/L的青霉素和100 mg/L的硫酸链霉素和10～15%的胎牛血清FBS）少许，并将组织碎块接种到培养瓶。待细胞爬出并长到70～80%汇合时，进行传代培养或冷冻保存。
1.3 克隆胚胎构建及培养：
将成熟42～46 h的猪卵母细胞在0.1～0.3 %的透明质酸酶中涡旋震荡，去除卵丘细胞；挑选排出第一极体的成熟卵母细胞进行去核【在显微操作仪下用盲吸法去核法进行去核，简述如下：用固定针固定卵母细胞，用外径为18～20μm的去核针吸取第一极体及其周围的少量细胞质，然后用去核针轻压透明带切口再挤出些许胞质；或用5～10μg/ml的Hoechest 33342（一种活细胞染料，其与细胞DNA可逆性结合，在紫外光照射下，可以发出荧光） 染色15～20min后，在紫外光下直接对卵母细胞进行去核】。然后吸取中等大小、圆形、细胞膜折光度较好的供体细胞注射到透明带下方，并轻点透明带使供体与卵母细胞膜接触良好。
实验时将重构卵在融合液【0.25 M甘露醇 + 0.05 mmol/L的 CaCl2 + 0.1 mmol/L 的MgS04 + 0.01% 的聚乙烯醇】中融合，再分批移到融合槽的激活液【0.25 M的甘露醇 + 0.1 mmol/L 的CaCl2 + 0.l mmol/L的 MgS04 + 0.01%聚乙烯醇】中进行激活，激活完后移入延迟激活液【改良猪合子培养液（mPZM+0.4%牛血清白蛋白BSA）+ 7.5 μg/ml的CB（细胞松弛素）】中激活3h，然后再移入胚胎培养液【mPZM+0.4%牛血清白蛋白BSA】中，在39℃的培养箱中培养直至移植。
本实验所用的电融合仪为ECM-2001。
1.4 胚胎移植：
选用自然发情或诱导发情的母猪作为受体母猪，发情当天至第2 d 进行手术胚胎移植，手术前停喂饲料12h；将克隆胚胎置入37℃的便携式培养箱中并带入猪场。手术前：由兽医对受体猪的健康状况进行检查，然后利用0.025 g/ml戊巴比妥钠（用无菌生理盐水配制）按20～25 mg/kg（猪体重）进行麻醉后绑定，分别用1%高锰酸钾溶液、3%碘酊和75%酒精消毒（脱碘）消毒手术部位。手术时：在侧腹部表皮做5～7cm左右切口，然后依次钝性分离肌肉、脂肪、腹膜，快速、轻柔取出输卵管和卵巢，并观察卵巢上排卵情况，准备移植；整个过程不断用保温生理盐水冲洗保留组织，保持其湿度。将胚胎移植管从输卵管伞部插入5～10cm，然后将克隆胚胎缓缓注入，撤出，快速缝合创口，并作好创面保护。手术后：连续2 d注射青霉素、链霉素防止感染，单独隔离受体母猪，注意观察愈后，并于移植后28～30天B超检查受体母猪怀孕情况。
二、试验设计：
1、比较上述两种卵母细胞成熟方式对卵母细胞成熟率和孤雌激活胚胎发育率情况。同时也比较用本发明的3-D摇床成熟培养体系成熟不同数目的卵母细胞（50组，用5ml成熟液成熟50个卵子；100组，用5ml成熟液成熟100个卵子；150组，用5ml成熟液成熟150个卵子）对成熟率和孤雌激活胚胎发育率的影响。
2、将3-D摇床成熟培养产生的卵母细胞进行核移植并做胚胎移植，检验克隆胚胎的体内发育效率。
三、实验结果与分析：
表1 不同组别卵母细胞体外成熟效率及胚胎发育效率
| 组别 | 成熟数 | 极体数 | 分裂数/分裂率 | 囊胚数/囊胚率 |
| 对照组 | 752 | 609/80.9% | 572/93.3% | 440/71.2% |
| 50组 | 478 | 409/85.4% | 392/99.3% | 317/77.2% |
| 100组 | 825 | 687/82.2% | 645/93.8% | 524/76.1% |
| 150组 | 1065 | 831/79.1% | 696/84.4% | 496/70.2% |
