JPS62675B2 - - Google Patents
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Description
本発明はα―グリセロホスフエートオキシダー
ゼの製法に関する。 α―グリセロホスフエートオキシダーゼ並びに
有用な、その調製及び抽出技術は、
Koditschek、L.K.およびUmbreit、W.W.の“ス
トレプトコカスフエイチウムF24のα―グリセロ
ホスフエートオキシダーゼ”、ジヤーナル オブ
バクテリオロジー、98巻、３号、1063―1068頁
（1969年）並びにJacobs、N.J.およびVan
Demark、P.J.の“ストレプトコカス フエカリ
スのα―グリセロホスフエート酸化酵素の精製及
び性質”、アーカイブズ オブ バイオケミスト
リー アンド バイオフイジツクス、88巻、250
−255頁に記載されている、この酵素は酸素の存
在下にα―グリセロホスフエートを酸化してジヒ
ドロキシアセトンホスフエート及び過酸化水素を
生成するのに有用である。 上掲のKcditschek及びUmbreitは、検圧検定法
を含む様々な効力検定技術を用いて研究したスト
レプトコカス フエイチウムF24のα―グリセロ
ホスフエートオキシダーゼの諸性質を説明してい
る。ストレプトコカス フエイチウムの培養は１
％トリプトン、１％酵母エキス、0.5％K2HPO4、
0.1％グルコース及び1.5％アガールから成るAC
アガール（以下AC媒質と呼ぶことがある）の穿
刺（stab）に保持した。これらの細胞は媒質から
分離し、酵素生成物を検定のため抽出した。 前述のJacobs及びVan Demarkは、彼等もその
研究において検圧検定法を用いて、ストレプトコ
カス フエカリス10Clのα―グリセロホスフエ
ートオキシダーゼの諸性質について記載してい
る。彼等は上述のAC媒質（但しグルコース0.2
％）中でストレプトコカス フエカリスを生長さ
せた。彼等はストレプトコカス フエカリスから
の酵素は受媒質としてＬ―α―グリセロホスフエ
ートに対しては高度な特異性を示し、β―グリセ
ロホスフエート、グリセロール、ジヒドロキシア
セトンホスフエートもしくは１，２―プロパンジ
オールホスフエートに対しては認識できるような
活性を示さない旨報じている。 Jacob、N.J.およびVan Demark、P.J.は、ジ
ヤーナル オブ、バクテリオロジー、79巻、532
―538頁（1960年）の報文“好気的及び嫌気的に
生長させたストレプトコカス フエカリスにおけ
るグリセロール酸化機構の比較”においてストレ
プトコカス フエカリスからの好気的及び嫌気的
生長細胞を用いた分類学的研究におけるグリセロ
ールの代謝について論じている。このストレプト
コカス フエカリスは前述のAC媒質で生長させ
ている。 Gunsalus、I.C.及びUmbreit、W.W.の“スト
レプトコカス フエカリスによるグリセロールの
酸化”、ジヤーナル オブ バクテリオロジー、
49巻、347―357頁（1945年）はストレプトコカス
フエカリスの活性細胞懸濁物によるグリセロー
ルの酸化の検定研究結果を報告している。彼等は
検定にピルビン酸塩を添加することによつて、ピ
ルビン酸塩がH2O2のスカベンジヤーとして作用
するので、グリセロール酸化レベルを高くするこ
とを見出した。α―グリセロホスフエートオキシ
ダーゼの活性は記載されていない。 Gunsalus、I.C.の“ストレプトコカス フエカ
リスによる嫌気的グリセロール発酵生成物”（ジ
ヤーナル オブ バクテリオロジー、54巻、239
―244頁（1947年）は、グリセロールと１％まで
の酵母エキスを含む媒質中でのストレプトコカス
フエカリスの生長について報告している。
Gunsalusはグリセロールによるストレプトコカ
ス フエカリスの生長は僅か（好気的生長）が殆
んど認められない（嫌気的生長）旨報告してい
る。 Claridge、C.A.及びHendlin、D.、の“ストレ
プトコカス フエカリスによるグリセロールの酸
化”（ジヤーナル オブ バクテリオロジー、84
巻、1181―1186頁（1962年））は一般的なワルブ
ルグ検定を用いて行なつたストレプトコカス フ
エカリスによるグリセロールの利用に関する研究
を報告している。彼等は、彼等の検定においてグ
リセロールを素早く酸化する細胞を得るために、
１％のグリセロール（10ｇ/）を補充した、１
ｇ/のグリセロールを含む媒質中でストレプト
コカス フエカリスを生長させることを示唆して
いる。α―グリセロホスフエートオキシターゼ活
性は記載されていない。 前述のいくつかの文献はグリセロールの酸化に
ついての研究を一般的に報じている。これらの文
献のうちの最初の二つ、即ち、“Koditschek及び
Umbreit”並びに“Jacobs及びVan Demark”の
みが彼等の検定でα―グリセロホスフエートオキ
シターゼの存在を示している。しかし、いずれの
文献もペデイオコカス属に属する微生物がα―グ
リセロホスフエートオキシダーゼを生産すること
を示唆していない。 発明の目的及び構成 本発明の目的は微生物を媒質又は培地中で生長
させることによつてα―グリセロホスフエートオ
キシダーゼを製造することにある。 本発明に従えば、ペデイオコカス属に属するα
―グリセロホスフエートオキシダーゼ生産性微生
物を培地において生長せしめ、次いで生成α―グ
リセロホスフエートオキシダーゼを抽出すること
を特徴とするα―グリセロホスフエートオキシダ
ーゼの製造方法が提供される。 発明の構成及び効果の具体的説明 本発明の実施に際し使用できる微生物ペデイオ
コカス属の代表的な種はペデイオコカス セリヴ
イジイエ（Pediococcus cerevisiae）である。特
に好ましいのはペデイオコカスセリヴイジイエ
ATCC8042及び8081である。 ストレプトコチ（Streptococci）はWood.A.J.
及びGunsalus、I.C.の“ストレプトコチの活性休
止細胞の製造”（ジヤーナル オブ バクテリオ
ロジー、44巻、337―341頁（1942年））に記載さ
れている、「STP媒質」と呼ばれる媒質中で普通
生長する。以下に述べるように、STP媒質中でス
トレプトコカス フエカリスATCC12755を生長
させると、60―80U／のα―グリセロホスフエ
ートオキシダーゼが製造される。 本明細書に記載するストレプトコカス フエカ
リスATCC12755なる名称の微生物は、最初
ATCC（American Type Culture Collection）
にストレプトコカス フエカリスATCC12755と
して寄託されたもので、ATCCのカタログ（1947
年、第11版）にその名称で掲載されている。この
ものは、前記カタログの第12版でストレプトコカ
ス フエイチウムATCC12755と名称変更されて
いる。 本発明に従えば、ラクトバシラチエエ科の微生
物、特にストレプトコカス フエカリスを炭素源
としてのピルビン酸塩、そして好ましくはグルコ
ースの添加及びα―グリセロホスフエートオキシ
ダーゼ用誘導質の添加によつて修正したSTP媒質
中で生長させることによつてα―グリセロホスフ
エートオキシダーゼが高収量で取得される。誘導
質としてグリセロールを添加することによつてα
―グリセロホスフエートオキシターゼの収量がグ
リセロールを添加しない場合に比較して３倍以上
も増加した。その他の有用なα―グリセロホスフ
エートオキシターゼ誘導質はグリセロールの同族
体、例えば、３―メチル―１，２―プロパンジオ
ール、１，３―プロパンジオール、１，２―プロ
パンジオール、２，３―ブタンジオール、１，
２，４―ブタントリオール、モノアセチン、１―
モノプロピオニン、１―モノブチリン、モノステ
アリン、モノオレイン及びトリラウリンなどであ
る。 誘導質の有用な量は、一般に、媒質リツトル当
り約1.0〜10ｇの範囲内であることを見出した。
好ましい媒質の使用量は媒質リツトル当り約2.0
〜約5.0ｇである。 Wood及びGunsalusによつて、呼称されたSTP
媒質は、グルコース―1.0ｇ/、酵母エキス―10
ｇ/、トリプトン10ｇ/及びK2HPO4―５ｇ/
を含む。これらの成分の有用な範囲は、グルコ
ース約0.1〜3.0ｇ/、酵母エキス1.0〜20ｇ/、
好ましくは約2.0〜10ｇ/、トリプトン約５〜20
ｇ/及びK2HPO4少なくとも約3.0ｇ/、好まし
くは約3.0〜約5.0ｇ/であることを確認した。 培地においてトリプトンに代えて使用すること
ができる他の蛋白水解物としては、例えば、
Sheffield Chemical Div.of Kraftco Corp.（ユ
ニオン、ニユージヤージー）から市販のソイ ペ
プトン タイプＴ（Soy Peptone Type Ｔ）、エ
ダミン（Edamin）タイプＴ、フアームアミン
（Ferm Amine）タイプ、、及び、Ｎ―
Ｚアミン（Amine）タイプAT、BT、ET及び
YTT；Cudahy Laboratories（オマハ、ネブラス
カ）からの市販のカゼイン ヒドロリセート
（Casein Hydrolysate）、アナトン（Anatone）、
ミクロバイオトン（Microbiotone）及びフアーマ
トン（Pharmatone）；Traders Protin Div.
