CN114711225B - 卵泡的冷冻保存和复苏方法 - Google Patents

卵泡的冷冻保存和复苏方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及卵泡冻存技术领域，尤其涉及卵泡的冷冻保存和复苏方法。本发明提供的冷冻保存卵泡的方法首先对卵泡进行封装，水凝胶封装可以有效阻止冰晶向内生长，减少胞外冰损伤，降低渗透性保护剂浓度。且因水凝胶的隔离，在冻存液中添加纳米颗粒不会对卵泡产生毒性，而通过纳米颗粒对冻存的卵泡进行磁感应加热和光感应加热，可以使卵泡受热均匀，提高复苏效率，提高复苏后卵泡的存活率。并且，封装后水凝胶的三维网状结构类似于细胞外基质，可以用于复苏后腔前卵泡的体外培养。

Description

卵泡的冷冻保存和复苏方法
技术领域
本发明涉及卵泡冻存技术领域，尤其涉及卵泡的冷冻保存和复苏方法。
背景技术
近年来，一些恶性疾病(如乳腺癌、血液病)在年轻女性中发病率越来越高。虽然积极的化疗、放疗或骨髓移植可以治愈90％的女孩和年轻女性，但这些治疗仍然会损害性腺功能，甚至导致卵巢早衰。因此，对女性生育力保存的需求急剧增加。对于患某些特殊疾病(如急性白血病、卵巢癌)青春期前的女孩和急需癌症治疗的妇女来说腔前卵泡的冷冻保存是一种安全的选择。
卵泡的发育一般分为原始卵泡、初级卵泡、二级卵泡、三级卵泡及窦卵泡(窦卵泡也可以理解为成熟卵泡)。其中，二级卵泡、三级卵泡都属于窦前卵泡，窦前卵泡存在于所有年龄的个体的生殖腺中，可以从年轻或老年妇女的卵巢中获得。
目前普遍冻存的卵泡是指窦卵泡，方法就是主要包括慢速冷冻和玻璃化冷冻保存。与传统的慢速冷冻相比，玻璃化冷冻保存所需设备简单，容易操作，被认为是一种更有效的冷冻保存方法。玻璃化冷冻保存通常是用高浓度的低温保护剂在超低温环境下使细胞进入一种非结晶的玻璃化状态。但是，高浓度的渗透性低温保护剂(高达6～10mol/L)可能导致不可控的渗透损伤和生物毒性，从而严重影响保存的效果及卵泡后续的发育。此外，传统的复温方式是将冻存管置于37℃恒温水浴中，边摇动边被动复温。该方法复温速率不够快，会导致严重的反玻璃化和再结晶，这对于腔前卵泡来说是致命的。
因此迫切需要找到一种低浓度保护剂冷冻以及快速复温的方法来实现腔前卵泡的冷冻保存。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供低浓度保护剂冷冻以及快速有效复温的卵泡冷冻保存和复苏方法。
本发明提供的卵泡的冷冻保存方法，包括：以海藻酸钠凝胶封装卵泡后，移入保护液A中孵育，然后移入保护液B中再次孵育，浸入液氮进行冻存；
所述保护液A中包括冷冻保护剂；
所述保护液B中包括冷冻保护剂、Fe3O4纳米颗粒和GO纳米颗粒；
所述冷冻保护剂选自二甲基亚砜、甘油、乙二醇、丙二醇、海藻糖、乙酰胺或甲醇中一种或两种以上的组合。
本发明中，所述冷冻保护剂为乙二醇、丙二醇和海藻糖。
本发明中，所述Fe3O4纳米颗粒的直径为10～50μm。所述GO纳米颗粒的直径为200～400μm。
一些具体实施例中，，所述Fe3O4纳米颗粒的直径为20μm。所述GO纳米颗粒的直径为300μm。
本发明所述的冻存方法中，首先以水凝胶对卵泡进行封装。水凝胶微封装作为一个保护屏障，将腔前卵泡和纳米颗粒隔离，有效抑制了纳米颗粒的毒性。而且，水凝胶微胶囊可以有效阻止冰晶向内生长，减少胞外冰损伤，降低渗透性保护剂浓度。此外，水凝胶的三维网状结构类似于细胞外基质，可以用于复苏后腔前卵泡的体外培养。但由于水凝胶的硬度和浓度会影响腔前卵泡的体外发育，所以制备水凝胶时选取浓度低的海藻酸钠制备水凝胶。
本发明所述冷冻保存方法中，所述海藻酸钠凝胶封装卵泡包括：将卵泡与0.5wt％～2wt％海藻酸钠溶液混合，滴入0.1mol/L～0.5mol/L氯化钙溶液。
