CN1986780A - 新型玻璃化液 - Google Patents
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Abstract
新型玻璃化液属于生物技术领域，涉及低温生物学领域深低温冷冻技术，特别是低温生物学领域深低温冷冻玻璃化技术，在经典EFS40、EG5.5液基础上，进行合理配伍、比对实验，浓度配比方案为：乙二醇∶Ficoll70(聚蔗糖)∶蔗糖＝5.5mol/L∶4.3mol/L∶0.5mol/L。本发明新型玻璃化液用于卵巢器官的玻璃化冷冻，降低了乙二醇的浓度，从7.1mol/L乙二醇降至5.5mol/L，添加了4.3mol/L Ficoll70(聚蔗糖)，同时将蔗糖的浓度调整为0.5mol/L。本发明新型玻璃化液具有浓度低，毒性小，玻璃化形成能力大，渗透压检测：新型玻璃化液和EFS40、EG5.5相比，新型玻璃化液在三种玻璃化液中渗透压最低，用于乳鼠卵巢的玻璃化冷冻，该液体在麦管内无论是在液氮还是空气中，均能保持玻璃态透明而无冰晶形成，渗透压低的优点，达到玻璃化冷冻要求。
Description
技术领域：
本发明新型玻璃化液涉及生物技术领域，特别是低温生物学领域深低温冷冻玻璃化技术中玻璃化液。
背景技术：
玻璃化冷冻是超低温保存的新技术，不仅操作方法简便，而且冻存效果好，目前广泛应用于各种卵子、胚胎的玻璃化冷冻保存，玻璃化冷冻被认为是可安全、有效保存各种有生命的细胞、组织和器官的生物活性，具有经济、简便和高效的优点，是近年低温生物学领域发展最快的研究方向之一。由Rall和Fahy[1](1985)在冷冻小鼠的8-细胞期胚胎时首创，他们采用的冷冻液是由二甲基亚砜、乙酰胺、丙二醇等组成的，由于抗冻剂毒性较大，冷冻效果的重复性不佳，对牛囊胚冷冻保存未能获得成功。1990年Kasai等人研制出一种简单的玻璃化冷冻方法，该方法采用低毒性的乙二醇作为细胞内液抗冻保护剂，以聚蔗糖和蔗糖作为细胞外液抗冻保护剂配制成玻璃化溶液EFS40(40％v/v乙二醇，18％聚蔗糖、0.5mol/L蔗糖)玻璃化冻存小鼠桑椹胚，解冻后发育率达97％～98％，1993年Ali J等人又报道一种低浓度的玻璃化液EG5.5，由5.5mol/L乙二醇(EG)和1.0mol/L蔗糖(EG5.5)组成，用于小鼠胚胎的冻存。由于玻璃化冷冻需要4-8mol/L的低温保护剂(Cryopresertectant agent，CPA)浓度和极快的冷冻速度才能形成玻璃态，高浓度的冷冻保护剂将带给细胞潜在的毒性和渗透性损伤，一直以来是影响冷冻效果，限制其在低温生物学领域广泛应用的关键性影响因素之一。
发明目的：
本发明新型玻璃化液，寻找一种适合不同的细胞和组织，满足4-8mol/L的低温保护剂浓度和极快的冷冻速度才能形成玻璃态要求，毒性较小的玻璃化溶液配比方案成为本发明新型玻璃化液研究的重点和焦点。
本发明新型玻璃化液在经典EFS40、EG5.5液基础上，进行合理配伍、比对实验，浓度配比方案为：乙二醇∶Ficoll70(聚蔗糖)∶蔗糖＝5.5mol/L∶4.3mol/L∶0.5mol/L。
本发明新型玻璃化液用于卵巢器官的玻璃化冷冻，降低了乙二醇的浓度，从7.1mol/L乙二醇降至5.5mol/L，添加了30％聚蔗糖，同时将蔗糖的浓度调整为0.5mol/L。
本发明新型玻璃化液具有浓度低，毒性小，玻璃化形成能力大，新型玻璃化液和EFS40、EG5.5相比，新型玻璃化液在三种玻璃化液中渗透压最低，用于乳鼠卵巢和胎儿卵巢皮质的玻璃化冷冻取得了良好的冷冻效果，该液体在麦管内无论是在液氮还是空气中，均能保持玻璃态透明而无冰晶形成，达到玻璃化冷冻要求。
具体实施方式：
