JP2007319114A - マンガンペルオキシダーゼの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】汎用性のある方法で担子菌を良好に培養し、一回の培養で得られるマンガンペルオキシダーゼの量を増やすことで、マンガンペルオキシダーゼを効率良く製造する方法を提供する。
【解決手段】担子菌を培養至適温度±2℃の範囲内の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、担子菌を培養してマンガンペルオキシダーゼを製造する方法に関する。
マンガンペルオキシダーゼは酸化還元酵素の一種であり、ビフェノールの合成に有用であるだけでなく、パルプ漂白やダイオキシンなど有害物質の分解除去への利用が考えられている。マンガンペルオキシダーゼは、白色腐朽菌などの担子菌を培養することによって、その産生物として得ることができるが、その際の担子菌の培養法としてこれまでに報告されているのは、静置培養又は振とう培養だけであり、撹拌培養で担子菌を良好に培養できるとの報告はなされていなかった。但し、ここでいう撹拌培養とは、菌体を担体等に担持せず培地中に浮遊させた状態とし、撹拌翼等により培地を撹拌しながら菌体を培養することを指す。
そして、一回の培養で得られるマンガンペルオキシダーゼの量も少なく、製造効率が低かった。
そして、一回の培養で得られるマンガンペルオキシダーゼの量も少なく、製造効率が低かった。
そこで、マンガンペルオキシダーゼの製造効率を高める方法として、例えば、担子菌の一種であるファネロケーテ クリソスポリウム(P.chrysosporium)OGC101株を静置培養中に、培養温度を上昇させてヒートショックを加える方法が提案されている(非特許文献1参照)。
Applied and Environmental Microbiology, Vol.59, P.4295−4299(1993)
Applied and Environmental Microbiology, Vol.59, P.4295−4299(1993)
しかし、非特許文献1に記載の方法では、一回の培養で得られるマンガンペルオキシダーゼの量を増やすことはできるが、まだ不充分であり、適用できる担子菌の培養法も静置培養だけなので、製造上の制約条件も多く、マンガンペルオキシダーゼの製造効率は已然不充分であるという問題点があった。
本発明は、上記事情に鑑みて為されたものであり、汎用性のある方法で担子菌を良好に培養し、一回の培養で得られるマンガンペルオキシダーゼの量を増やすことで、マンガンペルオキシダーゼを効率良く製造する方法を提供することを課題とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、担子菌の過剰増殖がマンガンペルオキシダーゼ産生に悪影響を及ぼしていることを見出した。そこで、更に検討した結果、培養の後期に温度をシフトさせることで過剰増殖を抑制することができ、高いマンガンペルオキシダーゼ生産性が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、担子菌を培養至適温度±2℃の範囲内の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法を提供するものである。
本発明によれば、一回の担子菌の培養でより多くのマンガンペルオキシダーゼを得ることができ、培養法として撹拌培養を適用できるので、通常汎用される発酵槽を用いることができ、マンガンペルオキシダーゼを効率良く製造することができる。
以下、本発明について詳しく説明する。なお、以下において、単位「M」は「mol/L」を、単位「mM」は「mmol/L」を、単位「μM」は「μmol/L」をそれぞれ示す。
[使用する微生物]
本発明で使用される担子菌としては、例えば、ファネロケーテ(Phanerochaete)属、フレビア(Phlebia)属、レンティヌラ(Lentinula)属、フェルリナス(Phellinus)属などに属する白色腐朽菌を挙げることができる。これらの中でも、ファネロケーテ属に属する菌が好ましい。ファネロケーテ属に属する菌の中でも、好ましいものとして、例えば、ファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、ファネロケーテ フラヴィド−アルバ(Phanerochaete flavido−alba)、ファネロケーテ ソルディダ(Phanerochaete sordida)、ファネロケーテ マグノリエ(Phanerochaete magnoliae)に属する菌等を挙げることができ、より好ましいものとして、ファネロケーテ クリソスポリウムに属する菌を挙げることができる。