Traders Oil Mill Co.（フオート ワース、テキ
サス）から市販のフアーマメデイア
（Pharmamedia）並びに硫酸アンモニウムがあげ
られる。 しかしながら、前記培地中のトリプトンに代え
て上述の蛋白水解物の一つを使用した場合には、
その蛋白水解物の最適量は、トリプトンの最適量
と多少変動することがある。特に有用な、トリプ
トンの代替物は、ソイ ペプトン タイプＴで、
これはトリプトンを用いた場合に比較してα―グ
リセロホスフエートオキシダーゼの収量を５倍以
上を増加させる。 前記培地中においてグルコースに代えて使用で
きる、その他の有用な炭素源は、例えば、クエン
酸、乳酸、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウ
ム、アスパラキン酸、グルタミン酸、コーンシロ
ツプ、糖密、フラクトース、ラクトース、マルト
ースおよびシユクローズである。 本発明の最も好ましい態様では、培地中にグル
コース約0.5〜約3.0ｇ/及びピルビン酸ナトリ
ウム約0.5〜約2.0ｇ/を添加する。培地中での
グルコースとピルビン酸ナトリウムの組合せはα
―グリセロホスフエートオキシダーゼの生成に相
剰効果を呈するようである。炭素源のこの組合せ
を用いる場合には、酸素収量は、炭素源としてグ
ルコース１ｇ/を用いた場合に比較して、実に
８倍も増加した。 前記培地中に有効量の無機塩類およびビタミン
類を報告するのが有利であることも見出した。こ
こにいう「有効量」なる語は、培地中に加えて酵
素の収量を増加させるのに十分な量の無機塩類及
びビタミン類の量をいう。このような無機塩及び
ビタミン類の添加量は塩及びビタミンの種類によ
つて変動する。この量は一般に少量で、当業者で
あれば通常の実験により極めて容易に定めること
ができる。 大規模な発酵器中でストレプトコカス フエカ
リスのような微生物を生長させて高収量の酵素を
取得する場合に、しばしば発泡が生ずる。この泡
立ちを制御するために、特に酵素を大バツチで製
造する場合に泡制御剤を使用するのが好ましい。
本発明の実施に際して有用な泡制御剤の一例は、
ダウケミカル社（ミツドランド、ミシガン）から
市販のポリグリコール（Polyglycol）Ｐ―2000で
ある。この消泡剤は酵素の生成を妨害することな
く培地中で0.5ｇ/までの量を使用できる。しか
し、一般には約0.1ｇ/で泡を制御するのに十分
である。その他の泡制御剤（消泡剤）も使用でき
る。その選定及び使用基準は発泡を制御する（押
える）ような濃度水準で酵素合成を抑制しないこ
とである。 本発明において使用する微生物は合理的な温度
範囲で生長させてα―グリセロホスフエートオキ
シダーゼを製造することができる。良好な結果は
25〜42℃の温度範囲で得ることができる。最良の
結果は約30℃の温度で達せられる。細胞を生長さ
せた後グリセロホスフエートオキシダーゼは常法
に従つて抽出することができる。 本発明の実施を例示する、以下の例において次
の条件を使用した。 １ 培養 以下の例１―11においてストレプトコカス
フエカリスATCC12755を用いた。 ２ 媒質 (a) 培養保存媒質。 培養保存には0.2％のグリセロールを含ま
せた、ミク検定培養アガール（Micro Assay
Culture agar）（Difco Laboratories、デト
ロイト、ミジガン）を用いた。 (b) 発酵媒質 (i) STP媒質（Wood及びGunsalus、1942）
ｇ/ グルコース 1.0 酵母エキス 10.0 トリプトン 10.0 K2HPC4 5.0 蒸留水 全量を１にする量 (ii) 改良STP媒質―１ ｇ/ グルコース 1.0 トリプトン 10.0 酵母エキス 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 蒸留水 全量を１にする量 (iii) 改良STP媒質―２ ｇ/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 蒸留水 全量を１にする量 (iv) 改良STP媒質―３ ｇ/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンＣ 5.0 ビタミン溶液 1.0 蒸留水 全量を１にする量 (v) 改良STP媒質―４ ｇ/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS 20ml ビタミン溶液 1.0ml 蒸留水 全量を１にする量 (vi) 改良STP媒質―５ ｇ/ グルコース 2.0 ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS 20.0ml ビタミン溶液 1.0ml 蒸留水 全量を１にする量 (vii) 改良STP媒質―６ ｇ/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS ５ml ビタミン溶液 １ml 蒸留水 全量を１にする量 (viii) 改良STP媒質―７ ｇ/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS 2.5ml ビタミン溶液 １ml 水道水 全量を１にする量 (c) ソルトソリユーシヨン (i) ソルトソリユーシヨンＡ 下記パート１とパート２を等容積で混合
してソルトソリユーシヨンＡを調製した。 パート１ ｇ/（0.1NHCl） MgSC4・7H2O 100.0 FeSO4・7H2O 10.0 MnSO4・H2O 1.0 NaMoC4・2H2O 0.5 0.1NHCl 全量を１にする量 パート２ ｇ/ CaCl2 10.0 蒸留水 全量を１にする量 (ii) ソルトソリユーシヨンＣ
ｇ/（0.1NHCl） MgSO4・7H2O 25.0 CaCl2・2H2O 0.1 FeSO4・7H2O 2.8 MnSO4・H2O 1.7 ZnSO4・7H2O 0.06 NaCl 0.6 (iii) ソルトソリユーシヨンPYS ｇ/ Na3C6H5O7・2H2O「クエン酸ナトリウ
ム」 5.0 MnCl2・4H2O 3.0 ZnCl 2.0 FeCl3・6H2O 2.0 MgCl2・6H2O 50.0 CuCl2・2H2O 0.2 CaCl2・2H2O 0.75 CoCl2・2H2O 0.2 NaMoO4・2H2O 0.1 Na2B4O7・10H2O 0.1 蒸留水 全量を１にする量 (d) ビタミン溶液 mg/ チアミン・HCl 200 ｐ―アミノ安息香酸 200 ピリドキシン・HCl 200 リボフラビン 200 Ｄ―パントテン酸（カルシウム塩） 200 ホール酸 2.0 ビチオン 2.0 リボフラビンは加温して溶液中に溶解させ
る。このビタミン溶液は殺菌濾過し、そして
殺菌後媒質に加えた。 (e) すべての大規模発酵において媒質には消泡
剤として0.01％ポリグリコールＰ―200をも
含ませた。 ３ 培養物の保存 培養物は0.2％のグリセロールを含ませたミ
クロ検定培養アガールの穿刺上に保存した。培
養物は少なくとも週に一度新鮮な穿刺上に移し
た。30℃で48時間温置の後穿刺を４℃で保存し