如表1所示，C02培养箱和3-D摇床用于猪卵母细胞成熟，成熟率和胚胎发育率方面没有显著差异。结果显示：3-D摇床体系可以替代昂贵的C02培养箱成熟，并且5ml培养液中成熟卵子数不能超过100为佳。本发明实验猪孤雌激活胚胎的囊胚发育率超过70%，达到国内领先水平。
本实验构建克隆胚胎1000多枚，每个受体猪移植100～200枚克隆胚胎，克隆胚胎的体内发育可以获得较好的效率，如28天妊娠率达到80%以上，妊娠到期率达到80%以上，窝产克隆猪数达到3头以上，均达到了国内领先水平。
本发明建立了操作简便、便宜、可操作性较强的卵母细胞3-D摇床成熟技术体系，可以完全替代传统的卵母细胞体外成熟方法。该体系对于哺乳动物卵母细胞体外成熟和胚胎培养的优化等提供了具体策略和方法，对于整个哺乳动物的胚胎工程产业化和相关发育生物学研究具有很大的应用价值和借鉴意义。
附图说明：
图1为本发明实验中对照组中卵母细胞C02培养箱体外成熟效率及胚胎发育效率；
图2为本发明实验中50组用5ml成熟液成熟50个卵子的成熟效率及胚胎发育效率；
图3为本发明实验中100组用5ml成熟液成熟100个卵子的成熟效率及胚胎发育效率；
图4为本发明实验中150组用5ml成熟液成熟150个卵子的成熟效率及胚胎发育效率。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释和说明：
实施例：一种简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，其具体操作步骤如下：
① 收集猪卵巢：从屠宰场收集普通商品猪卵巢,置于 30～37 ℃的
0.9%生理盐水中，5 h内运回实验室 ,并用生理盐水冲洗3～5 次；
②挑选卵母细胞：用带 12 号针头的 10 ml注射器抽取卵巢表面上直径为 2～6 ml 卵泡的卵母细胞 ,然后在实体显微镜下用胚胎移液器吸取带有2层卵丘细胞以上、胞质均匀的卵母细胞，在洗卵液中洗3 次，再在成熟液中洗 2次；
③卵母细胞成熟：将挑选好的卵母细胞放入含有卵母细胞成熟液的离心管中，用3-D摇床成熟45 h ,培养条件为39 ℃；
④供体细胞分离培养：无菌获取成年猪耳部组织样本，并于低温条件下及时运送到实验室；将其剪碎离心洗涤后，加入适量供体细胞培养液，并将组织碎块接种到培养瓶中；待供体细胞爬出并长到70～80%汇合度时，进行传代培养或冷冻保存；
⑤挑选成熟卵母细胞：将成熟42～46 h的猪卵母细胞在0.1～0.3 %的透明质酸酶中涡旋震荡，去除卵丘细胞，挑选排出第一极体的成熟卵母细胞，通过盲吸去核法进行去核；
⑥克隆胚胎构建：吸取中等大小、圆形、细胞膜折光度较好的供体细胞注射到透明带下方，并轻点透明带使供体细胞与去核的卵母细胞膜良好接触，形成重构卵；
⑦克隆胚胎培养：将重构卵在融合液中融合过后后，分批移到融合槽的激活液中进行激活；将激活过的重构胚，分批移入延迟激活液中激活3h，然后再移入胚胎培养液中，在39℃的培养箱中培养直至移植；
⑧克隆胚胎移植：选用自然发情或诱导发情的母猪作为受体母猪，发情当天至第2天手术进行克隆胚胎移植，手术前停喂饲料12h；将培养好的克隆胚胎置入37℃的便携式培养箱中带入猪场手术室；
⑨克隆胚胎移植后28～30天通过B超检查受体母猪怀孕情况。
在步骤③中，所述的卵母细胞成熟液为10%的卵泡液 + 1μg/ml 的促卵泡素FSH + 1μg/ml的促黄体素LH + 5.9g/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes + 5-15mM 的NaHCO3 + 10～20 ng/ml的表皮细胞生长因子EGF+ 0.57mM的半胱氨酸L-Cysteine + 75 μg/ml 的青霉素 + 50 μg/ml 的链霉素 + 2～8 mM 的维他命BT + 20 μM 的维他命E 。