具体的には、例えば、ファネロケーテ クリソスポリウムBKM−F−1767(ATCC24725)、ファネロケーテ クリソスポリウムSC26(ATCC64314)、ファネロケーテ クリソスポリウムME446(ATCC34541)、ファネロケーテ クリソスポリウムHHB−6251−sp(ATCC34540)、ファネロケーテ クリソスポリウムOGC101(ATCC201542)、ファネロケーテ クリソスポリウム INA−12(CNCM I−398)、ファネロケーテ クリソスポリウムI−1512 (CNCM I−1512)を挙げることができ、中でも特に好ましいものとしてファネロケーテ クリソスポリウムBKM−F−1767(ATCC24725)が挙げられる。
また、これらを宿主とした遺伝子組換え体であってもよい。
[使用する微生物]
本発明で使用される担子菌としては、例えば、ファネロケーテ(Phanerochaete)属、フレビア(Phlebia)属、レンティヌラ(Lentinula)属、フェルリナス(Phellinus)属などに属する白色腐朽菌を挙げることができる。これらの中でも、ファネロケーテ属に属する菌が好ましい。ファネロケーテ属に属する菌の中でも、好ましいものとして、例えば、ファネロケーテ クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、ファネロケーテ フラヴィド−アルバ(Phanerochaete flavido−alba)、ファネロケーテ ソルディダ(Phanerochaete sordida)、ファネロケーテ マグノリエ(Phanerochaete magnoliae)に属する菌等を挙げることができ、より好ましいものとして、ファネロケーテ クリソスポリウムに属する菌を挙げることができる。具体的には、例えば、ファネロケーテ クリソスポリウムBKM−F−1767(ATCC24725)、ファネロケーテ クリソスポリウムSC26(ATCC64314)、ファネロケーテ クリソスポリウムME446(ATCC34541)、ファネロケーテ クリソスポリウムHHB−6251−sp(ATCC34540)、ファネロケーテ クリソスポリウムOGC101(ATCC201542)、ファネロケーテ クリソスポリウム INA−12(CNCM I−398)、ファネロケーテ クリソスポリウムI−1512 (CNCM I−1512)を挙げることができ、中でも特に好ましいものとしてファネロケーテ クリソスポリウムBKM−F−1767(ATCC24725)が挙げられる。
また、これらを宿主とした遺伝子組換え体であってもよい。
[培地成分]
(マンガン塩)
本発明で用いるマンガン塩としては、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、シュウ酸マンガン、硝酸マンガン、リン酸マンガン及びこれらの水和物などが挙げられる。これらマンガン塩の培地中濃度は、マンガンペルオキシダーゼの高い生産性向上効果が得られることから、好ましくは250μM以上、より好ましくは250〜900μMであり、特に好ましくは300〜700μMとなるよう設定する。
(マンガン塩)
本発明で用いるマンガン塩としては、硫酸マンガン、塩化マンガン、酢酸マンガン、炭酸マンガン、シュウ酸マンガン、硝酸マンガン、リン酸マンガン及びこれらの水和物などが挙げられる。これらマンガン塩の培地中濃度は、マンガンペルオキシダーゼの高い生産性向上効果が得られることから、好ましくは250μM以上、より好ましくは250〜900μMであり、特に好ましくは300〜700μMとなるよう設定する。
(炭素源)
本発明で使用する培地には炭素源が含まれるが、該炭素源としては担子菌の培地に通常用いられる炭素源が利用でき、好ましいものとしてグルコース、グリセロール及びセルロースなどが挙げられ、特に好ましいものとしてグルコースが挙げられる。培地中のグルコース濃度は、菌の増殖やマンガンペルオキシダーゼの生産性に影響することから、好ましくは0.5質量%以上、より好ましくは1〜4質量%、特に好ましくは1.5〜3質量%となるよう設定する。
本発明で使用する培地には炭素源が含まれるが、該炭素源としては担子菌の培地に通常用いられる炭素源が利用でき、好ましいものとしてグルコース、グリセロール及びセルロースなどが挙げられ、特に好ましいものとしてグルコースが挙げられる。培地中のグルコース濃度は、菌の増殖やマンガンペルオキシダーゼの生産性に影響することから、好ましくは0.5質量%以上、より好ましくは1〜4質量%、特に好ましくは1.5〜3質量%となるよう設定する。
