JPH05292943A - 微生物の保存方法 - Google Patents
微生物の保存方法Info
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- JPH05292943A JPH05292943A JP4104890A JP10489092A JPH05292943A JP H05292943 A JPH05292943 A JP H05292943A JP 4104890 A JP4104890 A JP 4104890A JP 10489092 A JP10489092 A JP 10489092A JP H05292943 A JPH05292943 A JP H05292943A
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- citric acid
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 チオバチルス属に属する微生物を保存するに
あたり、糖、糖アルコール、グリセロール、炭酸塩、リ
ン酸塩、マグネシウム塩、塩化ナトリウム、アンモニウ
ム塩、アミノ酸及びポリエチレングリコールからなる群
から選ばれた少なくとも１種の物質を溶解させた溶液中
に該微生物細胞を懸濁し、該懸濁液を低温で保存する 【効果】 従来、保存中に急速に活性が低下するため、
用途が限られていたチオバチルス属に属する微生物の活
性を、長期間、維持させることができ、種々の用途への
適用が可能となる。
あたり、糖、糖アルコール、グリセロール、炭酸塩、リ
ン酸塩、マグネシウム塩、塩化ナトリウム、アンモニウ
ム塩、アミノ酸及びポリエチレングリコールからなる群
から選ばれた少なくとも１種の物質を溶解させた溶液中
に該微生物細胞を懸濁し、該懸濁液を低温で保存する 【効果】 従来、保存中に急速に活性が低下するため、
用途が限られていたチオバチルス属に属する微生物の活
性を、長期間、維持させることができ、種々の用途への
適用が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、チオバチルス属（Thio
bacillus属) に属する微生物の保存方法に関する。チオ
バチルス属に属する微生物は、バクテリアリーチングや
硫黄関連物質の脱臭に、更には亜硫酸酸化活性を利用し
た亜硫酸バイオセンサーの生物素子として有用である。
bacillus属) に属する微生物の保存方法に関する。チオ
バチルス属に属する微生物は、バクテリアリーチングや
硫黄関連物質の脱臭に、更には亜硫酸酸化活性を利用し
た亜硫酸バイオセンサーの生物素子として有用である。
【０００２】
【従来の技術】チオバチルス属に属する微生物の低温で
の保存方法について、Nakamuraらは、チオバチルス・チ
オオキシダンスを使い、種々の菌体調製条件及び保存条
件について検討を加え、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液
に保存することにより、４℃で保存した場合、長期間、
チオバチルス・チオオキシダンス（Thiobacillus thioo
xidans) の亜硫酸酸化活性を保持できると報告している
(J.Gen.Appl.Microbiol.,36 巻、41頁、1990年) 。
の保存方法について、Nakamuraらは、チオバチルス・チ
オオキシダンスを使い、種々の菌体調製条件及び保存条
件について検討を加え、0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液
に保存することにより、４℃で保存した場合、長期間、
チオバチルス・チオオキシダンス（Thiobacillus thioo
xidans) の亜硫酸酸化活性を保持できると報告している
(J.Gen.Appl.Microbiol.,36 巻、41頁、1990年) 。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】チオバチルス属に属す
る微生物は、一般の微生物と異なり、炭素源としてグル
コースなどの糖源を利用することができず、炭酸ガスを
固定しており、また、還元硫黄化合物を酸化することに
より生育のためのエネルギーを得ている化学独立栄養細
菌である。
る微生物は、一般の微生物と異なり、炭素源としてグル
コースなどの糖源を利用することができず、炭酸ガスを
固定しており、また、還元硫黄化合物を酸化することに
より生育のためのエネルギーを得ている化学独立栄養細
菌である。
【０００４】このため、培養が難しく、また、菌体の収
率も低いため効率的な培養方法の開発と一旦培養した菌
体を活性を保持したまま長期間保存する方法の開発が望
まれていた。上記のNakamuraらの方法では、２枚の酢酸