た。生物体の保存用の別の方法は液体窒素中で
の貯蔵である。この目的のため培養物はSTP媒
質中で20時間生長させた。次に細胞を分離し、
アレン（Allen）のソルトソリユーシヨン
（Allen、A.B、アーカイブス オブ マイクロ
バイオロジー、32巻、270〜277頁、1959年）を
含む無菌の10％グリセロール水溶液中に再懸濁
させた。この懸濁物の少量を殺菌ガラスアンプ
ルに添加し、次に密封し、液窒中に貯蔵した。 ４ 小規模発酵 (a) 接種剤の調製 ミクロ検定培養アガールで48時間生長させ
た培養を250mlエーレンマイヤーフラスコ中
の50mlの、STP媒質又は改良STP媒質―２中
に移した。フラスコを30℃及び200rpmで振
とうした。20時間の温置後、内容物をソーバ
ル（Sorvall）の冷凍遠心機（RCIIB型、デ
ユポンインスツルメント社、ニユータウン、
コネチカツト）において４℃、12000Xgで15
分間遠心分離した。上澄液は捨て、細胞はも
とと同じ容積の無菌水中に再懸濁した。この
懸濁物を接種剤として用いた。 (b) 酵素の製造 250mlエーレンマイヤーフラスコ中の25ml
の発酵媒質に上記（4a）で述べたようにして
調製した接種剤1.5mlを接種した。フラスコ
を30℃で200rpmで振とうした。フラスコを
20時間振とう後、それぞれのフラスコからサ
ンプル2.5mlを採取した。このサンプルをソ
ーバル冷凍遠心機において19000Xgで15分間
遠心した。この細胞を脱イオン水2.5ml中に
再懸濁させた。この懸濁物を10倍に希釈し
た。この希釈懸濁液を乾燥細胞重量の決定及
びα―グリセロホスフエート（α―GP）オ
キシダーゼの検定用に用いた。 ５ 大規模発酵 (a) 接種剤の調製 150発酵器用の接種剤を次の３通りの方
法で調製した。 (1) 500mlの改良STP媒質―２を含む６個の
2.8のフエルンバツハフラスコに0.2％の
グリセロールを含ませたミクロ検定培養ア
ガールの穿刺で48時間生長させたストレプ
トコカス フエカリスATCC12755を接種
した。１個の穿刺を各フエルンバツハフラ
スコの接種に用いた。フラスコを30℃で
125rpmで振とうした。20時間温置後、フ
ラスコ内容物を冷凍遠心機（RCIIB型、デ
ユポン インスツルメント社、ニユータウ
ン、コネチカツト）で6000Xgで15分間無
菌的に遠心分離した。上澄液を捨て、細胞
ペレツトを無菌蒸留水中に再懸濁した。６
個のフラスコからの細胞を再懸濁させるの
に全量で500mlの蒸留水を用いた。この細
胞懸濁液を150発酵器の接種を用いた。 (2) この調製法は、フラスコの内容物を遠心
しなかつた以外は上と同様である。６個の
フラスコからの全発酵肉汁を150発酵器
の接種に用いた。 (3) この接種剤調製法は、本明細書に記載し
た実験のほとんどの接種剤の調製に使用し
た。50mlの改良STP媒質―２を含む250ml
のエーレンマイヤーフラスコに、0.2％グ
リセロールを加えたミクロ検定培養アガー
ルの穿刺で48時間生長させたストレプトコ
カス フエカリスATCC12755を接種し
た。フラスコを30℃及び200rpmで振とう
した。12時間振とう後、フラスコ内容物を
14発酵器の接種に用いた。接種前に、こ
の発酵器に所望の発酵媒質10を装入し、
１時間殺菌した。媒質を30℃に冷却し、上
述のようにした接種した。この媒質を３枚
の平羽根付のタービン型インペラを用いて
1300rpmで撹拌した。通気のためにリンク
状スパージヤーを用いた。空気流量は
0.2VVM（１分間当りの媒質単位容積当り
の容積）、即ち２/mmであつた。これは
我々に８mm-1の物質移動係数ＫL・ａを与
えた。12時間後、全肉汁を150発酵器に
接種するのに使用した。培養の純度は接種
の発育を通して監視した。この目的のため
に顕微鏡試験及び平板培養技術を用いた。 (b) α―GPオキシダーゼの製造 150の発酵器に適当な発酵媒質100を装
入し、１時間殺菌した。媒質を30℃に冷却し
た。これを上述の方法(3)のようにして調製し
た14発酵器の内容物を無菌状態で移すこと
によつて接種した。この媒質を３枚の平羽根
付のタービン型インペラで250rpmで撹拌
し、リング状スパージヤーで通気した。通気
速度は0.18VVM又は20空気／mmであつ
た。かかる条件下ＫL・ａの値は1.15mm-1で
あつた。温度は30℃に保持した。サンプルを
自動サンプラー（ニユーブランズウイツク
サイエンテイフイク社、ニユーブランズウイ
ツク、ニユージヤージー）で無菌的に毎時抜
き取り、細胞の生長度及びα―GPオキシタ
ーゼの生成を測定した。溶存酸素濃度を膜電
極（IL530、工業的酸素測定システム、セン
サーラブス、デイビジヨン オプ インスト
ルメンテーシヨン ラボラトリーズ社、レキ
シントン、マサチユセツツ）で監視した。ま
たインゴール電極（タイプ764―31B、ドク
ター、ダブリユー、インゴール社、キユーリ
ツヒ、スイス）でPHも測定した。発酵器を、
酵素レベルが所望の値に到達した時、冷水で
10℃まで冷却し、細胞を冷凍連続遠心機（セ
パ遠心機Z81G型、カールパドウベルグ
GMBH、西独）で採取した。平均発酵時間
は９−10時間であつた。 ６ 乾燥細胞重量の測定 乾燥細胞重量と660mmにおける吸光度の関係
を示す検量線を調製した。スペクトロニツク20
スペクトロフオトメータ（Spectronie20
Spectrophotometer）（パウシユ アンド ロ
ーム、ロチエスター、ニユーヨーク）で吸光度
を測定し、乾燥細胞重量を検量線から計算し
た。 ７ α―グリセロホスフエート オキシターゼ活
性の検定 α―GPオキシターゼ活性は、α―GPオキシ
ターゼによつてα―グリセロホスフエートを酸
化させるに際して放出されるH2O2によるロイ
コ染料のベルオキシダーゼ接触酸化を測定する
ことによつて決定した。酸素活性の一単位
（Ｕ）は37℃及びPH7.0で１分間当りに基質の１
μモルを製品に転換する酸素の量で定義する。 (a) 試薬 (i) KPバツフアー：0.1Mリン酸カリウム緩
衝液、PH7.0 (ii) 基質溶液：100mlのKPバツフアーにα―
グリセロホスフエート17.288ｇを溶解、 (iii) 染料溶液：100mlの脱イオン水に３，
3′―ジメトキシ―ベンチジン ジヒドロク
ロリド（ｃ―ジアニジン）１ｇを溶解、 (iv) 染浄剤：KPバツフアー10ml中にトリト
ン（Triton）Ｘ―100（ローム アンド
ハース、フイラデルフイア、ペンシルヴア
ニア、から市販のポリエトキシエチレン界
面活性剤）１ｇを溶解、 (v) バツフアー溶液：KPバツフア50ml中に
ホースラデイシユ ペルオキシダーゼ タ
イプ3.3mgを溶解し、これに染料溶液1.1
ml及び洗浄剤溶液6.6mlを添加し、KPバツ
フアーで全量を100mlにする。 (b) 方法 試験管中のバツフアー溶液６ml及び基質溶
液１mlを水浴シエカー（ニユーブランズウイ
ツクサイエンテイフイツク、ニユーブランズ
ウイツク、ニユージヤージー）で37℃で15分
間で平衡状態にさせた。このサンプルをml当
り５―25mUのα―GPオキシターゼを合うよ
うに稀釈した。正しく希釈したサンプル１ml