本发明所述封装步骤采用带喷嘴的离心管进行封装。离心管的体积为1.5mL，离心管的顶部设置有喷嘴，喷嘴的直径为100～500μm。离心管的喷嘴内装有浓度为0.5wt％～2wt％海藻酸钠溶液，离心管底部装有0.1mol/L～0.5mol/L氯化钙溶液。进行封装的步骤包括，将卵泡加入装海藻酸钠溶液的喷嘴中，经离心使喷嘴中的海藻酸钠溶液和卵泡在离心力作用下落入离心管底部的氯化钙溶液中，形成水凝胶微球。在上述海藻酸钠和氯化钙浓度和喷嘴的直径下，离心力为100×g～500×g制备的微球更稳定。
本发明所述冷冻方法中，将所述封装有卵泡的水凝胶微球转移至含有保护剂A的麦管中孵育20min后，再加入保护剂B孵育10min。
所述冷冻保存方法中，所述保护液A包括水和0.5mol/L～2mol/L乙二醇、0.5mol/L～2mol/L丙二醇和0.5mol/L～2mol/L的海藻糖。一些实施例中，所述保护液A由水和1mol/L乙二醇、1mol/L丙二醇和1mol/L海藻糖组成。
所述冷冻保存方法中，所述保护液B包括水和0.5mol/L～2mol/L乙二醇、0.5mol/L～2mol/L丙二醇、0.5mol/L～2mol/L的海藻糖、0.1wt％～1wt％Fe3O4纳米颗粒和0.01wt％～0.1wt％GO纳米颗粒。一些实施例中，所述保护液B由水和1mol/L乙二醇、1mol/L丙二醇、1mol/L的海藻糖、0.5wt％Fe3O4纳米颗粒和0.05wt％GO纳米颗粒。
本发明所述的保存液B随卵泡一同冻存，其中含有两种分别具有磁热(Fe3O4)和光热性质(GO)的纳米颗粒。两种纳米颗粒的浓度和配比可以任意调节，以获得适宜的升温速率。在37℃恒温水浴的基础上，通过结合了磁感应加热和光感应加热的纳米复温，实现了腔前卵泡低渗透性保护剂(1～3mol/L)的玻璃化冷冻保存。在复苏过程中，利用其中含有的Fe3O4纳米颗粒和GO纳米颗粒在磁感应加热和光感应加热的共同作用下，实现快速均匀的复温，提高卵泡的存活率。
本发明中，所述卵泡为窦前卵泡。窦前卵泡是卵泡的早期阶段，在卵巢皮质中占很大比例的卵泡，在保存、繁殖或研究方面具有巨大的潜力。
本发明所述冷冻保存方法获得冻存卵泡的复苏方法，包括：将冻存的卵泡置于37℃，进行磁感应加热和近红外加热。
本发明中，所述冻存的卵泡存在于麦管中，所述置于37℃为置于37℃的水中。
所述磁感应加热的电流为5A～30A，优选为15A。所述近红外加热的功率为1W/cm2～10W/cm2，优选为3W/cm2。
本发明所述复苏方法获得卵泡的体外培养方法，包括，将复苏后的细胞以培养基培养；所述培养基包括培养基A和培养基B。本发明提供的培养基A和培养基B对培养结果产生显著影响，其他培养基条件下，无法获得类似的培养效果。
本发明中，所述培养基A包括：α-MEM、8％(v/v)～12％(v/v)FBS、80～120mIU/mLFSH、1×～2×ITS、800～1200IU/mL LIF和3～7μg/mL EGF。一些实施例中，所述培养基A包括：α-MEM、10％(v/v)FBS、100mIU/mL FSH、1×ITS、1000IU/mL LIF和5μg/mL EGF。
本发明中，所述培养基B包括：α-MEM、8％(v/v)～12％(v/v)FBS、80～120mIU/mLFSH+1×～2×ITS+800～1200IU/mL LIF+3～7μg/mL EGF、150～250mIU/mL LH和2～3U/mLHCG。一些实施例中，所述培养基B包括：α-MEM、10％(v/v)FBS、100mIU/mL FSH+1×ITS+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF、200mIU/mL LH和2.5U/mL HCG。
本发明中，所述电磁感应电流的强度和红外加热的功率需要与保存液中纳米颗粒的添加量严格配合。本发明说明书中记载的相关参数皆经大量筛选工作后获得，例如，对Fe3O4纳米颗粒含量、GO纳米颗粒含量进行调整，都综合采用其他电磁强度或红外功率，都有可能对复苏效果产生影响，最终导致卵泡的存活率降低，不足90％。