(その他の培地成分)
また本発明の培地は、前記のマンガン塩や炭素源以外に、窒素源、ビタミン、リン酸、界面活性剤、緩衝液、マンガン以外の各種金属塩等を含んでいてもよい。例えば、窒素源としては、酒石酸アンモニウムを始めとするアンモニウム塩などが挙げられる。ビタミンとしては、例えば、チアミンなどが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ツイーン80(Tween80)、ツイーン20(Tween20)、トリトンX−100(TritonX−100)、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などが挙げられる。マンガン以外の各種金属塩としては、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、硫酸カリウムアルミニウム、硫酸銅、硫酸第一鉄などの硫酸鉄、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸カリウム、モリブデン酸ナトリウムなど、あるいはこれらの水和物などが挙げられる。またpH調整剤として、塩酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなど、通常使用される各種酸、アルカリを含んでいてもよい。これらの他、キレート剤としてニトリロ三酢酸などを含んでいてもよい。
なお、培地は調製後にオートクレーブ滅菌することが好ましい。
また本発明の培地は、前記のマンガン塩や炭素源以外に、窒素源、ビタミン、リン酸、界面活性剤、緩衝液、マンガン以外の各種金属塩等を含んでいてもよい。例えば、窒素源としては、酒石酸アンモニウムを始めとするアンモニウム塩などが挙げられる。ビタミンとしては、例えば、チアミンなどが挙げられる。界面活性剤としては、例えば、ツイーン80(Tween80)、ツイーン20(Tween20)、トリトンX−100(TritonX−100)、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液などが挙げられる。マンガン以外の各種金属塩としては、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸コバルト、硫酸亜鉛、硫酸カリウムアルミニウム、硫酸銅、硫酸第一鉄などの硫酸鉄、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸カリウム、モリブデン酸ナトリウムなど、あるいはこれらの水和物などが挙げられる。またpH調整剤として、塩酸、硫酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなど、通常使用される各種酸、アルカリを含んでいてもよい。これらの他、キレート剤としてニトリロ三酢酸などを含んでいてもよい。
なお、培地は調製後にオートクレーブ滅菌することが好ましい。
[培養条件]
本発明における担子菌の培養方法は、固体培養、液体培養のいずれであってもよいが、培養のし易さから液体培養が好ましい。担子菌の培養に適した培養温度は20〜45℃である。また、培地のpHは3.5〜7.5が好ましく、4.0〜7.0がより好ましい。pHの調整には各種の緩衝液や塩酸又は硫酸など通常用いられる酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニアなど、通常用いられるアルカリを使用することができる。
本発明における担子菌の培養方法は、固体培養、液体培養のいずれであってもよいが、培養のし易さから液体培養が好ましい。担子菌の培養に適した培養温度は20〜45℃である。また、培地のpHは3.5〜7.5が好ましく、4.0〜7.0がより好ましい。pHの調整には各種の緩衝液や塩酸又は硫酸など通常用いられる酸、あるいは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニアなど、通常用いられるアルカリを使用することができる。
[製造方法1]
本発明の製造方法は、担子菌を培養至適温度±2℃の範囲内の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養することを特徴とする。担子菌の培養は前述の条件で行えば良い。ここで、培養至適温度とは、任意の培地で担子菌を培養した時に、担子菌の増殖速度が最大となる温度のことを指す。
