JP7151049B2 - 微生物を増殖させる方法 - Google Patents
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Description
<1> グルコース及びグリセロールを、微生物を含む培養液に間欠的に添加することを含む培養工程を含む、微生物を増殖させる方法。
<2> 前記微生物は、染色体上に、作動可能なgalR遺伝子及び作動可能なglpR遺伝子のうち少なくとも1つを有する、<1>に記載の方法。
<3> 前記培養工程において、グルコースとグリセロールとが同時に前記培養液に添加される、<1>又は<2>に記載の方法。
<4> 前記微生物が大腸菌である、<1>~<3>のうちいずれか1つに記載の方法。
<5> 前記培養工程は、前記培養液中のグルコースの量及びグリセロールの量に関係するパラメータを測定すること、及びその測定結果に基づいてグルコース及びグリセロールを添加することを含む、<1>~<4>のうちいずれか1つに記載の方法。
<6> 前記培養工程におけるグルコース及びグリセロールの添加が、測定された前記パラメータと、それぞれの所定の設定値との比較に基づいて行われる、<5>に記載の方法。
<7> 前記培養工程におけるグルコース及びグリセロールの添加が、グルコース及びグリセロールの前回の添加終了時からの前記パラメータの変動量に基づいて行われる、<5>に記載の方法。
<8> 前記パラメータが、培養液中のpH、培養液の溶存酸素濃度、培養液中のグルコース及びグリセロールの濃度、排気中の二酸化炭素濃度、並びに排気中の酸素濃度からなる群から選択される少なくとも1種である、<5>~<7>のうちいずれか1つに記載の方法。
<9> 前記培養工程において、培養液1Lあたり、グルコース濃度が5質量%~40質量%でありグリセロール濃度が20質量%~94質量%である水溶液が0.1g~100gの量で間欠的に添加される、<1>~<8>のうちいずれか1つに記載の方法。
本開示において「~」を用いて示された数値範囲は、「~」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
本開示において、記載される各要素は、その数について特に明記されない限りは、一つ存在しても、複数存在しても構わない。
本開示において、組成物中の各成分の量は、組成物中の各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
微生物の主たる炭素源は、通常、グルコースであって、グルコースが枯渇することにより微生物がグリセロールを代謝する状態になっても、グリセロールを代謝する効率は、通常時にグルコースを代謝する効率よりも低いものである。このため、グリセロールを利用して微生物を効率的に増殖させる観点からは、炭素源としてグリセロールのみを用いるのではなく、グリセロールとグルコースとを併せて用いることが好ましい。
さらに、グルコースを単独で添加する場合と比較して、添加するグルコース量を低下させることができるため、グルコース濃度はグルコース単独で添加する場合よりも低い濃度となり、グリセロール代謝系の発現がより強化されることとなる。本開示に係る微生物を増殖させる方法によって、グリセロールを炭素源として利用しつつ効率的に微生物を増殖させることができる理由は以上のとおりのものと推定される。
本開示に係る微生物を増殖させる方法において用いられる微生物は、グリセロール代謝能を有する微生物であれば特に限定されない。グリセロール代謝能を有する微生物は、グリセロールを唯一の炭素源とした場合でも生育が可能である。また、前記微生物は、グルコースの存在下ではグリセロール代謝を抑制する制御系を有していることが好ましい。グリセロール代謝の抑制は、グリセロール代謝に寄与する酵素の活性を抑制することであってもよいし、グリセロール代謝に寄与する酵素をコードする遺伝子の発現を抑制するものであってもよい。このような制御系を構築する遺伝子の例としては、galR、glpR(いずれも転写リプレッサー)などが挙げられる。このような制御系が存在する場合に、本開示に係る微生物を増殖させる方法により得られる効果がより顕著となる。
本開示に係る微生物を増殖させる方法における微生物を含む培養液は、微生物と、当該微生物が増殖するための栄養源を含む培地と、を含むものであれば特に限定されない。培地としては、炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培地に使用する成分としては、公知のものを用いることができる。例えば、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、NZアミン及びジャガイモ等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、デンプン及び有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素及び塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム及び鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用できる。培地の具体的な例としては、LB培地やM9培地などが挙げられる。