本发明复苏后的卵泡还封装有水凝胶，因此，复苏的腔前卵泡不经过任何处理，可直接在水凝胶内进行原位体外培养，且能获得良好的培养效果。
本发明提供的冷冻保存卵泡的方法首先对卵泡进行封装，水凝胶封装可以有效阻止冰晶向内生长，减少胞外冰损伤，降低渗透性保护剂浓度。且因水凝胶的隔离，在冻存液中添加纳米颗粒不会对卵泡产生毒性，而通过纳米颗粒对冻存的卵泡进行磁感应加热和光感应加热，可以使卵泡受热均匀，提高复苏效率，提高复苏后卵泡的存活率。并且，封装后水凝胶的三维网状结构类似于细胞外基质，可以用于复苏后腔前卵泡的体外培养。
附图说明
图1示腔前卵泡的水凝胶微封装，其中，1示腔前卵泡；2示海藻酸钠；3示氯化钙；4示含腔前卵泡的水凝胶微球；
图2示保护剂孵育及纳米颗粒的添加、腔前卵泡的玻璃化冷冻保存、腔前卵泡的纳米复温，其中，5示麦管；6示GO；7示Fe3O4；8示低温保护剂；9、液氮冷冻；10示激光加热；11示电磁加热；12示37℃水浴；
图3示复温后腔前卵泡的体外原位培养，其中，13示96孔板原位培养腔前卵泡。
具体实施方式
本发明提供了卵泡的冷冻保存和复苏方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明公开了一种腔前卵泡微封装、冻存、纳米复温及体外3D培养的方法。该方法先是通过一种离心装置对腔前卵泡进行水凝胶微封装，简单方便而且有效防止封装过程中腔前卵泡的丢失。在37℃恒温水浴的基础上，采用结合了磁感应加热和光感应加热的纳米复温对腔前卵泡进行加热，可实现快速均匀复温，有效缩短反玻璃化或重结晶持续的时间，从而降低了玻璃化冷冻保存对渗透性保护剂的需求。采用水凝胶微封装，将腔前卵泡和纳米颗粒完全隔离开，有效的抑制了纳米颗粒对腔前卵泡的潜在毒性。而且，冷冻过程水凝胶微胶囊可以阻止冰晶向细胞内生长，也从侧面降低对渗透性保护剂需求的浓度。此外，水凝胶的三维网络结构类似于细胞外基质，可用于腔前卵泡的体外培养。本发明成功地实现了小鼠腔前卵泡低浓度渗透性保护剂玻璃化冷冻保存及冻后原位培养(在之前用于冷冻保存的水凝胶微胶囊中)。通过该方法可以获得成熟的卵母细胞，及健康生出小鼠，为女性生育的保存及其相关研究提供了技术保障。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
腔前卵泡微封装、冻存、纳米复温及体外3D培养的方法，具体操作如下：
1)腔前卵泡的水凝胶微封装：通过一个小的离心装置进行。离心装置由1.5mL特制的离心管和喷嘴组成。通过管盖上的孔将喷嘴(直径300μm)固定在特制离心管上。首先，将0.3mol/L氯化钙溶液加入特制离心管中，并将含有腔前卵泡的海藻酸钠溶液(浓度为1wt％)装入喷嘴中，并以100×g离心2分钟，得到生成装有腔前卵泡的海藻酸盐水凝胶微胶囊，再将其收集到培养基中以进行后续操作。
2)保护剂孵育及纳米颗粒的添加：将封装后的腔前卵泡浸入由水和1mol/L乙二醇+1mol/L丙二醇+1mol/L的海藻糖组成的低温保护剂中，孵育20分钟，然后将其移入由水和1mol/L乙二醇+1mol/L丙二醇+1mol/L的海藻糖+0.5％Fe3O4+0.05％GO纳米颗粒组成的低温保护剂中孵育10分钟。
3)腔前卵泡的玻璃化冷冻保存：将含有纳米颗粒和卵泡的保护剂添加到麦管中，然后将麦管直接快速浸入液氮进行玻璃化冷冻保存。
4)腔前卵泡的纳米复温：将盛有37℃水的50mL离心管放入通了15A电流的电磁线圈中，并对准上边的已经打开近红外激光发射器，然后迅速的取出液氮中的麦管置于水浴中的近红外斑点下(功率为3W/cm2)进行纳米复温2-3s。