を平衡させた前記試験管に添加した。サンプ
ルの代りに脱イオン水１mlでブランクを調製
した。試験管を水浴シエカー中で37℃で振と
うした。色の展開を、スペクトロニツク20ス
ペクトロメーターを用いて430mlで５分毎に
１時間測定した。 染料に対する吸光係数を求め、光学濃度を
利用された基質の濃度に変換するのに用い
た。 ８ 物質移動係数（ＫL・ａ）の決定 物質移動係数は溶存酸素濃度と出口酸素濃度
とを監視することにより求めた。溶存酸素濃度
は前述の５(b)項（α―GPオキシターゼの製
造）で述べた膜電極を用いて求めた。 出口酸素濃度は磁気分析計（タイプCA150、
サーボメツクスコントローズ、リミテイド、ク
ロウボロウ、サセツクス、英国）を用いて測定
した。 ＫL・ａの計算には次の関係式を用いた。 ＮA＝ＫL・ａ（Ｃ※−ＣL） 式中、ＮA＝物質移動速度 ＫL＝物質移動係数 ａ＝界面積 Ｃ※＝溶存酸素の飽和濃度 ＣL＝瞬間溶存酸素濃度 例１−５は上述の小規模スケール技術の使用を
例示する。 例 １ グリセロールの誘導効果 グリセロールの添加は酸素の製造に画期的な効
果をもつ。グリセロール２ｇ/を含む媒質にお
いて最大の製造効果が得られた（第１表参照）。
更にグリセロール濃度に増大させても酵素の収量
は増大しなかつた。培養物の生長は大きく影響を
受けなかつた。即ち、乾燥細胞重量は高々20％程
度増大したのに対し、酵素収量の増大は３倍以上
であつた。
ゼの製法に関する。 α―グリセロホスフエートオキシダーゼ並びに
有用な、その調製及び抽出技術は、
Koditschek、L.K.およびUmbreit、W.W.の“ス
トレプトコカスフエイチウムF24のα―グリセロ
ホスフエートオキシダーゼ”、ジヤーナル オブ
バクテリオロジー、98巻、３号、1063―1068頁
（1969年）並びにJacobs、N.J.およびVan
Demark、P.J.の“ストレプトコカス フエカリ
スのα―グリセロホスフエート酸化酵素の精製及
び性質”、アーカイブズ オブ バイオケミスト
リー アンド バイオフイジツクス、88巻、250
−255頁に記載されている、この酵素は酸素の存
在下にα―グリセロホスフエートを酸化してジヒ
ドロキシアセトンホスフエート及び過酸化水素を
生成するのに有用である。 上掲のKcditschek及びUmbreitは、検圧検定法
を含む様々な効力検定技術を用いて研究したスト
レプトコカス フエイチウムF24のα―グリセロ
ホスフエートオキシダーゼの諸性質を説明してい
る。ストレプトコカス フエイチウムの培養は１
％トリプトン、１％酵母エキス、0.5％K2HPO4、
0.1％グルコース及び1.5％アガールから成るAC
アガール（以下AC媒質と呼ぶことがある）の穿
刺（stab）に保持した。これらの細胞は媒質から
分離し、酵素生成物を検定のため抽出した。 前述のJacobs及びVan Demarkは、彼等もその
研究において検圧検定法を用いて、ストレプトコ
カス フエカリス10Clのα―グリセロホスフエ
ートオキシダーゼの諸性質について記載してい
る。彼等は上述のAC媒質（但しグルコース0.2
％）中でストレプトコカス フエカリスを生長さ
せた。彼等はストレプトコカス フエカリスから
の酵素は受媒質としてＬ―α―グリセロホスフエ
ートに対しては高度な特異性を示し、β―グリセ
ロホスフエート、グリセロール、ジヒドロキシア
セトンホスフエートもしくは１，２―プロパンジ
オールホスフエートに対しては認識できるような
活性を示さない旨報じている。 Jacob、N.J.およびVan Demark、P.J.は、ジ
ヤーナル オブ、バクテリオロジー、79巻、532
―538頁（1960年）の報文“好気的及び嫌気的に
生長させたストレプトコカス フエカリスにおけ
るグリセロール酸化機構の比較”においてストレ
プトコカス フエカリスからの好気的及び嫌気的
生長細胞を用いた分類学的研究におけるグリセロ
ールの代謝について論じている。このストレプト
コカス フエカリスは前述のAC媒質で生長させ
ている。 Gunsalus、I.C.及びUmbreit、W.W.の“スト
レプトコカス フエカリスによるグリセロールの
酸化”、ジヤーナル オブ バクテリオロジー、
49巻、347―357頁（1945年）はストレプトコカス
フエカリスの活性細胞懸濁物によるグリセロー
ルの酸化の検定研究結果を報告している。彼等は
検定にピルビン酸塩を添加することによつて、ピ
ルビン酸塩がH2O2のスカベンジヤーとして作用
するので、グリセロール酸化レベルを高くするこ
とを見出した。α―グリセロホスフエートオキシ
ダーゼの活性は記載されていない。 Gunsalus、I.C.の“ストレプトコカス フエカ
リスによる嫌気的グリセロール発酵生成物”（ジ
ヤーナル オブ バクテリオロジー、54巻、239
―244頁（1947年）は、グリセロールと１％まで
の酵母エキスを含む媒質中でのストレプトコカス
フエカリスの生長について報告している。
Gunsalusはグリセロールによるストレプトコカ
ス フエカリスの生長は僅か（好気的生長）が殆
んど認められない（嫌気的生長）旨報告してい
る。 Claridge、C.A.及びHendlin、D.、の“ストレ
プトコカス フエカリスによるグリセロールの酸
化”（ジヤーナル オブ バクテリオロジー、84
巻、1181―1186頁（1962年））は一般的なワルブ
ルグ検定を用いて行なつたストレプトコカス フ
エカリスによるグリセロールの利用に関する研究
を報告している。彼等は、彼等の検定においてグ
リセロールを素早く酸化する細胞を得るために、
１％のグリセロール（10ｇ/）を補充した、１
ｇ/のグリセロールを含む媒質中でストレプト
コカス フエカリスを生長させることを示唆して
いる。α―グリセロホスフエートオキシターゼ活
性は記載されていない。 前述のいくつかの文献はグリセロールの酸化に
ついての研究を一般的に報じている。これらの文
献のうちの最初の二つ、即ち、“Koditschek及び
Umbreit”並びに“Jacobs及びVan Demark”の
みが彼等の検定でα―グリセロホスフエートオキ
シターゼの存在を示している。しかし、いずれの
文献もペデイオコカス属に属する微生物がα―グ
リセロホスフエートオキシダーゼを生産すること
を示唆していない。 発明の目的及び構成 本発明の目的は微生物を媒質又は培地中で生長
させることによつてα―グリセロホスフエートオ
キシダーゼを製造することにある。 本発明に従えば、ペデイオコカス属に属するα
―グリセロホスフエートオキシダーゼ生産性微生
物を培地において生長せしめ、次いで生成α―グ
リセロホスフエートオキシダーゼを抽出すること
を特徴とするα―グリセロホスフエートオキシダ
ーゼの製造方法が提供される。 発明の構成及び効果の具体的説明 本発明の実施に際し使用できる微生物ペデイオ
コカス属の代表的な種はペデイオコカス セリヴ
イジイエ（Pediococcus cerevisiae）である。特
に好ましいのはペデイオコカスセリヴイジイエ
ATCC8042及び8081である。 ストレプトコチ（Streptococci）はWood.A.J.