セルロースの膜の間に培養した菌体を封入し、0.1Mクエ
ン酸緩衝液(pH6.0) 中に４℃で保存した場合、３ヵ月
間、当初の亜硫酸酸化活性を保持できたとする結果が得
られているが、亜硫酸酸化活性を測定する条件が酸化反
応に必須である酸素が律速となる条件で測定しており、
実際には、活性の低下が起こっていると考えられるこ
と、３ヵ月以上では顕著な活性の低下が認められるこ
と、また、保存条件が、他のチオバチルス属の菌株では
有効でなく、広範囲の菌株に適用できないという問題点
があった。
率も低いため効率的な培養方法の開発と一旦培養した菌
体を活性を保持したまま長期間保存する方法の開発が望
まれていた。上記のNakamuraらの方法では、２枚の酢酸
セルロースの膜の間に培養した菌体を封入し、0.1Mクエ
ン酸緩衝液(pH6.0) 中に４℃で保存した場合、３ヵ月
間、当初の亜硫酸酸化活性を保持できたとする結果が得
られているが、亜硫酸酸化活性を測定する条件が酸化反
応に必須である酸素が律速となる条件で測定しており、
実際には、活性の低下が起こっていると考えられるこ
と、３ヵ月以上では顕著な活性の低下が認められるこ
と、また、保存条件が、他のチオバチルス属の菌株では
有効でなく、広範囲の菌株に適用できないという問題点
があった。
【０００５】本発明は、広範囲のチオバチルス属に属す
る微生物の活性を低温で長期間維持させる方法を提供す
ることを目的とする。
る微生物の活性を低温で長期間維持させる方法を提供す
ることを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するため、鋭意検討し、チオバチルス属に属する
微生物を保存するにあたり、糖、糖アルコール、グリセ
ロール、炭酸塩、リン酸塩、マグネシウム塩、塩化ナト
リウム、アンモニウム塩、アミノ酸及びポリエチレング
リコールからなる群から選ばれた少なくとも１種の物質
を溶解させた溶液中に該微生物細胞を懸濁し、該懸濁液
を低温で保存することにより、チオバチルス属に属する
微生物の活性を長期間保持できることを見出し、本発明
を完成するに至った。
を達成するため、鋭意検討し、チオバチルス属に属する
微生物を保存するにあたり、糖、糖アルコール、グリセ
ロール、炭酸塩、リン酸塩、マグネシウム塩、塩化ナト
リウム、アンモニウム塩、アミノ酸及びポリエチレング
リコールからなる群から選ばれた少なくとも１種の物質
を溶解させた溶液中に該微生物細胞を懸濁し、該懸濁液
を低温で保存することにより、チオバチルス属に属する
微生物の活性を長期間保持できることを見出し、本発明
を完成するに至った。
【０００７】本発明の対象となる微生物としては、チオ
バチルス属に属する微生物であれば如何なるものでもよ
く、例えば、チオバチルス・チオオキシダンス、例えば
チオバチルス・チオオキシダンス IFO 13724、チオバチ
ルス・チオオキシダンス JCM3866、JCM 3867、JCM 386
8、JCM 7814、チオバチルス・チオオキシダンス ATCC19
703 、ATCC 21835、チオバチルス・チオオキシダンス F
ERM BP-3467 、チオバチルス・チオオキシダンス 11773
(FERM BP-3119) 又はチオバチルス・フェロオキシダン
ス(Thiobacillus ferrooxidans) 、例えばチオバチルス
・フェロオキシダンス JCM 3863 、チオバチルス・フェ
ロオキシダンス IFO 14245、IFO 14246、IFO 14262 、
チオバチルス・フェロオキシダンス ATCC 13598 、ATCC
13661、ATCC 14119、ATCC 23270、ATCC 33020等が挙げ
られる。
バチルス属に属する微生物であれば如何なるものでもよ
く、例えば、チオバチルス・チオオキシダンス、例えば
チオバチルス・チオオキシダンス IFO 13724、チオバチ
ルス・チオオキシダンス JCM3866、JCM 3867、JCM 386
8、JCM 7814、チオバチルス・チオオキシダンス ATCC19
703 、ATCC 21835、チオバチルス・チオオキシダンス F
ERM BP-3467 、チオバチルス・チオオキシダンス 11773
(FERM BP-3119) 又はチオバチルス・フェロオキシダン
ス(Thiobacillus ferrooxidans) 、例えばチオバチルス
・フェロオキシダンス JCM 3863 、チオバチルス・フェ
ロオキシダンス IFO 14245、IFO 14246、IFO 14262 、
チオバチルス・フェロオキシダンス ATCC 13598 、ATCC
13661、ATCC 14119、ATCC 23270、ATCC 33020等が挙げ
られる。
【０００８】保存するための前記微生物の培養方法につ
