KR20070042056A - 실험 동물 초기 배아의 유리화 보존 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 다가 알코올로서, 10 내지 15 ％(w/v)의 프로필렌글리콜만을 포함하는 인산 완충액을 베이스로 하는 유리화 보존액 및 다가 알코올로서 10 내지 15 ％(w/v)의 프로필렌글리콜 및 25 내지 35 ％(w/v)의 에틸렌글리콜만을 포함하고, 또한 15 내지 25 ％(w/v)의 퍼콜(등록 상표) 및 0.2 M 내지 0.5 M의 수크로오스를 포함하는 인산 완충액을 베이스로 하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포 유리화 보존액, 및 이들을 이용한 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포 유리화 보존 방법을 제공한다.
포유 동물 초기 배아, 포유 동물 ES 세포, 유리화 보존 방법.

Description

실험 동물 초기 배아의 유리화 보존 방법 {Vitrification Cryopreservation Of Initial Embryo Of Experimental Animals}
도 1은 융해 후의 ES 세포의 생존성과 P10 중의 프로필렌글리콜 농도의 관계를 나타내는 도면.
도 2는 융해 후의 ES 세포의 생존성과 PEPeS 농도의 관계를 나타내는 도면.
도 3은 PEPeS 농도에 의한 고체면의 양상을 나타내는 도면.
도 4는 각종 방법으로 보존한 ES 세포의 융해 후의 생존성을 나타내는 도면.
도 5는 복수의 ES 세포 계통을 본 발명의 방법으로 보존한 결과를 나타내는 도면.
도 6은 유리화 보존한 마모셋(Marmoset) ES 세포의 염색 결과를 나타내는 도면.
도 7은 유리화 보존한 마모셋 ES 세포를 이용한 테라토마 형성 실험의 결과를 나타내는 도면.
<비특허 문헌 1> Nakao K. et al., Exp. Anim. 46(3), 31-234, 1997
<비특허 문헌 2> D.G. Whittingham, J. Reprod. Fert. (1975)43, 575-578
<비특허 문헌 3> M. S. Han et al., Theriogenology 59(2003) 1851-1863
<비특허 문헌 4> Fujioka T et al., (2004) Int. J. Dev. Biol. 48:1149-1154
<비특허 문헌 5> Reubinoff B. E. et al., (2001) HumanReprod. Vol. 16, No.10 2187-2194
본 발명은 포유 동물 초기 배아 또는 ES 세포의 유리화 보존하는 방법에 관한 것이다.
실험 동물학 및 그의 주변 산업에 있어서 배아의 동결 보존 기술은 생식 공학 등을 이용한 동물 생산이나 계통 보존 등의 기초를 이루는 중요한 기술이다. 이미 마우스에서는, 채취의 용이함 때문에, 2 세포기 배아를 이용한 보존이 행해지고 있다(비특허 문헌 1 참조).
그러나, 래트의 2 세포기 배아 등의 초기 배아를 보존하면, 그의 복원율은 나빠서 반드시 무처치 배아와 동일한 태자(胎子)로의 발생률을 얻을 수 없다(비특허 문헌 2 및 3 참조). 이와 같이 실험 동물 배아의 동결 보존 기술에는 아직 개선되어야 할 점이 많다.
한편, 영장류의 ES 세포는 발생의 연구, 유전자 개변(改變) 동물의 제조, 재생 의료 등의 임상에의 이용이 기대되고 있다. 이 ES 세포를 상기 목적으로 효율적으로 사용하기 위해서는, 세포를 대규모로 증식시켜 보존하고, 필요시에 필요량 을 공급하는 것이 필요하였다. 또한, 세포 배양은 항상 형질의 변이 위험이 있고, 그 때문에 수립한 세포의 일부를 보존하는 것도 필요하다. 이미 영장류 ES 세포의 보존은 몇 종류인가의 방법이 보고되어 있다. 그러나, 세포 생존율이 높은 방법(비특허 문헌 4 참조)은, 20 내지 30 정도의 ES 세포 덩어리(Clump)를 보존하는 것밖에 할 수 없다. 또한, 대량의 ES 세포를 한번에 보존시키는 방법(비특허 문헌 5 참조)은 있지만, 융해 후의 세포 생존율은 10 내지 20 ％로 현저하게 낮다. 따라서, 한번에 대량의 ES 세포를 보존할 수 있고, 또한 융해 후의 세포 생존성이 높으며, 미분화능을 유지할 수 있는 방법이 요망되었다.
고농도로 내동제(耐凍劑)를 포함하는 용액을 직접 액체 질소 중 또는 액체 질소 가스 중에 투입하면, 용액이 빙정(氷晶)화되지 않고 유리화라고 불리는 상태를 형성하는 것으로 알려져 있다. 유리화는 본질적으로 결정을 형성하지 않고 용액이 고체화하는 것이다. 유리화를 이용하여 동물 세포를 보존하는 방법이 여러가지 개발되어 있다. 그러나, 래트 초기 배아나 포유 동물 ES 세포에 대해서는, 개체 복원성이 우수한 보존법은 없었다.
