JP4790370B2 - 実験動物初期胚のガラス化保存方法 - Google Patents
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Description
[1] 多価アルコールとして、10〜15%(v/v)のプロピレングリコールのみを含むリン酸緩衝液をベースとする哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用ガラス化保存液。
[2] 多価アルコールとして10〜15%(v/v)のプロピレングリコールおよび25〜35%(v/v)のエチレングリコールのみを含み、さらに15〜25%(v/v)のPercoll(登録商標)および0.2M〜0.5Mのスクロースを含むリン酸緩衝液をベースとする哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用ガラス化保存液。
[3] NaCl 700〜900mg/100mL、KCl 15〜25mg/100mL、CaCl28〜15mg/100mL、KH2PO4 15〜25mg/100mL、MgCl2・6H2O 7.5〜12.5mg/100mL、Na2HPO4 100〜130mg/100mL、Na-ピルビン酸 3〜4mg/100mL、グルコース75〜125mg/100mL、抗生物質 5〜10mg/100mL、BSA 250〜350mg/100mL、および10〜15%(v/v)のプロピレングリコールからなる[1]の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用ガラス化保存液。
[4] NaCl 700〜900mg/100mL、KCl 15〜25mg/100mL、CaCl28〜15mg/100mL、KH2PO4 15〜25mg/100mL、MgCl2・6H2O 7.5〜12.5mg/100mL、Na2HPO4 100〜130mg/100mL、Na-ピルビン酸 3〜4mg/100mL、グルコース75〜125mg/100mL、抗生物質 5〜10mg/100mL、BSA 250〜350mg/100mL、10〜15%(w/v)のプロピレングリコール、25〜35%(v/v)のエチレングリコール、15〜25%(v/v)のPercoll(登録商標)および0.2M〜0.5Mのスクロースからなる[2]の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用ガラス化保存液。
[6] 哺乳動物初期胚が哺乳動物2細胞期胚である[1]〜[5]のいずれかのガラス化保存液。
[7] 哺乳動物2細胞期胚がラット2細胞期胚であり、哺乳動物ES細胞が霊長類ES細胞である[6]のガラス化保存液。
[8] [1]もしくは[3]のガラス化保存液ならびに[2]、[4]および[5]のいずれかのガラス化保存液を含む哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞ガラス化保存用試薬キット。
[9] さらに、0.2M〜0.5Mのスクロースを含むリン酸緩衝液をベースとするガラス化保存哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用融解液を含む[8]の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存試薬キット。
[10] リン酸緩衝液をベースとするガラス化保存哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用融解液がNaCl 700〜900mg/100mL、KCl 15〜25mg/100mL、CaCl2 8〜15mg/100mL、KH2PO415〜25mg/100mL、MgCl2・6H2O 7.5〜12.5mg/100mL、Na2HPO4100〜130mg/100mL、Na-ピルビン酸 3〜4mg/100mL、グルコース75〜125mg/100mL、抗生物質 5〜10mg/100mL、BSA 250〜350mg/100mLおよび0.2M〜0.5Mのスクロースからなるガラス化保存哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用融解液である[9]の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞ガラス化保存試薬キット。
[12] 哺乳動物2細胞期胚がラット2細胞期胚であり、哺乳動物ES細胞が霊長類ES細胞である[11]のガラス化保存試薬キット。
[13] 哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞を[1]または[3]のガラス化保存液で前処理し、さらに[2]、[4]および[5]のいずれかのガラス化保存液に入れて凍結保存することを含む哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存方法。
[14] 哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞を[1]または[3]のガラス化保存液に室温で5〜10分間浸漬し、次いで30秒〜2分間0℃〜5℃の温度条件下に置き、さらに哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞を含む前記ガラス化保存液を、40〜60倍量の[2]、[4]および[5]のいずれかのガラス化保存液に入れて凍結保存することを含む[13]の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存方法。
[15] 哺乳動物初期胚が哺乳動物2細胞期胚である[13]または[14]の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存方法。