いては、特に制限はないが、培地としては、チオバチル
ス属に属する微生物は炭酸ガスを炭素源として利用でき
るので、通気培養すれば空気中に存在する炭酸ガスを利
用できるので、培地に炭素源を特に添加する必要はない
が、炭酸カリウムなどの炭酸塩を適宜添加することによ
り、生育の向上が認められる。また、エネルギー源とし
ては、硫黄粉末、チオ硫酸、四チオン酸などの還元硫黄
化合物を添加する必要がある。鉄酸化能を有する菌株の
場合には、硫酸第一鉄などの鉄塩を培地に添加する必要
がある。上記以外に、硫酸アンモニウムなどの窒素源と
リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩など生育に必
要な無機塩を添加する必要がある。
いては、特に制限はないが、培地としては、チオバチル
ス属に属する微生物は炭酸ガスを炭素源として利用でき
るので、通気培養すれば空気中に存在する炭酸ガスを利
用できるので、培地に炭素源を特に添加する必要はない
が、炭酸カリウムなどの炭酸塩を適宜添加することによ
り、生育の向上が認められる。また、エネルギー源とし
ては、硫黄粉末、チオ硫酸、四チオン酸などの還元硫黄
化合物を添加する必要がある。鉄酸化能を有する菌株の
場合には、硫酸第一鉄などの鉄塩を培地に添加する必要
がある。上記以外に、硫酸アンモニウムなどの窒素源と
リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩など生育に必
要な無機塩を添加する必要がある。
【０００９】培地のpH及び培養温度は、微生物が生育で
きる範囲であれば特に制限はない。培養した微生物は、
微生物を死滅させないような緩衝液又は水で洗浄し、菌
体を得る。本発明の保存方法としては、例えば、糖、糖
アルコール、グリセロール、炭酸塩、リン酸塩、マグネ
シウム塩、塩化ナトリウム、アンモニウム塩、アミノ酸
及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれた少
なくとも１種の物質を溶解させた緩衝液、水などの溶液
と混合し、攪拌することにより懸濁させ、得られた微生
物細胞懸濁液を低温で保存する方法が挙げられる。
きる範囲であれば特に制限はない。培養した微生物は、
微生物を死滅させないような緩衝液又は水で洗浄し、菌
体を得る。本発明の保存方法としては、例えば、糖、糖
アルコール、グリセロール、炭酸塩、リン酸塩、マグネ
シウム塩、塩化ナトリウム、アンモニウム塩、アミノ酸
及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれた少
なくとも１種の物質を溶解させた緩衝液、水などの溶液
と混合し、攪拌することにより懸濁させ、得られた微生
物細胞懸濁液を低温で保存する方法が挙げられる。
【００１０】また、J.Gen.Appl.Microbiol.,36巻、41
頁、1990年記載の方法の如く２枚の酢酸セルロースなど
の膜の間に培養した菌体を封入したり、ポリアクリルア
ミド、寒天、アルギン酸などの親水性基材やキトサンな
どのゲル内に公知の方法で包括化したような固定化した
微生物細胞を前記溶液に浸漬し、低温で保存してもよ
い。
頁、1990年記載の方法の如く２枚の酢酸セルロースなど
の膜の間に培養した菌体を封入したり、ポリアクリルア
ミド、寒天、アルギン酸などの親水性基材やキトサンな
どのゲル内に公知の方法で包括化したような固定化した
微生物細胞を前記溶液に浸漬し、低温で保存してもよ
い。
【００１１】尚、本明細書中に記載する濃度は、特記し
ない限り、重量／重量％を示す。糖としては、ショ糖、
ラフィノース、トレハロースなどが好適に用いられ、そ
の溶液中の濃度は、好ましくは５〜20％、更に好ましく
は10〜15％である。糖アルコールとしては、マンニトー
ル、ソルビトールなどが好適に用いられ、その溶液中の
濃度は、好ましくは５〜20％、更に好ましくは10〜15％
である。グリセロールの溶液中の濃度は、好ましくは５
〜20％、更に好ましくは10〜15％である。炭酸塩として
は、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムが好適に用いられ、
その溶液中の濃度は、好ましくは0.01〜１％、更に好ま
しくは0.05〜0.2 ％である。リン酸塩としては、リン酸
ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウムが好
適に用いられる、その溶液中の濃度は、好ましくは0.05
〜５％、更に好ましくは0.1〜0.5 ％である。マグネシ
ウム塩としては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム
が好適に用いられ、その溶液中の濃度は、好ましくは