在步骤④中，所述的供体细胞培养液为 66 mg/L的青霉素 + 100 mg/L的硫酸链霉素 + 10～15%的胎牛血清FBS 。
在步骤⑤中，所述盲吸去核法如下：用固定针固定卵母细胞，用外径为18～20μm的去核针吸取第一极体及其周围的少量细胞质，然后用去核针轻压透明带切口再挤出些许胞质；或用5～10μg/ml的Hoechest 33342（一种活细胞染料，其与细胞DNA可逆性结合，在紫外光照射下，可以发出荧光）染色15～20min后，在紫外光下直接对卵母细胞进行去核。
在步骤⑦中，所述融合液为0.25 M的甘露醇 + 0.05 mmol/L的 CaCl2 + 0.1 mmol/L的 MgS04 + 0.01%聚乙烯醇；所述激活液为0.25 M的甘露醇 + 0.1 mmol/L的 CaCl2 + 0.l mmol/L的 MgS04 + 0.01%的聚乙烯醇；所述激活液为改良猪合子培养液mPZM+0.4%牛血清白蛋白BSA + 7.5 μg/ml的细胞松弛素CB；所述胚胎培养液为猪合子培养液mPZM + 0.4%牛血清白蛋白BSA 。
在步骤⑧中，所述受体母猪在手术前要由兽医对其健康状况进行检查，然后用无菌生理盐水配制0.025 g/ml的戊巴比妥钠，按猪体重20～25 mg/kg的用量进行麻醉后绑定；再分别用1%的高锰酸钾溶液、3%的碘酊和75%的酒精消毒需要手术部位；手术时，在侧腹部表皮做5～7cm左右的切口，然后依次钝性分离肌肉、脂肪、腹膜，快速、轻柔地取出输卵管和卵巢，并观察卵巢上排卵情况，准备移植；整个过程中要不断用保温生理盐水冲洗保留组织，保持其湿度；将胚胎移植管从输卵管伞部插入5～10cm，然后将克隆胚胎缓缓注入、撤出、快速缝合创口，并作好创面保护；手术后连续两天注射青霉素或链霉素消炎防止感染，单独隔离受体母猪。
本发明提供了一种操作简便、便宜、可操作性较强的猪卵母细胞3-D摇床成熟技术体系，经3-D摇床成熟的卵母细胞经克隆移植培育后，猪孤雌激活胚胎的囊胚发育率超过70%，可以完全替代传统的卵母细胞体外成熟方法。该体系对于哺乳动物卵母细胞体外成熟和胚胎培养的优化等提供了具体策略和方法，对于整个哺乳动物的胚胎工程产业化和相关发育生物学研究具有很大的应用价值和借鉴意义。
Claims (7)
1.一种简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，其具体操作步骤如下：
①收集猪卵巢：从屠宰场收集普通商品猪卵巢,置于 30～37 ℃的0.9%生理盐水中，5 h内运回实验室 ,并用生理盐水冲洗3～5 次；
②挑选卵母细胞：用带 12 号针头的 10 ml注射器抽取卵巢表面上直径为 2～6 ml 卵泡的卵母细胞 ,然后在实体显微镜下用胚胎移液器吸取带有2层卵丘细胞以上、胞质均匀的卵母细胞，在洗卵液中洗3 次，再在成熟液中洗 2次；
③卵母细胞成熟：将挑选好的卵母细胞放入含有卵母细胞成熟液的离心管中，用3-D摇床成熟45 h ,培养条件为39 ℃；
④供体细胞分离培养：无菌获取成年猪耳部组织样本，并于低温条件下及时运送到实验室；将其剪碎离心洗涤后，加入适量供体细胞培养液，并将组织碎块接种到培养瓶中；待供体细胞爬出并长到70～80%汇合度时，进行传代培养或冷冻保存；
⑤挑选成熟卵母细胞：将成熟42～46 h的猪卵母细胞在0.1～0.3 %的透明质酸酶中涡旋震荡，去除卵丘细胞，挑选排出第一极体的成熟卵母细胞，通过盲吸去核法进行去核；
⑥克隆胚胎构建：吸取中等大小、圆形、细胞膜折光度较好的供体细胞注射到透明带下方，并轻点透明带使供体细胞与去核的卵母细胞细胞膜良好接触，形成重构卵；