[16] 哺乳動物2細胞期胚がラット2細胞期胚であり、哺乳動物ES細胞が霊長類ES細胞である[15]の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存方法。
ガラス化保存の対象が哺乳動物の胚である場合、哺乳動物胚をガラス化保存液P10に1〜20分間、好ましくは3〜15分間、さらに好ましくは5〜10分間浸漬する。浸漬は室温(22〜25℃)で行えばよい。次いで浸漬により前処理した胚をガラス化保存液P10と共に凍結保存チューブに入れ、数十秒から数分間、好ましくは30秒〜2分間、さらに好ましくは1分間、0℃〜5℃、好ましくは0℃で冷却する。その後、P10に入れたまま、ガラス化保存液PEPeSに入れて-196℃以下の低温で凍結すればよい。凍結は例えば液体窒素を用いて行えばよい。この際の胚を含むP10とPEPeSの容積比は、1:99〜20:80であり、好ましくは2.5:97.5〜10:90であり、さらに好ましくは5:95である。あるいは、凍結しようとする胚を含むP10を4〜100倍量、好ましくは10〜75倍量、さらに好ましくは40〜60倍量、特に好ましくは45倍量のPEPeSに入れればよい。本発明のガラス化保存液P10は胚やES細胞をガラス化保存する場合の前処理に用いられるので、ガラス化保存前処理液ということもできる。
胚はラットの2細胞期胚を用いた。ラットはBrl Han:Wist@Jcl(GALAS)を使用した。メスは8〜12週齢、雄は12〜24週齢のものを用いた。供試胚は過排卵処置後に自然交配させたメスから採取した2細胞期胚を使用した。具体的には、メスラットにPMGSを150IU/kgの投与量で腹腔内に注射し、48時間後に、hCGを75IU/kgの投与量で腹腔内に注射した。hCG注射後直ちに交配し、翌朝スメアを採取し、性周期と精子進入を確認した。hCG注射後45時間後にスメア陽性メスから卵管かん流法で2細胞期胚を採取した。約1時間37℃、5%CO2、95%Airの条件で培養した後に、試験に用いた。
胚をP10に5分または10分間浸漬した後にSPB1に移し、2分間後にPB1で3回洗浄してから顕微鏡下での胚の形態観察による生存検査を行った。生存胚は胚移植を行い、胎子発生を検査した。
前処置は、胚をP10に2分、5分または10分間浸漬して行った。対照としてP10無処置の比較区も設けた。その後、胚を5μlの溶液と共にチューブに移して0℃で1分間冷却した。次に95μlのPEPeS(0℃)を注入して、1分後に液体窒素に入れてガラス化を行った。加温はチューブを液体窒素から室温に移した後、30秒後に900μlのSPB1(37℃)を注入し、10回程度ピペッティングして行った。回収した胚はPB1液に入れ、2分後に同液で3回洗浄してから顕微鏡下での胚の形態観察による生存検査を行った。生存胚は胚移植を行い、胎子発生を検査した。
マーモセットES細胞は、(財)実験動物中央研究所で樹立されたNo.40とNo.20の2系統を使用した(Sasaki E. et al., (2005) Establishment of Novel Embryonic Stem Cell Lines Derived from the Common Marmoset (Callithrix jacchus). Stem Cells. (in press))。保存実験には、トリプシン処理して分離した細胞塊(Clump)を、採卵ピペットで回収して使用した。
前処置として細胞塊を、室温(22〜25℃)下で1mlのP10に5分間浸漬した。次に細胞塊を5μlのP10と共に保存チューブ(Nunc 375353)に導入して0℃で1分間冷却した。その後、0℃に冷却した95μlのPEPeSをチューブに入れた。1分間0℃で静置した後、液体窒素(LN2)液層中に入れてガラス化保存をおこなった。保存した細胞塊の融解は以下の方法で行った。LN2からチューブを室温下に移動して、約30秒後に900μlのSPB1を注入して直ちに4〜5回ピペッティングを行う。次に融解した溶液中をシャーレに移し、細胞塊を採卵ピペットで回収した。回収した細胞塊はPB1に移して2分間静置、その後培養を開始した。
P10の濃度の検討のため、PB1にプロピレングリコールを0、5、10、15%の濃度で添加した溶液を用いてNo.40の細胞塊を保存した。またPEPeSの濃度検討は、PEPeSをPB1で75、50、0%に希釈した溶液を用いて保存を行った。保存後に加温を行ってから培養を開始、その4日後に倒立顕微鏡下の観察で細胞塊の生存数を確認した。
No.40を用いて既存方法との比較実験を行った。保存には本発明の方法かDAP213を用いたガラス化法及び、緩慢凍結方法を用いた。検証は培養4日後に倒立顕微鏡下の観察で細胞塊の生存数を確認して行った。
No.40とNo.20を用いて、細胞系統が違っても、本発明の方法が有効かを検証した。検証は、保存後に加温を行ってから培養を開始、その4日後に倒立顕微鏡下で観察して細胞塊の生存数を確認して行った。
No.40とNo.20を用いてガラス化保存、加温後のES細胞が未分化能を維持しているか検証した。保存した細胞塊は加温後に一定期間培養してから検証に使用した。免疫染色には、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81およびアルカリホスファターゼをES細胞のマーカーとして用いた。また融解後の細胞塊を免疫不全マウス(NOD/Scid/γcnull)の皮下に移植して、3ヶ月後にサンプリングを行い、移植した細胞塊のテラトーマ形成能を確認した。
Claims (12)
- NaCl 700〜900mg/100mL、KCl 15〜25mg/100mL、CaCl2 8〜15mg/100mL、KH2PO4 15〜25mg/100mL、MgCl2・6H2O 7.5〜12.5mg/100mL、Na2HPO4 100〜130mg/100mL、Na-ピルビン酸 3〜4mg/100mL、グルコース75〜125mg/100mL、抗生物質 5〜10mg/100mL、BSA 250〜350mg/100mL、および10〜15%(v/v)のプロピレングリコールからなる、多価アルコールとして10〜15%(v/v)のプロピレングリコールのみを含むリン酸緩衝液をベースとする哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用ガラス化保存液。
- NaCl 700〜900mg/100mL、KCl 15〜25mg/100mL、CaCl2 8〜15mg/100mL、KH2PO4 15〜25mg/100mL、MgCl2・6H2O 7.5〜12.5mg/100mL、Na2HPO4 100〜130mg/100mL、Na-ピルビン酸 3〜4mg/100mL、グルコース75〜125mg/100mL、抗生物質 5〜10mg/100mL、BSA 250〜350mg/100mL、10〜15%(v/v)のプロピレングリコール、25〜35%(v/v)のエチレングリコール、15〜25%(v/v)のPercoll(登録商標)および0.2M〜0.5Mのスクロースからなる、多価アルコールとして10〜15%(v/v)のプロピレングリコールおよび25〜35%(v/v)のエチレングリコールのみを含み、さらに15〜25%(v/v)のPercoll(登録商標)および0.2M〜0.5Mのスクロースを含むリン酸緩衝液をベースとする哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用ガラス化保存液。
- NaCl 700〜900mg/100mL、KCl 15〜25mg/100mL、CaCl2 8〜15mg/100mL、KH2PO4 15〜25mg/100mL、MgCl2・6H2O 7.5〜12.5mg/100mL、Na2HPO4 100〜130mg/100mL、Na-ピルビン酸 3〜4mg/100mL、グルコース75〜125mg/100mL、抗生物質 5〜10mg/100mLおよびBSA 250〜350mg/100mLからなる溶液に請求項2に記載のガラス化保存液を75〜100%(v/v)含有させた哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用ガラス化保存液。
- 請求項1に記載のガラス化保存液ならびに請求項2または3に記載のガラス化保存液を含む哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存用試薬キット。
- さらに、0.2M〜0.5Mのスクロースを含むリン酸緩衝液をベースとするガラス化保存哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用融解液を含む請求項4記載の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存試薬キット。
- リン酸緩衝液をベースとするガラス化保存哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用融解液がNaCl 700〜900mg/100mL、KCl 15〜25mg/100mL、CaCl2 8〜15mg/100mL、KH2PO4 15〜25mg/100mL、MgCl2・6H2O 7.5〜12.5mg/100mL、Na2HPO4 100〜130mg/100mL、Na-ピルビン酸 3〜4mg/100mL、グルコース 75〜125mg/100mL、抗生物質 5〜10mg/100mL、BSA 250〜350mg/100mLおよび0.2M〜0.5Mのスクロースからなるガラス化保存哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞用融解液である請求項5記載の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存試薬キット。
- 哺乳動物初期胚が哺乳動物2細胞期胚である請求項4〜6のいずれか1項に記載のガラス化保存試薬キット。
- 哺乳動物2細胞期胚がラット2細胞期胚であり、哺乳動物ES細胞が霊長類ES細胞である請求項7記載のガラス化保存試薬キット。
- 哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞を請求項1に記載のガラス化保存液で前処理し、さらに請求項2または3に記載のガラス化保存液に入れて凍結保存することを含む哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存方法。
- 哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞を請求項1に記載のガラス化保存液に室温で5〜10分間浸漬し、次いで30秒〜2分間0℃〜5℃の温度条件下に置き、さらに哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞を含む前記ガラス化保存液を、40〜60倍量の請求項2または3に記載のガラス化保存液に入れて凍結保存することを含む請求項9記載の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存方法。
- 哺乳動物初期胚が哺乳動物2細胞期胚である請求項9または10に記載の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存方法。
- 哺乳動物2細胞期胚がラット2細胞期胚であり、哺乳動物ES細胞が霊長類ES細胞である請求項11記載の哺乳動物初期胚または哺乳動物ES細胞のガラス化保存方法。
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