CN102138552A - 一种冷冻猪精子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冷冻保存猪精子的方法，出人意料的，在冷冻过程中使用9(w/v)％的低密度白蛋白进行处理能显著提高冷冻解冻后猪精子DNA的完整性；也能显著改善冷冻解冻后猪精子体外受精(IVF)率。

Description

一种冷冻猪精子的方法

技术领域

本发明涉及用于提高动物精原干细胞增殖率的培养液体系和使用方法，可使动物精原干细胞在短期内大量增殖。

背景技术

在猪精液的冷冻过程中，包括稀释液的选用、精子冷冻和复苏过程的处理技术等，其首要目标是阻止在精子细胞内部形成足以使精子致死的冰晶结构，同时提高冻后精子活率，尽量避免冷冻一解冻过程中对精子顶体及质膜的损伤。Pace等用超速离心的方法提纯卵黄，发现蛋黄中的一种低密度成分对精子具有冷冻保护作用。卵黄中的低密度成分主要是由低密度脂蛋白(10w delasity lipoprotein，LDL)组成，它在精子冻融过程中可以抵御低温打击，提高精子活率、顶体完整率和质膜完整性。Demianowicz等和Moussa等研究证实卵黄中的低密度脂蛋白具有冷冻保护作用。Crahaml[3]也曾指出，在精子冻融过程中，LDL可以黏附在精子细胞膜上，从而保护精子质膜的完整性。在牛冷冻精液的研究方面，Moussa等曾以8％(w/v)的LDL代替卵黄，冷冻，解冻后精子活率以及运动特性均有所提高。

在精子冷冻保存中，往往加入蛋黄或牛奶以降低在向5℃降温过程中精子遭受冷休克的受损程度。但是蛋黄中的某些成分可抑制精子呼吸，降低精子活率，而且添加蛋黄后严重影响冷后精子品质的检测。研究证明[7]，蛋黄中的高密度脂蛋白(highdensity lipoprotein.HDL)可诱导精子膜上的胆固醇外流，从而导致提前获能或出现一些获能样变化。因此，国外一直在致力于研究蛋黄中对精子真正起保护作用的有效成分及保护机制，试 图以其中的有效成分完全替代蛋黄。近几年研究认为，蛋黄中对精子膜起保护作用的有效成分是低密度脂蛋白(LDL)，且认为LDL以两种可能得机制保护精子：一种机制是，LDL可使蛋黄发生凝胶化，LDL外膜的磷脂释放出来在精子膜表面形成一层保护膜，还可代替精子膜上的一些磷脂，从而降低精子膜相位转变温度；另一种机制是，LDL可与精浆蛋白快速、特异地结合，从而阻止精浆蛋白诱导的精子膜胆固醇和磷脂外流。但是，LDL用于精子冷冻保存的探索研究主要集中在牛上，而且通常所获得的猪精子冷冻解冻后猪精子DNA的完整性不高，此外冻解冻后猪精子体外受精(IVF)率也不高。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种冷冻保存猪精子的方法。为了实现上目的，本发明采取如下技术方案：

一种冷冻保存猪精子的方法，包括如下步骤：

采集猪精子，除去精清；

加入冷冻基础液，在冰箱中进行预冻；

然后在液氮中进行冷冻

其特征在于所述的冷冻基础液中包含9％(w/v)低密度脂蛋白。

在其中一个实施方式中，所述低密度脂蛋白提取自新鲜鸡蛋。

在其中一个实施方式中，所采集的精子活力大于80％和/或顶体完整率超过70％的精液。

在其中一个实施方式中，所述的冷冻稀释液每100mL包括Tris2.42g，柠檬酸1.48g，葡萄糖1.10g，9％(v/v)的甘油，LDL添加比例为9％。

在其中一个实施方式中，在于在精液中加入冷冻稀释液时使得甘油的最终浓度为3％，精子密度为1.5～2×109spz/mL。

本发明还涉及上述方法所冷冻保存以及解冻所得到的猪精子。

出人意料的，本发明人发现，使用含有9％(w/v)低密度脂蛋白进行冷冻 时能显著提高冷冻解冻后猪精子DNA的完整性；也能显著改善冷冻解冻后猪精子体外受精(IVF)率