及びGunsalus、I.C.の“ストレプトコチの活性休
止細胞の製造”（ジヤーナル オブ バクテリオ
ロジー、44巻、337―341頁（1942年））に記載さ
れている、「STP媒質」と呼ばれる媒質中で普通
生長する。以下に述べるように、STP媒質中でス
トレプトコカス フエカリスATCC12755を生長
させると、60―80U／のα―グリセロホスフエ
ートオキシダーゼが製造される。 本明細書に記載するストレプトコカス フエカ
リスATCC12755なる名称の微生物は、最初
ATCC（American Type Culture Collection）
にストレプトコカス フエカリスATCC12755と
して寄託されたもので、ATCCのカタログ（1947
年、第11版）にその名称で掲載されている。この
ものは、前記カタログの第12版でストレプトコカ
ス フエイチウムATCC12755と名称変更されて
いる。 本発明に従えば、ラクトバシラチエエ科の微生
物、特にストレプトコカス フエカリスを炭素源
としてのピルビン酸塩、そして好ましくはグルコ
ースの添加及びα―グリセロホスフエートオキシ
ダーゼ用誘導質の添加によつて修正したSTP媒質
中で生長させることによつてα―グリセロホスフ
エートオキシダーゼが高収量で取得される。誘導
質としてグリセロールを添加することによつてα
―グリセロホスフエートオキシターゼの収量がグ
リセロールを添加しない場合に比較して３倍以上
も増加した。その他の有用なα―グリセロホスフ
エートオキシターゼ誘導質はグリセロールの同族
体、例えば、３―メチル―１，２―プロパンジオ
ール、１，３―プロパンジオール、１，２―プロ
パンジオール、２，３―ブタンジオール、１，
２，４―ブタントリオール、モノアセチン、１―
モノプロピオニン、１―モノブチリン、モノステ
アリン、モノオレイン及びトリラウリンなどであ
る。 誘導質の有用な量は、一般に、媒質リツトル当
り約1.0〜10ｇの範囲内であることを見出した。
好ましい媒質の使用量は媒質リツトル当り約2.0
〜約5.0ｇである。 Wood及びGunsalusによつて、呼称されたSTP
媒質は、グルコース―1.0ｇ/、酵母エキス―10
ｇ/、トリプトン10ｇ/及びK2HPO4―５ｇ/
を含む。これらの成分の有用な範囲は、グルコ
ース約0.1〜3.0ｇ/、酵母エキス1.0〜20ｇ/、
好ましくは約2.0〜10ｇ/、トリプトン約５〜20
ｇ/及びK2HPO4少なくとも約3.0ｇ/、好まし
くは約3.0〜約5.0ｇ/であることを確認した。 培地においてトリプトンに代えて使用すること
ができる他の蛋白水解物としては、例えば、
Sheffield Chemical Div.of Kraftco Corp.（ユ
ニオン、ニユージヤージー）から市販のソイ ペ
プトン タイプＴ（Soy Peptone Type Ｔ）、エ
ダミン（Edamin）タイプＴ、フアームアミン
（Ferm Amine）タイプ、、及び、Ｎ―
Ｚアミン（Amine）タイプAT、BT、ET及び
YTT；Cudahy Laboratories（オマハ、ネブラス
カ）からの市販のカゼイン ヒドロリセート
（Casein Hydrolysate）、アナトン（Anatone）、
ミクロバイオトン（Microbiotone）及びフアーマ
トン（Pharmatone）；Traders Protin Div.
Traders Oil Mill Co.（フオート ワース、テキ
サス）から市販のフアーマメデイア
（Pharmamedia）並びに硫酸アンモニウムがあげ
られる。 しかしながら、前記培地中のトリプトンに代え
て上述の蛋白水解物の一つを使用した場合には、
その蛋白水解物の最適量は、トリプトンの最適量
と多少変動することがある。特に有用な、トリプ
トンの代替物は、ソイ ペプトン タイプＴで、
これはトリプトンを用いた場合に比較してα―グ
リセロホスフエートオキシダーゼの収量を５倍以
上を増加させる。 前記培地中においてグルコースに代えて使用で
きる、その他の有用な炭素源は、例えば、クエン
酸、乳酸、酢酸ナトリウム、コハク酸ナトリウ
ム、アスパラキン酸、グルタミン酸、コーンシロ
ツプ、糖密、フラクトース、ラクトース、マルト
ースおよびシユクローズである。 本発明の最も好ましい態様では、培地中にグル
コース約0.5〜約3.0ｇ/及びピルビン酸ナトリ
ウム約0.5〜約2.0ｇ/を添加する。培地中での
グルコースとピルビン酸ナトリウムの組合せはα
―グリセロホスフエートオキシダーゼの生成に相
剰効果を呈するようである。炭素源のこの組合せ
を用いる場合には、酸素収量は、炭素源としてグ
ルコース１ｇ/を用いた場合に比較して、実に
８倍も増加した。 前記培地中に有効量の無機塩類およびビタミン
類を報告するのが有利であることも見出した。こ
こにいう「有効量」なる語は、培地中に加えて酵
素の収量を増加させるのに十分な量の無機塩類及
びビタミン類の量をいう。このような無機塩及び
ビタミン類の添加量は塩及びビタミンの種類によ
つて変動する。この量は一般に少量で、当業者で
あれば通常の実験により極めて容易に定めること
ができる。 大規模な発酵器中でストレプトコカス フエカ
リスのような微生物を生長させて高収量の酵素を
取得する場合に、しばしば発泡が生ずる。この泡
立ちを制御するために、特に酵素を大バツチで製
造する場合に泡制御剤を使用するのが好ましい。
本発明の実施に際して有用な泡制御剤の一例は、
ダウケミカル社（ミツドランド、ミシガン）から
市販のポリグリコール（Polyglycol）Ｐ―2000で
ある。この消泡剤は酵素の生成を妨害することな
く培地中で0.5ｇ/までの量を使用できる。しか
し、一般には約0.1ｇ/で泡を制御するのに十分
である。その他の泡制御剤（消泡剤）も使用でき
る。その選定及び使用基準は発泡を制御する（押
える）ような濃度水準で酵素合成を抑制しないこ
とである。 本発明において使用する微生物は合理的な温度
範囲で生長させてα―グリセロホスフエートオキ
シダーゼを製造することができる。良好な結果は
25〜42℃の温度範囲で得ることができる。最良の
結果は約30℃の温度で達せられる。細胞を生長さ
せた後グリセロホスフエートオキシダーゼは常法
に従つて抽出することができる。 本発明の実施を例示する、以下の例において次
の条件を使用した。 １ 培養 以下の例１―11においてストレプトコカス
フエカリスATCC12755を用いた。 ２ 媒質 (a) 培養保存媒質。 培養保存には0.2％のグリセロールを含ま
せた、ミク検定培養アガール（Micro Assay
Culture agar）（Difco Laboratories、デト
ロイト、ミジガン）を用いた。 (b) 発酵媒質 (i) STP媒質（Wood及びGunsalus、1942）
ｇ/ グルコース 1.0 酵母エキス 10.0 トリプトン 10.0 K2HPC4 5.0 蒸留水 全量を１にする量 (ii) 改良STP媒質―１ ｇ/ グルコース 1.0 トリプトン 10.0 酵母エキス 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 蒸留水 全量を１にする量 (iii) 改良STP媒質―２ ｇ/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 蒸留水 全量を１にする量 (iv) 改良STP媒質―３ ｇ/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンＣ 5.0 ビタミン溶液 1.0 蒸留水 全量を１にする量 (v) 改良STP媒質―４ ｇ/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS 20ml ビタミン溶液 1.0ml 蒸留水 全量を１にする量 (vi) 改良STP媒質―５ ｇ/ グルコース 2.0 ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS 20.0ml ビタミン溶液 1.0ml 蒸留水 全量を１にする量 (vii) 改良STP媒質―６ ｇ/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS ５ml ビタミン溶液 １ml 蒸留水 全量を１にする量 (viii) 改良STP媒質―７ ｇ/ ピルビン酸ナトリウム 2.0 酵母エキス 2.0 トリプトン 10.0 K2HPO4 5.0 グリセロール 2.0 ソルトソリユーシヨンPYS 2.5ml ビタミン溶液 １ml 水道水 全量を１にする量 (c) ソルトソリユーシヨン (i) ソルトソリユーシヨンＡ 下記パート１とパート２を等容積で混合