⑦克隆胚胎培养：将重构卵在洗涤液中洗涤3遍后，分批移到融合槽的融合液中进行融合；将融合过的重构胚，分批移入激活液中激活3h，然后再移入胚胎培养液中，在39℃的培养箱中培养直至移植；
⑧克隆胚胎移植：选用自然发情或诱导发情的母猪作为受体母猪，发情当天至第2天手术进行克隆胚胎移植，手术前停喂饲料12h；将培养好的克隆胚胎置入37℃的便携式培养箱中带入猪场手术室；
⑨克隆胚胎移植后28～30天通过B超检查受体母猪怀孕情况。
2. 根据权利要求1所述的简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，其特征在于：在步骤③中，所述的卵母细胞成熟液为10%的卵泡液 + 1μg/ml 的促卵泡素FSH + 1μg/ml的促黄体素LH + 5.9g/L的羟乙基哌嗪乙硫磺酸Hepes + 5-15mM 的NaHCO3 + 10～20 ng/ml的表皮细胞生长因子EGF + 0.57mM的半胱氨酸L-Cysteine + 75 μg/ml 的青霉素 + 50 μg/ml 的链霉素 + 2～8 mM 的维他命BT + 20 μM 的维他命E 。
3.根据权利要求1所述的简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，其特征在于：在步骤④中，所述的供体细胞培养液为 66 mg/L的青霉素 + 100 mg/L的硫酸链霉素 + 10～15%的胎牛血清FBS 。
4.根据权利要求1所述的简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，其特征在于：在步骤⑤中，所述盲吸去核法如下：用固定针固定卵母细胞，用外径为18～20μm的去核针吸取第一极体及其周围的少量细胞质，然后用去核针轻压透明带切口再挤出些许胞质；或用5～10μg/ml的活细胞染料染色15～20min后，在紫外光下直接对卵母细胞进行去核。
5.根据权利要求1所述的简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，其特征在于：在步骤⑦中，所述融合液为0.25 M的甘露醇 + 0.05 mmol/L的 CaCl2 + 0.1 mmol/L的 MgS04 + 0.01%聚乙烯醇；所述激活液为0.25 M的甘露醇 + 0.1 mmol/L的 CaCl2 + 0.l mmol/L的 MgS04 + 0.01%的聚乙烯醇；所述激活液为改良猪合子培养液mPZM+0.4%牛血清白蛋白BSA + 7.5 μg/ml的细胞松弛素CB；所述胚胎培养液为猪合子培养液mPZM + 0.4%牛血清白蛋白BSA 。
6.根据权利要求1所述的简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，其特征在于：在步骤⑧中，所述受体母猪在手术前要由兽医对其健康状况进行检查，然后用无菌生理盐水配制0.025 g/ml的戊巴比妥钠，按猪体重20～25 mg/kg的用量进行麻醉后绑定；再分别用1%的高锰酸钾溶液、3%的碘酊和75%的酒精消毒需要手术部位；手术时，在侧腹部表皮做5～7cm左右的切口，然后依次钝性分离肌肉、脂肪、腹膜，快速、轻柔地取出输卵管和卵巢，并观察卵巢上排卵情况，准备移植；整个过程中要不断用保温生理盐水冲洗保留组织，保持其湿度；将胚胎移植管从输卵管伞部插入5～10cm，然后将克隆胚胎缓缓注入、撤出、快速缝合创口，并作好创面保护；手术后连续两天注射青霉素或链霉素消炎防止感染，单独隔离受体母猪。
7.根据权利要求1所述的简便、高效、低耗的猪卵母细胞体外成熟克隆培育方法，其特征在于：经3-D摇床成熟的卵母细胞获得的猪孤雌激活胚胎的囊胚发育率超过70%。
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