实施例1：采用新型液玻璃化冻存新生小鼠卵巢，解冻后进行成年鼠肾被膜下移植，而且观察到受体鼠在长达半年的时间内每3-4天都出现一次规律的动情周期。后期我们采用新型玻璃化液、EG5.5、EFS40三种液体冻存新生大鼠卵巢器官，对冷冻效果从组织学和功能学角度进行了系统比较。结果显示：对乳鼠卵巢玻璃化冻融后异体肾被膜下移植，新型玻璃化液组有91.67％(12/11)的大鼠恢复了动情周期，高于EG5.5的66.67％、EFS40的75％和新鲜移植组的81.81％，但无显著性差异。动情周期的恢复时间新型玻璃化液、EG5.5、EFS40冷冻三组均稍长于新鲜移植组，但无显著性差异。新型玻璃化液组中一只鼠规律的动情周期一直维持至移植术后5月，取材时发现双侧肾被膜下均存在尚存活的移植卵巢，已长大如性成熟排卵5月正常大鼠的卵巢大小，且移植卵巢表面均可见多个卵泡突出卵巢表面，光镜下进行组织学观察，高倍视野下，有5-7个正在发育的各级卵泡，及发达的间质腺，类似同时期卵巢。三组血清E2和FSH与正常大鼠激素水平相似，各个阶段取材的存活卵巢内卵泡数虽然少于新鲜移植组，但与新鲜移植组无显著性差异。凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax和TUNEL末端标记的免疫组织化学结果证实经新型玻璃化液冻存的卵泡凋亡比率小于EG5.5、EFS40液组，从而证实：新型玻璃化液冻存乳鼠卵巢，没有影响卵泡的生理学特性，冷冻复苏后的乳鼠卵巢，即使没有经历幼年到性成熟的过程依然能在受体鼠体内很好的存活，恢复卵泡的生长发育，能够同新鲜卵巢一样恢复生理活性。将新型玻璃化液用于成年小鼠卵巢器官的冻存，在没有剥离被膜的情况下，异体肾被膜下移植后成活情况良好，出现100％的动情周期恢复率，移植10只，10只均出现动情周期。
实施例2：在采用新型玻璃化液冻存胎儿卵巢，冻融后进行裸鼠的肾被膜下异种移植，结果有75％的裸鼠恢复了动情周期，略高于新鲜培养后移植组62.5％，18周后取材，可见胎儿卵巢在裸鼠的肾被膜下已长大成圆形，组织学观察：在异种裸鼠肾被膜下存活的胎儿卵巢，不但分布有大量发育的窦前卵泡，而且形成窦卵泡，该结果在目前国际研究中都处于领先地位。
Claims (1)
1.新型玻璃化液，含有乙二醇、蔗糖、Ficoll70(聚蔗糖)，其特征在于：浓度配比方案为：乙二醇∶Ficoll70(聚蔗糖)∶蔗糖＝5.5mol/L∶4.3mol/L∶0.5mol/L
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102550541A (zh) * | 2010-12-23 | 2012-07-11 | 潘峰 | 器官玻璃化冷冻保存液 |
| CN102771471A (zh) * | 2012-08-22 | 2012-11-14 | 宁夏医科大学 | 卵巢大皮质片玻璃化冷冻保护液及冷冻方法 |
| CN104585165A (zh) * | 2015-02-24 | 2015-05-06 | 陈德琼 | 人体器官冷冻保护液 |
| CN109644991A (zh) * | 2019-01-31 | 2019-04-19 | 力盟低温医学(深圳)有限公司 | 结合激光技术在不含渗透性保护剂下的冷冻样本处理方法 |
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2006
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN102550541A (zh) * | 2010-12-23 | 2012-07-11 | 潘峰 | 器官玻璃化冷冻保存液 |
| CN102550541B (zh) * | 2010-12-23 | 2016-02-17 | 潘峰 | 器官玻璃化冷冻保存液 |
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