KR100987949B1

KR100987949B1 - 세포 보존액

Info

Publication number: KR100987949B1
Application number: KR1020100056783A
Authority: KR
Inventors: 노인완; 문상호
Original assignee: 주식회사 유니셀바이오
Priority date: 2010-06-15
Filing date: 2010-06-15
Publication date: 2010-10-18

Abstract

본 발명은 수집된 세포의 세포학적 진단을 위한 보존 용액에 관한 것으로, 수집된 세포를 적정 범위 내의 PH로 유지하면서 보관하고, 세포의 단백질 변성을 억제하여 형태학적 구조를 유지하며, 세포의 건조 및 부패를 방지하기 위한 세포 보존액에 관한 것이다.
본 발명의 세포 보존액은, 부피 %로, 완충 용액 40~70%, 케톤 1.0~10.0%, 세포 코팅제 1.0~10.0%, 폴리올 0.1~2.0%, 가교결합제 0.2~5.0%, 세제 0.1~0.5%, 점액용해제 0.1~2.0%, PH유지제 0.1~2.0%, 혈액제거제 0.1~2.0%, 방부제 0.1~0.5% 및 나머지 잔량이 용매를 포함하여 된 것이다.
이에 따르면 장시간 보관이 가능함과 아울러 세포가 건조해지는 것을 방지함으로써, 혈성 등의 검체 검사시 정확성을 부여할 수 있는 유용한 효과를 가질 수 있으며, 실온에서 검체를 장기간 보관할 수 있으므로, 검체 보관시 발생되는 비용을 대폭 절감할 수 있다.

Description

세포 보존액{CELL-PRESERVING SOLUTION}

본 발명은 세포 보존액에 관한 것으로, 특히 세포학적 진단을 보조하기 위해 수집된 세포의 형태학적 구조를 장시간 유지하면서 세포의 건조 방지 및 변성을 방지하도록 된 세포 보존액에 관한 것이다.

세포학적 진단을 위한 보조용액이란 인체에서 채취된 세포를 잘 보존하여 세포병리학적 진단을 하는 액상세포검사(Liquid Based Cytology)를 하기 위한 용액을 말하는 것이다. 액상세포검사는 부인과 검체인 자궁경부세포, 그리고 비부인과 검체인 객담, 체액, 소변, 세침흡인생검 등에 이용되는 것으로 수집된 세포를 현미경으로 검사하여 암세포의 유무를 확인하는 것을 주로 한다.

종래의 세포병리학적검사는 세포를 슬라이드 위에 도말하여 검사하는 재래식 세포진 검사(Conventional Pap Smear)를 주로 시행하고 있다.

그러나 이 경우 세포를 유리 슬라이드 위에 도말하게 되면 세포들이 건조되고, 점액이나 적혈구가 제거되지 않아 결과 판독의 어려움이 있다.

또한 자궁경부에서 브러시로 채취한 세포들 중 10%의 세포만이 슬라이드에 도말되고 나머지 세포들은 모두 버려지므로 진단에 중요한 세포들이 슬라이드위에 도말되지 못할 가능성이 있어서 검사의 신뢰성이 낮은 문제점이 있다.

상기한 문제점을 해결하기 위하여 최근에는 액상세포검사(Liquid Based Cytology)법이 개발되었다.

이는 수집된 조직세포를 세포학적 진단을 위한 보조용액에 보관하여 후속되는 병리학적 검사를 진행할 수 있도록 고안된 것으로서, 브러시로 세포를 채취한 후 채취된 세포들을 세포보관용 용액에 보관한 후 필요시 상기 세포보관 용액 내에 보관되던 세포를 검사하여 세포의 이상 유무를 진단하는 방법이다.

상기한 재래식 세포진 검사법에 따른 세포검사의 정확도와 액상세포 검사법에 따른 세포검사의 정확도를 비교하여 설명하고 있는 도면이다.

세포진 검사법에 따르면 검사체가 슬라이드에서 불균등하게 분포하므로 어느 부분을 관찰하느냐에 따라 진단이 달라질 위험이 있으나, 액상세포검사법에 따를 경우에는 검사체가 슬라이드에 균일하게 분포하므로 진단의 정확도 높다는 것을 알 수 있다.

이러한 액상세포 검사법을 시행하기 위해서는 수집된 세포를 보관해 둘 수 있는 용액이 필요한데, 종래의 액상세포 검사법에 사용되었던 용액은 95%에탄올이었다.

