CN108029676A - 细胞核质体的冷冻方法 - Google Patents

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吴克良
赵涵
马金龙
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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了一种细胞核质体的冷冻方法，包括步骤：备用透明带的制备、细胞核质体的获得、细胞核质体的装载以及核质体的冷冻。本发明方法利用透明带或人工合成的透明带样凝胶结构为载体，核质体的冷冻损伤小，复苏率高。

Description

细胞核质体的冷冻方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及细胞核质体的冷冻。
背景技术
细胞冷冻技术是生物领域的常用技术，可以使细胞中的遗传物质以及细胞质物质得以长期保存，在合适的时候复苏并使用，延长细胞使用期，提高细胞使用效率。但是对于一些水分较多的细胞，如卵母细胞等体积大的细胞，冷冻会导致细胞产生功能性损伤，使机体损伤或退变，直接影响了卵母细胞整体核物质的利用效率。冷冻对体积较大细胞产生损伤的主要原因是冷冻过程中过多的水分更加容易形成冰晶，从而对细胞产生不可逆的损伤而使得无法实现有效保存遗传物质的目的。因此，本领域中迫切需要一种能够冻存此类细胞核物质的方法。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种细胞核质体冷冻及使用方法，可以充分地保存并利用好遗传物质。具体地，遗传物质的主要成分大部分集中在细胞核部分，如果能够将多余的胞质部分去除，仅仅含有细胞核以及少量的细胞质，则其冷冻的效果会好很多。
本发明的核质体由细胞核以及附带的少量细胞质组成，所述少量细胞质的量为保存遗传物质以及冷冻复苏后不影响细胞功能的量；本领域技术人员根据经验可以掌握该量。
本发明的细胞核质体的冷冻方法包括：
⑴备用透明带的制备：将非人哺乳动物的卵子或胚胎的透明带里的胞质部分去除；优选地，利用显微操作方式去除胞质部分；
或者所述备用透明带为人工合成的透明带样凝胶结构；
⑵细胞核质体的获得：将非人哺乳动物细胞中的部分细胞质去除，得到核质体；优选地，使用显微操作针进行分离；
⑶细胞核质体的装载：将分离出来的核质体注射进步骤⑴制备的备用透明带中；
⑷装载后的核质体的冷冻：将装有核质体的透明带按照卵子或胚胎冷冻的方式进行冷冻。
优选地，所述方法还包括：⑸冷冻核质体的复苏：当需要使用核质体的时候，将冷冻的装载有核质体的透明带按照卵子或胚胎的复苏方式进行复苏。
优选地，本方法中，所述非人哺乳动物为小鼠、仓鼠、兔子或猪。
优选地，步骤⑴中所述卵子可以是MII期卵子、MI期卵子、GV期卵子或退变的卵子。
优选地，步骤⑴中所述胚胎可以是正常或非正常受精来源的优胚、非优胚或囊胚。
优选地，步骤⑴中，使用吸取或挤压方式进行显微操作。
优选地，步骤⑵中，所述非人哺乳动物细胞为体细胞、卵母细胞或卵子。
优选地，步骤⑵中，所述核质体可以为第一极体、第二极体、纺锤体或第二极体对应核质体。
其中，第二极体对应核质体，是卵子激活后所特有的现象，指第二次减数分裂会形成第二极体以及对应的细胞核，对应的细胞核分离出来就是核质体。
优选地，步骤⑷中所述冷冻的方式可以为玻璃化或程序化冷冻法。
优选地，步骤⑸中所述复苏的方式可以为玻璃化或程序化复苏法。
去除透明带里的胞质部分、将细胞中部分细胞质去除、将核质体注射进透明带中这些操作都是本领域常规操作。
利用本发明所述的方法进行核质体的冷冻及使用，具有以下明显的优势：
(1)核质体的体积小，冷冻复苏率高，冷冻损伤小；
(2)可以冷冻保存数年时间而不影响核质体的活性；
(3)可以分批进行解冻、分批重构，不需要考虑细胞在体外只能维持1天或几天的活力；
(4)冷冻时核质体状态已经明确，重构操作时可以更加灵活地进行时间规划，最大的实现核质的同步性；
(5)利用透明带作为载体，含水量少，冷冻和复苏过程可以容易地进行操作，避免了样本的技术性丢失。
本发明的方法为细胞冻存，特别是含水量大的细胞的核物质的冻存提供了新的途径，保证细胞遗传物质不丢失、损伤小。本发明的方法可以应用于哺乳动物的细胞冻存，如人的卵母细胞冻存。
附图说明
图1为备用透明带制备的示意图，其中，1为兔卵子透明带上打的孔，2为卵子固定针，3为胚胎活检针或挤压针；
图2为备用透明带制备的示意图，其中，4为兔卵子透明带，5为兔卵子的胞质部分；
图3为获取核质体的示意图，其中，6为兔卵母细胞的第一极体；
图4表示将核质体第一极体注入备用透明带的示意图；
