CN109644991A - 结合激光技术在不含渗透性保护剂下的冷冻样本处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了结合激光技术在不含渗透性保护剂下的冷冻样本处理方法。它包括S1、细胞样本冷冻：从细胞缓冲液中取出细胞样本后浸置于冷冻液中，然后将包含有细胞样本的冷冻液的液滴转移至玻璃化冷冻载杆上，最后直接将玻璃化冷冻载杆浸入液氮中进行冷冻保存；按质量摩尔浓度计，冷冻液由蔗糖溶液、盐溶液、聚蔗糖溶液、纳米碳粒混合而成；S2、利用激光脉冲向液滴施加热量；S3、将解冻后的细胞样本置于解冻液中进行洗涤。本发明利用低浓度的非渗透性蔗糖成分来处理生物样本，使其脱水后即可直接放置于液氮中进行冷冻保存；同时，在激光复温技术的配合下，在短时间内对生物样本的超快速解冻处理，极大地提高了生物样本的成活率以及发育潜能。

Description

结合激光技术在不含渗透性保护剂下的冷冻样本处理方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其是一种结合激光技术在不含渗透性保护剂下进行冷冻生物样本处理方法。
背景技术
自1949年英国Polge等人发现在精液冷冻稀释液中加入保护剂——甘油，可以起到降低低温冷冻过程对精子的损害的特殊保护作用开始，目前诸如乙二醇、二甲基亚砜、乙酰胺、丙三醇等渗透性物质常常被作为低温保护剂来保存各种细胞(如卵细胞、胚胎等等生物样本)。虽然这些保护剂所具有的毒性以及对细胞所产生的损害是客观存在的，但是就目前的低温保存技术而言，又不得不使用这些化学性物质作为细胞的低温保存剂，特别是像卵子、胚胎等这样的大细胞。所以在对这些大细胞进行冷冻保存、解冻的处理的过程中，需要严格控制保护剂的浓度、冷冻及解冻的处理时间、处理温度等等，以期最大限度地避免保护剂的毒性对细胞的后期发育造成损害。
随着辅助生殖技术的快速发展及应用，为充分挖掘动物的遗传和繁殖能力、增加纯种家畜和优秀个体的后代数量、缩短家畜的改良周期以及保存具有优良遗传特性的胚胎和基因等提供了技术保障。另外，近几年来，人类的不孕不育变得越来越严重，癌症患者数量也持续增加，如何有效的保存患者的生育能力以及提高卵子和胚胎保存后的利用效率就显得非常重要。而传统的生物样本处理方法显然已经无法满足辅助生殖技术的快速发展及应用需求。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供结合激光技术在不含渗透性保护剂下的冷冻样本处理方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
结合激光技术在不含渗透性保护剂下的冷冻样本处理方法，它包括以下步骤：
S1、细胞样本冷冻：从细胞缓冲液中取出细胞样本后，浸置于冷冻液中并保持静浸状态至少2.0min，然后将包含有细胞样本的冷冻液的液滴转移至玻璃化冷冻载杆上并将液滴的大小控制在3μL以内，最后直接将玻璃化冷冻载杆浸入液氮中进行冷冻保存；其中按质量摩尔浓度计，冷冻液以由1.0mol/kg蔗糖溶液、0.15mol/kg盐溶液和0.0062mol/kg聚蔗糖溶液混合而成的溶液为基础液经添加0.4μg/ml的纳米碳粒配置而成；
S2、细胞样本解冻：将玻璃化冷冻载杆从液氮中取出后，利用激光脉冲向液滴施加热量，使液滴在吸收激光热量后率先解冻并同时将热量传递给液滴内的细胞样本以最终实现细胞样本的解冻；
S3、冷冻液成分去除：将解冻后的细胞样本置于解冻液中进行洗涤，去除细胞样本上的冷冻液成分；
S4、细胞样本培养：将解冻后的细胞样本转移至二氧化碳培养箱中进行培养。
优选地，在步骤S1中，将包含有细胞样本的冷冻液的液滴转移至玻璃化冷冻载杆上后，保证在2min之内将玻璃化冷冻载杆进入液氮中进行冷冻保存。
优选地，在步骤S3中，将解冻后的细胞样本浸入于蔗糖的质量摩尔浓度在0.5mol/kg的解冻液作平衡洗涤至少5min，以去除细胞样本上的冷冻液成分。