그러나 이 경우에는 세포를 장기간 보존할 수 없는 단점(약 일주일정도 보관가능)이 있으며, 적혈구가 제거되지 않아 적혈구를 제거하기 위한 별도의 공정이 필요한 단점이 있었다. 그리고 세포핵의 변형으로 DNA추출을 할 수 없는 단점이 있었다.

본 발명은 상기한 제반 문제점을 감안하여 이를 해결하고자 창안된 것으로서, 그 목적은 수집된 세포의 형태학적 구조를 유지하면서 장시간 보관이 가능하도록 보존성을 향상시킴과 아울러, 세포가 건조해지는 것을 방지하여 세포학적 진단을 위한 세포 보존액을 제공하는 데 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 부피 %로, 완충 용액 40~70%, 케톤 1.0~10.0%, 세포 코팅제 1.0~10.0%, 폴리올 0.1~2.0%, 가교결합제 0.2~5.0%, 세제 0.1~0.5%, 점액용해제 0.1~2.0%, PH유지제 0.1~2.0%, 혈액제거제 0.1~2.0%, 방부제 0.1~0.5%를 포함하고, 나머지 잔량이 용매를 포함하여 된 것을 특징으로 한다.

상기 완충용액은 인산 버퍼를 채용하고, 용매로 알코올을 채용한다.

상기 가교결합제로 포름알데히드를 채용한다.

상기 방부제는 소듐아자이드, 구연산, 소르브산, 벤조산나트륨, 포르말린 중 적어도 하나가 선택된다.

상기 방부제는 함초액을 포함하되,

상기 함초액은 함초분말이 증류수에 첨가되어 용해된 것을 채택하며,

상기 함초액은 함초 분말을 증류수 100중량부에 대해 0.5~5.0중량부를 첨가한다.

본 발명은 수집된 세포의 형태학적 구조를 유지하면서 보존성을 향상시킴과 아울러, 세포가 건조해지는 것을 방지하기 위한 세포 보존액에 관한 것인 바, 이에 따르면 본 발명은 장시간 보관이 가능함과 아울러 세포가 건조해지는 것을 방지함으로써, 혈성 등의 검체 검사시 정확성을 부여할 수 있는 유용한 효과를 갖는다.

또한, 본 발명의 세포 보존액은 실온에서 검체를 장기간 보관할 수 있으므로, 검체 보관시 발생되는 비용을 대폭 절감할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시 예에 해당하는 세포 보존액에 1개월 보관된 검체의 염색상을 나타낸 도면.
도 2는 본 발명의 실시 예에 해당하는 세포 보존액에 18개월이상 보관된 검체의 염색상을 나타낸 도면.
도 3은 비교 예에 해당하는 용액에 1년 보관된 검체의 염색상을 나타낸 도면.

이하에서는, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 수집된 세포의 세포학적 진단을 위한 보존 용액에 관한 것으로, 수집된 세포를 적정 범위 내의 PH로 유지하면서 보관하고, 세포의 단백질 변성을 억제하여 형태학적 구조를 유지하며, 세포의 건조 및 부패를 방지하기 위한 것이다.

본 발명에 따른 세포 보존액은, 부피 %(이하에서는 부피 %를 생략함)로, 완충 용액 40~70%, 케톤 1.0~10.0%, 세포 코팅제 1.0~10.0%, 폴리올 0.1~2.0%, 가교결합제 0.2~5.0%, 세제 0.1~0.5%, 점액용해제 0.1~2.0%, PH유지제 0.1~2.0%, 혈액제거제 0.1~2.0%, 방부제 0.1~0.5% 및 나머지 잔량이 용매를 포함하여 된 것이다.

더 상세히 설명하면, 완충 용액은 인산 버퍼 용액을 채용하며, 이는 핵탄맥질 고정 및 삼투압을 유지하기 위함이다.

용매는 세포 침투성, 탈수, 세균 억제를 위하여 에틸 알코올을 채용한다.

PH 유지제는 아세트산(초산)을 채용하되, 약산성을 유지하도록 PH 2.0~6.5의 농도를 유지하도록 한다.

혈액 제거제는 용혈제로서의 기능을 수행하도록 아세트산을 채용할 수 있다.

가교결합제는 일 예로 포름 알데히드를 채용하여 분자가교결합, 불용성 생성물 생산 등의 기능을 갖는다.

세제는 계면활성제의 일종 NP세포인 Nonidet P40을 채용한다.

점액용해제는 점액의 분산을 위해 디티오트레이톨을 채용할 수 있다.

또한, 수집된 세포의 건조를 방지하기 위해 폴리올의 일종으로 글리세롤을 채용할 수 있다.