5)复温后腔前卵泡的体外原位培养：复温后取出麦管中水凝胶封装的腔前卵泡，直接置于之前已经装有100mL培养基A的96孔板中进行体外培养，每隔一天更换一半培养基，直到发育成腔前卵泡，然后更换为培养基B，继续培养16-22h，直至发育出成熟卵细胞。
培养基A包括：α-MEM+10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF。
培养基B包括：α-MEM+10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF+200mIU/mL LH+2.5U/mL HCG。
对比例1
腔前卵泡微封装、冻存、纳米复温及体外3D培养的方法，具体操作如下：
1)腔前卵泡的水凝胶微封装：通过一个小的离心装置进行。离心装置由1.5mL特制的离心管和喷嘴组成。通过管盖上的孔将喷嘴(直径300μm)固定在特制离心管上。首先，将0.3mol/L氯化钙溶液加入特制离心管中，并将含有腔前卵泡的海藻酸钠溶液(浓度为1wt％)装入喷嘴中，并以100×g离心2分钟，得到生成装有腔前卵泡的海藻酸盐水凝胶微胶囊，再将其收集到培养基中以进行后续操作。
2)保护剂孵育及纳米颗粒的添加：将封装后的腔前卵泡浸入由水和1mol/L乙二醇+1mol/L丙二醇+1mol/L的海藻糖组成的低温保护剂中，孵育20分钟。
3)腔前卵泡的玻璃化冷冻保存：将含有纳米颗粒和卵泡的保护剂添加到麦管中，然后将麦管直接快速浸入液氮进行玻璃化冷冻保存。
4)腔前卵泡的纳米复温：将盛有37℃水的50mL离心管进行复温5-7s。
5)复温后腔前卵泡的体外原位培养：复温后取出麦管中水凝胶封装的腔前卵泡，直接置于之前已经装有100mL培养基A的96孔板中进行体外培养，每隔一天更换一半培养基，直到发育成腔前卵泡，然后更换为培养基B，继续培养16-22h，直至发育出成熟卵细胞。
培养基A包括：α-MEM+10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF。
培养基B包括：α-MEM+10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF+200mIU/mL LH+2.5U/mL HCG。
对比例2
腔前卵泡微封装、冻存、纳米复温及体外3D培养的方法，具体操作如下：
1)腔前卵泡的水凝胶微封装：通过一个小的离心装置进行。离心装置由1.5mL特制的离心管和喷嘴组成。通过管盖上的孔将喷嘴(直径300μm)固定在特制离心管上。首先，将0.3mol/L氯化钙溶液加入特制离心管中，并将含有腔前卵泡的海藻酸钠溶液(浓度为1wt％)装入喷嘴中，并以100×g离心2分钟，得到生成装有腔前卵泡的海藻酸盐水凝胶微胶囊，再将其收集到培养基中以进行后续操作。
2)保护剂孵育及纳米颗粒的添加：将封装后的腔前卵泡浸入由水和1mol/L乙二醇+1mol/L丙二醇+1mol/L的海藻糖组成的低温保护剂中，孵育20分钟，然后将其移入由水和1mol/L乙二醇+1mol/L丙二醇+1mol/L的海藻糖+0.5％Fe3O4纳米颗粒组成的低温保护剂中孵育10分钟。
3)腔前卵泡的玻璃化冷冻保存：将含有纳米颗粒和卵泡的保护剂添加到麦管中，然后将麦管直接快速浸入液氮进行玻璃化冷冻保存。
4)腔前卵泡的纳米复温：将盛有37℃水的50mL离心管放入通了15A电流的电磁线圈中进行纳米复温3-4s。
5)复温后腔前卵泡的体外原位培养：复温后取出麦管中水凝胶封装的腔前卵泡，直接置于之前已经装有100mL培养基A的96孔板中进行体外培养，每隔一天更换一半培养基，直到发育成腔前卵泡，然后更换为培养基B，继续培养16-22h，直至发育出成熟卵细胞。
培养基A包括：α-MEM+10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF。