0.005〜0.5 ％、更に好ましくは0.01〜0.05％である。
塩化ナトリウムの溶液中の濃度は、好ましくは0.05〜1
M、更に好ましくは0.1 〜0.3Mである。アンモニウム塩
としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムが好適
に用いられ、その溶液中の濃度は、好ましくは0.05〜1
M、更に好ましくは0.1 〜0.3Mである。アミノ酸として
は、グルタミン酸、アスパラギン酸が好適に用いられ、
その溶液中の濃度は、好ましくは0.05〜５％、更に好ま
しくは0.3 〜1.5 ％である。ポリエチレングリコールと
しては、平均分子量が400 から6000のものが好適に用い
られ、その溶液中の濃度は、好ましくは５〜20％、更に
好ましくは５〜15％である。
ない限り、重量／重量％を示す。糖としては、ショ糖、
ラフィノース、トレハロースなどが好適に用いられ、そ
の溶液中の濃度は、好ましくは５〜20％、更に好ましく
は10〜15％である。糖アルコールとしては、マンニトー
ル、ソルビトールなどが好適に用いられ、その溶液中の
濃度は、好ましくは５〜20％、更に好ましくは10〜15％
である。グリセロールの溶液中の濃度は、好ましくは５
〜20％、更に好ましくは10〜15％である。炭酸塩として
は、炭酸カリウム、炭酸ナトリウムが好適に用いられ、
その溶液中の濃度は、好ましくは0.01〜１％、更に好ま
しくは0.05〜0.2 ％である。リン酸塩としては、リン酸
ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸アンモニウムが好
適に用いられる、その溶液中の濃度は、好ましくは0.05
〜５％、更に好ましくは0.1〜0.5 ％である。マグネシ
ウム塩としては、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム
が好適に用いられ、その溶液中の濃度は、好ましくは
0.005〜0.5 ％、更に好ましくは0.01〜0.05％である。
塩化ナトリウムの溶液中の濃度は、好ましくは0.05〜1
M、更に好ましくは0.1 〜0.3Mである。アンモニウム塩
としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムが好適
に用いられ、その溶液中の濃度は、好ましくは0.05〜1
M、更に好ましくは0.1 〜0.3Mである。アミノ酸として
は、グルタミン酸、アスパラギン酸が好適に用いられ、
その溶液中の濃度は、好ましくは0.05〜５％、更に好ま
しくは0.3 〜1.5 ％である。ポリエチレングリコールと
しては、平均分子量が400 から6000のものが好適に用い
られ、その溶液中の濃度は、好ましくは５〜20％、更に
好ましくは５〜15％である。
【００１２】前記溶液としては、そのpHを一定に保持す
るため、緩衝液を用いることが好ましいが、かかる緩衝
液としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝
液など一般的に使用されている緩衝液を使用すればよ
い。該緩衝液の塩濃度は、好ましくは0.01〜1M、更に好
ましくは0.05〜0.3Mであり、また、pHは、好ましくは２
〜７、更に好ましくは４〜６である。
るため、緩衝液を用いることが好ましいが、かかる緩衝
液としては、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝
液など一般的に使用されている緩衝液を使用すればよ
い。該緩衝液の塩濃度は、好ましくは0.01〜1M、更に好
ましくは0.05〜0.3Mであり、また、pHは、好ましくは２
〜７、更に好ましくは４〜６である。
【００１３】また、前記溶液への菌体の懸濁は、溶液中
に均一になるように攪拌等の通常の操作で実施すればよ
い。菌体を懸濁した微生物細胞懸濁液は、低温、即ち２
〜10℃、好ましくは３〜６℃で保存する。
に均一になるように攪拌等の通常の操作で実施すればよ
い。菌体を懸濁した微生物細胞懸濁液は、低温、即ち２
〜10℃、好ましくは３〜６℃で保存する。
【００１４】
【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。
【００１５】
【実施例１】チオバチルス・チオオキシダンス JCM 781
4 をチオ硫酸ナトリウム5g、リン酸二水素カリウム3g、
硫酸アンモニウム0.2g、硫酸マグネシウム0.25g 、硫酸
第一鉄0.01g/リットル(pH5.5) の組成の培地に植菌し、
培養した。培養は、全容量５リットル、培地液量３リッ
トルの小型ジャーファーメンターを使用し、攪拌数250r
pm、通気量0.5vvmの条件で30℃で48時間行った。培養中
は、５％NaOH水溶液を適宜添加し、培養液のpHがほぼ5.