本発明の製造方法は、担子菌を培養至適温度±2℃の範囲内の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養することを特徴とする。担子菌の培養は前述の条件で行えば良い。ここで、培養至適温度とは、任意の培地で担子菌を培養した時に、担子菌の増殖速度が最大となる温度のことを指す。
温度シフト前の培養は、培地へ空気を供給しながら行うことが好ましく、この場合の空気の供給量は、200〜2000mL/min/L培養液であることが好ましい。
温度シフト後の培養は、培地に酸素を含む気体を供給しながら行うことが好ましい。この時供給する気体中の酸素分圧は30%以上であることが好ましく、80〜100%であることがより好ましい。そして、この時の培地への酸素の供給量は、1〜100mL/min/L培養液であることが好ましい。
温度シフト後の培養は、培地に酸素を含む気体を供給しながら行うことが好ましい。この時供給する気体中の酸素分圧は30%以上であることが好ましく、80〜100%であることがより好ましい。そして、この時の培地への酸素の供給量は、1〜100mL/min/L培養液であることが好ましい。
温度シフト前の培養温度は、37℃程度であることが好ましい。また、温度シフト後の培養温度は、温度シフト前の培養温度より低い温度が好ましい。シフト後の温度が42℃程度であると、マンガンペルオキシダーゼの産生量は増えるが、急激に失活することがある。
培養温度のシフトは、一度だけでなく、多段階で行っても良い。ただし、最初の温度シフトを昇温とした場合には、その後の温度シフトも昇温とすることが好ましく、最初の温度シフトを冷却とした場合には、その後の温度シフトも冷却とすることが好ましい。培養温度のシフトを多段階で行う場合、二回目以降の温度のシフト幅は特に限定されない。
また、温度シフトに要する時間は特に限定されないが、できるだけ速やかにシフトすることが好ましい。
また、温度シフトに要する時間は特に限定されないが、できるだけ速やかにシフトすることが好ましい。
担子菌の培養は、ベラトリルアルコールを含む培地で行うことが好ましい。この場合、ベラトリルアルコールは温度シフト前の段階から培地に添加しても良いし、温度シフト時に添加してもよい。培地中のベラトリルアルコールの濃度は、0.5〜10mMであることが好ましい。
最初の温度シフトを行うまでの担子菌培養時間は、種菌の植菌量にも影響されるが、最初の温度シフトのタイミングが菌体増殖中期以降となるようにすることが好ましく、この場合、前述の培養条件下であれば概ね2〜4日である。そして、最初の温度シフト後の培養時間は、マンガンペルオキシダーゼの産生量が最大となるように設定すれば良いが、前述の培養条件下であれば、2〜4日であることが好ましい。それぞれこのように時間設定することで、マンガンペルオキシダーゼを最も効率良く製造することができる。なお、ここで菌体増殖中期とは、菌体の増殖が最も活発な対数増殖期を過ぎた直後の時期を指す。
担子菌の培養は、静置培養あるいは振とう培養でも行うことができるが、撹拌培養であることが好ましい。この場合の撹拌速度は、培地量等により適宜選択すれば良い。本発明の構成により、担子菌を用いたマンガンペルオキシダーゼ産生培養を初めて撹拌培養で良好に行うことができる。
なお、本発明でいう撹拌培養とは、菌体を担体等に担持せず培地中に浮遊させた状態とし、撹拌翼等により培地を撹拌しながら菌体を培養することを指す。
なお、本発明でいう撹拌培養とは、菌体を担体等に担持せず培地中に浮遊させた状態とし、撹拌翼等により培地を撹拌しながら菌体を培養することを指す。
[製造方法2]
また、マンガンペルオキシダーゼは、少なくとも、担子菌を増殖させる工程と、次いで培地に酸素を含む気体を供給しながら該増殖工程の温度から±1℃以上シフトさせた温度で担子菌にマンガンペルオキシダーゼを産生させる工程とを有する製造方法でも高い生産性で製造できる。
ここで、担子菌を増殖させる工程では、前述の温度シフト前の条件で担子菌培養を行えば良く、担子菌にマンガンペルオキシダーゼを産生させる工程では、少なくとも、前記増殖工程から±1℃以上培養温度をシフトさせて培地に酸素を含む気体を供給しながら培養を継続すれば良い。
また、マンガンペルオキシダーゼは、少なくとも、担子菌を増殖させる工程と、次いで培地に酸素を含む気体を供給しながら該増殖工程の温度から±1℃以上シフトさせた温度で担子菌にマンガンペルオキシダーゼを産生させる工程とを有する製造方法でも高い生産性で製造できる。
ここで、担子菌を増殖させる工程では、前述の温度シフト前の条件で担子菌培養を行えば良く、担子菌にマンガンペルオキシダーゼを産生させる工程では、少なくとも、前記増殖工程から±1℃以上培養温度をシフトさせて培地に酸素を含む気体を供給しながら培養を継続すれば良い。