본 발명은 동물 초기 배아 또는 동물 ES 세포의 유리화 보존을 위한 유리화 보존액 및 유리화 보존 방법의 제공을 목적으로 한다.
본 발명자들은 래트의 2 세포기 배아 및 영장류의 ES 세포의 보존에 대하여 예의 검토하여, 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 보존에 적합한 신 규한 유리화 보존액을 개발하고, 또한 상기 유리화 보존액을 이용한 유리화 보존 방법을 개발하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
[1] 다가 알코올로서, 10 내지 15 ％(v/v)의 프로필렌글리콜만을 포함하는 인산 완충액을 베이스로 하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 유리화 보존액.
[2] 다가 알코올로서 10 내지 15 ％(v/v)의 프로필렌글리콜 및 25 내지 35 ％(v/v)의 에틸렌글리콜만을 포함하고, 또한 15 내지 25 ％(v/v)의 퍼콜(Percoll)(등록 상표) 및 0.2 M 내지 0.5 M의 수크로오스를 포함하는 인산 완충액을 베이스로 하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 유리화 보존액.
[3] [1]에 있어서, NaCl 700 내지 900 mg/100 mL, KCl 15 내지 25 mg/100 mL, CaCl2 8 내지 15 mg/100 mL, KH2PO4 15 내지 25 mg/100 mL, MgCl2ㆍ6H20 7.5 내지 12.5 mg/100 mL, Na2HPO4 100 내지 130 mg/100 mL, Na-피루브산 3 내지 4 mg/100 mL, 글루코오스 75 내지 125 mg/100 mL, 항생 물질 5 내지 10 mg/100 mL, BSA 250 내지 350 mg/100 mL, 및 10 내지 15 ％(v/v)의 프로필렌글리콜을 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 유리화 보존액.
[4] [2]에 있어서, NaCl 700 내지 900 mg/100 mL, KCl 15 내지 25 mg/100 mL, CaCl2 8 내지 15 mg/100 mL, KH2PO4 15 내지 25 mg/100 mL, MgCl2ㆍ6H20 7.5 내지 12.5 mg/100 mL, Na2HPO4 100 내지 130 mg/100 mL, Na-피루브산 3 내지 4 mg/100 mL, 글루코오스 75 내지 125 mg/100 mL, 항생 물질 5 내지 10 mg/100 mL, BSA 250 내지 350 mg/100 mL, 및 10 내지 15 ％(v/v)의 프로필렌글리콜, 25 내지 35 ％(v/v)의 에틸렌글리콜, 15 내지 25 ％(v/v)의 퍼콜(등록 상표) 및 0.2 M 내지 0.5 M의 수크로오스를 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 유리화 보존액.
[5] NaCl 700 내지 900 mg/100 mL, KCl 15 내지 25 mg/100 mL, CaCl2 8 내지 15 mg/100 mL, KH2PO4 15 내지 25 mg/100 mL, MgCl2ㆍ6H20 7.5 내지 12.5 mg/100 mL, Na2HPO4 100 내지 130 mg/100 mL, Na-피루브산 3 내지 4 mg/100 mL, 글루코오스 75 내지 125 mg/100 mL, 항생 물질 5 내지 10 mg/100 mL 및 BSA 250 내지 350 mg/100 mL를 포함하는 용액에 [4]의 유리화 보존액을 75 내지 100 ％(v/v) 함유시킨 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 유리화 보존액.
[6] [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 있어서, 포유 동물 초기 배아가 포유 동물 2 세포기 배아인 유리화 보존액.
[7] [6]에 있어서, 포유 동물 2 세포기 배아가 래트 2 세포기 배아이고, 포유 동물 ES 세포가 영장류 ES 세포인 유리화 보존액.
[8] [1] 또는 [3]의 유리화 보존액 및 [2], [4] 및 [5] 중 어느 하나의 유리화 보존액을 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존용 시약 키트.
[9] [8]에 있어서, 0.2 M 내지 0.5 M의 수크로오스를 포함하는 인산 완충액 을 베이스로 하는 유리화 보존 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 융해액을 더 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 시약 키트.
[10] [9]에 있어서, 인산 완충액을 베이스로 하는 유리화 보존 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 융해액이 NaCl 700 내지 900 mg/100 mL, KCl 15 내지 25 mg/100 mL, CaCl2 8 내지 15 mg/100 mL, KH2PO4 15 내지 25 mg/100 mL, MgCl2ㆍ6H20 7.5 내지 12.5 mg/100 mL, Na2HPO4 100 내지 130 mg/100 mL, Na-피루브산 3 내지 4 mg/100 mL, 글루코오스 75 내지 125 mg/100 mL, 항생 물질 5 내지 10 mg/100 mL, BSA 250 내지 350 mg/100 mL, 및 0.2 M 내지 0.5 M의 수크로오스를 포함하는 유리화 보존 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 융해액인 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 시약 키트.