0 になるように制御した。
4 をチオ硫酸ナトリウム5g、リン酸二水素カリウム3g、
硫酸アンモニウム0.2g、硫酸マグネシウム0.25g 、硫酸
第一鉄0.01g/リットル(pH5.5) の組成の培地に植菌し、
培養した。培養は、全容量５リットル、培地液量３リッ
トルの小型ジャーファーメンターを使用し、攪拌数250r
pm、通気量0.5vvmの条件で30℃で48時間行った。培養中
は、５％NaOH水溶液を適宜添加し、培養液のpHがほぼ5.
0 になるように制御した。
【００１６】培養を終了した培養液は遠心分離し、集菌
した後、0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) で洗菌し、
菌体濃度がOD660nm で0.8 になるように10％ショ糖を含
む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁して、微生
物細胞懸濁液を調製した。対照として0.1Mクエン酸−Na
OH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液を調製し
た。
した後、0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) で洗菌し、
菌体濃度がOD660nm で0.8 になるように10％ショ糖を含
む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁して、微生
物細胞懸濁液を調製した。対照として0.1Mクエン酸−Na
OH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液を調製し
た。
【００１７】調製した微生物細胞懸濁液を４℃で保存
し、経時的に亜硫酸酸化活性を測定した。亜硫酸酸化活
性は、微生物細胞懸濁液0.5ml 、0.1Mクエン酸−NaOH緩
衝液(pH5.5) 0.5ml、蒸留水1.5mlの組成からなる液に１
分間空気をバブリングした後、0.1M亜硫酸水素ナトリウ
ム溶液(5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む0.1M
クエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に溶解)0.5mlを反応液に
加え、30℃で酸素消費量を溶存酸素計(YSI社 モデル5
3) で測定した。
し、経時的に亜硫酸酸化活性を測定した。亜硫酸酸化活
性は、微生物細胞懸濁液0.5ml 、0.1Mクエン酸−NaOH緩
衝液(pH5.5) 0.5ml、蒸留水1.5mlの組成からなる液に１
分間空気をバブリングした後、0.1M亜硫酸水素ナトリウ
ム溶液(5mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む0.1M
クエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に溶解)0.5mlを反応液に
加え、30℃で酸素消費量を溶存酸素計(YSI社 モデル5
3) で測定した。
【００１８】４℃保存開始時の亜硫酸酸化活性は、10.4
mgO2/min・g-cellであった。３カ月保存後の亜硫酸酸化
活性は、対照の0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5)に懸
濁して保存した場合が、5.6mgO2/min ・g-cellであった
のに対し、10％ショ糖を含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液
(pH5.5) に懸濁して保存した場合には、10.1mgO2/min・
g-cellであり、亜硫酸酸化活性は低下していなかった。
mgO2/min・g-cellであった。３カ月保存後の亜硫酸酸化
活性は、対照の0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5)に懸
濁して保存した場合が、5.6mgO2/min ・g-cellであった
のに対し、10％ショ糖を含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液
(pH5.5) に懸濁して保存した場合には、10.1mgO2/min・
g-cellであり、亜硫酸酸化活性は低下していなかった。
【００１９】また、６ヵ月保存後の亜硫酸酸化活性は、
対照が2.4mgO2/min ・g-cellであったのに対し、10％シ
ョ糖を含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁し
て保存した場合には、7.7mgO2/min ・g-cellであった。
対照が2.4mgO2/min ・g-cellであったのに対し、10％シ
ョ糖を含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁し
て保存した場合には、7.7mgO2/min ・g-cellであった。
【００２０】
【実施例２】チオバチルス・チオオキシダンス FERM BP
-3467 を実施例１と同一な条件で培養し、菌体を得た。
得られた菌体を0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) で洗
菌し、菌体濃度がOD660nm で0.8 になるように10％ラフ
ィノースを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸
濁して、微生物細胞懸濁液を調製した。
-3467 を実施例１と同一な条件で培養し、菌体を得た。
得られた菌体を0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) で洗
菌し、菌体濃度がOD660nm で0.8 になるように10％ラフ
ィノースを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸
濁して、微生物細胞懸濁液を調製した。
【００２１】同様にして、10％トレハロースを含む0.1M
クエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸
濁液、10％マンニトールを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝
液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液、10％ソルビト
ールを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁し
た微生物細胞懸濁液、0.1 ％炭酸カリウムを含む0.1Mク
エン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁
液、0.3 ％リン酸カリウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩
衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液、0.3 ％リン
酸アンモニウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.