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1.1LDL的提取

从一群饲养标准及日粮组成相同的养鸡场收集新鲜鸡蛋，经75％的酒精消毒蛋壳，手工打破后将卵黄和蛋清分离。将卵黄小心地在洁净的滤纸上滚动，以便去除卵黄系带和卵黄膜上黏附的少量蛋清，然后用手术刀片划破卵黄膜，将卵黄收集于经过冰块预处理的烧杯中。新鲜卵黄收集后，依据。Moussa等[1]介绍的方法提取LDL先用等渗盐溶液(0.17mol/LNaCI，W/V)将卵黄稀释2-3倍，并不断搅拌1h，然后在4℃下10 000×g离心45min后，将上清液与沉淀物分离。为避免蛋黄中所含有的小颗粒物的干扰，同样条件下再次离心。将2次离心后收集的上清液与40％的硫酸铵溶液混合，在4℃下充分搅拌1h后，混合物离心45min(10 000×g，4℃)，使溶液分层，以沉淀卵黄蛋白。离心后，弃去沉淀物，将上清液(漂浮物)用蒸馏水透析12h，以除去溶液中的硫酸铵。在硫酸铵从溶液中完全去除后，再次将溶液离心45min(10 000×g，4℃)，离心后上清液的漂浮物即为LDL。

1.2精液采集采

用人工手握采精法，精液样品来自6头成年杜洛克公猪的精液。采用标准的实验室方法，利用显微镜评价精液特性。测定富含精子部分的精液样品的体积、精子密度和活动精子的比例，只有精子活力大于80％，顶体完整率超过70％的精液用于实验。

1.3溶液的配置

BTS由205mmol/L。葡萄糖、20.39mmol/L。氯化钠、54mmol/L氯化钾、15.01mmol/L碳酸氢钠、3.35mmol/LEDTA和50μg/ml.硫酸卡那霉素 构成。

冷冻基础液是TCG(Tris-citric acid-glucose)[4]。TCG基础液的组成(g/100mL三蒸水)是：Tris2.42，柠檬酸1.48，葡萄糖1.10；冷冻稀释液由冷冻基础液加上9％(v/v)的甘油组成。为了寻找稀释液中LDL添加的最佳比例，本试验设置7％、8％、9％和10％共4个梯度水平。

精子低渗液：果糖0.6756g(75mmol/L)，二水柠檬酸钠0.3676g(25mmol/L)，溶于50mL 4次蒸馏水中。

成熟培养液：TCM199+10％PFF+半胱氨酸+双抗(65mg/L青霉素，50mg/L链霉素)。

1.4精液的冷冻

采集精液之后，在室温静止半个小时后，置预运转的离心机内离心(500×g，10min)，弃全部精清，按1∶1或者是1∶2的比例，在加入等量等温的常温保存液重悬，12-15层纱布包裹使其缓慢降至室温后，再次进行离心(800×g，10min)，弃上清液。然后将经过离心后浓缩的精液用冷冻基础液作2∶1稀释(使甘油的最终浓度为3％，调整精子密度为1.5～2×109spz/mL)将稀释以后的精液轻轻混匀后，将试管用12～15层无菌纱布包裹后放入冰箱，使其缓慢降温至5℃，平衡1.5～3h。

1.5精液的品质检查

细管法冷冻解冻程序：用专用注射器将稀释、平衡后的精液迅速装入0.25mL细管中，水平放置在一铝制薄板上，5℃冰箱平衡2～3h。取细管支架放到液氮面以上5厘米，盖上容器平衡10分钟。然后水平摆好放在支架上盖好盖，在液氮面上熏蒸10分钟，之后迅速将细管冻精浸入液氮内保存。解冻：将细管从液氮中取出，迅速投入37℃的水浴中，解冻45s，待其解冻后，擦干细管上的水珠，剪断封口粉的一端，然后检测精液的质量。

1.5.1精子活率的测定

37℃，45s水浴解冻，然后用等温的解冻液(95％相应的常温保存液+5 ％相应的冷冻基础液)作1∶10稀释后，37℃水浴孵育5min，取10μL精液于载玻片上，加盖玻片后，在显微镜下评定精子活率(直线运动精子百分率)。