由于采用了上述方案，本发明利用蔗糖溶液、盐溶液和聚糖溶液配置而成的低温保存液没有任何渗透性保护剂的存在，可完全规避保存液中毒性成分对生物样本的影响或损害；利用低浓度的非渗透性蔗糖成分来处理生物样本(如卵子、胚胎等等)，使其脱水后即可直接放置于液氮中进行冷冻保存；同时，由于解冻生物样本的速率是决定样本解冻后成活率及发育潜能的关键因素，在激光复温技术的配合下，利用激光所具有能量密度大等特点，在短时间内迅速地提高冷冻的生物样本的升温速率，实现对生物样本的超快速解冻处理，使生物样本能够快速通过容易造成生物样本损伤的玻璃化转移温度，从而极大地提高了生物样本的成活率以及发育潜能；整个方法有利于提高对于诸如卵子、胚胎等生物样本的利用率，特别对于重要疾病模型的实验动物、经济大动物、海洋生物以及人类的生育力保存具有非常重要的意义。
具体实施方式
以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。
实施例一
结合激光技术在不含渗透性保护剂下的冷冻样本处理方法，它包括以下步骤：
S1、细胞样本冷冻：将获取的卵子首先置于细胞缓冲液(即：PBS溶液)中进行预处理，然后从细胞缓冲液中取出卵子，将其浸置于冷冻液中并保持静浸状态至少2.0min，随后再将包含有卵子的冷冻液的液滴转移至玻璃化冷冻载杆的薄片上并将液滴的大小控制在3μL以内，最后直接将玻璃化冷冻载杆浸入液氮中进行冷冻保存；其中，按质量摩尔浓度计，冷冻液以由1.0mol/kg蔗糖溶液、0.15mol/kg盐溶液和0.0062mol/kg聚蔗糖溶液混合而成的溶液为基础液经添加0.4μg/ml的纳米碳粒配置而成；
S2、细胞样本解冻：将玻璃化冷冻载杆从液氮中取出后，利用波长为1064μm、功率小于10kw的激光脉冲向液滴施加热量，使液滴在吸收激光热量后率先解冻并同时将热量传递给液滴内的卵子以最终实现卵子的解冻，此过程主要是利用冷冻液中所含有的纳米碳粒来吸收并传递激光能量，实现对液滴及包含于其内的轮子细胞由外至内的快速解冻；
S3、冷冻液成分去除：将解冻后的细胞样本置于解冻液中进行洗涤，去除细胞样本上的冷冻液成分；
S4、细胞样本培养：将解冻后的卵子转移至二氧化碳培养箱中进行培养，然后作体外受精，观察后续卵子的发育情况。
实施例二
结合激光技术在不含渗透性保护剂下的冷冻样本处理方法，它包括以下步骤：
S1、细胞样本冷冻：将获取的胚胎(2细胞期胚胎和8细胞期胚胎)首先置于细胞缓冲液(即：PBS溶液)中进行预处理，然后从细胞缓冲液中取出胚胎，将其浸置于冷冻液中并保持静浸状态至少2.0min，随后再将包含有胚胎的冷冻液的液滴转移至玻璃化冷冻载杆的薄片上并将液滴的大小控制在3μL以内，最后直接将玻璃化冷冻载杆浸入液氮中进行冷冻保存；其中，按质量摩尔浓度计，冷冻液以由1.0mol/kg蔗糖溶液、0.15mol/kg盐溶液和0.0062mol/kg聚蔗糖溶液混合而成的溶液为基础液经添加0.4μg/ml的纳米碳粒配置而成；在完成胚胎在冷冻液中静浸之后、将液滴转移至玻璃化冷冻载杆之前，可利用冷冻液对细胞卵子进行充分洗涤以清洗胚胎表侧的缓冲液；
S2、细胞样本解冻：将玻璃化冷冻载杆从液氮中取出后，利用波长为1064μm、功率小于10kw的激光脉冲向液滴施加热量，使液滴在吸收激光热量后率先解冻并同时将热量传递给液滴内的胚胎以最终实现胚胎的解冻，此过程主要是利用冷冻液中所含有的纳米碳粒来吸收并传递激光能量，实现对液滴及包含于其内的轮子细胞由外至内的快速解冻；
S3、冷冻液成分去除：将解冻后的细胞样本置于解冻液中进行洗涤，去除细胞样本上的冷冻液成分；
S4、细胞样本培养：将解冻后的细胞样本转移至二氧化碳培养箱中进行培养，然后作体外受精，观察后续胚胎的发育情况。
作为优选方案，在具体实施本实施例一和二时，将包含有细胞样本(即：卵子、2细胞期胚胎、8细胞期胚胎)冷冻液的液滴转移至玻璃化冷冻载杆上后，最好保证2min之内将玻璃化冷冻载杆进入液氮中进行冷冻保存。
作为优选方案，在实施例一和二的步骤S3中，将解冻后的细胞样本浸入于蔗糖的质量摩尔浓度在0.5mol/kg的解冻液作平衡洗涤至少5min，以去除细胞样本上的冷冻液成分。
相比于传统低温保存液，本实施例利用蔗糖溶液、盐溶液和聚糖溶液配置而成的低温保存液没有任何渗透性保护剂的存在，可完全规避保存液中渗透性保护剂的毒性对生物样本的影响或损害；利用低浓度的非渗透性蔗糖成分来处理生物样本(如卵子、胚胎等等)，使其脱水后即可直接放置于液氮中进行冷冻保存；同时，由于解冻生物样本的速率是决定样本解冻后成活率及发育潜能的关键因素，在激光复温技术的配合下，利用激光所具有能量密度大等特点，在短时间内迅速地提高冷冻的生物样本的升温速率，实现对生物样本的超快速解冻处理，使生物样本能够快速通过玻璃化转移温度，从而极大地提高了生物样本的成活率以及发育潜能。
以卵子、2细胞期胚胎和8细胞期胚胎作为实施本方法的对象，通过采用传统解冻方法和激光解冻方法进行解冻处理，可充分验证本方法的实施性、有益效果(详见表一)以及本方法与传统方法之间的差异(详见表二)。
从表一中可以看出：经本实施例的方法处理后的生物样本(无论是卵子还是胚胎)，在没有任何渗透性保护剂的保存过程中，其成活率和发育潜能均得到了显著的提高，如果利用本实施例的保存液并采用常规解冻方法所处理的生物样本则没有任何成活的可能性。
从表二中可以看出：本实施例的方法对冷冻保存液中起到保存作用的保存剂的浓度、冷冻速率等要求更低，解冻速率大幅提升，从而可在避免使用“毒性”低温保存剂的情况下，在极短时间内实现对生物样品的解冻，进而有效保证生物样本的成活率和发育潜能。
综上所述，本实施例所提供的保存液及处理方法，可以在没有任何渗透性保护剂的作用下实现低温保存过程，并结合激光复温技术实现对生物样本的解冻，提高了生物样本保存后的成活率和发育潜能，有利于提高对于诸如卵子、胚胎等生物样本的利用率，特别对于重要疾病模型的实验动物、经济大动物、海洋生物以及人类的生育力保存具有非常重要的意义。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.结合激光技术在不含渗透性保护剂下的冷冻样本处理方法，其特征在于：它包括以下步骤：
S1、细胞样本冷冻：从细胞缓冲液中取出细胞样本后，浸置于冷冻液中并保持静浸状态至少2.0min，然后将包含有细胞样本的冷冻液的液滴转移至玻璃化冷冻载杆上并将液滴的大小控制在3μL以内，最后直接将玻璃化冷冻载杆浸入液氮中进行冷冻保存；其中按质量摩尔浓度计，冷冻液以由1.0mol/kg蔗糖溶液、0.15mol/kg盐溶液和0.0062mol/kg聚蔗糖溶液混合而成的溶液为基础液经添加0.4μg/ml的纳米碳粒配置而成；
S2、细胞样本解冻：将玻璃化冷冻载杆从液氮中取出后，利用激光脉冲向液滴施加热量，使液滴在吸收激光热量后率先解冻并同时将热量传递给液滴内的细胞样本以最终实现细胞样本的解冻；
S3、冷冻液成分去除：将解冻后的细胞样本置于解冻液中进行洗涤，去除细胞样本上的冷冻液成分；
S4、细胞样本培养：将解冻后的细胞样本转移至二氧化碳培养箱中进行培养。
2.如权利要求1所述的结合激光技术在不含渗透性保护剂下的冷冻样本处理方法，其特征在于：在步骤S1中，将包含有细胞样本的冷冻液的液滴转移至玻璃化冷冻载杆上后，保证在2min之内将玻璃化冷冻载杆进入液氮中进行冷冻保存。
3.如权利要求1所述的结合激光技术在不含渗透性保护剂下的冷冻样本处理方法，其特征在于：在步骤S3中，将解冻后的细胞样本浸入于蔗糖的质量摩尔浓度在0.5mol/kg的解冻液作平衡洗涤至少5min，以去除细胞样本上的冷冻液成分。
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