5) に懸濁した微生物細胞懸濁液、0.02％硫酸マグネシ
ウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁し
た微生物細胞懸濁液、0.2M塩化ナトリウムを含む0.1Mク
エン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁
液、0.5 ％グルタミン酸ナトリウムを含む0.1Mクエン酸
−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液、５
％ポリエチレングリコール400 を含む0.1Mクエン酸−Na
OH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液を調製し
た。
クエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸
濁液、10％マンニトールを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝
液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液、10％ソルビト
ールを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁し
た微生物細胞懸濁液、0.1 ％炭酸カリウムを含む0.1Mク
エン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁
液、0.3 ％リン酸カリウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩
衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液、0.3 ％リン
酸アンモニウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.
5) に懸濁した微生物細胞懸濁液、0.02％硫酸マグネシ
ウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁し
た微生物細胞懸濁液、0.2M塩化ナトリウムを含む0.1Mク
エン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁
液、0.5 ％グルタミン酸ナトリウムを含む0.1Mクエン酸
−NaOH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液、５
％ポリエチレングリコール400 を含む0.1Mクエン酸−Na
OH緩衝液(pH5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液を調製し
た。
【００２２】対照として0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH
5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液を調製した。調製し
た微生物細胞懸濁液を４℃で保存し、経時的に亜硫酸酸
化活性を測定した。亜硫酸酸化活性は、実施例１と同様
にして測定した。結果を表１に示す。
5.5) に懸濁した微生物細胞懸濁液を調製した。調製し
た微生物細胞懸濁液を４℃で保存し、経時的に亜硫酸酸
化活性を測定した。亜硫酸酸化活性は、実施例１と同様
にして測定した。結果を表１に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【実施例３】実施例２と同一の方法で培養して得られた
チオバチルス・チオオキシダンス FERM BP-3467 の菌体
を0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) で洗菌し、菌体濃
度がOD660nm で10になるように0.1Mクエン酸−NaOH緩衝
液(pH5.5) に懸濁して、微生物細胞懸濁液を調製した。
チオバチルス・チオオキシダンス FERM BP-3467 の菌体
を0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) で洗菌し、菌体濃
度がOD660nm で10になるように0.1Mクエン酸−NaOH緩衝
液(pH5.5) に懸濁して、微生物細胞懸濁液を調製した。
【００２５】この微生物細胞懸濁液50マイクロリットル
をJ.Gen.Appl.Microbiol.,36巻、41頁(1990 年) 記載の
方法で２枚の酢酸セルロース膜（ミリポア社製、MF- ミ
リポア HAWPO2500、ポアサイズ0.45ミクロン) の間に封
入し、菌体を固定化した膜を作製した。この固定化微生
物膜を10％ショ糖を含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH
5.5) 、10％ラフィノースを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩
衝液(pH5.5) 、10％トレハロースを含む0.1Mクエン酸−
NaOH緩衝液(pH5.5) 、10％マンニトールを含む0.1Mクエ
ン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、10％ソルビトールを含む0.