してソルトソリユーシヨンＡを調製した。 パート１ ｇ/（0.1NHCl） MgSC4・7H2O 100.0 FeSO4・7H2O 10.0 MnSO4・H2O 1.0 NaMoC4・2H2O 0.5 0.1NHCl 全量を１にする量 パート２ ｇ/ CaCl2 10.0 蒸留水 全量を１にする量 (ii) ソルトソリユーシヨンＣ
ｇ/（0.1NHCl） MgSO4・7H2O 25.0 CaCl2・2H2O 0.1 FeSO4・7H2O 2.8 MnSO4・H2O 1.7 ZnSO4・7H2O 0.06 NaCl 0.6 (iii) ソルトソリユーシヨンPYS ｇ/ Na3C6H5O7・2H2O「クエン酸ナトリウ
ム」 5.0 MnCl2・4H2O 3.0 ZnCl 2.0 FeCl3・6H2O 2.0 MgCl2・6H2O 50.0 CuCl2・2H2O 0.2 CaCl2・2H2O 0.75 CoCl2・2H2O 0.2 NaMoO4・2H2O 0.1 Na2B4O7・10H2O 0.1 蒸留水 全量を１にする量 (d) ビタミン溶液 mg/ チアミン・HCl 200 ｐ―アミノ安息香酸 200 ピリドキシン・HCl 200 リボフラビン 200 Ｄ―パントテン酸（カルシウム塩） 200 ホール酸 2.0 ビチオン 2.0 リボフラビンは加温して溶液中に溶解させ
る。このビタミン溶液は殺菌濾過し、そして
殺菌後媒質に加えた。 (e) すべての大規模発酵において媒質には消泡
剤として0.01％ポリグリコールＰ―200をも
含ませた。 ３ 培養物の保存 培養物は0.2％のグリセロールを含ませたミ
クロ検定培養アガールの穿刺上に保存した。培
養物は少なくとも週に一度新鮮な穿刺上に移し
た。30℃で48時間温置の後穿刺を４℃で保存し
た。生物体の保存用の別の方法は液体窒素中で
の貯蔵である。この目的のため培養物はSTP媒
質中で20時間生長させた。次に細胞を分離し、
アレン（Allen）のソルトソリユーシヨン
（Allen、A.B、アーカイブス オブ マイクロ
バイオロジー、32巻、270〜277頁、1959年）を
含む無菌の10％グリセロール水溶液中に再懸濁
させた。この懸濁物の少量を殺菌ガラスアンプ
ルに添加し、次に密封し、液窒中に貯蔵した。 ４ 小規模発酵 (a) 接種剤の調製 ミクロ検定培養アガールで48時間生長させ
た培養を250mlエーレンマイヤーフラスコ中
の50mlの、STP媒質又は改良STP媒質―２中
に移した。フラスコを30℃及び200rpmで振
とうした。20時間の温置後、内容物をソーバ
ル（Sorvall）の冷凍遠心機（RCIIB型、デ
ユポンインスツルメント社、ニユータウン、
コネチカツト）において４℃、12000Xgで15
分間遠心分離した。上澄液は捨て、細胞はも
とと同じ容積の無菌水中に再懸濁した。この
懸濁物を接種剤として用いた。 (b) 酵素の製造 250mlエーレンマイヤーフラスコ中の25ml
の発酵媒質に上記（4a）で述べたようにして
調製した接種剤1.5mlを接種した。フラスコ
を30℃で200rpmで振とうした。フラスコを
20時間振とう後、それぞれのフラスコからサ
ンプル2.5mlを採取した。このサンプルをソ
ーバル冷凍遠心機において19000Xgで15分間
遠心した。この細胞を脱イオン水2.5ml中に
再懸濁させた。この懸濁物を10倍に希釈し
た。この希釈懸濁液を乾燥細胞重量の決定及
びα―グリセロホスフエート（α―GP）オ
キシダーゼの検定用に用いた。 ５ 大規模発酵 (a) 接種剤の調製 150発酵器用の接種剤を次の３通りの方
法で調製した。 (1) 500mlの改良STP媒質―２を含む６個の
2.8のフエルンバツハフラスコに0.2％の
グリセロールを含ませたミクロ検定培養ア
ガールの穿刺で48時間生長させたストレプ
トコカス フエカリスATCC12755を接種
した。１個の穿刺を各フエルンバツハフラ
スコの接種に用いた。フラスコを30℃で
125rpmで振とうした。20時間温置後、フ
ラスコ内容物を冷凍遠心機（RCIIB型、デ
ユポン インスツルメント社、ニユータウ
ン、コネチカツト）で6000Xgで15分間無
菌的に遠心分離した。上澄液を捨て、細胞
ペレツトを無菌蒸留水中に再懸濁した。６
個のフラスコからの細胞を再懸濁させるの
に全量で500mlの蒸留水を用いた。この細
胞懸濁液を150発酵器の接種を用いた。 (2) この調製法は、フラスコの内容物を遠心
しなかつた以外は上と同様である。６個の
フラスコからの全発酵肉汁を150発酵器
の接種に用いた。 (3) この接種剤調製法は、本明細書に記載し
た実験のほとんどの接種剤の調製に使用し
た。50mlの改良STP媒質―２を含む250ml
のエーレンマイヤーフラスコに、0.2％グ
リセロールを加えたミクロ検定培養アガー
ルの穿刺で48時間生長させたストレプトコ
カス フエカリスATCC12755を接種し
た。フラスコを30℃及び200rpmで振とう
した。12時間振とう後、フラスコ内容物を
14発酵器の接種に用いた。接種前に、こ
の発酵器に所望の発酵媒質10を装入し、
１時間殺菌した。媒質を30℃に冷却し、上
述のようにした接種した。この媒質を３枚
の平羽根付のタービン型インペラを用いて
1300rpmで撹拌した。通気のためにリンク
状スパージヤーを用いた。空気流量は
0.2VVM（１分間当りの媒質単位容積当り
の容積）、即ち２/mmであつた。これは
我々に８mm-1の物質移動係数ＫL・ａを与
えた。12時間後、全肉汁を150発酵器に
接種するのに使用した。培養の純度は接種
の発育を通して監視した。この目的のため
に顕微鏡試験及び平板培養技術を用いた。 (b) α―GPオキシダーゼの製造 150の発酵器に適当な発酵媒質100を装
入し、１時間殺菌した。媒質を30℃に冷却し
た。これを上述の方法(3)のようにして調製し
た14発酵器の内容物を無菌状態で移すこと
によつて接種した。この媒質を３枚の平羽根
付のタービン型インペラで250rpmで撹拌
し、リング状スパージヤーで通気した。通気
速度は0.18VVM又は20空気／mmであつ
た。かかる条件下ＫL・ａの値は1.15mm-1で
あつた。温度は30℃に保持した。サンプルを
自動サンプラー（ニユーブランズウイツク
サイエンテイフイク社、ニユーブランズウイ
ツク、ニユージヤージー）で無菌的に毎時抜
き取り、細胞の生長度及びα―GPオキシタ
ーゼの生成を測定した。溶存酸素濃度を膜電
極（IL530、工業的酸素測定システム、セン
サーラブス、デイビジヨン オプ インスト
ルメンテーシヨン ラボラトリーズ社、レキ
シントン、マサチユセツツ）で監視した。ま
たインゴール電極（タイプ764―31B、ドク
ター、ダブリユー、インゴール社、キユーリ
ツヒ、スイス）でPHも測定した。発酵器を、
酵素レベルが所望の値に到達した時、冷水で
10℃まで冷却し、細胞を冷凍連続遠心機（セ
パ遠心機Z81G型、カールパドウベルグ
GMBH、西独）で採取した。平均発酵時間
は９−10時間であつた。 ６ 乾燥細胞重量の測定 乾燥細胞重量と660mmにおける吸光度の関係
を示す検量線を調製した。スペクトロニツク20
スペクトロフオトメータ（Spectronie20
Spectrophotometer）（パウシユ アンド ロ
ーム、ロチエスター、ニユーヨーク）で吸光度
を測定し、乾燥細胞重量を検量線から計算し
た。 ７ α―グリセロホスフエート オキシターゼ活
性の検定 α―GPオキシターゼ活性は、α―GPオキシ
ターゼによつてα―グリセロホスフエートを酸
化させるに際して放出されるH2O2によるロイ
コ染料のベルオキシダーゼ接触酸化を測定する
ことによつて決定した。酸素活性の一単位
（Ｕ）は37℃及びPH7.0で１分間当りに基質の１
μモルを製品に転換する酸素の量で定義する。 (a) 試薬 (i) KPバツフアー：0.1Mリン酸カリウム緩
衝液、PH7.0 (ii) 基質溶液：100mlのKPバツフアーにα―
グリセロホスフエート17.288ｇを溶解、 (iii) 染料溶液：100mlの脱イオン水に３，
3′―ジメトキシ―ベンチジン ジヒドロク
ロリド（ｃ―ジアニジン）１ｇを溶解、 (iv) 染浄剤：KPバツフアー10ml中にトリト
ン（Triton）Ｘ―100（ローム アンド
ハース、フイラデルフイア、ペンシルヴア
ニア、から市販のポリエトキシエチレン界
面活性剤）１ｇを溶解、 (v) バツフアー溶液：KPバツフア50ml中に
ホースラデイシユ ペルオキシダーゼ タ
イプ3.3mgを溶解し、これに染料溶液1.1
ml及び洗浄剤溶液6.6mlを添加し、KPバツ
フアーで全量を100mlにする。 (b) 方法 試験管中のバツフアー溶液６ml及び基質溶
液１mlを水浴シエカー（ニユーブランズウイ
ツクサイエンテイフイツク、ニユーブランズ
ウイツク、ニユージヤージー）で37℃で15分
間で平衡状態にさせた。このサンプルをml当
り５―25mUのα―GPオキシターゼを合うよ
うに稀釈した。正しく希釈したサンプル１ml
を平衡させた前記試験管に添加した。サンプ
ルの代りに脱イオン水１mlでブランクを調製
した。試験管を水浴シエカー中で37℃で振と
うした。色の展開を、スペクトロニツク20ス
ペクトロメーターを用いて430mlで５分毎に
１時間測定した。 染料に対する吸光係数を求め、光学濃度を
利用された基質の濃度に変換するのに用い
た。 ８ 物質移動係数（ＫL・ａ）の決定 物質移動係数は溶存酸素濃度と出口酸素濃度
とを監視することにより求めた。溶存酸素濃度
は前述の５(b)項（α―GPオキシターゼの製
造）で述べた膜電極を用いて求めた。 出口酸素濃度は磁気分析計（タイプCA150、
サーボメツクスコントローズ、リミテイド、ク
ロウボロウ、サセツクス、英国）を用いて測定
した。 ＫL・ａの計算には次の関係式を用いた。 ＮA＝ＫL・ａ（Ｃ※−ＣL） 式中、ＮA＝物質移動速度 ＫL＝物質移動係数 ａ＝界面積 Ｃ※＝溶存酸素の飽和濃度 ＣL＝瞬間溶存酸素濃度 例１−５は上述の小規模スケール技術の使用を
例示する。 例 １ グリセロールの誘導効果 グリセロールの添加は酸素の製造に画期的な効
果をもつ。グリセロール２ｇ/を含む媒質にお
いて最大の製造効果が得られた（第１表参照）。
更にグリセロール濃度に増大させても酵素の収量
は増大しなかつた。培養物の生長は大きく影響を
受けなかつた。即ち、乾燥細胞重量は高々20％程
度増大したのに対し、酵素収量の増大は３倍以上
であつた。
【表】
培養物は表示の濃度のグリセロールを補充した
STP媒質中で生長させた。 例 ２ 炭素源の効果 (a) グルコースの効果 第２表に示したように、培養物の生長はグル
コースの濃度に完全に依存した。グルコースを
含まない媒質で得られた乾燥細胞重量に比較し
て３ｇ/のグルコースを添加した場合には乾
燥細胞重量が３倍増加した。グルコース濃度も
α―GPオキシターゼの生成に重大な効果を呈
し、媒質中にグルコースのない場合には38％の
生成量低下を来した。酵素の生成量は、グルコ
ース濃度が1.0ｇ/までグルコース濃度の増加
に従つて増加した。グルコース濃度が更に増加
させるとα―GPオキシダーゼの生成量は低下
した。
STP媒質中で生長させた。 例 ２ 炭素源の効果 (a) グルコースの効果 第２表に示したように、培養物の生長はグル
コースの濃度に完全に依存した。グルコースを
含まない媒質で得られた乾燥細胞重量に比較し
て３ｇ/のグルコースを添加した場合には乾
燥細胞重量が３倍増加した。グルコース濃度も
α―GPオキシターゼの生成に重大な効果を呈
し、媒質中にグルコースのない場合には38％の
生成量低下を来した。酵素の生成量は、グルコ
ース濃度が1.0ｇ/までグルコース濃度の増加
に従つて増加した。グルコース濃度が更に増加
させるとα―GPオキシダーゼの生成量は低下
した。
【表】
前述の如く、培養はSTP媒質中で実施した。
グルコースの量は表示の通り変化させた。 (b) ピルビン酸ナトリウムの効果 第３表に示したように、グルコースをピルビ
ン酸ナトリウムで置換することによつてα―
GPオキシターゼの生長および製造は著しく改
良された。しかし、３ｇ/を越えるピルビン
酸塩の高濃度は酵素の製造量を低下させる。改
良STP媒質―２、３、４においては炭素源とし
て、2.0ｇ/の最適濃度でグルコースに置き換
えた。生物体は、媒質中のグルコースを表示濃
度のピルビン酸ナトリウムに置き換えた以外
は、前述の改良STP媒質―１で生長させた。
グルコースの量は表示の通り変化させた。 (b) ピルビン酸ナトリウムの効果 第３表に示したように、グルコースをピルビ
ン酸ナトリウムで置換することによつてα―
GPオキシターゼの生長および製造は著しく改
良された。しかし、３ｇ/を越えるピルビン
酸塩の高濃度は酵素の製造量を低下させる。改
良STP媒質―２、３、４においては炭素源とし
て、2.0ｇ/の最適濃度でグルコースに置き換
えた。生物体は、媒質中のグルコースを表示濃
度のピルビン酸ナトリウムに置き換えた以外
は、前述の改良STP媒質―１で生長させた。
【表】
酸ナトリ
ウム
〃 1.0 0.46 386 193
〃 2.0 0.60 484 242
〃 5.0 0.55 314 157
a：対照
(c) グルコースとピルビン酸との組合せ効果 第４表に示すように、グルコース2.0ｇ/と
ピルビン酸ナトリウム2.0ｇ/を共用した場合
には培養物の生長が増大し、そして驚くべきこ
とに同時に酵素生成量が著しく増加することが
認められた。この前記改良STP媒質―５と呼ば
れる改良媒質は本発明の好ましい媒質である。
ウム
〃 1.0 0.46 386 193
〃 2.0 0.60 484 242
〃 5.0 0.55 314 157
a：対照
(c) グルコースとピルビン酸との組合せ効果 第４表に示すように、グルコース2.0ｇ/と
ピルビン酸ナトリウム2.0ｇ/を共用した場合
には培養物の生長が増大し、そして驚くべきこ
とに同時に酵素生成量が著しく増加することが
認められた。この前記改良STP媒質―５と呼ば
れる改良媒質は本発明の好ましい媒質である。
【表】
【表】
培養物は上記グルコース及びピルビン酸ナト
リウム濃度の改良STP媒質―４で生長させた。 例 ３ ビタミンの効果 ビタミンは培養物の生長には影響を与えない
が、酵素の生成を30％以上も促進する（第５表参
照）。酵素生成量の増大はビタミン濃度の増加に
比例はしていない。
リウム濃度の改良STP媒質―４で生長させた。 例 ３ ビタミンの効果 ビタミンは培養物の生長には影響を与えない
が、酵素の生成を30％以上も促進する（第５表参
照）。酵素生成量の増大はビタミン濃度の増加に
比例はしていない。
【表】
培養物は改良STP媒質―３で生長させた。ビタ
ミン溶液の濃度は表に示すように変化させた。ビ
タミン溶液の組成に関しては前述の「２(d)ビタミ
ン溶液」の項参照。 例 ４ 無機塩の効果 痕跡性元素の添加による酵素生成の促進は痕跡
性元素が我々の発酵媒質中において他の限定栄養
素であることを示した。痕跡性元素は培養物が
PPMオーダー又はそれ以下の非常に少量、痕跡
量で必要とする元素である。培養はトレース量の
多くの元素を必要とし、これらを多く供給すれば
するほど、酵素収量は良くなる。第6A、6B、及
び6C表の結果は、ソルトソリユーシヨンＣより
多くの痕跡性元素を含むソルトソリユーシヨン
PYSがα―GPオキシターゼの生成の改良効果に
おいてソルトソリユーシヨンＣより良好である。
このソルトソリユーシヨンＣは、同じ理由でソル
トソリユーシヨンＡよりすぐれている。
ミン溶液の濃度は表に示すように変化させた。ビ
タミン溶液の組成に関しては前述の「２(d)ビタミ
ン溶液」の項参照。 例 ４ 無機塩の効果 痕跡性元素の添加による酵素生成の促進は痕跡