培养基B包括：α-MEM+10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF+200mIU/mL LH+2.5U/mL HCG。
对比例3
腔前卵泡微封装、冻存、纳米复温及体外3D培养的方法，具体操作如下：
1)腔前卵泡的水凝胶微封装：通过一个小的离心装置进行。离心装置由1.5mL特制的离心管和喷嘴组成。通过管盖上的孔将喷嘴(直径300μm)固定在特制离心管上。首先，将0.3mol/L氯化钙溶液加入特制离心管中，并将含有腔前卵泡的海藻酸钠溶液(浓度为1wt％)装入喷嘴中，并以100×g离心2分钟，得到生成装有腔前卵泡的海藻酸盐水凝胶微胶囊，再将其收集到培养基中以进行后续操作。
2)保护剂孵育及纳米颗粒的添加：将封装后的腔前卵泡浸入由水和1mol/L乙二醇+1mol/L丙二醇+1mol/L的海藻糖组成的低温保护剂中，孵育20分钟，然后将其移入由水和1mol/L乙二醇+1mol/L丙二醇+1mol/L的海藻糖+0.05％GO纳米颗粒组成的低温保护剂中孵育10分钟。
3)腔前卵泡的玻璃化冷冻保存：将含有纳米颗粒和卵泡的保护剂添加到麦管中，然后将麦管直接快速浸入液氮进行玻璃化冷冻保存。
4)腔前卵泡的纳米复温：将盛有37℃水的50mL离心管对准上边的已经打开近红外激光发射器，然后迅速的取出液氮中的麦管置于水浴中的近红外斑点下(功率为3W/cm2)进行纳米复温3-4s。
5)复温后腔前卵泡的体外原位培养：复温后取出麦管中水凝胶封装的腔前卵泡，直接置于之前已经装有100mL培养基A的96孔板中进行体外培养，每隔一天更换一半培养基，直到发育成腔前卵泡，然后更换为培养基B，继续培养16-22h，直至发育出成熟卵细胞。
培养基A包括：α-MEM+10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF。
培养基B包括：α-MEM+10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF+200mIU/mL LH+2.5U/mL HCG。
对比例4
腔前卵泡微封装、冻存、纳米复温及体外3D培养的方法，具体操作如下：
1)腔前卵泡的水凝胶微封装：通过一个小的离心装置进行。离心装置由1.5mL特制的离心管和喷嘴组成。通过管盖上的孔将喷嘴(直径300μm)固定在特制离心管上。首先，将0.3mol/L氯化钙溶液加入特制离心管中，并将含有腔前卵泡的海藻酸钠溶液(浓度为3wt％)装入喷嘴中，并以100×g离心2分钟，得到生成装有腔前卵泡的海藻酸盐水凝胶微胶囊，再将其收集到培养基中以进行后续操作。
2)保护剂孵育及纳米颗粒的添加：将封装后的腔前卵泡浸入由水和1mol/L乙二醇+1mol/L丙二醇+1mol/L的海藻糖组成的低温保护剂中，孵育20分钟，然后将其移入由水和1mol/L乙二醇+1mol/L丙0二醇+1mol/L的海藻糖+0.5％Fe3O4+0.05％GO纳米颗粒组成的低温保护剂中孵育10分钟。
3)腔前卵泡的玻璃化冷冻保存：将含有纳米颗粒和卵泡的保护剂添加到麦管中，然后将麦管直接快速浸入液氮进行玻璃化冷冻保存。
4)腔前卵泡的纳米复温：将盛有37℃水的50mL离心管放入通了45A电流的电磁线圈中，并对准上边的已经打开近红外激光发射器，然后迅速的取出液氮中的麦管置于水浴中的近红外斑点下(功率为15W/cm2)进行纳米复温1-2s。
5)复温后腔前卵泡的体外原位培养：复温后取出麦管中水凝胶封装的腔前卵泡，直接置于之前已经装有100mL培养基A的96孔板中进行体外培养，每隔一天更换一半培养基，直到发育成腔前卵泡，然后更换为培养基B，继续培养16-22h，直至发育出成熟卵细胞。
培养基A包括：α-MEM +10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF。