[11] [8] 내지 [10] 중 어느 하나에 있어서, 포유 동물 초기 배아가 포유 동물 2 세포기 배아인 유리화 보존 시약 키트.
[12] [11]에 있어서, 포유 동물 2 세포기 배아가 래트 2 세포기 배아이고, 포유 동물 ES 세포가 영장류 ES 세포인 유리화 보존 시약 키트.
[13] 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포를 [1] 또는 [3]에 기재된 유리화 보존액으로 전처리하고, [2], [4] 및 [5] 중 어느 하나에 기재된 유리화 보존액에 넣어 동결 보존하는 것을 더 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 방법.
[14] [13]에 있어서, 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포를 [1] 또는 [3]에 기재된 유리화 보존액에 실온에서 5 내지 10 분간 침지하고, 계속해서 30 초 내지 2 분간 0 ℃ 내지 5 ℃의 온도 조건하에 두며, 또한 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포를 포함하는 상기 유리화 보존액을, 40 내지 60 배량의 [2], [4] 및 [5] 중 어느 하나의 유리화 보존액에 넣어 동결 보존하는 것을 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 방법.
[15] [13] 또는 [14]에 있어서, 포유 동물 초기 배아가 포유 동물 2 세포기 배아인 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 방법.
[16] [15]에 있어서, 포유 동물 2 세포기 배아가 래트 2 세포기 배아이고, 포유 동물 ES 세포가 영장류 ES 세포인 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 방법.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
본 발명의 포유 동물 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존을 위한 유리화 보존액으로는, 인산 완충액을 베이스로 하는 보존액이고, 수정(修正) 인산 완충액(PB1)에 프로필렌글리콜을 첨가한 PB10 및 PB1에 프로필렌글리콜, 에틸렌글리콜, 퍼콜(등록 상표) 및 수크로오스를 첨가한 PEPeS가 있다.
PB1은, NaCl 700 내지 900 mg/100 mL, 바람직하게는 800 mg/mL; KCl 15 내지 25 mg/100 mL, 바람직하게는 20 mg/mL; CaCl2 8 내지 15 mg/100 mL, 더욱 바람직하게는 12 mg/100 mL; KH2PO4 15 내지 25 mg/100 mL, 바람직하게는 20 mg/100 mL; MgCl2ㆍ6H2O 7.5 내지 12.5 mg/100 mL, 바람직하게는 10 mg/100 mL; Na2HPO4 100 내지 130 mg/100 mL, 바람직하게는 115 mg/100 mL; Na-피루브산 3 내지 4 mg/100 mL, 바람직하게는 3.6 mg/100 mL; 글루코오스 75 내지 125 mg/100 mL, 바람직하게는 100 mg/100 mL; 페니실린 G 5 내지 10 mg/100 mL, 바람직하게는 7.5 mg/100 mL; 및 BSA 250 내지 350 mg/100 mL, 바람직하게는 300 mg/100 mL를 포함하고, 전형적으로는 후술하는 표 1의 조성을 갖는다.
P10은, PB1에 5 내지 15 ％(v/v), 바람직하게는 10 내지 15 ％(v/v), 특히 바람직하게는 10 ％(v/v)의 프로필렌글리콜을 첨가한 것이다. 또한, PEPeS는, PB1에 5 내지 15 ％(v/v), 바람직하게는 10 내지 15 ％(v/v), 특히 바람직하게는 10 ％(v/v)의 프로필렌글리콜, 25 내지 35 ％(v/v), 바람직하게는 30 ％(v/v)의 에틸렌글리콜, 15 내지 25 ％(v/v), 바람직하게는 20 ％(v/v)의 퍼콜(등록상표), 및 0.2 M 내지 0.5 M, 바람직하게는 0.3 M의 수크로오스를 첨가한 것이다. 본 발명의 유리화 보존액은 글리세롤, 폴리에틸렌글리콜을 포함하지 않고 다가 알코올로서 프로필렌글리콜만을 포함하거나 또는 프로필렌글리콜 및 에틸렌글리콜만을 포함한다. 또한, 본 발명의 유리화 보존액은 디메틸술폭시드를 포함하지 않는다. PEPeS는 PB1을 더 혼합하여 PEPeS 농도 50 내지 100 ％(v/v), 바람직하게는 75 내지 100 ％로 이용할 수도 있다.
상기 중, 페니실린 G 대신에 스트렙토마이신, 겐타마이신 등의 다른 항생 물질을 포함할 수도 있고, 또한 복수의 구성 물질을 포함할 수도 있다. 또한, BSA( 소태아 혈청) 대신에 말, 양, 염소 등의 태아 혈청을 포함할 수도 있다.
본 발명의 유리화 보존의 대상은 포유 동물 초기 배아이고, 동물종 및 배아의 단계는 한정되지 않지만, 바람직한 동물종은 설치류, 영장류이고, 설치류, 특히 래트가 바람직하다. 또한, 배아의 단계는 2 세포 배아기가 바람직하다. 또한, 본 발명의 유리화 보존의 대상은 포유 동물 ES 세포를 포함한다. ES 세포는 포유 동물 ES 세포이고, 바람직하게는 영장류 ES 세포이다. 포유 동물의 배아는 공지된 방법으로 채취할 수 있고, 또한 포유 동물 ES 세포는 공지된 방법으로 수립할 수 있다.
본 발명의 유리화 보존은 상기 유리화 보존액 P10 및 PEPeS를 이용한다.
유리화 보존의 대상이 포유 동물의 배아인 경우, 포유 동물 배아를 유리화 보존액 P10에 1 내지 20 분간, 바람직하게는 3 내지 15 분간, 더욱 바람직하게는 5 내지 10 분간 침지한다. 침지는 실온(22 내지 25 ℃)에서 행할 수 있다. 계속해서 침지에 의해 전처리한 배아를 유리화 보존액 P10과 함께 동결 보존 튜브에 넣어, 수십 초 내지 수분 간, 바람직하게는 30 초 내지 2 분간, 더욱 바람직하게는 1 분간, 0 ℃ 내지 5 ℃, 바람직하게는 0 ℃에서 냉각시킨다. 그 후, P10에 넣은 채로, 유리화 보존액 PEPeS에 넣어 -196 ℃ 이하의 저온에서 동결시킬 수 있다. 동결은 예를 들면 액체 질소를 이용하여 행할 수 있다. 이 때의 배아를 포함하는 P10과 PEPeS의 용적비는 1:99 내지 20:80이고, 바람직하게는 2.5:97.5 내지 10:90이며, 더욱 바람직하게는 5:95이다. 또는, 동결하고자 하는 배아를 포함하는 P10을 4 내지 100배량, 바람직하게는 10 내지 75배량, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 배량, 특히 바람직하게는 45배량의 PEPeS에 넣을 수 있다. 본 발명의 유리화 보존액 P10은 배아나 ES 세포를 유리화 보존하는 경우의 전처리에 이용되기 때문에, 유리화 보존 전처리액이라고 말할 수도 있다.
본 발명의 유리화 방법에 의해 동결 보존한 배아 또는 ES 세포는, 예를 들면 동결 배아 또는 ES 세포를 포함하는 동결 튜브를 액체 질소로부터 꺼내어 10 초 내지 60 초, 바람직하게는 약 30 초 실온에 두고, 그 후 5 내지 10배량의 실온에 유지한 융해용 용액을 주입하여 융해시키고, 그 후 융해용 용액으로 배아 또는 ES 세포를 세정할 수 있다. 융해용 용액은 한정되지 않지만, 예를 들면 상기 BP1에 0.2 내지 0.5 M, 바람직하게는 0.3 M의 수크로오스를 첨가한 용액을 사용할 수 있다.
본 발명의 유리화 방법에 의해 동결 보존한 배아는, 융해 후의 생존율이 높고, 배아 이식 후의 태자 발생률이 높다. 또한, 본 발명의 유리화법에 의해 동결 보존한 ES 세포는 융해 후의 생존율이 높고, 다능성도 유지하고 있다.
본 발명은 또한 상기 유리화 보존액 P10 및 유리화 보존액 PEPeS의 상기 두 가지를 각각 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포 보존용 시약 키트도 포함한다. 상기 키트는 상기한 바와 같이, 최초에 유리화 보존액 P10을 이용하여 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포를 전처리하고, 또한 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포를 PEPeS에 넣어 동결 보존하여 이용한다.
본 발명의 방법을 CIEA 방법이라 부르는 경우도 있다.
<실시예>
본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실 시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 래트 2 세포기 배아의 유리화 보존
배아는 래트의 2 세포기 배아를 이용하였다. 래트는 Brl Han:Wist@ Jcl(GALAS)을 사용하였다. 암컷은 8 내지 12 주령, 수컷은 12 내지 24 주령의 것을 이용하였다. 공시(供試) 배아는 과배란 처치 후에 자연 교배시킨 암컷으로부터 채취한 2 세포기 배아를 사용하였다. 구체적으로는, 암컷 래트에 PMGS를 150 IU/kg의 투여량으로 복강 내에 주사하고, 48 시간 후에 hCG를 75 IU/kg의 투여량으로 복강 내에 주사하였다. hCG 주사 후 즉시 교배하고, 다음날 아침 스미어를 채취하여, 성주기와 정자 진입을 확인하였다. hCG 주사 후 45 시간 후에 스미어 양성 암컷으로부터 난관 관류법으로 2 세포기 배아를 채취하였다. 약 1 시간, 37 ℃, 5 ％ CO2, 95 ％ 공기의 조건에서 배양한 후에, 시험에 이용하였다.
유리화에는, 인산 완충액을 수정한 PB1액(표 1)에 10 ％ 프로필렌글리콜을 첨가한 용액(P10)과, PB1액에 10 ％ 프로필렌글리콜, 30 ％ 에틸렌글리콜, 20 ％ 퍼콜(등록 상표), 0.3 M 수크로오스를 첨가한 용액(PEPeS)을 이용하였다. 또한, 가온(加溫)에는, PB1에 0.3 M 수크로오스를 첨가한 용액(SPB1)을 사용하였다.
Figure 112005060689547-PAT00001
유리화 보존을 이하와 같이 하여 행하였다. 전처치로서 2 세포기 배아를, 실온(22 내지 25 ℃)하에서 100 ㎕의 P10에 5 분간 침지하였다. 다음에 초기 배아를 5 ㎕의 P10과 함께 보존 튜브(Nunc 375353)에 도입하여 0 ℃에서 1 분간 냉각시켰다. 그 후, 0 ℃로 냉각시킨 95 ㎕의 PEPeS를 튜브에 넣었다. 1 분간 0 ℃에서 정치한 후, 액체 질소(LN2)액층 중에 넣어 유리화 보존을 행하였다.
보존한 초기 배아의 융해는 이하의 방법으로 행하였다. LN2로부터 튜브를 실온하로 이동시키고, 약 30 초 후에 900 ㎕의 SPB1을 주입하여 즉시 4 내지 5회 피펫팅을 행한다. 다음에 융해된 용액을 샤알레에 옮기고, 초기 배아를 채란(採卵) 피펫으로 회수하였다. 회수한 세포 덩어리는 PB1에 옮겨 2 분간 정치하고, 그 후 PB1액으로 2회 세정하여 그 후의 실험에 사용하였다.
전처치의 검토
배아를 P10에 5 분 또는 10 분간 침지한 후에 SPB1에 옮기고, 2 분 후에 PB1로 3회 세정하고 나서 현미경하에서의 배아의 형태 관찰에 의한 생존 검사를 행하였다. 생존 배아는 배아 이식을 행하여, 태자 발생을 검사하였다.
배아의 생존율(표 2)은 모두 100 ％였다. 또한, 태자로의 발생률(표 3)은 5 분ㆍ10 분(72.4 내지 81.7 ％) 모두 높은 값이었다. 이로부터, 전처치 용액에의 침지는, 5 내지 10 분이면, 그 후의 배아의 발생에는 영향이 없는 것으로 판명되었다.
Figure 112005060689547-PAT00002
Figure 112005060689547-PAT00003
유리화 보존의 검토
전처치는, 배아를 P10에 2 분, 5 분 또는 10 분간 침지하여 행하였다. 대조로서 P10 무처치의 비교구도 설치하였다. 그 후, 배아를 5 ㎕의 용액와 함께 튜브에 옮겨 0 ℃에서 1 분간 냉각시켰다. 다음에 95 ㎕의 PEPeS(0 ℃)를 주입하고, 1 분 후에 액체 질소에 넣어 유리화를 행하였다. 가온은 튜브를 액체 질소로부터 실온으로 옮긴 후, 30 초 후에 900 ㎕의 SPB1(37 ℃)을 주입하여, 10회 정도 피펫팅하여 행하였다. 회수한 배아는 PB1액에 넣고, 2 분 후에 동일한 액으로 3회 세정하고 나서 현미경하에서의 배아의 형태 관찰에 의한 생존 검사를 행하였다. 생존 배아는 배아 이식을 행하여 태자 발생을 검사하였다.
P10 무처치의 비교구(63.3 ％)를 제외하고, P10에서 전처치를 행한 배아의 생존율은 모두(92.0 내지 93.6 ％) 높은 값이었다(표 4). 이 결과로부터 전처치로서 P10에 침지하는 것이 융해 후의 배아의 생존성을 향상시키는 것으로 판명되었다. 융해된 배아의 태자 발생(표 5)은, P10 무처치에서는 0 ％였다. 또한, P10으로 전처치를 행한 구의 발생률은 45.5 내지 65.2 ％이며, 5 분간 처치한 경우에 가장 고율이었다.
Figure 112005060689547-PAT00004
Figure 112005060689547-PAT00005
이상의 결과로부터, 신규 유리화 보존액을 사용한 경우, 배아를 P10에 5 분간 침지한 후에 유리화하는 방법이, 래트의 2 세포기 배아의 보존에 효과적인 것이 분명해졌다.
실시예 2 마모셋 ES 세포의 유리화 보존
마모셋 ES 세포는, (財)실험 동물 중앙 연구소에서 수립된 No.40과 No.20의 2 계통을 사용하였다(문헌[Sasaki E. et al., (2005) Establishment of Novel Embryonic Stem Cell Lines Derived from the Common Marmoset (Callithrix jacchus). Stem Cells. (in press)]). 보존 실험에는, 트립신 처리하여 분리한 세포 덩어리를, 채란 피펫으로 회수하여 사용하였다.
본 발명의 방법의 유리화 보존에는, PB1에 10 ％ 프로필렌글리콜을 첨가한 전처치 용액(P10)과, PB1에 10 ％ 프로필렌글리콜, 30 ％ 에틸렌글리콜, 20 ％ 퍼콜(등록 상표), 0.3 M 수크로오스를 첨가한 용액(PEPeS)을 이용하였다. 또한, 융해에는, PB1에 0.3 M 수크로오스를 첨가한 용액(SPB1)을 이용하였다.
비교구의 유리화 보존(문헌[Fujioka T. et al., Int. J. Dev. Biol. 48:1149-1154])에는, PB1에 2 몰의 DMDO, 1 몰의 아세트아미드, 3 몰의 프로필렌글리콜을 첨가한 용액(DAP213)을 이용하였다. 또한, 완만 동결(문헌[Reubinoff B. E. et al., HumanReprod. Vol.16, No.10 2187-2194)에는 10 ％ DMSO를 FCS에 첨가한 용액(SF)을 사용하였다.
ES 세포의 보존과 융해 방법은 이하와 같았다.
전처치로서 세포 덩어리를 실온(22 내지 25 ℃)하에서 1 ml의 P10에 5 분간 침지하였다. 다음에 세포 덩어리를 5 ㎕의 P10과 함께 보존 튜브(Nunc 375353)에 도입하여 0 ℃에서 1 분간 냉각시켰다. 그 후, 0 ℃로 냉각시킨 95 ㎕의 PEPeS를 튜브에 넣었다. 1 분간 0 ℃에서 정치한 후, 액체 질소(LN2)액층 중에 넣어 유리화 보존을 행하였다. 보존한 세포 덩어리의 융해는 이하의 방법으로 행하였다. LN2로부터 튜브를 실온하로 이동하고, 약 30 초 후에 900 ㎕의 SPB1을 주입하여 즉시 4 내지 5회 피펫팅을 행한다. 다음에 융해된 용액을 샤알레에 옮기고, 세포 덩어리를 채란 피펫으로 회수하였다. 회수한 세포 덩어리는 PB1에 옮겨 2 분간 정치하고, 그 후 배양을 개시하였다.
비교구의 유리화 보존(문헌[Fujioka T. et al., Int. J. Dev. Biol. 48:1149-1154])은, 200 ㎕의 DAP213에 세포 덩어리를 넣고, 15 초 후에 LN2로 냉각시켜 행하였다. 융해는 LN2하에서 보존한 튜브를 실온으로 이동하여, 37 ℃의 PB1을 900 ㎕ 주입하고, 그 후 피펫팅하여 행하였다. 완만 동결은, 실온하에서 100 μ의 SF 액에 세포 덩어리를 넣어, 1 ℃/분의 속도로 -80 ℃까지 냉각시키고, O/N 후에 LN2에 넣었다. 보존한 세포 덩어리는, LN2로부터 튜브를 꺼내어 37 ℃ 수욕에서 융해시킨 후, 세포 덩어리를 PB1로 세정하고 나서 배양을 개시하였다.
모든 실험에서, 세포 덩어리는 1 튜브에 50개 넣고, 7 일간 LN2 액층 내에서 보존하였다. 또한, 튜브는 동일한 형태를 사용하였다.
유리화 보존에 이용하는 용액의 농도 설정
P10 농도의 검토를 위해, PB1에 프로필렌글리콜을 0, 5, 15 ％의 농도로 첨가한 용액을 이용하여 No.40의 세포 덩어리를 보존하였다. 또한, PEPeS의 농도 검토는, PEPeS를 PB1로 75, 50, 0 ％로 희석한 용액을 이용하여 보존을 행하였다. 보존 후에 가온하고 나서 배양을 개시하고, 그의 4 일 후에 도립(倒立) 현미경하의 관찰에 의해 세포 덩어리의 생존수를 확인하였다.
P10의 농도 검증(도 1)에서는, 미보존의 비교구에 대하여 0, 5 ％는 의미 있게 낮은 값이 되었다. 이에 대하여, 10 ％(P10)와 15 ％의 구는 비교구와 차이가 없었다. 이로부터, 유리화 보존에는 프로필렌글리콜 10 내지 15 ％ 구가 최적인 것을 알 수 있었다. 그러나, 동해(凍害) 보호제는 통상적으로 농도가 높아지면 세포 독성을 야기하기 때문에, 보다 낮은 농도인 10 ％의 구를 이용하는 것으로 하였다.
PEPeS의 농도 검증(도 2)에서는, 비교구에 대하여 0과 50 ％의 구는 의미 있게 낮은 결과가 되었다. 이에 대하여 100 ％와 75 ％의 구는 비교구와 의미 있는 차이는 없었다. 이로부터 보존에는 PEPeS 100 내지 75 ％의 구가 효과적인 것을 알 수 있었다. 그러나, PEPeS 농도의 저하는 용액의 탈유리화를 초래하였다. 특히 75 ％의 구에서는 유리화 면에 흰 스폿(도 3)이 확인되었다. 이것은 일부 빙정이 생긴 것을 나타내고, 튜브 내의 보존 조건이 균일하지 않은 것을 알 수 있었다. 그 때문에 보존에는 100 ％ PEPeS를 이용하는 것으로 하였다.
다른 보존 방법과의 비교
No.40을 이용하여 기존 방법과의 비교 실험을 행하였다. 보존에는 본 발명의 방법이나 DAP213을 이용한 유리화법 및 완만 동결 방법을 이용하였다. 검증은 배양 4 일 후에 도립 현미경하의 관찰에 의해 세포 덩어리의 생존수를 확인하여 행하였다.
비교구와 PEPeS구 사이에는 차이는 보이지 않았다(도 4). 이에 대하여 SF구와 DAP213구는 의미 있게 낮은 값이었다. 특히 DAP213구에 대하여 PEPeS구는 의미 있게 높은 값으로 되어 있었기 때문에, 동일한 유리화 보존에서도, 본 발명의 방법이 마모셋 ES 세포의 보존에 적합한 것을 알 수 있었다.
복수의 세포 계통에서의 비교
No.40과 No.20을 이용하여, 세포 계통이 다르더라도, 본 발명의 방법이 유효한 가를 검증하였다. 검증은, 보존 후에 가온하고 나서 배양을 개시하고, 그의 4 일 후에 도립 현미경하에서 관찰하여 세포 덩어리의 생존수를 확인하여 행하였다.
No.40과 No.20에서 비교구와 유리화 사이에 의미 있는 차이는 확인되지 않았다(도 5).
보존 후의 ES 세포의 미분화능의 유지
No.40과 No.20을 이용하여 유리화 보존, 가온 후의 ES 세포가 미분화능을 유지하고 있는 가를 검증하였다. 보존한 세포 덩어리는 가온 후에 일정 기간 배양하고 나서 검증에 사용하였다. 면역 염색에는, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 및 알칼리 포스파타아제를 ES 세포의 마커로서 이용하였다. 또한, 융해 후의 세포 덩어리를 면역 부전(不全) 마우스(NOD/Scid/γcnull)의 피하에 이식하고, 3 개월 후에 샘플링을 행하여, 이식한 세포 덩어리의 테라토마 형성능을 확인하였다.
모든 염색에 있어서, 미보존의 ES 세포(문헌[Sasaki E. et al., (2005) Establishment of Novel Embryonic Stem Cell Lines Derived from the Common Marmoset (Callithrix jacchus). Stem Cells. (in press)])의 보고와 동일한 결과(도 6)가 되었다. 또한, 테라토마 형성 실험(도 7)에서는, No.40에서 혈관, 근육, 지방이 확인되었고, No.20에서는 털, 모낭, 연골, 편평 상피가 확인되었다. 이들도 미보존의 세포(문헌[Sasaki E. et al., (2005) Establishment of Novel Embryonic Stem Cell Lines Derived from the Common Marmoset (Callithrix jacchus). Stem Cells. (in press)])의 보고와 동일한 결과였다.
이들 결과로부터, 본 발명의 유리화 보존 방법은, 영장류 ES 세포의 보존법으로서 효과적인 것을 알 수 있었다.
본 발명의 유리화 보존액은, 래트 2 세포기 배아나 영장류 ES 세포 등의 동물 초기 배아 또는 동물 ES 세포의 보존에 적합하고, 본 발명의 보존액을 이용한 본 발명의 유리화 보존 방법에 의해 동물 초기 배아 또는 동물 ES 세포를 동결 보존하면, 융해 후의 높은 생존율 및 개체 복원율을 달성할 수 있다.

Claims (16)

  1. 다가 알코올로서, 10 내지 15 ％(v/v)의 프로필렌글리콜만을 포함하는 인산 완충액을 베이스로 하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 유리화 보존액.
  2. 다가 알코올로서 10 내지 15 ％(v/v)의 프로필렌글리콜 및 25 내지 35 ％(v/v)의 에틸렌글리콜만을 포함하고, 또한 15 내지 25 ％(v/v)의 퍼콜(Percoll)(등록 상표) 및 0.2 M 내지 0.5 M의 수크로오스를 포함하는 인산 완충액을 베이스로 하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 유리화 보존액.
  3. 제1항에 있어서, NaCl 700 내지 900 mg/100 mL, KCl 15 내지 25 mg/100 mL, CaCl2 8 내지 15 mg/100 mL, KH2PO4 15 내지 25 mg/100 mL, MgCl2ㆍ6H20 7.5 내지 12.5 mg/100 mL, Na2HPO4 100 내지 130 mg/100 mL, Na-피루브산 3 내지 4 mg/100 mL, 글루코오스 75 내지 125 mg/100 mL, 항생 물질 5 내지 10 mg/100 mL, BSA 250 내지 350 mg/100 mL, 및 10 내지 15 ％(v/v)의 프로필렌글리콜을 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 유리화 보존액.
  4. 제2항에 있어서, NaCl 700 내지 900 mg/100 mL, KCl 15 내지 25 mg/100 mL, CaCl2 8 내지 15 mg/100 mL, KH2PO4 15 내지 25 mg/100 mL, MgCl2ㆍ6H20 7.5 내지 12.5 mg/100 mL, Na2HPO4 100 내지 130 mg/100 mL, Na-피루브산 3 내지 4 mg/100 mL, 글루코오스 75 내지 125 mg/100 mL, 항생 물질 5 내지 10 mg/100 mL, BSA 250 내지 350 mg/100 mL, 및 10 내지 15 ％(v/v)의 프로필렌글리콜, 25 내지 35 ％(v/v)의 에틸렌글리콜, 15 내지 25 ％(v/v)의 퍼콜(등록 상표) 및 0.2 M 내지 0.5 M의 수크로오스를 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 유리화 보존액.
  5. NaCl 700 내지 900 mg/100 mL, KCl 15 내지 25 mg/100 mL, CaCl2 8 내지 15 mg/100 mL, KH2PO4 15 내지 25 mg/100 mL, MgCl2ㆍ6H20 7.5 내지 12.5 mg/100 mL, Na2HPO4 100 내지 130 mg/100 mL, Na-피루브산 3 내지 4 mg/100 mL, 글루코오스 75 내지 125 mg/100 mL, 항생 물질 5 내지 10 mg/100 mL 및 BSA 250 내지 350 mg/100 mL를 포함하는 용액에 제4항에 기재된 유리화 보존액을 75 내지 100 ％(v/v) 함유시킨 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 유리화 보존액.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 포유 동물 초기 배아가 포유 동물 2 세포기 배아인 유리화 보존액.
  7. 제6항에 있어서, 포유 동물 2 세포기 배아가 래트 2 세포기 배아이고, 포유 동물 ES 세포가 영장류 ES 세포인 유리화 보존액.
  8. 제1항 또는 제3항의 유리화 보존액 및 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 유리화 보존액을 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존용 시약 키트.
  9. 제8항에 있어서, 0.2 M 내지 0.5 M의 수크로오스를 포함하는 인산 완충액을 베이스로 하는 유리화 보존 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 융해액을 더 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 시약 키트.
  10. 제9항에 있어서, 인산 완충액을 베이스로 하는 유리화 보존 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 융해액이 NaCl 700 내지 900 mg/100 mL, KCl 15 내지 25 mg/100 mL, CaCl2 8 내지 15 mg/100 mL, KH2PO4 15 내지 25 mg/100 mL, MgCl2ㆍ6H20 7.5 내지 12.5 mg/100 mL, Na2HPO4 100 내지 130 mg/100 mL, Na-피루브산 3 내지 4 mg/100 mL, 글루코오스 75 내지 125 mg/100 mL, 항생 물질 5 내지 10 mg/100 mL, BSA 250 내지 350 mg/100 mL, 및 0.2 M 내지 0.5 M의 수크로오스를 포함하는 유리화 보존 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포용 융해액인 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 시약 키트.
  11. 제8항에 있어서, 포유 동물 초기 배아가 포유 동물 2 세포기 배아인 유리화 보존 시약 키트.
  12. 제11항에 있어서, 포유 동물 2 세포기 배아가 래트 2 세포기 배아이고, 포유 동물 ES 세포가 영장류 ES 세포인 유리화 보존 시약 키트.
  13. 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포를 제1항 또는 제3항의 유리화 보존액으로 전처리하고, 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 유리화 보존액에 넣어 동결 보존하는 것을 더 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 방법.
  14. 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포를 제1항 또는 제3항의 유리화 보존액에 실온에서 5 내지 10 분간 침지하고, 계속해서 30 초 내지 2 분간 0 ℃ 내지 5 ℃의 온도 조건하에 두며, 또한 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포를 포함하는 상기 유리화 보존액을, 40 내지 60배량의 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 유리화 보존액에 넣어 동결 보존하는 것을 포함하는 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 방법.
  15. 제13항에 있어서, 포유 동물 초기 배아가 포유 동물 2 세포기 배아인 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 방법.
  16. 제15항에 있어서, 포유 동물 2 세포기 배아가 래트 2 세포기 배아이고, 포유 동물 ES 세포가 영장류 ES 세포인 포유 동물 초기 배아 또는 포유 동물 ES 세포의 유리화 보존 방법.
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