培養工程においては、微生物を培養液中で培養する。培養工程は、グルコース及びグリセロールを、微生物を含む培養液に間欠的に添加することを含むが、この添加操作については後述する。また、微生物の本培養を行う前には、一般的な手法により微生物の前培養を行ってもよい。
培養工程における微生物細胞の細胞密度は特に限定されず、例えば106個/mL~1010個/mLであってもよい。培養の結果得られる菌体量が大きいことが好ましい。培養のボリュームについても特に限定されず、所望の菌体量に応じて適切なボリュームで培養すればよいが、例えば0.1L~10000Lであってもよい。培養は、培養タンクなど一般的に用いられる培養装置、培養機器を用いて行えばよい。
培養中に通気を行うかどうかについても微生物の特性に基づいて決定すればよい。通気を行う場合には、通気量は空気の場合、例えば0.02vvm~5.0vvm、好ましくは0.1vvm~2.0vvmとしてもよい。また、培養液は、培養液の均一性を高めるために、撹拌翼などを用いて適宜撹拌してもよい。
本開示に係る微生物を増殖させる方法においては、培養工程はグルコース及びグリセロールを、微生物を含む培養液に間欠的に添加することを含む。本開示において、間欠的な添加とは、時間間隔を空けて複数回の添加を行うことを意味する。つまり、間欠的な添加においては、添加を行っている時期と、次の回の添加を行っている時期との間に、添加を行っていない時期が存在する。培養液中におけるグルコースの濃度は、使用する微生物の性質に応じて設定すればよいが、培養液に対して例えば0.01質量%~10質量%としてもよい。同様に、グリセロールの濃度についても、使用する微生物の性質に応じて設定すればよいが、培養液に対して例えば0.01質量%~10質量%としてもよい。
微生物として、野生型の大腸菌(Escherichia coli W3110)(ATCC27325)を準備した。
500mLのバッフル付三角フラスコに下記の組成の培地100mLを調製し、121℃、20分間のオートクレーブにより滅菌した。上記の大腸菌を一白金耳で植菌し、37℃、130rpmにて培養した。
酵母エキストラクト 5.0 g/L
ポリペプトン 10.0 g/L
NaCl 5.0 g/L
塩化コバルト・六水和物 10.0mg/L
硫酸第二鉄・七水和物 40.0mg/L
pH7.5
27.5質量% グリセロール
27.5質量% グルコース
45質量% 水
上記水溶液1の代わりに、炭素源としてグリセロールのみを含む下記組成の水溶液2を添加したこと以外は、実施例1と同様の処理を行った。
55質量% グリセロール
45質量% 水
上記水溶液1の代わりに、炭素源としてグルコースのみを含む下記組成の水溶液3を添加した点以外は、実施例1と同様の処理を行った。
55質量% グルコース
45質量% 水
実施例1、比較例1、及び参考例1における、培養を開始してから、24時間後、48時間後、及び52時間後の菌体得量(g/kg)を表2に示す。
Claims (4)
- グルコース及びグリセロールを、大腸菌を含む培養液に間欠的に添加することを含む培養工程を含み、
前記培養工程は、前記培養液中のグルコースの量及びグリセロールの量に関係するパラメータを測定すること、及びその測定結果に基づいてグルコース及びグリセロールを添加することを含み、
前記パラメータが、培養液中のpHであり、
前記培養工程において、グルコース濃度が5質量%~40質量%でありグリセロール濃度が20質量%~94質量%である水溶液が、培養液1Lあたり、0.1g~100gの量で間欠的に添加される、大腸菌を増殖させる方法。 - 前記大腸菌は、染色体上に、作動可能なgalR遺伝子及び作動可能なglpR遺伝子のうち少なくとも1つを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記培養工程におけるグルコース及びグリセロールの添加が、測定された前記パラメータと、それぞれの所定の設定値との比較に基づいて行われる、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記培養工程におけるグルコース及びグリセロールの添加が、グルコース及びグリセロールの前回の添加終了時からの前記パラメータの変動量に基づいて行われる、請求項1又は請求項2に記載の方法。
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