1.5.2精子顶体完整性的测定

将精液滴于载玻片一端，用另一个载玻片推片，要求薄而均匀，风干5min。用滴管吸固定液，使载玻片一端稍抬高，将固定液缓缓向下流，直至铺满整个载玻片，然后平放静止15min后，将固定液弃去，用流水冲洗后，待干。姬姆萨染液染色90min后将染色液弃去，流水冲洗后待干，干后用1000倍油镜检查5个不同视野计数200个精子。顶体完整率＝顶体完整精子数/所计精子数。

1.5.3精子质膜完整性的低渗膨胀测定

细管解冻后，精液用精子低渗液(37℃)稀释调整密度至1×106～2×106个/mL，并孵育30～60min，混匀，取10L精子悬浮滴于血细胞计数板上，在显微镜下观察，计算弯尾精子百分率(认为质膜完整的精子在低渗液中孵育后由于质膜的通透选择性，尾部会吸水膨胀而呈现不同程度的弯曲)。每次计算至少200个精子。

1.5.4精子的其他指标测定

包括精子的平均路径速度(VAP)、运动的线速度(LIN)、平均侧摆幅度(ALH)和平均鞭打频率(BCF)的测定，采用计算机辅助精液分析法(computer-assistecl semen analyzer，CASA)。

1.6体外胚胎生产

体外胚胎生产采用的是Roca等[5]的试验方法。

1.7统计分析

通过SPSS统计软件，利用t检验和方差分析进行数据处理。

2结果与分析

2.1不同离心速度提取的LDL添加不同浓度后对冻融猪精液质量参数的 影响

2.1.1 8000转/分离心速度离心的LDL对冻融猪精液质量参数的影响

从表1可以看出，以8 000r/min离心速度离心的LDL最佳浓度为9％(P＜0.05)，精子活率达到40.44％，精子活率、顶体完整率得到提高(P＜0.05)，而低渗膨胀率却显著下降(P＞0.05)，但运动学参数显著升高(P＜0.05)。

表1：LDL(8000r/min)离心速度离心后，添加不同浓度LDL对冻融猪精液质量参数的影响

注：同行数据肩标字母不同者差异显著P＜0.05

2.1.2 10000转/分离心速度离心的LDL对冻融猪精液质量参数的影响

从表2可以看出，以10 000r/min离心速度离心LDL，当LDL浓度从7％增加9％时，精子冻后活率也相应提高，但当LDL浓度为10％时，精子活率却迅速下降。本试验结果表明，LDL的最佳浓度为9％，精子活率达到52.13％。与表1比较可见LDL在冷冻一解冻过程中可以更有效地保护精子，提高精子活率、顶体完整率和质膜完整性，运动学参数也得到显著升高(P＜0.05)。

表2：LDL(10000r/min)离心速度离心LDL后，添加不同浓度LDL对冻融猪精液质量参数的影响

注：同行数据肩标字母不同者差异显著P＜0.05

2.2 10000转/分离心速度离心的LDL，不同浓度添加后对胚胎体外发育能 力的影响

表3以10000转/分离心速度离心LDL，当LDL浓度从7％增加到9％时，可显著提高卵裂率。但当LDL浓度为10％时，卵裂率却下降。本试验结果表明，LDL的最佳浓度为9％，卵裂率达到46.35％，与稀释液中添加7％、8％、10％LDL相比差异显著(P＜0.05)。

表3在冷冻稀释液中添加不同浓度LDL后对胚胎体外发育能力的影响

注：同行数据肩标字母不同者差异显著P＜0.05

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种冷冻保存猪精子的方法，包括如下步骤：

采集猪精子，除去精清；

加入冷冻基础液，在冰箱中进行预冻；

然后在液氮中进行冷冻

其特征在于所述的冷冻基础液中包含9％(w/v)低密度脂蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低密度脂蛋白提取自新鲜鸡蛋。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所采集的精子活力大于80％和/或顶体完整率超过70％的精液。

4.权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于所述的冷冻稀释液每100mL包括Tris 2.42g，柠檬酸1.48g，葡萄糖1.10g，9％(v/v)的甘油，LDL添加比例为9％。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于在精液中加入冷冻稀释液时使得甘油的最终浓度为3％，精子密度为1.5～2×109spz/mL。

6.权利要求1-5任意一项所述方法冷冻保存得到的猪精子。

7.权利要求1-5任意一项所述方法得到猪精子的解冻猪精子。