图5表示含有核质体的透明带的冷冻示意图，其中，7为冷冻载体，8为含有核质体的透明带，9为冷冻液。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。如无具体说明，下述实施例中使用的仪器、试剂均为本领域常规仪器、试剂，所使用的方法也是本领域的常规操作方法。本领域技术人员根据下文内容可以毫无疑义地实施所述内容并获得对应结果。
以下实施例中所使用的动物卵子、胚胎等均来自本单位饲养动物。这些材料也是本领域的常规实验材料，可以通过商购或自培养的方式获得。
实施例1：
⑴如图1和图2所示，用卵子固定针2固定兔的MII期卵子，在卵子的透明带上打孔1，用挤压针3通过挤压的方式去除卵子胞质部分5，获得备用透明带4；
⑵如图3所示，将兔卵母细胞的第一极体6使用显微操作针分离出来，得到核质体；
⑶如图4所示，将分离出来的第一极体6注射进步骤⑴所制备的备用透明带4中；
⑷如图5所示，采用玻璃化冷冻的方法，在冷冻载体7上利用冷冻液9(Ivitri)将含有第一极体的透明带8冷冻起来。
在需要使用时，将冷冻的含有第一极体的透明带采用玻璃化解冻方法(根据解冻液生产商提供的方法即可)进行复苏；然后将新鲜的兔卵子的纺锤体去除，并采用仙台病毒融合的方式与复苏的第一极体进行融合形成重构的卵子。本次实验共冻存20枚兔第一极体的核质体，利用上述复苏后，20枚均存活且功能完整。
本实施例中的附图为方法过程的示意图，其所代表的意义同样可以用于其它实施方式中。
实施例2：
⑴将小鼠GV卵子用挤压的方式去除卵子胞质部分，获得备用透明带；
⑵将小鼠卵子的第一极体使用显微操作针分离出来，获得核质体；
⑶将分离出来的第一极体注射进步骤⑴所制备的备用透明带中；
⑷采用玻璃化冷冻的方法，在冷冻载体上利用冷冻液将含有第一极体的透明带冷冻起来。
本次实验共冷冻16枚第一极体的核质体。之后，采用玻璃化解冻方法进行复苏，然后将新鲜小鼠卵子的纺锤体去除，并采用仙台病毒融合的方式与复苏后的第一极体进行融合形成重构的卵子。经检查，这些重构的卵子形态和功能正常，说明本次冷冻的第一极体没有受到损伤，该冷冻方法安全可靠。
实施例3：
⑴将仓鼠卵裂期胚胎用挤压的方式去除卵子胞质部分，获得备用透明带；
⑵将仓鼠卵子的第一极体使用显微操作针分离出来，得到核质体；
⑶将分离出来的第一极体注射进步骤⑴所制备的备用透明带中；
⑷采用玻璃化冷冻的方法，在冷冻载体上利用冷冻液将含有第一极体的透明带冷冻起来。
本次实验共冷冻了22枚第一极体。1个月后，将冷冻的含有第一极体的透明带采用玻璃化解冻方法进行复苏；将新鲜的仓鼠卵子的纺锤体去除，并采用仙台病毒融合的方式与复苏的第一极体进行融合形成重构的卵子。经检验，仅一枚卵子重构失败，其它重构卵子的形态和功能完全正常。
实施例4：
⑴将猪MII期卵子用挤压的方式去除卵子胞质部分，获得备用透明带；
⑵将另取的猪卵子的第二极体使用显微操作针分离出来，得到核质体；
⑶将分离出来的第二极体注射进步骤⑴所制备的备用透明带中；
⑷采用玻璃化冷冻的方法将含有第二极体的透明带冷冻起来。
本次实验共冷冻12枚第二极体。20天后，将冷冻的含有第二极体的透明带采用玻璃化解冻方法进行复苏；将新鲜的猪卵子受精后的第二极体及对应核质体去除，并采用仙台病毒融合的方式使其与复苏的第二极体进行融合以形成重构的受精卵。经检验，这些重构受精卵形态正常，能够正常分裂和发育并形成胚胎。
实施例5：
⑴将小鼠MII卵子用挤压的方式去除卵子胞质部分，获得备用透明带；
⑵将另取的小鼠卵子的第二极体对应核质体使用显微操作针分离出来；
⑶将分离出来的第二极体对应核质体注射进步骤⑴所制备的备用透明带中；
⑷采用玻璃化冷冻的方法将含有第二极体对应核质体的透明带冷冻起来。
此次实验共冷冻25份样品。15天后，将冷冻的含有第二极体对应核质体的透明带采用玻璃化解冻方法进行复苏；将新鲜的小鼠卵子受精后的第二极体对应核质体去除，并采用仙台病毒融合的方式使其与复苏的第二极体对应核质体进行融合形成重构的受精卵。经培育，有24个重构的受精卵发育成胚胎，说明这些冷冻样品的功能没有受到任何影响。
实施例6：
⑴将仓鼠MII卵子用挤压的方式去除卵子胞质部分，获得备用透明带；
⑵将另取的仓鼠卵子的第二极体及对应核质体使用显微操作针分离出来；
⑶将分离出来的第二极体及对应核质体注射进步骤⑴所制备的备用透明带中；
⑷采用玻璃化冷冻的方法将含有第二极体及对应核质体的透明带冷冻起来，备用。
此次共冷冻18份样品。15天后，将冷冻的含有第二极体及对应核质体的透明带采用玻璃化解冻方法进行复苏；将新鲜的仓鼠卵子受精后的第二极体及对应核质体去除，并采用仙台病毒融合的方式使其与复苏的核质体进行融合形成重构的受精卵。经培育，这些重构的受精卵全部培育成胚胎，说明这些核质体在冷冻过程中没有受到影响。