1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、10％グリセロールを
含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.1 ％炭酸カ
リウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.1
％炭酸ナトリウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH
5.5) 、0.3 ％リン酸カリウムを含む0.1Mクエン酸−NaO
H緩衝液(pH5.5) 、0.3 ％リン酸ナトリウムを含む0.1M
クエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.3 ％リン酸アンモニ
ウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.02％
硫酸マグネシウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH
5.5) 、0.02％塩化マグネシウムを含む0.1Mクエン酸−N
aOH緩衝液(pH5.5) 、0.1M塩化ナトリウムを含む0.1Mク
エン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.1M塩化アンモニウムを
含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.1M硫酸アン
モニウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 及び
0.3 ％リン酸カリウムと0.02％硫酸マグネシウムを含む
0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.5 ％グルタミン
酸ナトリウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5)
、0.5 ％アスパラギン酸ナトリウムを含む0.1Mクエン
酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、５％ポリエチレングリコール
400 を含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) にそれぞ
れ浸漬し、４℃で保存した。
をJ.Gen.Appl.Microbiol.,36巻、41頁(1990 年) 記載の
方法で２枚の酢酸セルロース膜（ミリポア社製、MF- ミ
リポア HAWPO2500、ポアサイズ0.45ミクロン) の間に封
入し、菌体を固定化した膜を作製した。この固定化微生
物膜を10％ショ糖を含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH
5.5) 、10％ラフィノースを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩
衝液(pH5.5) 、10％トレハロースを含む0.1Mクエン酸−
NaOH緩衝液(pH5.5) 、10％マンニトールを含む0.1Mクエ
ン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、10％ソルビトールを含む0.
1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、10％グリセロールを
含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.1 ％炭酸カ
リウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.1
％炭酸ナトリウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH
5.5) 、0.3 ％リン酸カリウムを含む0.1Mクエン酸−NaO
H緩衝液(pH5.5) 、0.3 ％リン酸ナトリウムを含む0.1M
クエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.3 ％リン酸アンモニ
ウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.02％
硫酸マグネシウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH
5.5) 、0.02％塩化マグネシウムを含む0.1Mクエン酸−N
aOH緩衝液(pH5.5) 、0.1M塩化ナトリウムを含む0.1Mク
エン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.1M塩化アンモニウムを
含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.1M硫酸アン
モニウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 及び
0.3 ％リン酸カリウムと0.02％硫酸マグネシウムを含む
0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、0.5 ％グルタミン
酸ナトリウムを含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5)
、0.5 ％アスパラギン酸ナトリウムを含む0.1Mクエン
酸−NaOH緩衝液(pH5.5) 、５％ポリエチレングリコール
400 を含む0.1Mクエン酸−NaOH緩衝液(pH5.5) にそれぞ
れ浸漬し、４℃で保存した。
【００２６】対照として固定化した微生物膜を0.1Mクエ
ン酸−NaOH緩衝液(pH5.5）に浸漬し、４℃で保存した。
固定化した微生物膜の亜硫酸酸化活性は、Appl.Microbi
ol.Biotechnol.,31 巻、351 頁(1989 年) 記載の装置を
使用し、J.Gen.Appl.Microbiol.,36巻、41頁（1990年)
記載の方法で測定した。
ン酸−NaOH緩衝液(pH5.5）に浸漬し、４℃で保存した。
固定化した微生物膜の亜硫酸酸化活性は、Appl.Microbi
ol.Biotechnol.,31 巻、351 頁(1989 年) 記載の装置を
使用し、J.Gen.Appl.Microbiol.,36巻、41頁（1990年)
記載の方法で測定した。
【００２７】４℃保存開始時の亜硫酸酸化活性は、亜硫
酸水素ナトリウム10mg/ リットルを基質として使用し、
細胞が亜硫酸を酸化するのにともなう酸素消費の量を酸
素電極で検出し、酸素電極の出力電流の変化量( 減少
値) として測定したところ、640nA であった。結果を表
２に示す。
酸水素ナトリウム10mg/ リットルを基質として使用し、
細胞が亜硫酸を酸化するのにともなう酸素消費の量を酸
素電極で検出し、酸素電極の出力電流の変化量( 減少
値) として測定したところ、640nA であった。結果を表
２に示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】
【発明の効果】本発明によれば、従来、保存中に急速に