担子菌増殖工程は、培地へ空気を供給しながら行うことが好ましく、この場合の空気の供給量は、200〜2000mL/min/L培養液であることが好ましい。
また、マンガンペルオキシダーゼを産生させる工程において、培地へ供給する、酸素を含む気体中の酸素分圧は、30%以上であることが好ましく、80〜100%であることがより好ましい。そして、この時の培地への酸素の供給量は、1〜100mL/min/L培養液であることが好ましい。
担子菌増殖工程の温度は、37℃程度であることが好ましい。また、マンガンペルオキシダーゼ産生工程の温度は、担子菌増殖工程の温度±1℃であるが、担子菌増殖工程の温度より1℃以上低い温度が好ましい。シフト後の温度が42℃程度であると、マンガンペルオキシダーゼの産生量は増えるが、急激に失活することがある。
上記の点以外は、担子菌増殖工程は、前記製造方法1の温度シフト前の培養条件を適用し、マンガンペルオキシダーゼ産生工程は、前記製造方法1の温度シフト後の培養条件を適用すれば良い。
また、マンガンペルオキシダーゼを産生させる工程において、培地へ供給する、酸素を含む気体中の酸素分圧は、30%以上であることが好ましく、80〜100%であることがより好ましい。そして、この時の培地への酸素の供給量は、1〜100mL/min/L培養液であることが好ましい。
担子菌増殖工程の温度は、37℃程度であることが好ましい。また、マンガンペルオキシダーゼ産生工程の温度は、担子菌増殖工程の温度±1℃であるが、担子菌増殖工程の温度より1℃以上低い温度が好ましい。シフト後の温度が42℃程度であると、マンガンペルオキシダーゼの産生量は増えるが、急激に失活することがある。
上記の点以外は、担子菌増殖工程は、前記製造方法1の温度シフト前の培養条件を適用し、マンガンペルオキシダーゼ産生工程は、前記製造方法1の温度シフト後の培養条件を適用すれば良い。
本発明の製造方法1または2によれば、マンガンペルオキシダーゼの生産性(単位時間当たりの培地単位体積あたりの産生量、mg/L培養液)は従来よりも高く、例えば、非特許文献1に記載の方法に対して約6倍以上であり、培地1Lあたり40mg程度のマンガンペルオキシダーゼが得られる。さらに、通常汎用される発酵槽を用いることもでき、製造上の制約条件も低いので、マンガンペルオキシダーゼを効率良く低コストで製造することができる。なお、マンガンペルオキシダーゼの生産性は、例えば、後述の実施例に記載のように、マンガンペルオキシダーゼの活性を測定することで算出することができる。
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下の実施例に何ら限定されるものではない。
[実施例]温度シフト培養
(培地)
表1に示した培地各2.5Lを5試験区用意した。なお、表1中の6×トレースエレメンツの組成を表2に示した。そして、pH電極を備えた5L容量発酵槽Bioneer−N型(株式会社丸菱バイオエンジ製)5台に前記培地をそれぞれ仕込み、121℃、20分間のオートクレーブ処理で滅菌した。
[実施例]温度シフト培養
(培地)
表1に示した培地各2.5Lを5試験区用意した。なお、表1中の6×トレースエレメンツの組成を表2に示した。そして、pH電極を備えた5L容量発酵槽Bioneer−N型(株式会社丸菱バイオエンジ製)5台に前記培地をそれぞれ仕込み、121℃、20分間のオートクレーブ処理で滅菌した。
(培養)
前記の各発酵槽にファネロケーテ クリソスポリウム BKM−F−1767 (ATCC24725)を植菌し、37℃、空気供給0.5vvm、フルゾーン翼(神鋼パンテック株式会社製)150rpmの条件で撹拌培養を開始した。培養中、培養液のpHは4.5を維持するよう、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いて制御した。
3日後、ベラトリルアルコールをそれぞれ1.05ml添加し、空気の供給を停止すると共に30ml/minで酸素供給を開始した。更にこのとき、培養温度を37℃からそれぞれ、a:23℃、b:25℃、c:28℃、d:32℃、e:42℃にシフトさせた。各々の条件で培養を継続し、経時的に培養液を採取した。採取したサンプルを下記酵素活性測定に供し、マンガンペルオキシダーゼ濃度を算出した。
前記の各発酵槽にファネロケーテ クリソスポリウム BKM−F−1767 (ATCC24725)を植菌し、37℃、空気供給0.5vvm、フルゾーン翼(神鋼パンテック株式会社製)150rpmの条件で撹拌培養を開始した。培養中、培養液のpHは4.5を維持するよう、硫酸及び水酸化ナトリウムを用いて制御した。