Claims (10)

1.一种细胞核质体的冷冻方法，包括：
⑴备用透明带的制备：将非人哺乳动物的卵子或胚胎的透明带里的胞质部分去除；
或者所述备用透明带为人工合成的透明带样凝胶结构；
⑵细胞核质体的获得：将非人哺乳动物细胞中的部分细胞质去除，得到非人哺乳动物细胞的核质体；优选地，使用显微操作针进行分离；
⑶细胞核质体的装载：将分离出来的核质体注射进步骤(1)制备的备用透明带中；
⑷装载后的核质体的冷冻：将装有核质体的透明带按照卵子或胚胎冷冻的方式进行冷冻。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：⑸冷冻核质体的复苏：当需要使用核质体的时候，将冷冻的装有核质体的透明带按照卵子或胚胎的复苏方式进行复苏。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述非人哺乳动物为小鼠、仓鼠、兔或猪。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤⑴中所述卵子是MII期卵子、MI期卵子、GV期卵子或退变的卵子。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤⑴中所述胚胎是正常或非正常受精来源的优胚、非优胚或囊胚。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤⑴中，利用显微操作方式去除胞质部分；优选地，使用吸取或挤压方式进行显微操作。
7.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤⑵中，所述非人哺乳动物细胞为体细胞、卵母细胞或卵子。
8.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤⑵中，所述核质体为第一极体、第二极体、纺锤体或第二极体对应核质体。
9.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤⑷中，所述冷冻方式为玻璃化或程序化冷冻法。
10.根据权利要求3所述的方法，其中，步骤⑸中，所述复苏方式为玻璃化或程序化复苏法。
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