수집된 세포의 고정제 및 세포 침투의 기능을 수행하기 위한 케톤(ketone)은 탄소가 3개인 아세톤을 채용한다.

세포 코팅, 수축 방지 및 핵 세부 유지를 위한 세포코팅제로는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 채택할 수 있다.

방부제로는, 소듐아자이드, 구연산, 소르브산, 벤조산나트륨, 포르말린 중 적어도 하나가 선택되거나, 둘이상이 혼합된 것을 채택할 수 있다.

더 바람직하게는, 방부제는 상기한 종류외에 함초액이 포함된 것을 채택할 수 있다.

방부제의 일 예로 소듐 아자이드를 채택할 수 있으며, 함초액은 함초 분말가루가 증류수에 용해된 것을 채용한다.

함초액은 천연 방부제라 불리는 함초를 분말화한 함초 분말을 증류수 100중량부에 대해 0.5~5.0중량부를 첨가할 수 있다.

이는, 0.5중량부 미만일 경우 그 효과를 기대하기 어렵고, 5.0중량부를 초과할 경우에는 점도가 높아질 우려가 있기 때문이다.

이러한 구성으로 된 세포 보존액은 수집된 세포의 검체 전 보전 처리에 사용된다.

상기한 세포 보존액을 구성하는 구성요소들 중 용매, 케톤, 세포코팅제, 폴리올, 가교결합제, 세제를 먼저 선 배합한다.

이후에, 완충 용액, 점액용해제, PH 유지제, 혈액제거제, 방부제를 배합한 후에 선 배합된 용액과 혼합한다.

이때, 선 배합된 용액을 "A"용액이라 하고, 후 배합된 용액을 "B"용액이라 할 때, "A"용액과 "B"용액의 배합 순서는 상관없이 진행할 수 있으며 배합된 두 용액을 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

혼합된 세포 보존액은 실온(15~30℃)에서 유지하는 것이 바람직하다.

한편, 검체 작업의 실시 예로는 검체를 원심분리기에 넣어서 회전 동작으로 원심 분리한 후에, 원심 분리된 검체의 상층액을 제거한 후에 MonoLex를 첨가한 다음에, 믹싱 작업을 한 후에 검체를 원심 분리한다.

이어서, 원심 분리된 검체의 상층액을 제거한 후에 분리된 검체를 검체병에 넣어서 장비를 이용하여 슬라이드를 제작하는 과정을 갖는다.

이러한 검체 처리방식은 혈성이나 점액도에 따라 다소 차이를 보일 수 있다.

본 발명은 브러시로 세포를 채취한 후 채취된 세포들을 세포 보존액에 보관한 후에 필요시 세포 보존액 내에 보관되던 세포를 검사하여 세포의 이상 유무를 진단할 수 있다.

이하, 본 발명 세포 보존액에 따라 제조한 실시 예들을 비교예와 대비하여 설명하기로 한다.

[실시 예 1]

PH 3인 인산 버퍼 용액 40중량부, 아세톤 1.0중량부, 폴리에틸렌글리콜 2.0중량부, 글리세롤 0.5중량부, 포름알데히드 0.2중량부, 세제인 Nonidet P40 0.1중량부, 디티 오트레이톨 0.2중량부, 아세트산(초산) 0.5중량부, 아세트산 0.5중량부, 소듐아자이드 0.2중량부, 에틸 알코올 54.8중량부로 제조한다.

[실시 예 2]

PH 3인 인산 버퍼 용액 40중량부, 아세톤 2.0중량부, 폴리에틸렌글리콜 5.0중량부, 글리세롤 1.0중량부, 포름알데히드 1.0중량부, 세제인 Nonidet P40 0.3중량부, 디티 오트레이톨 0.5중량부, 아세트산(초산) 1.0중량부, 아세트산 1.0중량부, 소듐아자이드 0.3중량부, 에틸 알코올 47.9중량부로 제조한다.

[실시 예 3]

PH 3인 인산 버퍼 용액 40중량부, 아세톤 5.0중량부, 폴리에틸렌글리콜 5.0중량부, 글리세롤 2.0중량부, 포름알데히드 3.0중량부, 세제인 Nonidet P40 0.5중량부, 디티 오트레이톨 0.5중량부, 아세트산(초산) 1.0중량부, 아세트산 1.0중량부, 소듐아자이드 0.4중량부, 함초액 0.1중량부, 에틸 알코올 37.0중량부로 제조한다.

[실시 예 4]

PH 3인 인산 버퍼 용액 40중량부, 아세톤 10.0중량부, 폴리에틸렌글리콜 9.0중량부, 글리세롤 2.0중량부, 포름알데히드 5.0중량부, 세제인 Nonidet P40 0.5중량부, 디티 오트레이톨 0.5중량부, 아세트산(초산) 1.0중량부, 아세트산 1.0중량부, 소듐아자이드 0.5중량부, 에틸 알코올 30.5중량부로 제조한다.

[실시 예 5]

PH 3인 인산 버퍼 용액 40중량부, 아세톤 5.0중량부, 폴리에틸렌글리콜 5.0중량부, 글리세롤 2.0중량부, 포름알데히드 3.0중량부, 세제인 Nonidet P40 0.5중량부, 디티 오트레이톨 0.5중량부, 아세트산(초산) 1.0중량부, 아세트산 1.0중량부, 소듐아자이드 0.4중량부, 함초액 0.1중량부, 에틸 알코올 중량부 41.5로 제조한다.

[실시 예 6]

PH 3인 인산 버퍼 용액 40중량부, 아세톤 5.0중량부, 폴리에틸렌글리콜 5.0중량부, 글리세롤 2.0중량부, 포름알데히드 3.0중량부, 세제인 Nonidet P40 0.5중량부, 디티 오트레이톨 0.5중량부, 아세트산(초산) 1.0중량부, 아세트산 1.0중량부, 소듐아자이드 0.3중량부, 함초액 0.2중량부, 에틸 알코올 37.0중량부로 제조한다.

[비교 예 1]

95%의 에탈올 용액을 사용한 것이다.

[비교 예 2]

인산완충식염수(phosphate buffered saline ; PBS)을 사용한다.

상기한 본 발명의 실시 예들과 비교 예들을 보관기간에 따른 형태학적 실험과 적혈구 제거도와 염색상 실험 및 유전자 검사 가능여부를 조사한 실험 결과는 다음과 같다.

상기한 실험에 사용되는 세포는 자궁 경부의 세포를 브러시를 이용하여 채취한 세포를 이용하기로 한다.

먼저 보관 기간에 따른 형태학적 소견 실험은 수집된 세포를 보존 용액에 보관할 경우 보관기간에 따른 형태학적 변화를 측정하여 보존 용액 내의 세포 보존 성능을 시험하기 위한 것이다.

그 실험 방법은 수집된 세포를 보존 용액내에 실온에서 보관한다.

이후 1개월, 6개월, 12개월, 18개월, 24개월이 각각 경과된 후에 보존액에 보관되어 있는 세포를 한외여과용 고분자박막(Filtered Membrane}에 부착시키고, 부착된 세포를 다시 유리 슬라이드 위에 이동시킨다.

이우헤 슬라이드로 이동된 세포들을 95%에탄올에 고정한 후 염색(Pap Stain)하여 현미경으로 각각의 세포들을 관찰한다.

적혈구 제거도 실험 및 염색상 실험은 수집된 세포에 묻어 있는 적혈구가 보존 용액에 의해 제거되는지의 여부를 판단하기 위한 것이다.

그 적혈구 제거도 실험방법은 자궁경부를 스크럽한 브러시를 본 발명의 보존 용액이 담겨진 용기 또는 비교 예에 해당하는 용액이 담겨진 용기의 바닥에 접촉시켜 브러시에 묻어 있는 자궁 경부 세포들을 용기 내부로 이동시킨다.

이어서, 24시간이 지난 후에 각각의 용기에서 용액 2cc를 채취하여 한외여과용 고분자박막에 부착시키고, 부착된 세포를 유리 슬라이드 위에 이동시킨 후에 염색하여 현미경으로 관찰한다.

염색상 실험방법은 적혈구 제거도 검사과정에서 세포를 채취하는 방식과 동일하며, 다만 1달 혹은 1년 후에 각각의 용기에 담겨진 용액을 한외여과용 고분자박막을 통하여 여과시켜, 보관된 세포를 한외여과용 고분자 박막으로 이동시킨다.

이후에 자궁경부 세포가 이동된 고분자박막을 세포 관찰용 유리 슬라이드에 찍어서 유리 슬라이드측으로 이동시킨다.

세포가 이동된 슬라이드를 95% 에탄올에 담가서 고정한 후에 염색하고 현미경으로 관찰하여 판독한다.

유전자 검사 가능여부 조사방법은 수집된 검체 세포를 본 발명의 실시 예들에 해당하는 보존 용액 또는 비교 예에 해당하는 용액 내에서 실온에서 1개월 이상 보관한 후에, 보관된 용액을 2cc 정도를 추출하여 중합효소연쇄반응(PCR : Polymerase Chain Reaction)을 25회 내지 30회 반복한 후 전기영동사진을 찍는다.

상기한 실험 방식들을 적용한 본 발명의 실시 예들과 비교 예들의 실험결과는 아래의 표 1에서와 같다.

	보관기간에 따른 형태학적 소견					염색상	적혈구 제거도	유전자검사 가능여부
	1개월	6개월	12개월	18개월	24개월	염색상	적혈구 제거도	유전자검사 가능여부
실시 예1	적절	적절	적절	적절	부적절	적절	85%	가능
실시 예2	적절	적절	적절	적절	적절	적절	90%	가능
실시 예3	적절	적절	적절	적절	적절	적절	95%	가능
실시 예4	적절	적절	적절	적절	적절	적절	95%	가능
실시 예5	적절	적절	적절	적절	적절	적절	95%	가능
실시 예6	적절	적절	적절	적절	적절	적절	95%	가능
비교 예1	부적절	부적절	부적절	부적절	부적절	1주이상 부적절	불가	일부 가능
비교 예2	실온보관불가	실온보관불가	실온보관불가	실온보관불가	실온보관불가	부적절	불가	냉장 보관시 가능

표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시 예들에 해당하는 세포 보존액에 보관 중인 검체들은 장시간 경과된 후에도 세포의 원형이 그대로 유지되고 있는 데 반하여, 비교 예 1,2의 경우에는 세포의 보존이 불가능하거나 세포 변형이 발생되어 형태학적 구조를 유지할 수 없기 때문에 검체 진단이 불가능하다.

도 1은 본 발명의 실시 예에 해당하는 보존액에 1개월 정도 보관된 검체의 염색상을 나타낸 도면이고, 도 2는 본 발명 실시 예에 해당하는 보존액에 18개월이상 보관된 검체의 염색상을 나타낸 도면이다.

본 발명 실시 예에 해당하는 보존액에 담겨져 보관된 검체는 염색상 검사 결과 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이, 정상세포와 암세포의 구분이 가능하도록 세포 특성에 따라 다른 색으로 식별 가능함을 알 수 있다.

반면에, 도 3은 비교 예에 해당하는 용액에 1년 보관된 검체의 염색상을 나타낸 도면으로서, 검체의 각 세포들이 변성되어 파괴되거나 불분명하게 엉켜 있어 세포학적 진단이 불가능함을 알 수 있다.

또한, 본 발명의 실시 예에 해당하는 보존액에 보관된 검체는 별도의 다른 절차없이 앞서 설명한 바와 같이 중합효소연쇄반응을 수회 반복하여 유전자 검사를 할 수 있다.

특히, 실온에서 보관중인 세포를 이용하더라도 유전자 검사를 할 수 있으며, 이때 유전자 검사율은 약 99.9%에 달한다.

따라서, 빠른 검사가 가능할 뿐만 아니라, 장기간 실온에서 보관한 세포라 하더라도 유전자 검사가 가능하므로, 세포학적 진단을 위한 세포의 보관시 발생하는 비용을 대폭 절감할 수 있다.

Claims

부피 %로, 완충 용액 40~70%, 케톤 1.0~10.0%, 세포 코팅제 1.0~10.0%, 폴리올 0.1~2.0%, 가교결합제 0.2~5.0%, 세제 0.1~0.5%, 점액용해제 0.1~2.0%, PH유지제 0.1~2.0%, 혈액제거제 0.1~2.0%, 방부제 0.1~0.5%를 포함하고, 나머지 잔량이 용매를 포함하여 된 것을 특징으로 하는 세포 보존액.
청구항 1에 있어서,
상기 완충용액은 인산 버퍼를 채용하고, 용매로 알코올을 채용하는 것을 특징으로 하는 세포 보존액.
청구항 1에 있어서,
상기 가교결합제로 포름알데히드를 채용한 것을 특징으로 하는 세포 보존액.
청구항 1 내지 청구항 3중 어느 한 항에 있어서,
상기 방부제는 소듐아자이드, 구연산, 소르브산, 벤조산나트륨, 포르말린 중 적어도 하나가 선택된 것을 특징으로 하는 세포 보존액.
청구항 4에 있어서,
상기 방부제는 함초액을 포함하되,
상기 함초액은 함초분말이 증류수에 첨가되어 용해된 것을 채택하며,
상기 함초 분말을 증류수 100중량부에 대해 0.5~5.0중량부를 첨가한 것을 특징으로 하는 세포 보존액.