3日後、ベラトリルアルコールをそれぞれ1.05ml添加し、空気の供給を停止すると共に30ml/minで酸素供給を開始した。更にこのとき、培養温度を37℃からそれぞれ、a:23℃、b:25℃、c:28℃、d:32℃、e:42℃にシフトさせた。各々の条件で培養を継続し、経時的に培養液を採取した。採取したサンプルを下記酵素活性測定に供し、マンガンペルオキシダーゼ濃度を算出した。
(マンガンペルオキシダーゼ(MnP)の活性測定)
MnPの活性は、硫酸マンガンを基質とした酸化反応(Mn3+−マロン酸錯体形成)の光学的測定により決定した。すなわち、分光光度計用石英セルを反応容器とし、この反応容器中に蒸留水435μL、500mMマロン酸二ナトリウム−HCl(pH4.5)50μL、50mM硫酸マンガン5μL、培養液サンプル5μLを入れ、これに対し10mM過酸化水素5μLを添加することで酸化反応を開始した。
そして、分光光度計UV−1650PC(株式会社島津製作所製)を用いて、反応液のUV270nmにおける吸収の増加をモニタすることで反応初速度を測定した。濃度既知のMnP溶液との反応初速度比較により、培養液サンプル中のMnPの濃度(mg/L)を算出した。
試験区a〜eのそれぞれにおけるMnPの最高濃度を表3に示す。a〜e全試験区において、後述の比較例試験区fよりも高いMnP濃度、即ち高い生産性が認められた。ただし、試験区eでは、MnPの濃度が最高値に達した後、急激な失活が認められた。
MnPの活性は、硫酸マンガンを基質とした酸化反応(Mn3+−マロン酸錯体形成)の光学的測定により決定した。すなわち、分光光度計用石英セルを反応容器とし、この反応容器中に蒸留水435μL、500mMマロン酸二ナトリウム−HCl(pH4.5)50μL、50mM硫酸マンガン5μL、培養液サンプル5μLを入れ、これに対し10mM過酸化水素5μLを添加することで酸化反応を開始した。
そして、分光光度計UV−1650PC(株式会社島津製作所製)を用いて、反応液のUV270nmにおける吸収の増加をモニタすることで反応初速度を測定した。濃度既知のMnP溶液との反応初速度比較により、培養液サンプル中のMnPの濃度(mg/L)を算出した。
試験区a〜eのそれぞれにおけるMnPの最高濃度を表3に示す。a〜e全試験区において、後述の比較例試験区fよりも高いMnP濃度、即ち高い生産性が認められた。ただし、試験区eでは、MnPの濃度が最高値に達した後、急激な失活が認められた。
[比較例]定温度培養
培養3日後以降も温度をシフトさせることなく、37℃で培養を継続したこと以外は、実施例と同様にして培地調製、培養及び酵素活性測定を行った(試験区f)。その結果、表3に示すように、MnPの濃度は実施例よりも低い値となった。
培養3日後以降も温度をシフトさせることなく、37℃で培養を継続したこと以外は、実施例と同様にして培地調製、培養及び酵素活性測定を行った(試験区f)。その結果、表3に示すように、MnPの濃度は実施例よりも低い値となった。
本発明は、安価なマンガンペルオキシダーゼの供給に有用である。
Claims (7)
- 担子菌を培養至適温度±2℃の範囲内の温度で培養し、次いで当該温度と培養至適温度との差の絶対値より、培養至適温度との差の絶対値が大きくなるようにシフトさせた温度で培養することを特徴とするマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
- 培地に酸素を含む気体を供給しながら、前記温度シフト後の担子菌培養を行う請求項1に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
- 前記酸素を含む気体中の酸素分圧が30%以上である請求項2に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
- 前記温度シフトを、菌体増殖中期以降に行う請求項1〜3のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
- ベラトリルアルコールを含む培地で培養を行う請求項1〜4のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
- 前記培養が撹拌培養である請求項1〜5のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
- 前記担子菌がファネロケーテ(Phanerochaete)属に属する菌である請求項1〜6のいずれか一項に記載のマンガンペルオキシダーゼの製造方法。
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