培养基B包括：α-MEM +10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF+200mIU/mL LH+2.5U/mL HCG。
对比例5
腔前卵泡直接置于装有100mL培养基的96孔板中进行体外培养，每隔一天更换一半培养基，直到发育成腔前卵泡，然后更换为培养基B，继续培养16-22h，直至发育出成熟卵细胞。
培养基A包括：α-MEM +10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF。
培养基B包括：α-MEM +10％(v/v)FBS+100mIU/mL FSH+ITS(1x)+1000IU/mL LIF+5μg/mL EGF+200mIU/mL LH+2.5U/mL HCG。
效果比较
表1冻后腔前卵泡的存活率：
组别 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 实施例1
重复1 59 72 76 60 89
重复2 56 73 73 65 92
重复3 55 70 72 62 90
均值(％) 56.7 71.7 73.7 62.3 90.3
结果表明，相对于其他处理组，实施例所得冻后腔前卵泡的存活率最高，与其他各对照组相比，皆存在显著性差异(p<0.05)。
表2冻后卵泡直径发育：
组别 1天 4天 7天 10天 13天
对比例5 125μm 250μm 295μm 356μm 362μm
实施例1 127μm 246μm 298μm 357μm 360μm
结果表明，相对于对比例5而言，经过冷冻复温的实施例1的卵泡在培养过程中和没有经过冷冻复温的新鲜卵泡发育情况表现一致，说明水凝胶封装以及光热和磁热相结合的纳米复温技术不会影响窦前卵泡的发育生长能力。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.卵泡的冷冻保存方法，包括：以海藻酸钠凝胶封装卵泡后，移入保护液A中孵育，然后移入保护液B中再次孵育，浸入液氮进行冻存；
所述海藻酸钠凝胶封装卵泡包括：采用离心微流控法，将卵泡与0.5wt％～2wt％海藻酸钠溶液混合，喷嘴内径为340μm，100×g离心2分钟，滴入0.1mol/L～0.5mol/L氯化钙溶液；
所述保护液A由水和1mol/L乙二醇、1mol/L丙二醇、1mol/L的海藻糖组成；
所述保护液B由水和1mol/L乙二醇、1mol/L丙二醇、1mol/L的海藻糖、0.5wt％Fe3O4纳米颗粒和0.05wt％GO纳米颗粒组成。
2.根据权利要求1所述的冷冻保存方法，其特征在于，所述卵泡为窦前卵泡。
3.权利要求1或2所述冷冻保存方法获得冻存卵泡的复苏方法，包括：将冻存的卵泡置于37℃，进行磁感应加热和近红外加热。
4.根据权利要求3所述的复苏方法，其特征在于，所述冻存的卵泡存在于麦管中，所述置于37℃为置于37℃的水中。
5.根据权利要求3所述的复苏方法，其特征在于，所述磁感应加热的电流为5A～30A。
6.根据权利要求4所述的复苏方法，其特征在于，所述近红外加热的功率为1W/cm2～10W/cm2。
7.权利要求3～6任一项所述复苏方法获得卵泡的体外培养方法，包括，将复苏后的细胞以培养基培养；
所述培养基包括培养基A和培养基B；
所述培养基A包括：α-MEM、8％(v/v)～12％(v/v)FBS、80～120mIU/mL FSH、1×～2×ITS、800～1200IU/mL LIF和3～7μg/mL EGF；
所述培养基B包括：α-MEM、8％(v/v)～12％(v/v)FBS、80～120mIU/mL FSH+1×～2×ITS+800～1200IU/mL LIF+3～7μg/mL EGF、150～250mIU/mL LH和2～3U/mLHCG。
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