活性が低下するため、用途が限られていたチオバチルス
属に属する微生物の活性を、長期間、維持させることが
でき、種々の用途への適用が可能となる。
活性が低下するため、用途が限られていたチオバチルス
属に属する微生物の活性を、長期間、維持させることが
でき、種々の用途への適用が可能となる。
Claims (8)
- 【請求項１】 チオバチルス属に属する微生物を保存す
るにあたり、糖、糖アルコール、グリセロール、炭酸
塩、リン酸塩、マグネシウム塩、塩化ナトリウム、アン
モニウム塩、アミノ酸及びポリエチレングリコールから
なる群から選ばれた少なくとも１種の物質を溶解させた
溶液中に該微生物細胞を懸濁し、該懸濁液を低温で保存
することを特徴とするチオバチルス属に属する微生物の
保存方法。 - 【請求項２】 糖がショ糖、ラフィノースまたはトレハ
ロースである請求項１記載の保存方法。 - 【請求項３】 糖アルコールがマンニトール又はソルビ
トールである請求項１記載の保存方法。 - 【請求項４】 炭酸塩が炭酸カリウム又は炭酸ナトリウ
ムである請求項１記載の保存方法。 - 【請求項５】 リン酸塩がリン酸ナトリウム、リン酸カ
リウム又はリン酸アンモニウムである請求項１記載の保
存方法。 - 【請求項６】 マグネシウム塩が硫酸マグネシウム又は
塩化マグネシウムである請求項１記載の保存方法。 - 【請求項７】 アンモニウム塩が塩化アンモニウム又は
硫酸アンモニウムである請求項１記載の保存方法。 - 【請求項８】 アミノ酸がグルタミン酸又はアスパラギ
ン酸である請求項１記載の保存方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4104890A JPH05292943A (ja) | 1992-04-23 | 1992-04-23 | 微生物の保存方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4104890A JPH05292943A (ja) | 1992-04-23 | 1992-04-23 | 微生物の保存方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05292943A true JPH05292943A (ja) | 1993-11-09 |
Family
ID=14392767
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4104890A Pending JPH05292943A (ja) | 1992-04-23 | 1992-04-23 | 微生物の保存方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05292943A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001129580A (ja) * | 1999-11-02 | 2001-05-15 | Kl Plant Kk | 油脂含有排水の処理装置 |
| JP2004505024A (ja) * | 2000-07-26 | 2004-02-19 | ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション | 生物学的物質用の保存及び貯蔵媒体 |
| WO2006106806A1 (ja) * | 2005-03-30 | 2006-10-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 乾燥微生物の保存安定性向上方法 |
| KR100987949B1 (ko) * | 2010-06-15 | 2010-10-18 | 주식회사 유니셀바이오 | 세포 보존액 |
| JP2016521704A (ja) * | 2013-06-05 | 2016-07-25 | レビオティクス インコーポレイテッドＲｅｂｉｏｔｉｘ，Ｉｎｃ． | 微生物叢回復療法（ｍｒｔ）、組成物および製造方法 |
-
1992
- 1992-04-23 JP JP4104890A patent/JPH05292943A/ja active Pending
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001129580A (ja) * | 1999-11-02 | 2001-05-15 | Kl Plant Kk | 油脂含有排水の処理装置 |
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| WO2006106806A1 (ja) * | 2005-03-30 | 2006-10-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | 乾燥微生物の保存安定性向上方法 |
| JPWO2006106806A1 (ja) * | 2005-03-30 | 2008-09-11 | 協和醗酵工業株式会社 | 乾燥微生物の保存安定性向上方法 |
| JP4866842B2 (ja) * | 2005-03-30 | 2012-02-01 | 協和発酵バイオ株式会社 | 乾燥微生物の保存安定性向上方法 |
| KR100987949B1 (ko) * | 2010-06-15 | 2010-10-18 | 주식회사 유니셀바이오 | 세포 보존액 |
| JP2016521704A (ja) * | 2013-06-05 | 2016-07-25 | レビオティクス インコーポレイテッドＲｅｂｉｏｔｉｘ，Ｉｎｃ． | 微生物叢回復療法（ｍｒｔ）、組成物および製造方法 |
| JP2017178966A (ja) * | 2013-06-05 | 2017-10-05 | レビオティクス インコーポレイテッドＲｅｂｉｏｔｉｘ，Ｉｎｃ． | 微生物叢回復療法組成物 |
| US10391129B2 (en) | 2013-06-05 | 2019-08-27 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture |
| US10493111B2 (en) | 2013-06-05 | 2019-12-03 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture |
| US10603341B2 (en) | 2013-06-05 | 2020-03-31 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture |
| US10610547B2 (en) | 2013-06-05 | 2020-04-07 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture |
| US10624932B2 (en) | 2013-06-05 | 2020-04-21 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture |
| US11554143B2 (en) | 2013-06-05 | 2023-01-17 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |