CN101313072B - 细胞核移植 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了细胞核移植的方法，其包括，例如对卵母细胞的透明带的修饰，和/或将卵母细胞分成几部分。本发明也公开了生产遗传修饰的非人类哺乳动物的方法。通过所公开的方法而得到的遗传修饰的非人类哺乳动物也在本发明的范围内。所公开的内容还有细胞的深低温保藏方法。

Description

细胞核移植
发明领域
本发明涉及在哺乳动物中细胞核移植的方法，并涉及获得的遗传修饰的哺乳动物或可通过该方法获得的遗传修饰的动物。而且，本发明涉及卵母细胞、受精卵、胚胎(其中包括胚泡)的玻璃化方法。
发明背景
对供体细胞进行遗传修饰并将其用于核移植的能力提供了生产遗传修饰的动物的工具，所述遗传修饰的动物可用于例如严重人类疾病研究和药物测试中的疾病模型。
传统的细胞核移植技术包括2步显微操作。第一步包括成熟卵母细胞的去核，第二步包括供体细胞核的转移。然而，已证明显微操作具有几处缺点，例如需要昂贵的设备，需要高水平技术人员以及耗时的工作。
最近开发出使用体细胞作为供体细胞的改进的核移植方法——一种被称为手工克隆(HMC)的方法，其包括使用无透明带的卵母细胞。该方法与传统的核移植相比，简化之处在于不再需要显微操作。该方法已经用在牛中(Vajta等2001 Cloning 3，89-95；Vajta等2003Biol.Reprod.68，571-578；Vajta等2005 Reprod.Fertil.Dev.17，1-16；Tecirlioglu等，2004)。而且，已有记录在牛(Booth等2001Cloning Stem Cells 3，139-150；Oback等Cloning Stem Cells 5，3-12)和猪(Booth等2001 Cloning Stem Cells 3，191-197)中使用一步显微操作的无透明带核移植的应用。该方法技术要求更低、时间消耗更少的事实已促使研究者建议将HMC技术用于其他物种。然而，大量的技术问题使得HMC在猪中的应用比初步设想的要求更高。所面临的问题之一涉及猪卵母细胞的低浮力密度，这包括透明带完整(ZI)以及尤其是无透明带(ZF)的猪卵母细胞。因此，猪卵母细胞不沉降到平皿的底部。此外，这些卵母细胞的表面具有粘性，当去除透明带后很难避免它们之间的附着。而且，ZF猪卵母细胞非常易碎，很难以对待牛卵母细胞中描述的方式将其二分。
最近，HMC技术被应用在猪核移植中，但效率低，其中使用遗传修饰的体细胞-成纤维细胞作为供体细胞从而产生遗传修饰的克隆胚泡(Kragh等2004 Reproduction，Fertility and Development 16，315-318)。
本发明改进了通过HMC进行体细胞核移植的技术，从而产生了提高的胚胎重建率，并因此使获得遗传修饰动物的机会显著升高。
通过核移植方法大规模产生遗传修饰动物的障碍之一是无法通过应用在其他物种上的方法深低温保藏猪卵母细胞和胚胎。这是因为猪卵母细胞和胚胎的高脂质含量。克隆猪胚胎的深低温保藏可通过缓解后勤问题而显著改善体细胞克隆的产量。然而，最近发表了一种非侵入性方案，其通过离心但不需要随后的显微操作(Esaki等2004 BiolReprod.71，432-6)而对猪胚胎去脂。
发明概述
本发明一方面涉及细胞核移植的方法，其包括以下步骤：a)构建具有至少一部分经修饰的透明带的至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少2部分，从而获得至少一个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合，e)得到重建的胚胎。
本发明第二方面涉及细胞核移植方法，其包括以下步骤：a)构建至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少3部分，从而获得至少2个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合，e)得到重建的胚胎。
本发明第三方面涉及产生遗传修饰的或转基因的非人类哺乳动物的方法，其包括以下步骤：a)构建具有至少一部分经修饰的透明带的至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少2部分，从而获得具有核的卵母细胞和至少一个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合，e)得到重建的胚胎，f)活化该重建的胚胎以形成胚胎，g)培养所述胚胎，以及h)将所述的培养胚胎转移到寄主哺乳动物中，使得该胚胎发育成遗传修饰的胎儿。
本发明第四方面涉及生产遗传改造的或转基因的非人类哺乳动物的方法，其包括以下步骤：a)构建至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少3部分，从而获得至少一个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合，e)得到重建的胚胎，f)活化该重建的胚胎以形成胚胎，g)培养所述胚胎，以及h)将所述的培养胚胎转移到寄主哺乳动物中，使得该胚胎发育成遗传修饰的胎儿。
本发明第五方面涉及深低温保藏猪胚胎的方法，其包括以下步骤：a)构建至少一个猪卵母细胞，b)对该卵母细胞去脂，c)活化重建的胚胎以形成胚胎，d)培养所述胚胎，e)将该胚胎玻璃化。
本发明第六方面涉及克隆非人类哺乳动物的方法，其包括以下步骤：a)构建根据本发明的方案获得的胚胎，任选地解冻胚胎，b)将所述的培养胚胎转移到寄主哺乳动物中，使得该胚胎发育成遗传修饰的胎儿。
本发明第七方面涉及通过本文所限定的方法可获得的遗传修饰的非人类哺乳动物。
本发明另一方面涉及通过本文所限定的方法可获得的遗传修饰的非人类胚胎。
本发明另一方面涉及通过本文所限定的方法可获得的遗传修饰的非人类胚胎，在其组织细胞内具有来自至少3个不同母源的线粒体。
本发明最后一方面涉及培养重建的胚胎(胚胎)的方法，其包括以下步骤：a)构建具有至少一部分透明带的至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少2部分，从而获得具有核的卵母细胞和至少一个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合，e)得到重建的胚胎，f)活化该重建的胚胎以形成胚胎，以及e)培养所述胚胎。
附图说明
图1.(a)卵母细胞三分；(b)用于第一次融合的成纤维细胞-卵母细胞碎片偶联体；(c)以三联体重建的胚胎(注意在AC电流下伸长)；(d)三联体融合。刻度尺＝50μm。
图2.(a)部分透明带消化后的体外成熟的卵母细胞，(b)离心后去脂的卵母细胞，(c)去脂的卵母细胞的二分，(d)用于第一次融合的成纤维细胞-卵母细胞碎片偶联体，(e)从去脂的卵母细胞发育来的四细胞期的重建胚胎，(f)从完整卵母细胞发育来的四细胞期重建胚胎，(g)加温后从去脂的胚胎再膨胀的胚泡，(h)对加温后从去脂的胚胎再膨胀的胚泡进行Hoechst染色和UV照射。尺代表100μm。
图3.在化学辅助去核中进行二分。注意与较小部分(推定的核体)连接的突出锥(extrusion cone)或极体。立体显微镜照片。尺代表50μm。
图4.有和无染色质的Hoechst染色和UV照射。UB光源，倒置荧光显微镜照片。尺代表50μm。(a)在推定的细胞质体中没有染色质(b)在推定的核体中有染色质。
图5.使用化学辅助手工去核(CAHE)产生的第7天胚泡的立体显微镜照片。尺代表50μm。
图6.化学辅助手工去核(CAHE)后发育而来的胚泡的Hoechst染色和UV照射。尺代表50μm。
发明详述
本发明提供通过核移植克隆哺乳动物的改进方法，其中核移植是指将核酸DNA的完整互补物从一个细胞导入至去核的细胞。
体细胞核移植
在克隆中，将体细胞的核或体细胞移植到自身的核被去除(失核或去核)的卵细胞(卵母细胞)内被称作体细胞核移植。新的个体将从这个重建的胚胎开始发育，并在遗传上与体细胞供体相同。在本发明中，体细胞核移植方法是一种细胞核移植方法，其包括以下步骤：a)构建具有至少一部分经修饰的透明带的至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少2部分，从而获得至少一个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合，e)得到重建的胚胎。然而，本发明也涉及细胞核移植的方法，其包含以下步骤：)构建至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少3部分，从而获得至少2个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合，e)得到重建的胚胎。
可改变所列步骤中的参数以获得对给定动物物种最有效的核移植。下文详细描述了多种参数。
卵母细胞
根据本发明所述的术语“卵母细胞”是指未成熟的雌性生殖细胞，其未完成形成卵子(配子)的成熟过程。在本发明中，去核的卵母细胞是核移植过程中的受体细胞。
根据本发明所述的卵母细胞是从哺乳动物的输卵管和/或卵巢中分离而来的。通常，卵母细胞取自死亡的动物，然而也可以从活动物的输卵管和/或卵巢中分离而来。在一个具体实施方式中，卵母细胞通过输卵管回收方法或经阴道的回收方法而分离。在优选的具体实施方式中，卵母细胞通过吸取而分离。卵母细胞在去核前，通常在本领域技术人员已知的多种培养基中成熟。卵母细胞也可以从刚处死动物的卵巢或者冷冻和/或解冻的卵巢中分离。优选地，卵母细胞新鲜地分离自输卵管。
卵母细胞或细胞质体也可以在使用前被深低温保藏。尽管本领域技术人员认识到新鲜分离的、成熟的卵母细胞是优选的，也应当认识到在收集后或成熟后深低温保藏卵母细胞是可以的。如果使用深低温保藏的卵母细胞，那么这些卵母细胞必须在置于成熟培养基内之前先进行解冻。解冻深低温保藏的物质从而使其在解冻过程之后具有活性的方法是本领域普通技术人员已知的。然而，通常卵母细胞和细胞质体的深低温保藏是要求非常高的程序，其在猪中尤其难，这是因为上文提到的猪卵母细胞和细胞质体的普遍易碎，以及高脂质含量使其对寒冷伤害(即，在冷却和加温程序中在+15至+5℃之间发生的伤害)十分敏感。
在另一个具体实施方式中，收集在体内成熟的成熟(分裂中期II)卵母细胞并用于本文中公开的核移植方法。
基本上，从非超数排卵或超数排卵的哺乳动物开始发情后或者注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)或相似的激素后35-48小时，通过外科手术收集成熟的分裂中期II卵母细胞。
当卵母细胞在体外培养时，可去除可能已积累的在体内围绕在卵母细胞周围的卵丘细胞以提供处于对去核更合适的成熟阶段的卵母细胞。可通过吹打或涡旋来去除卵丘细胞，例如存在0.1-5％透明质酸酶，例如0.2-5％透明质酸酶，例如0.5-5％透明质酸酶，例如0.2-3％透明质酸酶，例如0.5-3％透明质酸酶，例如0.5-2％透明质酸酶，例如0.5-1％透明质酸酶，例如0.5％透明质酸酶。
优选方法中的第一步包括从合适的动物中分离受体卵母细胞。在这一点上，卵母细胞可以从任何动物来源并在任何成熟阶段而获得。
已报道进行去核以及核移植的卵母细胞的成熟阶段对核移植方法的成功十分重要。经常通过吸取从哺乳动物卵巢收获未成熟的(前期I)的卵母细胞。为应用如遗传改造、核移植和克隆的技术，这些收获的卵母细胞在用作核移植的受体细胞前，优选地在体外成熟。
优选地，成功的哺乳动物胚胎克隆使用中期II阶段的卵母细胞作为受体卵母细胞，因为认为在此成熟阶段的卵母细胞能够被或者已被充分活化从而将被导入的核视作一个授精精子来处理。然而，本发明涉及适用于进行体细胞核移植的任何成熟阶段的卵母细胞，通过本发明的体细胞核移植方法可获得的胚胎、胚泡和/或动物。
卵母细胞的体外成熟通常在成熟培养基中进行，直到卵母细胞到达中期II阶段或排出第一极体。未成熟卵母细胞到达成熟所用的时间被称为成熟期。
在本发明的优选具体实施方式中，卵母细胞来自大母猪或小母猪，优选地来自大母猪。
动物
在根据本发明的细胞核移植方法中涉及的供体(体细胞或体细胞的核)和受体(细胞质体)是非人类哺乳动物。同样地，根据本发明可以被植入重建胚胎的动物是非人类哺乳动物。哺乳动物可以是有蹄类动物，所述有蹄类动物选自由如下家养的或野生的代表动物组成的组：牛科、羊科、鹿科、猪科、马科和骆驼科。在特别的具体实施方式中，哺乳动物是母牛或公牛、野牛、美洲野牛、绵羊、大角羊、马、矮马、驴、骡子、鹿、麋鹿、北美驯鹿、山羊、水牛、骆驼、骆马、羊驼或猪。
在本发明一个特别的具体实施方式中，哺乳动物是猪。在一个具体实施方式中，猪是野猪。在另一个具体实施方式中，猪是家猪(Susscrofa或S.domesticus)。在另一个具体实施方式中，本发明涉及小型猪，但也涉及近交系猪。
在一个特别的具体实施方式中，猪可选自如下构成的组：兰德瑞斯猪、约克夏猪、汉普夏猪、杜洛克猪、中国梅山猪、波克夏猪和皮特兰猪。在另一个具体实施方式中，本发明涉及由兰德瑞斯猪、约克夏猪、汉普夏猪和杜洛克猪构成的组。然而，本发明也涉及由兰德瑞斯猪、杜洛克猪和中国梅山猪构成的组。相似地，由波克夏猪、皮特兰猪、兰德瑞斯猪和中国梅山猪构成的组可以是本发明的对象。但由兰德瑞斯猪和中国梅山猪构成的组也是本发明的对象。
在一个特别的具体实施方式中，猪是兰德瑞斯猪或约克夏猪。在一个特别的具体实施方式中，本发明涉及汉普夏品种的猪和杜洛克品种的猪。在另一个优选的具体实施方式中，猪是中国梅山品种的猪。然而，波克夏猪也包括在本发明内，而且在特别的具体实施方式中，皮特兰猪也包括在本发明内。
本发明的另一个具体实施方式涉及选自如下组的小型猪：戈丁根猪(Goettingen)、尤卡坦猪(Yucatan)、巴马香猪、五指山猪、西双版纳猪。
在另一个具体实施方式中，本发明涉及由戈丁根猪和尤卡坦猪构成的组。另外地，本发明涉及由巴马香猪、五指山猪、西双版纳猪构成的组。特别地，本发明涉及戈丁根猪。但尤卡坦猪也与本发明相关。相似地，巴马香猪包括在本发明内，五指山猪以及尤其是西双版纳猪也包括在本发明内。
根据本发明的供体哺乳动物可以是雌性或雄性。所述哺乳动物的年龄可以是任何年龄，例如成年，或例如胎儿。
胚胎
根据本发明，重建的胚胎(即，单细胞胚胎)包含供体细胞的遗传物质。随后，重建的胚胎在有丝分裂开始后，逐渐分裂成多细胞胚胎。在体外，通常通过本文所述的活化来诱导有丝分裂的开始。
在本发明中，术语“胚胎”也指重建的胚胎，其是在核移植过程后，在经活化而开始有丝分裂后形成的胚胎。重建的胚胎在体外培养。
当胚胎包括大约12-16个细胞时，其被称作“桑椹胚”。随后，胚胎进一步分裂并形成许多细胞，并且在其中心产生了充满液体的囊腔——囊胚腔。在此阶段，胚胎被称作“胚泡”。在为植入做好准备之时发育阶段的“受精的”卵母细胞，其来自桑椹胚并由内细胞团、内腔和被称为滋养外胚层细胞的外层细胞组成。
根据本发明的胚泡可被植入到寄主哺乳动物的子宫内，并继续生长成胎儿直至动物。在本文提供的用于产生遗传修饰的或转基因的非人类哺乳动物、用于克隆非人类哺乳动物、用于培养重建的胚胎和/或用于深低温保藏猪胚胎的方法中，胚胎可以在体外培养。胚胎可以例如进行序贯培养(sequential culture)。应当认识到胚胎可以是正常胚胎，或在本文其它地方限定的重建的胚胎。
细胞质体
核被去除的卵母细胞或卵母细胞的一部分。
供体细胞
本发明的术语“供体细胞”表示体细胞和/或来自生殖系的细胞。
本发明的术语“体细胞”表示来自任何发育阶段的动物的任何(体)细胞。例如体细胞可源自胎儿或成体组织。特别优选的体细胞是胎儿起源的那些细胞。然而，也可以使用来自生殖系的细胞。根据本发明，供体细胞是体细胞。在本发明的另一个具体实施方式中，供体细胞是从生殖细胞系衍生而来的细胞。
在本发明的一个优选的具体实施方式中，供体细胞具有所需的遗传特性。然而，供体细胞可具有通过在本文其它地方描述的遗传操作而得到的所需遗传特性。
体细胞选自如下构成的组：上皮细胞，神经细胞、表皮细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)，红细胞、巨噬细胞、单核细胞、单核的细胞、成纤维细胞、心肌细胞和其它肌细胞。
这些细胞可从不同的器官中获得，例如，皮肤、肺、胰腺、肝脏、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾脏、尿道和其它泌尿器官。
可从中取得体细胞的动物在本文的其它地方有描述。本发明的一个优选的具体实施方式使用与受体卵母细胞(细胞质体)相同物种来源的体细胞。
优选地，体细胞是成纤维细胞，其可从发育中的胎儿和成体动物大量地获得。此外，成纤维细胞可在体外容易地繁殖。最优选地，体细胞是胎儿来源的、体外培养的成纤维细胞。
在优选的具体实施方式中，体细胞被遗传修饰。在另一个本发明优选的具体实施方式中，体细胞是猪细胞，并且优选的是胎儿来源，或例如来自成体。
去核
卵母细胞的去核的方法可选自下述方法构成的组：吸取、物理去除、使用DNA特异的荧光染料、暴露于紫外光下和/或化学辅助的去核。在一个具体实施方式中，本发明涉及DNA特异荧光染料的应用。然而，可以通过暴露于紫外光下来进行去核。在特别的具体实施方式中，在物理去除核之前对去核施以化学辅助。使用例如抗肿瘤试剂(如秋水仙胺(N-去乙酰基-N-甲基 1 秋水仙碱))，和/或例如依托泊苷或相关试剂的化学辅助去核可在对透明带的酶促修饰前实施。化学辅助去核包括在成熟培养基中培养成熟的COC，所述成熟培养基在本文其它地方被描述并在特定的时间段内添加秋水仙胺。可向成熟培养基中添加0.1μg/ml-10μg/ml，如0.2μg/ml-10μg/ml，例如0.3μg/ml-10μg/ml，如0.25μg/ml-5μg/ml，例如0.3μg/ml-1μg/ml，如0.25μg/ml-0.5μg/ml，例如0.4μg/ml的秋水仙胺。相似地，可向成熟培养基中添加依托泊苷，例如0.1μg/ml-10μg/ml，如0.2μg/ml-10μg/ml，例如0.3μg/ml-10μg/ml，如0.25μg/ml-5μg/ml，例如0.3μg/ml-1μg/ml，如0.25μg/ml-0.5μg/ml，例如0.4μg/ml。在有抗肿瘤试剂时的COC培养时间是10分钟-5小时，如30分钟-5小时，例如10分钟-2小时，例如30分钟-2小时，例如10分钟-1.5小时，如20分钟-3小时，例如10分钟-3小时，如30分钟-1.5小时，例如45分钟。
在特别的具体实施方式中，化学辅助去核通过使用0.45μg/ml的秋水仙胺和/或依托泊苷添加到成熟培养基中45分钟来完成。
在特别的具体实施方式中，去核优选地通过物理去除核来进行。物理去除可通过分离完成，例如通过二分卵母细胞成两半(2个部分)——包含核的一半以及去核的卵母细胞一半(被称为细胞质体)，去除卵母细胞的有核一半并选择所得的细胞质体用于本发明的进一步步骤。或者，分离通过三分完成，从而产生3部分，其中2部分是细胞质体。在另一个具体实施方式中，卵母细胞可以被分成4部分，从而产生3个细胞质体。卵母细胞甚至可通过物理去除被分成5部分，产生4个细胞质体。相似地，卵母细胞可以被分成6部分，例如7部分，如8部分，例如9部分，如10部分或更多部分。
卵母细胞的物理分离以及随后的卵母细胞有核部分的去除可通过使用显微外科刀片来完成。可筛选卵母细胞以鉴定哪一些卵母细胞被成功去核。含有核DNA的卵母细胞部分可通过使用Hoechst荧光染料的染色来鉴定，其染色程序是本领域技术人员已知的。丢弃含有核DNA的卵母细胞部分，选择去核的卵母细胞(细胞质体)用于以后的程序。
透明带
透明带是厚的、透明的、非细胞性层或膜，其以均一厚度围绕在卵母细胞周围。
因为许多要素，所以通常认为完整的透明带在细胞核移植中是重要的。要素之一是维持极体靠近卵母细胞的中期板，以显示去核的合适位置。另一个要素涉及在融合前和融合期间，维持供体细胞与卵母细胞细胞质体接近。也认为透明带在融合期间保护了供体细胞和细胞质体。最后，认为重建和活化后的胚胎发育受到透明带的支持。
可通过多种方法对至少一部分透明带进行修饰。例如，可使用物理操作来修饰透明带。但也可使用利用如酸性溶液(台氏酸性液)的试剂的化学处理。可在本发明中使用的化学试剂的一个实例是酸性溶液，例如台氏液(Tyrode)。在本发明的一个特别的具体实施方式中，通过酶促消化修饰透明带。这样的酶促消化可通过包含例如胰蛋白酶的酶类而进行。另外地，可使用特殊的蛋白酶，如链霉蛋白酶。
在优选的具体实施方式中，酶促消化导致透明带的一部分至少部分消化，其在本发明的优选具体实施方式中表示透明带的至少一部分被去除，或者透明带被部分地去除。在这里，透明带没有被完全去除。
根据本发明的一个特别优选的具体实施方式，透明带被部分消化的部分的特征在于：透明带仍然可见，并且事实上卵母细胞没有变形。
可通过暴露于蛋白酶来实现部分消化。在本发明的另一个具体实施方式中，可通过使用链霉蛋白酶来完成部分消化。在另一个具体实施方式中，可通过蛋白酶和链霉蛋白酶的组合来实现部分消化。
在优选的具体实施方式中，链霉蛋白酶的浓度范围是0.1mg/ml-10mg/ml，如0.5mg/ml-10mg/ml，例如1mg/ml-10mg/ml，如1.5mg/ml-10mg/ml，例如2mg/ml-10mg/ml，如2.5mg/ml-10mg/ml，例如2.75mg/ml-10mg/ml，如3mg/ml-10mg/ml，例如3.25mg/ml-10mg/ml，如3.3mg/ml-10mg/ml，例如3.5mg/ml-10mg/ml。
优选的具体实施方式的链霉蛋白酶浓度范围是2mg/ml-5mg/ml，如2.25mg/ml-5mg/ml，例如2.5mg/ml-5mg/ml，如2.75mg/ml-5mg/ml，例如2.8mg/ml-5mg/ml，如2.9mg/ml-5mg/ml，例如3mg/ml-5mg/ml，如3.1mg/ml-5mg/ml，例如3.2mg/ml-5mg/ml，如3.3mg/ml-5mg/ml。
本发明特别的具体实施方式的链霉蛋白酶浓度范围是1mg/ml-4mg/ml，例如1mg/ml-3.9mg/ml，如1mg/ml-3.8mg/ml，例如1mg/ml-3.7mg/ml，如1mg/ml-3.6mg/ml，例如1mg/ml-3.5mg/ml，如1mg/ml-3.4mg/ml，例如1mg/ml-3.3mg/ml。
在优选的具体实施方式中，链霉蛋白酶浓度范围是2.5mg/ml-3.5mg/ml，如2.75mg/ml-3.5mg/ml，例如3mg/ml-3.5mg/ml。在特殊的具体实施方式中，链霉蛋白酶浓度是3.3mg/ml。
对技术人员明显的是链霉蛋白酶应当溶解在合适的培养基中，根据本发明的一个优选的培养基是T33(Hepes缓冲的TCM 199培养基，其中含有33％的牛血清)(之前在Vajta，等，2003中有描述)。
卵母细胞在链霉蛋白酶溶液中温育的时间范围是1秒-30秒，如2秒-30秒，例如3秒-30秒，如4秒-30秒，如5秒-30秒。
在本发明的另一具体实施方式中，温育的时间范围是2秒-15秒，如2秒-14秒，例如2秒-13秒，如2秒-12秒，例如2秒-11秒，如2秒-10秒，例如2秒-9秒，例如2秒-8秒，例如2秒-7秒，如2-6秒，例如2秒-5秒。
在本发明的特别具体实施方式中，温育的时间范围是3秒-10秒，如3秒-9秒，例如4秒-10秒，如3秒-8秒，例如4秒-9秒，如3秒-7秒，例如4秒-8秒，例如3秒-6秒，例如4秒-7秒，如3-5秒，例如4秒-6秒，如4秒-5秒。特别优选的温育时间是5秒。
在本发明的优选具体实施方式中，卵母细胞在3.3mg/ml链霉蛋白酶溶液中，于39℃下处理5秒钟。
重建的胚胎
术语“重建的胚胎”是指通过将供体细胞或供体细胞的核插入到去核卵母细胞中而形成的细胞，其相当于受精卵(在正常受精中)。然而，术语“重建的胚胎”也指“重组的细胞”。在本发明中，供体细胞是体细胞。然而，供体细胞也可以从生殖系细胞衍生而来。
融合
根据本发明是通过融合将供体细胞或来自供体细胞的膜包围的核移植到至少细胞质体内。在下文的情景下，术语“供体细胞”也指来自供体细胞的膜包围的核。可通过多种方法来实现融合。
融合可发生在供体细胞和至少一个细胞质体之间，如在供体细胞和至少2个细胞质体之间，例如在供体细胞和至少2个细胞质体之间，如在供体细胞和至少3个细胞质体之间，如在供体细胞和至少4个细胞质体之间，例如在供体细胞和至少5个细胞质体之间，如在供体细胞和至少6个细胞质体之间，例如在供体细胞和至少7个细胞质体之间，如在供体细胞和至少8个细胞质体之间。
可同时或依次根据上文所列的组合进行融合。在本发明的一个具体实施方式中，同时进行融合。在另一个具体实施方式中，依次进行至少一个细胞质体和供体细胞的融合。
例如，可通过化学融合来实现融合，其中供体细胞和至少一个细胞质体暴露于融合促进试剂，融合促进试剂例如蛋白质、糖蛋白或碳水化合物，或其组合。多种融合促进试剂是已知的，例如聚乙二醇(PEG)、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、外源凝集素、凝集素、病毒和仙台病毒。优选地使用植物凝集素(PHA)。然而也可以使用甘露醇和或聚乙烯醇。
另外地，可通过使用穿过融合平面的直流电(DC)的诱导来完成融合。经常使用交流电(AC)使供体和受体细胞排列对准。电融合产生了足够高的电脉冲，从而能瞬间打破细胞质体和供体细胞的膜并随后重新形成膜。其结果是在供体细胞和受体细胞之间打开了小通道。在供体细胞和受体细胞的膜相连的情况下，小通道会逐渐增加并且最终2个细胞会融合成1个细胞。
可使用交流电使少一个细胞质体和供体细胞排列对准，所述交流电的范围是0.06-0.5KV/cm，如0.1-0.4KV/cm，例如0.15-0.3KV/cm。在优选的具体实施方式中，使用0.2KV/cm的交流电使至少一个细胞质体和供体细胞排列对准。
可通过使用穿过至少1个细胞质体和供体细胞的融合平面的直流电来诱导融合。直流电的范围是0.5-5KV/cm，如0.75-5KV/cm，例如1-5KV/cm，如1.5-5KV/cm，例如2-5KV/cm。本发明的另一个优选的具体实施方式使用的直流电范围是0.5-2KV/cm。在另一个优选的具体实施方式中，直流电是2KV/cm。
直流电优选的使用时间范围是1-15微秒，如5-15微秒，例如5-10微秒。特别的具体实施方式中是9微秒。
在特别优选的具体实施方式中，使用直流电的融合可使用2KV/cm、9微秒的直流电。
然而可以将电融合和化学融合组合。
通常，电融合在本领域技术人员已知的融合室内进行。
融合可以以至少1步，如2步，例如3步，如4步，例如5步，如6步，例如7步，如8步进行。
融合可以在例如第一步中进行，其中至少一个细胞质体与供体细胞融合。融合的第二步可包括将融合的一对(细胞质体-供体细胞，重建的胚胎)与至少1个细胞质体，如至少2个细胞质体，例如3个细胞质体，如4个细胞质体，例如5个细胞质体，如6个细胞质体，例如7个细胞质体，如8个细胞质体融合。融合至少一个细胞质体和融合的一对的融合第二步可依次或同时进行。在一个具体实施方式中，至少2个细胞质体与融合的一对同时融合。在另一个具体实施方式中，至少2个细胞质体与融合的一对依次融合。
在本发明的一个具体实施方式中，融合的第二步也可以是活化步骤，其中重建的胚胎被活化而进入有丝分裂。如在本文其它地方所描述。
活化
在优选的具体实施方式中，可使重建的胚胎在活化前静置一段时间，以使供体细胞的核在去核细胞质体的全新环境下，重排其基因组并获得全能性。重建的胚胎可以在活化前例如静置1小时。
优选地，可活化重建的胚胎以诱导有丝分裂。活化的方法优选地选自如下构成的组：电脉冲、化学诱导休克、升高胞内二价阳离子水平或减少磷酸化。优选所述方法的组合用于活化。
在本发明的一个特别的具体实施方式中，活化和融合的第二步可同时进行。然而，重建的胚胎的活化和重建的胚胎与至少一个细胞质体之间融合的至少一个附加步骤可依次进行。
减少重建的胚胎内细胞蛋白的磷酸化可活化重建的胚胎，其中减少磷酸化可通过例如添加激酶抑制剂的已知方法进行。优选的具体实施方式可包括使用抑制蛋白质合成的试剂，例如放线菌酮。另一个优选的具体实施方式可使用抑制纺锤体形成的试剂，例如细胞松弛素B。
在本发明的一个具体实施方式中，可提高二价阳离子的细胞内水平。二价阳离子例如钙可以包括在活化培养基中。优选地，阳离子进入重建的胚胎，特别在使重建的胚胎接受电脉冲的时候更是如此。在优选的具体实施方式中，电脉冲可引起钙进入重建的胚胎。
使用直流电施加电脉冲可以是活化步骤。然而，在优选的具体实施方式中，用于活化的电脉冲还可作为附加的融合步骤。
在使用直流电施加电脉冲之前，可通过应用交流电将至少一个细胞质体和至少一个重建的胚胎排列对准。交流电的范围可以是0.06-0.5KV/cm，如0.1-0.4KV/cm，例如0.15-0.3KV/cm。在优选的具体实施方式中，使用0.2KV/cm的交流电将至少一个细胞质体和供体细胞排列对准。
可通过应用穿过至少一个细胞质体和供体细胞的融合平面的直流电来诱导活化。直流电的范围是0.2-5KV/cm，如0.4-5KV/cm，例如0.5-5KV/cm。本发明另一个优选的具体实施方式应用0.5-2KV/cm的直流电。在另一个优选的具体实施方式中，直流电是0.7KV/cm。
直流电优选的使用时间范围是10-200微秒，如25-150微秒，例如50-100微秒。在一个特别的具体实施方式中是80微秒。
在特别优选的具体实施方式中，使用直流电的融合可使用0.7KV/cm、80微秒的直流电。
根据本发明的活化的一个特别优选的具体实施方式将电脉冲与使重建的胚胎与抑制蛋白合成、纺锤体形成的试剂和二价阳离子接触相组合使用。
可通过上述方法的任何组合进行活化。
遗传修饰的类型
可通过本领域已知的任何标准方法遗传修饰供体细胞。遗传修饰可以是通过缺失、插入、复制和/或其它形式的突变(包括点突变)的基因组DNA的修饰。修饰可以在编码序列和/或非编码序列中实施。用于插入的DNA构建体可含有目的基因和/或如启动子、绝缘子、增强子、抑制子或核糖体进入位点的调节序列。在某些具体实施方式中，只向基因组中导入一个遗传修饰。然而在其它具体实施方式中，基因组在一个以上的位点被修饰。对如成纤维细胞的哺乳动物细胞的遗传修饰的合适技术包括：例如通过非同源重组的基因添加、通过同源重组的基因置换和基因编辑技术。这包括使用逆转录病毒插入、转座子转移和/或人工染色体技术。非同源DNA重组可以例如根据Kragh等(2004)Reprod.Fert.Dev.16：290或Kragh等(2004)Reprod.Fert.Dev.16：315中描述的进行，基于转座子的基因转移可根据Izsvak等(1997)Cell 91：501描述的进行。通过同源重组的基因置换可例如包括Urnow等(2005)Nature 435：646所描述的技术。基因编辑的技术在Andersen等(2002)J.Mol.Med.80：770，Liu等(2002)Gene Ther.9：118和Srensen等(2005)J.Mol.Med.83：39中得到描述。
胚胎的体外培养
本发明一方面涉及体外培养胚胎的方法，由此胚泡率升高到25.3％。这样，培养重建的胚胎的方法在本发明的范围内，其包括以下步骤：a)构建具有至少一部分透明带的至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少2部分，从而获得具有核的卵母细胞和至少一个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合，e)得到重建的胚胎，f)活化该重建的胚胎以形成胚胎，e)培养所述胚胎。
本发明另一方面涉及细胞核移植的方法，其中包括培养胚胎的步骤。
在与本文描述的方法相关的优选具体实施方式中，胚胎在依序的一组培养基中培养。优选地，胚泡生长在传统的培养基中，所述传统的培养基例如NCSU37或本领域技术人员已知的等同的培养基，其中去除葡萄糖并用其它试剂替代。一种试剂可以是丙酮酸盐。另一种试剂可以是乳酸盐。这些试剂也可以组合并替代传统培养基中的葡萄糖。
胚胎可以在如上所述替代的培养基中培养从第0天至第3天，例如从第0天至第2天。
丙酮酸盐的浓度范围是0.05-1mM，如0.1-1mM，例如0.125-1mM，如0.15-1mM。然而丙酮酸钠的浓度范围也可以是0.05mM-0.9mM，如0.05-0.8mM，例如0.05-0.7mM，如0.05-0.6mM，例如0.05-0.5mM，如0.05-0.4mM，例如0.05-0.3mM，如0.05-0.2mM。优选的浓度范围是0.05-0.17mM。丙酮酸钠的优选浓度是0.17mM。
乳酸盐的浓度范围是0.5-10mM，如0.75-10mM，例如1-10mM，如1.5-10mM，如1.75-10mM，例如2-10mM，如2.5-10mM.然而乳酸钠的浓度范围也可以是0.5mM-9mM，如0.5-8mM，例如0.5-7mM，如0.5-6mM，例如0.5-5mM，如0.5-4mM，例如0.5-03mM。优选的浓度范围是1-5mM，如2-4mM，例如2-3mM。乳酸钠的优选浓度是2.73mM。
在初始无葡萄糖的温育后，培养基葡萄糖再次替代丙酮酸盐和乳酸。胚胎可在含葡萄糖培养基中培养从第4天至第3天，优选从第3天至第7天。葡萄糖的浓度范围是1-10mM，如2-10mM，例如3-10mM，如4-10mM，例如5-10mM。然而，葡萄糖浓度也可以是1-9mM，如2-8mM，例如3-7mM，如4-6mM。根据本发明的葡萄糖的优选浓度是5.5mM。
在另一个优选的具体实施方式中，胚胎是猪胚胎。
遗传修饰的动物
根据本发明的一个具体实施方式，提供具有所需基因型的遗传修饰的或转基因的动物。
应当认识到本发明不包括修饰动物的遗传身份的步骤或从这些步骤得到的动物，这些步骤可能使动物痛苦而对人类或动物无任何实质性医学益处。
本发明涉及产生遗传修饰或转基因的非人类哺乳动物的方法，其包括以下步骤：a)构建具有至少一部分经修饰的透明带的至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少2部分，从而获得具有核的卵母细胞和至少1个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合，e)得到重建的胚胎，f)活化该重建的胚胎以形成胚胎，g)培养所述胚胎，以及h)将所述培养的胚胎转移到寄主哺乳动物中，使得该胚胎发育成遗传修饰的胎儿。
然而，遗传改造或转基因的非人类哺乳动物也可通过包括以下步骤的方法产生：a)构建至少一个卵母细胞，b)将该卵母细胞分成至少3部分，从而获得具有核的卵母细胞和至少1个细胞质体，c)构建具有所需遗传特性的供体细胞或细胞核，d)将至少一个细胞质体与该供体细胞或膜包围的细胞核融合，e)得到重建的胚胎，f)活化该重建的胚胎以形成胚胎，g)培养所述胚胎，以及h)将所述培养的胚胎转移到寄主哺乳动物中，使得该胚胎发育成遗传修饰的胎儿。
器官或组织捐献
在一个具体实施方式中，本发明的动物被用作人类或其它动物(相同物种的动物或其它物种的动物)的器官或组织捐献的来源。物种之间的转移经常被称为异种移植。可以移植的完整器官包括心脏、肾脏、肝脏、胰腺或肺。另外地，器官的部分(如特殊的器官组织)可以被移植或转移到人类或其它动物中。在另一个具体实施方式中，为治疗目的将来自本发明动物的单个细胞或单个细胞的群体转移到人类或另一动物中。
疾病模型
本发明也涉及克隆根据本发明方法的非人类哺乳动物的方法。这样，本发明一方面涉及包括以下步骤的克隆非人类哺乳动物的方法：a)构建如本文描述的胚泡，任选地解冻胚胎，b)将所述培养的胚胎转移到寄主哺乳动物中，使得胚胎发育成遗传修饰的胎儿。遗传修饰的胎儿可发育成非人类哺乳动物。
本发明也涵盖通过本文描述的方法可获得的、作为疾病模型的遗传修饰的动物。因此，本发明第二方面是通过本文描述的方法可获得的遗传修饰的非人类哺乳动物。另一方面涉及通过本文描述的方法可获得的遗传修饰的非人类胚胎。
本文所描述的方法不包括在非人类机体上进行的外科手术步骤。
本发明的用于细胞核移植的方法提供了产生用于任何相关疾病的模型动物的工具，希望设计所述模型动物以研究疾病的发生、潜在的治疗方案，药物测试和预防。所选择的疾病不局限在任何特定的疾病组。本发明开发遗传修饰的动物疾病模型的应用实例显示在下文中。然而，本发明不局限于下文所列的实例。
在通过HMC技术进行SCNT之前将遗传修饰导入到体细胞内。然而，在另一个具体实施方式中，可以在手工克隆(HMC)期间导入遗传修饰，例如在HMC程序的不同步骤时加入转基因，而转基因会找到到达胚胎基因组的途径。
遗传修饰包括致病基因、突变基因随机整合入体细胞基因组。也可以是正常非突变基因的随机整合，所述正常非突变基因当表达在特定的组织或在特定的表达水平时引起疾病。
导入的基因或转基因可来源于任何物种，其中包括细菌、猪、人类、小鼠、大鼠、酵母、无脊椎动物或植物。转基因的调节序列可驱动普遍的或可诱导的或者组织和/或时间特异的表达，并且也可以来源于任何物种，其中包括猪、人类、小鼠、大鼠、酵母、无脊椎动物或植物。
重要的是，通过同源重组靶向构建体或通过基因编辑程序可将体细胞中的遗传修饰靶向到猪基因组中的特定区域。特定基因的失活(例如敲除)可以引起疾病或表型，或者特定突变整合(敲入)到特定基因内可以引起疾病。同样，可通过同源重组方法将引起疾病的转基因整合到猪基因组的特定调节区域内。
在HMC程序之前或期间导入到猪基因组中的遗传修饰也可以是外遗传修饰(例如DNA甲基化或者组蛋白的甲基化或乙酰化/去乙酰化)，通过将体细胞、卵母细胞或重建的HMC胚胎与化学成分(如Tricostatin或具有相似作用的化合物)温育。
本发明涉及作为疾病模型的遗传修饰的动物，疾病模型例如是变性疾病、线粒体相关蛋白折叠疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病或硬化症的模型。然而，遗传性阿尔茨海默病模型也是本发明的一个具体实施方式。
在另一个具体实施方式中，疾病模型可以包括所有类型的癌症疾病，例如乳腺癌。但可以研究所有的癌症，如结肠癌或肺癌。
其它具体实施方式涉及用于治疗性活性分子或柔性脂质体皮肤渗透的分析的具有遗传传感器系统的模型。另一个具体实施方式涉及用于伤口愈合或溃疡治疗的疾病模型。而且，例如通过整形外科治疗畸形的疾病模型在本发明的范围内。同样地，与组织改造(例如细胞移植、组织移植、器官移植)相关的疾病模型在本发明的范围内。
其它的疾病模型是牛皮癣疾病模型和/或表皮松解性疾病(例如单纯性大疱性表皮松解症)的疾病模型。
同样地，治疗和预防由动脉粥样硬化症、缺血性心脏病引起的疾病的模型是本发明的具体实施方式。
模型也包括代谢疾病的模型，所述代谢疾病导致广泛的常见疾病，例如糖尿病和肥胖症。但动脉粥样硬化症和心血管疾病最初也可由代谢疾病所引起。肾脏衰竭是可由代谢功能障碍引起的疾病的另一个实例。
同样地，高血压最初也可因代谢功能障碍病引起并可在代谢疾病的遗传修饰动物模型中被研究。同样还有，线粒体蛋白突变引起的疾病，例如短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏、神经肌肉虚弱、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺失变体的表达引起的变性。
玻璃化
术语深低温保藏用于在活细胞的冷冻、储存和解冻过程中涉及的不同的细胞冷冻技术。玻璃化是深低温保藏的一种形式，其中快速冷却活细胞使得细胞的液体不形成冰。这样，玻璃化涉及冷却步骤，其中通过冷却到低的零下温度，例如(通常是)-80℃或-196℃(液氮的沸点)来保存细胞或整个组织。在这些低温下，任何生物活性都被有效地停止，所述生物活性包括能导致细胞死亡的生化反应。然而，玻璃化是指特殊的方法，其中在培养基、保存的细胞或组织中不允许形成冰。可通过使用高浓度的冷冻保护剂溶液和极高的冷却速度来实现此无冰冷却。加温也要以温度的快速升高来进行。
本发明一方面涉及玻璃化(深低温保藏)卵母细胞、细胞质体、细胞、胚胎或胚泡的能力。这样，本发明公开了包括以下步骤的猪胚胎深低温保藏的方法：a)构建至少一个猪卵母细胞，b)使该卵母细胞去脂，c)活化重建的胚胎以形成胚胎，d)培养所述胚胎，e)玻璃化该胚胎。而且，可如本文其它地方所述的将去脂的卵母细胞分离成至少2部分，从而获得具有核的卵母细胞和至少一个细胞质体。
特别地，本发明涉及卵母细胞的玻璃化，然而，本发明也涉及胚胎的玻璃化，优选地胚胎处于胚泡期。在一个具体实施方式中，在玻璃化前将胚胎培养到胚泡期。本发明尤其涵盖猪胚胎。同样地，本发明涵盖玻璃化的细胞质体，以及细胞。
本发明另一方面涉及通过本文描述的细胞核移植方法获得的猪胚胎的深低温保藏，其包括玻璃化猪胚胎的步骤。本发明另一方面涉及通过本文提供的方法获得的或可获得的猪胚胎。
在本文中使用的术语“深低温保藏”可以指对本发明的卵母细胞、细胞质体、细胞、胚胎或动物的玻璃化。深低温保藏中使用的温度优选地低于-80℃，更优选地低于-196℃。本发明的卵母细胞、细胞和胚胎可以深低温保藏无限量的时间。已知生物材料可以深低温保藏大于50年。
当使用方法以产生遗传改造的或转基因的非人类哺乳动物时，在移植到寄主哺乳动物前可深低温保藏胚胎，而这包括在本发明的范围内。移植前的这种深低温保藏可在胚胎发育的胚泡期进行。
本发明一方面涉及通过使用酶类试剂(例如链霉蛋白酶)的温和处理对卵母细胞非侵入性去脂。在优选的具体实施方式中，链霉蛋白酶优选的浓度范围是0.5-5mg/ml，如0.5mg/ml-3mg/ml，例如0.5mg/ml-2mg/ml。优选地，链霉蛋白酶的浓度是1mg/ml。在本发明的另一个具体实施方式中，通过使用浓度为3.3mg/ml的链霉蛋白酶处理来获得卵母细胞的非侵入性去脂。
在有合适的培养基存在下进行卵母细胞的去脂，例如包含50％牛血清的培养基。
可使去脂步骤进行一段时间，优选的范围是1-5分钟，特别是3分钟。然而，在链霉蛋白酶的浓度为2.5mg/ml-5mg/ml范围内的情况下，允许进行去脂步骤的时间段是5秒-15秒，例如5秒-10秒，如10秒-15秒。本发明的一个具体实施方式是使用3.3mg/ml的链霉蛋白酶对卵母细胞去脂10秒。
优选地，其后在合适的培养基中洗涤卵母细胞，例如添加了牛血清的Hepes缓冲的TCM-199培养基，所述牛血清例如是20％。链霉蛋白酶消化和洗涤的卵母细胞优选地以8,000-15,000xg，例如9,000-14,000xg进行离心。在特别优选的具体实施方式中，卵母细胞以12,000xg进行离心。离心可以进行10-30分钟，如20分钟。
在本发明的特别优选的具体实施方式中，卵母细胞通过浓度为1mg/ml的链霉蛋白酶去脂3分钟，其后洗涤卵母细胞并随后以12,000xg离心20分钟。
在本发明优选的具体实施方式中，可玻璃化去脂的卵母细胞。根据本发明的一个具体实施方式，去脂的卵母细胞可以被玻璃化并随后被加温以用于根据本发明的方法中。在另一个具体实施方式中，去脂的卵母细胞可用于本文中所描述的方法以生产例如胚胎，特别是优选地被玻璃化的胚泡期的胚胎。玻璃化的卵母细胞、细胞质体、细胞、胚胎或胚泡期的胚胎可如此被玻璃化。通过本发明的玻璃化步骤而产生的玻璃化的胚泡可储存并经加温植入合适的非人类的哺乳动物中以产生根据本文细胞核移植方法的遗传修饰的哺乳动物。
线粒体
通过本发明可获得的遗传修饰的非人类的哺乳动物和/或非人类的胚胎的组织细胞可含有不同母源的线粒体。在优选的具体实施方式中，非人类的哺乳动物和/或非人类的胚胎可含有来自唯一母源的线粒体，然而，在另一个优选的具体实施方式中，非人类的哺乳动物和/或非人类的胚胎可含有来自至少2个母源，如3个母源，例如4个母源，如5个母源，例如6个母源，如7个母源，例如8个母源，如9个母源，例如10个母源的线粒体。具有特定数目母源的可能性可基于观察到的线粒体类型来计算。
实施例
除非另有指明，所有的化学试剂购自Sigma Chemical Co.(StLouis，MO，USA)。
卵母细胞收集和体外成熟(IVM)
卵丘-卵母细胞复合体(COC)从屠宰场获得的大母猪和小母猪卵巢的2-6mm卵泡中吸取。50个为一组的COC在400μl添加10％(v/v)牛血清(CS)、10％(v/v)猪卵泡液、10IU/ml eCG、5IU/ml hCG(Suigonan Vet；Skovlunde，Denmark)的碳酸氢盐缓冲的TCM-199(GIBCO BRL)中，于″Submarine Incubation System″(SIS；Vajta，等1997)内，在38.5℃、5％ CO2、湿润空气中成熟41-44小时。
体外受精(IVF)
使用体外成熟的卵母细胞进行3次相同重复的IVF实验。在成熟后，使用含2mM咖啡因的mTBM(mTBMfert)洗涤COC两次并以50个为一组转移至400μl mTBMfert中。如前所述(Booth等，发表中)处理新鲜射出的精液。在38.5℃、5％ CO2、湿润空气中获能2小时后，精子以1×105个精子/ml的调整后终浓度添加到卵母细胞中。受精在38.5℃、5％ CO2、湿润空气中，于SIS内进行3小时。授精后，假定的受精卵在mYBMfert中涡旋以去除卵丘细胞，然后用IVC培养液洗涤并置于培养皿中(参见胚胎培养和评估)。
手工克隆(HMC)
所应用的HMC方法基于我们之前在牛和猪中的工作(Kragh，等，2004；Peura和Vajta，2003；Vajta等，2003)，但具有显著的修改。
简单的说，成熟开始后41小时，通过在含1mg/ml透明质酸酶的Hepes缓冲的TCM199中反复吹打来去除COC上的卵丘包埋。从此开始(除另有说明的地方)，所有的操作在调节到39℃的加热台上进行，所有用于操作卵母细胞的液滴都是20μl体积并用矿物油覆盖。卵母细胞在溶解有3.3mg/ml链霉蛋白酶的T33(T代表Hepes缓冲的TCM199培养基；数字表示CS添加的百分比(v/v)，在此是33％)中简短温育5秒钟。在卵母细胞在链霉蛋白酶溶液中开始变形前，取出卵母细胞并在T2和T20液滴中快速洗涤。具有部分消化但仍可见的透明带的卵母细胞在含3mg/ml聚乙烯醇(TPVA)和2.5μg/ml细胞松弛素B的T2液滴中排列成行。在立体显微镜监控下用Ultra Sharp SplittingBlades(AB Technology，Pullman，WA，USA；图1a)手工进行三分而不是二分。收集三分的卵母细胞的碎片，并用5μg/ml的Hoechst33342荧光染料在TPVA液滴中染色5分钟，其后置于60mm FalconPetri皿底部的1μl TPVA培养基的液滴中，并覆油(每滴3-4个碎片)。使用倒置显微镜和UV光，登记没有染色质染色的碎片(细胞质体)的位置，并随后在立体显微镜下收集到T10液滴中直到开始融合。
如前所述(Kragh等，发表中)制备胎儿成纤维细胞。融合以2步进行，其中第二步也包括起始活化。对于第一步，使用三分之一的所选细胞质体(优选地是较小的部分)。使用细拉并用火磨光的玻璃吸液管，将10个细胞质体作为一组转移到1mg/ml植物凝集素(PHA；ICN Pharmaceuticals，Australia)中放置3秒钟，随后分别快速滴到几个成纤维细胞中的一个上，所述成纤维细胞沉淀在T2液滴中。结合后，10个细胞质体-成纤维细胞对在融合培养基(0.3M甘露醇和0.01％PVA)中平衡10秒钟。使用0.6KV/cm、700KHz的交流电(AC)，将细胞对排列到融合室(BTX显微镜载片0.5mm融合室，450型；BTX，SanDiego，CA，USA)的金属丝上，而供体细胞离金属丝最远(图1b)，然后使用2.0KV/cm的直流电(DC)融合9μs。在电脉冲后，小心地将细胞对从金属丝上移开，转移到T10液滴中并温育以观察是否发生融合。
第一次融合后大约1小时，融合的细胞对和剩余的三分之二细胞质体在活化培养基液滴(0.3M甘露醇、0.1mM MgSO4、0.1mM CaCl2和0.01％聚乙烯醇(PVA))中分别平衡。在0.6KV/cm AC下，以10个一组细胞质体-融合的细胞对-细胞质体的三联体顺次排列到金属丝上，其中融合的细胞对位于中间(图1c)。使用0.7KV/cm、80μs的单DC脉冲用于第二次融合和起始活化。其后将三联体从金属丝上移开并小心地转移到T10液滴中以检查融合(图1d)。在添加5μg/ml细胞松弛素B和10μg/ml放线菌酮的培养基(参见胚胎培养和评估)中，在38.5℃、5％ CO2、5％ O2和90％ N2及最大湿度下，温育重建的胚胎4小时，其后在培养前，在IVC培养基中彻底洗涤3次。
孤雌激活(PA)
分别或与HMC平行产生孤雌激活的卵母细胞。除了使用链霉蛋白酶更长时间温育以使透明带完全去除外，使用与上述一样的方法剥离卵母细胞。无透明带(ZF)的卵母细胞随后在活化培养基(0.3M甘露醇、0.1mM MgSO4、0.1mM CaCl2和0.01％ PVA)中平衡10秒钟，并转移到融合室(BTX显微镜载片0.5mm融合室，450型；BTX，SanDiego，CA，USA)中。使用BLS CF-150/B细胞融合器(BLS，Budapest，Hungary)产生0.85KV/cm、80μs的单DC脉冲，并用于ZF卵母细胞。对于透明带完整(ZI)的卵母细胞，使用1.25KV/cm、80μs的单DC脉冲(其根据我们未发表的预实验，这些参数分别对ZI和ZF卵母细胞产生最高的活化和随后的体外发育)。电脉冲后的程序与HMC重建胚胎中的程序相同。
胚胎培养和评估
通过上述处理产生的所有猪胚胎培养在含有4mg/ml BSA的改进NCSU37培养基(Kikuchi等，2002)中，以及38.5℃、5％ CO2、5％ O2和90％ N2及最大湿度下。培养基从第0天(受精和活化的那天)至第2天添加0.17mm丙酮酸钠和2.73mm乳酸钠，其后从第2天至第7天用5.5mm葡萄糖代替丙酮酸钠和乳酸钠。所有的ZF胚胎培养在与上文所用相同的培养基和混合气体，以及WOW系统(Vajta等，2000)中，在第2天不从WOW中移出胚胎而小心地更换培养基。在第7天登记胚泡率。为确定细胞总数，在含20μg/μl Hoechst 33342荧光染料的甘油中固定胚泡并涂在玻璃显微镜载玻片上。染色24小时后，在具有落射荧光结合和UV-2A滤片的Diaphot 200倒置显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)下观察胚胎。
实施例1
大母猪(2.5岁，体重170Kg)所得的卵母细胞和小母猪(5.5～6个月，体重75kg)所得的卵母细胞之间的发育能力差异通过44小时体外成熟后的ZF和ZI PA来研究。以3次相同重复研究了4个混合组：(1)从大母猪得到的ZF卵母细胞(2)从大母猪得到的ZI卵母细胞(3)从小母猪得到的ZF卵母细胞(4)从小母猪得到的ZI卵母细胞。对于ZF活化，应用0.85KV/cm、80μs的单DC脉冲，而1.25KV/cm单脉冲用于活化ZI卵母细胞。如上所述培养7天后，测定每个活化胚胎的胚泡百分比。
研究了从大母猪或小母猪得到的孤雌激活的卵母细胞的体外发育能力。如表1所示，在ZF或ZI PA后，从大母猪得到的孤雌激活的卵母细胞的胚泡率显著大于从小母猪得到的卵母细胞。
表1.孤雌激活的大母猪和小母猪卵母细胞在第7天的胚泡发育
Figure S2006800363687D00271
a.b不同的上标表示显著性差异(p＜0.05)。
c.d不同的上标表示显著性差异(p＜0.05)。
*发育至胚泡的胚胎百分比(平均值±S.E.M)。
分别在体外生产(IVP)和体细胞核移植(SCNT)胚胎中检测大母猪和小母猪之间的卵母细胞发育能力的差异，得到与其它研究小组较早发表文献(Sherrer等，2004；Hyun等，2003)中相似的结论，即从大母猪得到的卵母细胞而来的胚胎在支持胚泡发育方面，优于从小母猪得到的卵母细胞的胚胎。尽管在我们的研究中使用的小母猪处在成熟的边缘，但PA后第7日的胚泡率之间的差异十分显著，证明大母猪卵母细胞较高的发育能力。
实施例2
在6次相同的重复中研究改进的猪HMC的可行性，以IVF和平行的ZF PA作为对照。在实施例2中使用能力更高的大母猪卵母细胞(根据实施例1)。重建和/或活化后的第7天，确定每重建胚胎的胚泡数量和随机选择的胚泡的总细胞数量。
三分后，大于90％的从形态完整的卵母细胞得到的卵母细胞碎片可回收用于HMC。平均从100个成熟的卵母细胞可重建37个胚胎。所有来源的猪胚胎的发育能力见表2。在第7天，17±4％的重建胚胎发育至胚泡期，其平均细胞数量是46±5，而IVF和ZF PA的胚泡率分别是30±6％和47±4％(n＝243，170，97)。
表2.HMC、IVF和ZF PA所产生的胚胎的体外发育
Figure S2006800363687D00282
a.b.c不同的上标表示显著性差异(p＜0.05)。
d.e不同的上标表示显著性差异(p＜0.05)。
尽管仍未达到理论最大效率，但透明带部分消化和卵母细胞三分的综合与我们早先的系统(Kragh等，2004 Reprod.Fertil.Dev 16，315-318)相比，几乎使重建胚胎的数量加倍。这种重建效率的提高在猪克隆中可能具有特别的优点，这是因为吸取后的卵母细胞回收比在牛中要求更高也更费时。更重要的一点是：猪核移植后实现怀孕需要高胚胎数量。猪中的IVC也被视为高要求、低效率的程序(Reed等，1992 Theriogeneology 37，95-109)。ZF系统的缺点是胚胎必须在体外达到至少是致密桑椹胚或早胚泡期，以避免因为没有透明带的保护层而在输卵管中的瓦解。另一方面，一旦处于胚泡期，无透明带胚胎可以成功地移植，这已由胚胎或体细胞核移植后出生的小牛(Peura等，1998；Tecirlioglu等，2004；Oback等，2003；Vajta等，2004)和卵母细胞的无透明带IVP后出生的小猪(Wu等，2004)所证明。NCSU37培养基是猪胚胎培养中应用最广泛、最成功的培养基。然而，尽管与其它培养基相比胚胎的发育得到了改进，但IVP猪胚胎的生存能力在IVC之后仍然被损害。一些报道认为葡萄糖在8细胞阶段前不易被早期猪胚胎所代谢，而在致密桑椹胚和胚泡期之间的胚胎中被大量使用(Flood等，1988)。在Kikuchi的研究中，在培养的前2天，用丙酮酸盐和乳酸盐取代NCSU37中的葡萄糖导致IVP猪胚胎的胚泡率为25.3％(Kukuchi等，2002)，这被我们本文的研究(平均IVP胚泡率为30％)所进一步证明。此外，对此序贯培养系统对猪HMC和ZF PA胚胎的第一次评估得到的胚泡率分别是17％和47％。有时，ZI PA的胚泡率甚至可达到90％的高水平(Du，未发表)。
统计分析
使用SPSS 11.0进行ANOVA分析。P＜0.05的概率被认为具有统计学显著性。
实施例3
从去脂的、体外成熟的卵母细胞产生的手工克隆猪胚泡的玻璃化
最近发表了通过离心而不需要随后的显微操作的猪胚胎去脂的非侵入方法(Esaki等2004 Biol Reprod.71，432-6)。
如前所述(Kuwayama等2005a；2005b)使用Cryotop(KitazatoSupply Co，Fujinomiya Japan)通过玻璃化进行胚胎/胚泡的深低温保藏。在进行玻璃化时，将胚胎/胚泡转移到平衡溶液(ES)中于39℃放置5-15分钟，平衡溶液由添加20％合成血清替代品(SSS)的TCM 199中含有7.5％(V/V)乙二醇(EG)和7.5％二甲基亚砜(DMSO)组成。在起初的收缩后，胚胎恢复到其最初的体积。将4～6个胚胎/胚泡转移到20ul玻璃化溶液(VS)的液滴中，所述玻璃化溶液由添加20％ SSS的TCM 199中含有15％(V/V)EG、15％(DMSO)和溶解的0.5M蔗糖组成。温育20秒钟后，胚胎装到Cryotop中并投入液氮。从暴露于VS到投入的过程在1分钟内完成。
通过将Cryotop直接浸入解冻溶液(TS)中1分钟来解冻胚胎/胚泡，所述解冻溶液由添加20％SSS的TCM199中含有1.0M的蔗糖组成，其后转移到稀释溶液(DS)中放置3分钟，所述稀释溶液由添加20％ SSS的TCM199中含有0.5M的蔗糖组成。为去除冷冻保护剂，胚胎/胚泡2次置于洗涤溶液(WS，添加20％ SSS的TCM199)中，每次5分钟。根据在添加10％牛血清(CS)的培养基中24小时恢复后的再膨胀率确定玻璃化胚泡的存活。
对体外成熟的猪卵母细胞使用非侵入性去脂方法，并在4次相同重复中研究去脂卵母细胞在孤雌激活后的进一步发育。卵母细胞随机地分成去脂和对照组。
对于去脂，卵母细胞在有50％牛血清(CS)存在下用1mg/ml链霉蛋白酶消化3分钟，并在添加20％CS的Hepes缓冲的TCM-199培养基中洗涤，这样导致部分透明带消化(图2a)。其后，在室温下，于添加2％CS、3mg/ml PVA和7.5μg/ml细胞松弛素B(CB)的Hepes缓冲的TCM-199培养基中离心(12000xg，20分钟)40-50个卵母细胞(图2b)。在2mg/ml链霉蛋白酶溶液中进一步消化完全去除离心的和完整的卵母细胞的透明带。
对于活化，两组中都使用85Kv/cm、80us的单直流电，其后用5μg/ml CB和10μg/ml放线菌酮(CHX)处理4小时。随后，所有的胚胎培养在改进的NCSU37培养基中。对第7天的胚泡进行玻璃化，并在38.5℃下使用Cryotop技术(Kuwayama等，RBM Online，发表中)加温。根据在添加10％CS的培养基中24小时恢复后的再膨胀率确定玻璃化胚泡的存活。在Hoechst染色后，确定两组中再膨胀胚泡的细胞数量。通过ANOVA分析比较所述结果。部分透明带消化和离心在173/192(90％)的卵母细胞中成功去脂。在去脂的和完整的卵母细胞之间没有发育至胚泡的差异(分别是28±7％对28±5％；P＞0.05)。然而，从去脂的卵母细胞得到的胚泡的存活率显著高于从完整的卵母细胞发育得到的胚泡的存活率(分别是85+6％对32±7％；P＜0.01)。从去脂的和完整的卵母细胞得到的再膨胀胚泡的平均细胞数量没有差异(分别是36±7对38±9；P＞0.05)。这些结果说明简单的去脂技术不妨碍激活的猪卵母细胞在体外的发育能力，并改善了所得胚泡的冷冻存活率而不显著损失细胞数量。
去脂后，两组卵母细胞的透明带都被完全去除。两组中都使用与上文相同的参数用于电激活。激活后第7天，确定胚泡率和胚泡细胞数量。
研究了对体外成熟的猪卵母细胞应用非侵入性去脂技术的可行性。90％(173/192)的卵母细胞被成功地去脂。如表3所示，在去脂的和完整的卵母细胞之间没有发育至胚泡的差异(分别是28±7％对28±5％；P＞0.05)。然而，从去脂的卵母细胞得到的胚泡的存活率显著高于从完整的卵母细胞发育得到的胚泡的存活率(分别是85+6％对32±7％；P＜0.01)。从去脂的或完整的卵母细胞得到的再膨胀胚泡的平均细胞数量没有差异(分别是36±7对38±9；P＞0.05)。
表3.从去脂的和完整的激活的卵母细胞得到的玻璃化-解冻胚胎的发育能力和冷冻存活率
  卵母细胞处理方法   激活的卵母细胞   胚泡率(％)   加温后再膨胀的胚泡(％)   再膨胀胚泡的平均细胞数量
  去脂的   173   28±7   85±6   36±7
  完整的   156   28±5   32±7   39±9
去脂卵母细胞的手工克隆
去脂的卵母细胞以5次重复用于HMC。非去脂卵母细胞的4次相同的重复用于HMC作为对照系统。重建后的第7天，两组产生的胚泡用Cryotop玻璃化。如通过PA产生的胚泡中所描述地确定再膨胀胚泡的存活率和细胞数量。
除非另有说明，所有的操作在调节到39℃的加热台上进行，所有用于操作卵母细胞的液滴都是20μl体积并用矿物油覆盖。对于体细胞核移植，应用在我们之前工作(Du等，2005)中描述的手工克隆(HMC)，其中具有一项改进：对于去脂和对照卵母细胞的去核，使用二分而不是三分。
简单来说，去除卵丘包围后，对照卵母细胞在溶解有3.3mg/ml链霉蛋白酶的T33中温育10秒钟。在卵母细胞在链霉蛋白酶溶液中开始变形前，将其取出并快速在T2和T20液滴中洗涤。离心后的去脂卵母细胞在3.3mg/ml链霉蛋白酶溶液中再消化5秒钟。
透明带被部分消化、扩张、软化的对照和去脂卵母细胞都在添加2.5μg/ml细胞松弛素B的T2液滴中排列。在立体显微镜监控下，使用Ultra Sharp Splitting Blades(AB Technology，Pullman，WA，USA)手工进行二分(图2c)。收集所得半个卵母细胞，并用5μg/mlHoechst 33342荧光染料在T2液滴中染色5分钟，其后放置到60mmFalcon Petri皿底部的1μl T2培养基液滴中，并覆油(每滴3-4个半个卵母细胞)。使用倒置显微镜和UV光，登记无染色质染色的半个卵母细胞(细胞质体)的位置。其后在立体显微镜下收集细胞质体并保存在T10液滴中。
如前所述(Kragh等，2005)，从单层中通过胰蛋白酶消化制备猪胎儿成纤维细胞。以2步进行融合，其中第二步也包括活化的起始。对于第一步，50％的可用细胞质体被转移到溶解有1mg/ml植物凝集素(PHA；ICN Pharmaceuticals，Australia)的T0中，放置3秒钟，其后快速滴到单个成纤维细胞上。结合后，细胞质体-成纤维细胞对在融合培养基(0.3M甘露醇和0.01％PVA)中平衡10秒钟并转移到融合室中。使用0.6KV/cm、700KHz的交流电(AC)将细胞质体-成纤维细胞对排列到融合室的金属丝上并使体细胞离金属丝最远(图2d)，其后使用2.0KV/cm的直流电融合9μs。电脉冲后，小心地从金属丝上移开细胞对，转移到T10液滴中并温育以观察是否发生融合。
第一次融合后大约1小时，每个细胞对在活化培养基内与另一个细胞质体融合。如上所述使用交流电和0.7KV/cm、80μs的单DC脉冲。在T10液滴中检测融合，其后重建的胚胎转移到添加了5μg/ml细胞松弛素B和10μg/ml放线菌酮的IVC0-2培养基(参见胚胎培养和评估)中。在38.5℃、5％ CO2，、5％ O2、90％ N2和最大湿度下温育4小时后，胚胎在培养前于IVC0-2培养基中洗涤3次。
表4.从去脂的和完整的卵母细胞得到的SCNT猪胚胎的玻璃化-解冻胚胎的发育能力和冷冻存活率
HMC组   重建胚胎的数量   胚泡率(％)*   加温后再膨胀的胚泡(％)*   再膨胀的胚泡的平均细胞数量*
  去脂的   240   21±6a   79±6b   41±7d
  完整的   150   23±6a   32±8c   39±5d
不同的上标表示显著性差异(p＜0.05)。
*：平均值±S.E.M。
通过在第7天时，胚泡率与对照HMC组比较，在使用去脂的卵母细胞的HMC中观察体外发育能力(分别是21±6％对23±6％；P＞0.05；表4)。从去脂的卵母细胞得到的克隆胚泡在玻璃化后的冷冻存活率显著高于从完整的卵母细胞发育的胚泡的冷冻存活率(分别是79±6％对32±8；P＜0.01)。
实施例4
化学辅助的手工去核(CAHE)以及与现有方法的比较
体外成熟41-42小时后，COC在添加0.4μg/ml秋水仙胺的相同溶液中进一步培养45分钟。其后通过在溶解有1mg/ml透明质酸酶的Hepes缓冲的TCM-199中吹打来去除卵丘细胞。从此处开始(除非另有说明)，所有的操作在调整到39℃的加热台上进行。所有用于操作卵母细胞的液滴都是20μl体积，并用矿物油覆盖。
在本文的其它地方描述了HMC程序的基本步骤。简单来说，没有卵丘细胞的卵母细胞在溶解有3.3mg/ml链霉蛋白酶的T33(T代表Hepes缓冲的TCM199培养基；数字表示CS添加的百分比(v/v)，在此是33％)中温育20秒钟。当透明带部分裂解并且卵母细胞发生轻微变形时，取出卵母细胞并在T2和T20液滴中快速洗涤。在添加2.5μg/ml细胞松弛素B(CB)的T2液滴中排列9个卵母细胞。使用细拉并用火磨光的玻璃吸液管，将卵母细胞旋转以找到表面上亮的突出锥和/或牢固结合的极体，并在立体显微镜监控下用显微刀片(ABTechnology，Pu11man，WA，USA)手工进行定向的二分。将少于一半的细胞质(接近突出或PB)与剩余部分分离(图3)。将液滴中所有9个卵母细胞二分后，收集较大部分和较小部分(具有突出或结合的PB)并分别置于分离的T2液滴中。
没有秋水仙胺处理的定向手工去核(OHE)
除了不使用秋水仙胺预温育外，所有步骤与上文描述的步骤相似。
去核的随机手工二分(RHE)
从本组的预处理中也省略秋水仙胺预温育。去除卵丘细胞后，如上所述使用链霉蛋白酶部分消化透明带。在添加2.5μg/ml CB的T2液滴中使用随机手工等二分。选择所有的半-卵母细胞并在T2液滴中用10μg/ml Hoechst 33342染色10分钟，其后置于用矿物油覆盖的1μl T2培养基液滴中(每滴中3个半-卵母细胞)。使用倒置显微镜和UV光，登记无染色质的半-卵母细胞(即，细胞质体)的位置。随后在立体显微镜下收集这些细胞质体并在进一步操作前保存在T2液滴中。
融合和活化的起始
如前所述(Kragh等，2005，Du等，2005)制备猪胎儿成纤维细胞。融合以2步进行，其中第二步也包括起始活化。对于第一步，使用细拉并用火磨光的玻璃吸液管，将大约100个体细胞置于T2液滴中，20-30个细胞质体置于T10液滴中。简短平衡后，每组合3个细胞质体的组转移到1mg/ml植物凝集素(PHA)中放置2-3秒钟，随后各自快速滴到单个体细胞上。结合后，再次取出细胞质体-体细胞对并转移到融合培养基(添加0.01％(w/v)PVA的0.3M甘露醇)中。使用0.6KV/cm、700KHz的交流电(AC)，平衡的细胞对被排列到融合室(BTX显微镜载片0.5mm融合室，450型；BTX，SanDiego，CA)的一条金属丝上，而体细胞离金属丝最远，然后使用2.0KV/cm的单直流电(DC)脉冲融合9μs。其后小心地将细胞对从金属丝上移到T10液滴中，并进一步温育以观察是否发生融合。
融合后大约1小时，在活化培养基(0.3M甘露醇、0.1mM MgSO4、0.1mM CaCl2，并添加0.01％[w/v]PVA)中分别平衡融合的细胞对和剩余的细胞质体。通过使用0.6KV/cm AC，一个细胞对和一个细胞质体被排列到融合室的一条金属丝上，并且融合的细胞对与金属丝接触。第二次融合和起始活化中使用0.86KV/cm、80微秒的单DC脉冲。在T10液滴中温育后检查融合。
传统克隆(TC)
如前所述(Chen等，1999；Zhang等，2005)使用Diaphot 200倒置显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)进行显微操作。简单来说，体外成熟42-44小时后，如上所述去除卵丘细胞。所有的操作在调整到39℃的加热台上进行。在60mm培养皿的盖的中心区域制作单个的50μl显微操作溶液液滴并用矿物油覆盖。包括20-30个卵母细胞和胎儿成纤维细胞的组置于相同的液滴中。温育15-30分钟后，使用持针(内径＝25-35μm，外径＝80-100μm)获取卵母细胞。在放置到5-6点钟的位置后，用斜口的注射针(内径＝20μm)吸取并去除第一极体和据推测含有中期板的邻近细胞质(大约是卵母细胞总体积的10％)。然后通过同一个裂口将胎儿成纤维细胞注入到该空间中。核移植(NT)后，重建的偶联体转移到用矿物油覆盖的培养基液滴中以恢复1-1.5小时，直到进行融合和活化。恢复培养基是添加4mg/mL BSA和7.5μg/mL CB的NCSU-23。重建的偶联体在融合培养基中温育4分钟。使用细拉并磨光的玻璃毛细管手工排列偶联体以使得接触平面与电极平行。其后使用单个、30微秒、2.0kV/cm的直流电脉冲。在添加7.5μg/mL CB的IVC0-2(在“胚胎培养和评估”中有说明)的液滴中培养30-60分钟后，在立体显微镜下检查融合结果。融合的偶联体在活化溶液中进行第二次脉冲。在T10中温育30分钟后，它们被转移到IVC0-2中以评估体外发育。
活化的进一步步骤
活化脉冲后，所有的重建胚胎在添加5μg/ml CB和10μg/ml放线菌酮的IVC0-2中，于38.5℃、5％ CO2、5％ O2，、90％ N2和最大湿度下温育。
胚胎培养和评估
4小时后，洗涤所有重建的和活化的胚胎并放置在Nunc 4孔培养皿内的400μl用矿物油覆盖的IVC0-2中，于38.5℃、5％CO2、5％O2，、90％ N2和最大湿度下培养。IVC0-2是改进的NCSU37培养基(Kikuchi等，1999)，其从第0天(活化的那一天)至第2天含有4mg/mlBSA、0.17mM丙酮酸钠和2.73mM乳酸钠。在第2天至第7天用5.5mM葡萄糖代替丙酮酸钠和乳酸钠(IVC2-7)。所有的无透明带胚胎在Well of the Well(WOW)系统(Vajta，2000))中、在与上文使用相同的培养基和混合气体中培养，并在第2天在不从WOW中移出胚胎的情况下小心地更换培养基。以15-30个为一组，在4孔皿的孔内、使用相同的培养基的量和组成培养TC胚胎。分别在第2天和第7天登记卵裂和胚泡率。为确定总细胞数量，在含10μg/μl Hoechst 33342的少量(＜2μl)甘油中固定胚泡并涂在玻璃显微镜载玻片上。在室温下染色几小时后，在具有落射荧光结合和UV-2A滤片的Diaphot 200倒置显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)下观察胚胎。
CAHE对OHE的效率比较
通过使用一共620个卵母细胞，在12次相同的重复中测试CAHE的效率和可靠性。成熟41-42小时后，卵母细胞进行秋水仙胺温育。在部分链霉蛋白酶消化后检测到突出锥和/或牢固结合的PB的卵母细胞中进行定向的二分。登记二分的卵母细胞对全部卵母细胞以及存活的卵母细胞对二分的卵母细胞的百分比。随后分别收集推定的细胞质体和核体，并用Hoechst 33342(10μg/ml在T2中，10分钟)染色。在倒置荧光显微镜下检测染色质的存在与否(图4)。
使用一共414个卵母细胞在9次相同重复中研究OHE的效率和可靠性。体外成熟42-43小时后，在部分链霉蛋白酶消化后检测到突出锥和/或PB的成熟卵母细胞中进行定向的二分。根据上一段中描述的方法评估结果。
结果显示在表5中。
表5.化学辅助的手工去核(CAHE)和定向手工去核(OHE)的效率
  组   处理的卵母细胞的数量   二分的/全部卵母细胞(％)*   细胞质体/二分(％)*   细胞质体/全部卵母细胞(％)*
  CAHE   620   96±1a   94±2b   90±3c
  OHE   414   92±2a   88±3b   81±4d
*：平均值±A.D.(绝对偏差)
不同的上标表示差异(P＜0.05)
在各组间，未观察到有关允许定向二分的突出锥和/或结合的极体或裂解率的差异，而且每个二分的卵母细胞的成功去核率也是相似的。然而，通过细胞质体比全部卵母细胞数量而测量的该程序的整体效率在CAHE中比在OHE组中高。
CAHE、RHE和TC产生的胚胎的体外发育比较
在8次重复中，一共468个体外成熟的卵母细胞随机分配并进行上述的3种去核程序。登记细胞质体和供体成纤维细胞的融合率。如前文所述活化并培养重建的胚胎。分别在第2天和第7天测定卵裂和胚泡率。在各组之间比较发育胚泡的立体显微特征。
表6.从化学辅助的手工去核(CAHE)、随机手工去核(RHE)和传统的、基于显微操作器的克隆(TC)得到的胚胎的发育能力。
  组   重建胚胎的数量   融合率(％)   卵裂率(％)*   胚泡率(％)*   胚泡的细胞数量(第7天)
  CAHE   150   87±7a   97±6b   28±9d   57±6e
  RHE   86   81±4a   87±8b   21±9d   49±7e
  TC   178   81±10a   69±9c   21±6d   53±6e
*：平均值±A.D.(绝对偏差)
不同的上标表示差异(P＜0.05)
CAHE、RHE和TC之间的去核后的融合率是相似的。在前2组中，第二次融合和活化导致可忽略(＜1％)的损失。尽管TC产生比其它2组低的每重建胚胎的卵裂率，但这种差异未出现在每重建胚胎的胚泡率中。
立体显微特征(尺寸；内细胞团的估计比例和轮廓)在组间没有差异。从CAHE、RHE和TC产生的胚泡的细胞数量(57±6对49±7对53±6)显示在表6，图5和图6中。
统计分析
使用微软XP Excel软件进行AVEDEV，使用SAS系统进行ANOVA。P＜0.05的概率认为是具有统计学显著性。
实施例5
小猪的生产
手工克隆(HMC)
体外成熟开始后41小时，通过在含1mg/ml透明质酸酶的Hepes缓冲的TCM 199中反复吹打来去除COC的卵丘包埋。从此开始(除了另有说明的地方)，所有的操作在调节到39℃的加热台上进行，所有用于操作卵母细胞的液滴都是20μl体积并用矿物油覆盖。卵母细胞在溶解有3.3mg/ml链霉蛋白酶的T33(T代表Hepes缓冲的TCM199培养基；数字表示牛血清(CS)添加的百分比(v/v)，在此是33％)中简短温育20秒钟，并随后在T2和T20液滴中快速洗涤。具有部分消化但仍可见的透明带的卵母细胞在添加2.5μg/ml细胞松弛素B(CB)的T2液滴中排列成行。使用细拉并用火磨光的玻璃吸液管旋转卵母细胞以找到表面上的极体(PB)，在立体显微镜监控下用显微刀片(AB Technology，Pullman，WA，USA)手工进行定向二分。这样，少于一半的卵母细胞细胞质(邻近突出或PB)从剩余的推定细胞质体上被去除。细胞质体在T2液滴中洗涤2次并收集在T10液滴中。
如前所述(Kragh，P.M.等Theriogenology 64，1536-1545(2005)制备胎儿成纤维细胞。
融合以2步进行，其中第二步也包括起始活化。对于第一步，使用推定为细胞质体的一半。使用细拉并用火磨光的玻璃吸液管，将10个细胞质体作为一组转移到1mg/ml植物凝集素(PHA；ICNPharmaceuticals，Australia)中放置3秒钟，随后分别快速滴到沉淀在T2液滴中的少数几个成纤维细胞中的一个上。结合后，10个细胞质体-成纤维细胞对在融合培养基(0.3M甘露醇和0.01％PVA)中平衡10秒钟。使用0.6KV/cm、700KHz的交流电(AC)，细胞对被排列到融合室(BTX显微镜载片0.5mm融合室，450型；BTX，SanDiego，CA，USA)的金属丝上，而体细胞离金属丝最远，然后使用2.0KV/cm的直流电(DC)融合9μs。在电脉冲后，小心地将细胞对从金属丝上移开，转移到T10液滴中并温育以观察是否发生融合。
第一次融合后大约1小时，融合的细胞对和剩余的细胞质体在活化培养基液滴(0.3M甘露醇、0.1mM MgSO4、0.1mM CaCl2和0.01％PVA)中分别平衡。在0.6KV/cm AC下，10个为一组将细胞质体-融合的细胞对顺次排列到金属丝上，其中融合的细胞对远离金属丝。0.7KV/cm、80μs的单DC脉冲用于第二次融合和起始活化。其后将细胞对从金属丝上移开并小心地转移到T10液滴中以检查融合。在添加5μg/mlCB和10μg/ml放线菌酮的PZM-3培养基中，于38.5℃、5％ CO2、5％ O2和90％ N2和最大湿度下，温育重建的胚胎4小时，其后在培养前彻底洗涤。
传统克隆(TC)
使用Diaphot 200倒置显微镜(Nikon，Tokyo，Japan)进行显微操作。体外成熟42-44小时后，如上所述去除卵丘细胞。所有的操作在调整到39℃的加热台上进行。在60mm培养皿的盖的中心区域制作单个的50μl显微操作溶液(添加4mg/mL BSA和7.5μg/mL CB的NCSU-23)液滴并用矿物油覆盖。20-30个卵母细胞和胎儿成纤维细胞的组置于相同的液滴中，在温育15-30分钟后，使用持针(内径＝25-35μm，外径＝80-100μm)获取一个卵母细胞。在放置到5-6点钟的位置后，用斜口的注射针(内径＝20μm)吸取并去除第一极体和据推测含有中期板的邻近细胞质(大约是卵母细胞总体积的10％)。然后通过同一个孔口将胎儿成纤维细胞注入该空间。核移植(NT)后，重建的偶联体转移到用矿物油覆盖的培养基液滴中以恢复1-1.5小时，直到进行融合和活化。重建的偶联体在融合培养基中温育4分钟。使用细拉并磨光的玻璃毛细管手工排列偶联体以使得接触平面与电极平行。其后使用单个、30微秒、2.0kV/cm的直流电脉冲。在添加7.5μg/mL CB的PZM-3培养基液滴中培养30-60分钟后，在立体显微镜下检查融合结果。融合的偶联体在活化溶液中进行第二次脉冲。在T10中温育30分钟后，它们被转移到PZM-3培养基中以评估体外发育。
胚胎培养和转移
重建的胚胎在添加4mg/ml BSA的PZM-3培养基(Dobrinsky，J.T.等Biol Reprod 55，1069-1074(1996))中培养。从HMC产生的无透明带的胚胎在改进的WOW系统(Feltrin，C.等Reprod FertilDev 18，126(2006))中培养。使用两种不同的细胞系(HMC使用LW1-2，TC使用LW2)作为HMC和TC的核供体细胞从而鉴定来自两种程序的后代。LW1-2和LW2分别来源于杂交(与杜洛克猪)和纯种丹麦兰德瑞斯猪的胎儿。
在体外培养7天后的平均每重建胚胎胚泡率是50.1±2.8％(平均值±S.E.M)，在HMC中显著高于(p＜0.01)我们实验室平行进行的TC(表7)，并且也是在猪克隆中已经报道的结果中最高的。
表7.
从手工克隆和传统克隆产生的胚胎的体外发育
 组   体细胞供体   重建胚胎的数量   卵裂率(％)   胚泡率(％)
 HMC   LW1-2   643   83.7±4.90a   50.06±2.80a
 TC   LW2   831   74.86±13.16b   28.98±2.84b
a.b.栏中不同上标的值具有显著差异(p＜0.05)。
*：平均值±S.E.M.
在动情周期的第4或5天，将从HMC和TC产生的混合胚泡通过外科手术转移到11只自然同步的大母猪中。通过超声波检查诊断出6个(55％)受体怀孕，2个流产，并且在撰写本文时2只大母猪分别生了3只和10只小猪。据我们所知，10只克隆小猪的产仔数是至今猪克隆中获得的最大产仔数。它们都健康并表现正常，除了一只显示出一个前肢末端关节的僵硬弯曲。％)
初步的结果说明当转移相似阶段的胚胎时，动情周期第4天的受体比第5天的受体更好地实现怀孕。
表8.克隆的猪胚胎的体内发育
微卫星分析
使用10个不同的猪微卫星标志的亲本分析确证了克隆小猪和用于核移植的供体细胞的相同基因型。鉴定是通过分别对来自每个新生小猪、代用大母猪以及源自代表丹麦兰德瑞斯猪和杜洛克猪的2个胎猪的供体皮肤成纤维细胞LW1-2和LW2的基因组DNA的微卫星分析完成的。位于不同猪染色体上的10个多态性微卫星基因座(SW886、SW58、SW2116、SW1989、SW152、SW378、KS139、SO167、SW1987、SW957)通过3色多重PCR扩增，产物使用程序Gene Mapper 3.7在GeneticAnalyzer 3130 X1(Applied Biosystems)上分析。
对于第二个受体，每胚胎产仔率(22％)是至今在猪克隆中已经报道中最高的(Walker，S.C.等Cloning Stem Cells 7，105-112(2005)；Hoshino，Y.等Cloning Stem Cells 7，17-26(2005))。在HMC(17％)和TC(15％)中得到可比较的活产/转移胚胎效率。
统计分析
使用独立样品t检验，通过SPSS 11.5评估实验组之间的差异。P＜0.05被认为具有显著性。
实施例6
可用于产生转基因的非人类哺乳动物作为单纯性大疱性表皮松解症的疾病模型的转基因的一个实例是人角蛋白14基因，其包括下文中粗体所示的突变。
整合到猪胎儿成纤维细胞(供体细胞)的转基因序列包括人角蛋白14启动子和包括起始、终止密码子(粗体)以及由S
Figure 2006800363687_1
rensen等，JInvest Dermatol.1999 Feb；112(2)：184-90所描述的引起疾病的突变(粗体并标下划线)的角蛋白14 cDNA。将该片段克隆到pN1-EGFP(clontech)中，其中包含polyA信号用于基因表达，和新霉素筛选基因以选择整合了转基因的细胞克隆。
Figure S2006800363687D00431
Figure S2006800363687D00441

Claims (22)

1.细胞核移植方法，其包括以下步骤：
a.构建具有通过酶促被部分除去透明带的至少一个猪卵母细胞，
b.将该猪卵母细胞分成2或3部分，从而获得至少一个细胞质体，
c.构建具有所需遗传特性的猪成纤维细胞供体细胞或猪成纤维细胞细胞核，
d.将至少一个细胞质体与该猪成纤维细胞供体细胞或膜包围的猪成纤维细胞细胞核融合，
e.得到重建的猪胚胎，
其中所述方法不包括在非人类动物体上进行的外科手术步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述猪卵母细胞被分成3部分，从而获得2个细胞质体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过突变、缺失和／或插入对所需一个或多个基因进行修饰而获得猪成纤维细胞供体细胞或猪成纤维细胞细胞核的所需遗传特性。
4.根据权利要求1所述的方法，其中融合方法选自化学融合、电融合和生物融合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中融合以至少一步进行。
6.根据权利要求1所述的方法，其中融合以至少两步进行。
7.根据权利要求4所述的方法，其中融合的第一步位于至少一个细胞质体和猪成纤维细胞供体细胞或膜包围的猪成纤维细胞细胞核之间。
8.根据权利要求4所述的方法，其中融合的第二步位于权利要求7的至少一个融合对和至少一个细胞质体之间。
9.产生遗传修饰的或转基因的猪的方法，其包括如下步骤：
a.构建具有通过酶促被部分除去透明带的至少一个猪卵母细胞，
b.将该猪卵母细胞分成2或3部分，从而获得具有核的卵母细胞和至少一个细胞质体，
c.构建具有所需遗传特性的猪成纤维细胞供体细胞或猪成纤维细胞细胞核，
d.将至少一个细胞质体与该猪成纤维细胞供体细胞或膜包围的猪成纤维细胞细胞核融合，
e.得到重建的猪胚胎，
f.活化该重建的猪胚胎进行有丝分裂以形成多细胞猪胚胎，
g.培养所述多细胞猪胚胎，以及
h.将所述培养的猪胚胎转移到猪寄主中，使得该猪胚胎发育成遗传修饰的猪胎儿，
其中所述方法不包括在非人类动物体上进行的外科手术步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤b中所述猪卵母细胞被分成3部分，从而获得至少两个细胞质体。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中用于活化重建的猪胚胎的方法选自如下构成的组：电脉冲、化学诱导休克、升高胞内二价阳离子水平和减少磷酸化。
12.根据权利要求9或10所述的方法，其中步骤d)和f)顺次或同时进行。
13.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述多细胞猪胚胎在体外培养。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多细胞猪胚胎在序贯培养基中进行培养。
15.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述多细胞猪胚胎在转移到猪寄主前被深低温保藏。
16.根据权利要求15所述的方法，其中多细胞猪胚胎处于胚泡期。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述猪胚胎在玻璃化前被培养至胚泡期。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述猪胚胎在玻璃化前被培养至胚泡期。
19.通过权利要求9所限定的方法得到的遗传修饰的猪的组织细胞，其中所述组织细胞具有来自至少3个不同母源的线粒体。
20.根据权利要求19所述的遗传修饰的猪的组织细胞，在所述细胞内具有来自至少4个不同母源的线粒体。
21.培养重建的猪胚胎的方法，其包括如下步骤：
a.构建具有通过酶促被部分除去透明带的至少一个猪卵母细胞，
b.将该卵母细胞分成2或3部分，从而获得具有核的猪卵母细胞和至少一个细胞质体，
c.构建具有所需遗传特性的猪成纤维细胞供体细胞或猪成纤维细胞细胞核，
d.将至少一个细胞质体与该猪成纤维细胞供体细胞或膜包围的猪成纤维细胞细胞核融合，
e.得到重建的猪胚胎，
f.活化该重建的猪胚胎进行有丝分裂以形成多细胞猪胚胎，
g.培养所述多细胞猪胚胎，
其中所述方法不包括在非人类动物体上进行的外科手术步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述猪胚胎在序贯培养基中培养。
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