性元素が我々の発酵媒質中において他の限定栄養
素であることを示した。痕跡性元素は培養物が
PPMオーダー又はそれ以下の非常に少量、痕跡
量で必要とする元素である。培養はトレース量の
多くの元素を必要とし、これらを多く供給すれば
するほど、酵素収量は良くなる。第6A、6B、及
び6C表の結果は、ソルトソリユーシヨンＣより
多くの痕跡性元素を含むソルトソリユーシヨン
PYSがα―GPオキシターゼの生成の改良効果に
おいてソルトソリユーシヨンＣより良好である。
このソルトソリユーシヨンＣは、同じ理由でソル
トソリユーシヨンＡよりすぐれている。
【表】
培養物は上記に示した濃度のソルトソリユーシ
ヨンＣを補充した改良STP媒質―２で生長させ
た。
ヨンＣを補充した改良STP媒質―２で生長させ
た。
【表】
リユーシ
ヨンA
a：対照
b：ソルトソリユーシヨンAの最適濃度
この培養実験に用いた媒質は上表のような補充
をした改良STP媒質―２である。
ヨンA
a：対照
b：ソルトソリユーシヨンAの最適濃度
この培養実験に用いた媒質は上表のような補充
をした改良STP媒質―２である。
【表】
改良STP媒質―３をこの実験には用いた。ソル
トソリユーシヨンＣを上表に示した濃度のソルト
ソリユーシヨンPXSで置き換えた。 例 ５ ビタミンと痕跡性元素の効果 前述の如く、媒質にビタミン混合物もしくは痕
跡性元素の様々な混合物のいずれかを補充した場
合に酵素の生成は増加する。このビタミン溶液と
ソルトソリユーシヨンＣの両者を添加した場合に
は第７表に示すような相剰効果が認められた。培
養物の生長には著しい効果は無かつた。
トソリユーシヨンＣを上表に示した濃度のソルト
ソリユーシヨンPXSで置き換えた。 例 ５ ビタミンと痕跡性元素の効果 前述の如く、媒質にビタミン混合物もしくは痕
跡性元素の様々な混合物のいずれかを補充した場
合に酵素の生成は増加する。このビタミン溶液と
ソルトソリユーシヨンＣの両者を添加した場合に
は第７表に示すような相剰効果が認められた。培
養物の生長には著しい効果は無かつた。
【表】
培養物は改良STP媒質―２で生長させた。この
媒質に上表に示した添加物を加えた。 以下の例６―11は、前述の大規模発酵技術に従
つて150の発酵器を用いた例を示した。 例 ６ 接種剤のサイズの効果 前述の３通りの接種剤の調製法を試験した。接
種剤のサイズ（６―10）は酵素の生成もしくは
培養物の生長には影響を与えなかつたが、接種剤
のサイズが増大すると最大生長及び酵素生成に到
達するのに必要な時間を30％減少した。第８表に
示す効果は、遠心及び再懸濁した細胞に比較して
全肉汁が満足な接種剤であることを示した。
媒質に上表に示した添加物を加えた。 以下の例６―11は、前述の大規模発酵技術に従
つて150の発酵器を用いた例を示した。 例 ６ 接種剤のサイズの効果 前述の３通りの接種剤の調製法を試験した。接
種剤のサイズ（６―10）は酵素の生成もしくは
培養物の生長には影響を与えなかつたが、接種剤
のサイズが増大すると最大生長及び酵素生成に到
達するのに必要な時間を30％減少した。第８表に
示す効果は、遠心及び再懸濁した細胞に比較して
全肉汁が満足な接種剤であることを示した。
【表】
心
10 (14 0.62 7.75 844 7.75
発酵
器)
本実験においては改良STP媒質―３を用いた。
方法の詳細は前述の通りである。 例 ７ グリセロールの効果 グリセロール濃度は２ｇ/を越えた増大して
も、フラスコもしくは大発酵器中でのリツトル当
りの酵素収量の改良効果は認められなかつた。し
かしながら、大発酵器中での細胞生長については
グリセロール濃度が２ｇ/を越えて増加するこ
とによる影響を現れた。生長に対する影響の認め
られないフラスコ・実験に対して、第９表に示す
ように発酵器における培養生長は48％増大した。
酵素合成に対するグリセロールの最適濃度は約２
ｇ/である。
10 (14 0.62 7.75 844 7.75
発酵
器)
本実験においては改良STP媒質―３を用いた。
方法の詳細は前述の通りである。 例 ７ グリセロールの効果 グリセロール濃度は２ｇ/を越えた増大して
も、フラスコもしくは大発酵器中でのリツトル当
りの酵素収量の改良効果は認められなかつた。し
かしながら、大発酵器中での細胞生長については
グリセロール濃度が２ｇ/を越えて増加するこ
とによる影響を現れた。生長に対する影響の認め
られないフラスコ・実験に対して、第９表に示す
ように発酵器における培養生長は48％増大した。
酵素合成に対するグリセロールの最適濃度は約２
ｇ/である。
【表】
この150発酵器での実験では改良STP媒質―
６を用いた。グリセロール濃度は上表のように変
えた。接種剤14発酵器で調製した。 例 ８ グリセロール同族体の効果 我々はα―オキシダーゼが誘導性の酵素であ
り、そしてグリセロールで誘導されることを示し
た。グリセロールは基質、α―グリセロホスフエ
ートの前駆物質であり、そして容易に利用される
炭素源であるので、その濃度は発酵中に減少する
に違いない。それ故、発酵中にその濃度が減少し
ない誘導質、即ち無償の誘導質を見つけることは
有用である。この理由のために我々は多くのグリ
セロール同族体及びモノグリセリドについて試験
した。 以下の実験は振とうフラスコ中で実施した。α
―GPオキシダーゼの誘導は、試験したすべての
グリセロール同族体について得られた（第10表参
照）。グリセロールを媒質から除いた場合には酵
素量は対照の38％に減少した。この量は、グリセ
ロールの同族体を添加した場合には、エチレング
リコールは例外して、対照の50％に増加した。エ
チレングリコールは酵素の合成を強く抑制した。
６を用いた。グリセロール濃度は上表のように変
えた。接種剤14発酵器で調製した。 例 ８ グリセロール同族体の効果 我々はα―オキシダーゼが誘導性の酵素であ
り、そしてグリセロールで誘導されることを示し
た。グリセロールは基質、α―グリセロホスフエ
ートの前駆物質であり、そして容易に利用される
炭素源であるので、その濃度は発酵中に減少する
に違いない。それ故、発酵中にその濃度が減少し
ない誘導質、即ち無償の誘導質を見つけることは
有用である。この理由のために我々は多くのグリ
セロール同族体及びモノグリセリドについて試験
した。 以下の実験は振とうフラスコ中で実施した。α
―GPオキシダーゼの誘導は、試験したすべての
グリセロール同族体について得られた（第10表参
照）。グリセロールを媒質から除いた場合には酵
素量は対照の38％に減少した。この量は、グリセ
ロールの同族体を添加した場合には、エチレング
リコールは例外して、対照の50％に増加した。エ
チレングリコールは酵素の合成を強く抑制した。
【表】
〓プロパンジオ
ール
ール
【表】
培養物は２ｇ/の酵母エキスを加えた改良
STP媒質―１中で生長させた。グリセロールを上
表のように置換した。 例 ９ 温度効果 発酵温度の30℃から25℃への降温は酵素生成を
22％だけ減少し、生長をほんの僅かに増大させ
た。しかし、温度を下げることによつて最大生長
及び酵素生成に到達するのに要する時間に驚くべ
き影響を与えた。即ち、それは25℃において30℃
における値の２倍にもなつた。（第11表参照）
STP媒質―１中で生長させた。グリセロールを上
表のように置換した。 例 ９ 温度効果 発酵温度の30℃から25℃への降温は酵素生成を
22％だけ減少し、生長をほんの僅かに増大させ
た。しかし、温度を下げることによつて最大生長
及び酵素生成に到達するのに要する時間に驚くべ
き影響を与えた。即ち、それは25℃において30℃
における値の２倍にもなつた。（第11表参照）
【表】
使用媒質は改良STP媒質―６で、接種剤のサイ
ズは10であつた。 例 10 窒素源の変更の効果 我々はトリプトンに代えて他の窒素源を評価し
た。トリプチカーゼ（triptcase）ペプトンが良
好な基質であることを見出した。トリプチカーゼ
ペプトンを含んだ媒質におけるα―GPオキシダ
ーゼの生成はトリプトンを含む媒質の場合に匹敵
した。ただし、トリプチカーゼペプトンはストレ
プトコカスの生長を同様には支持しなかつた。結
果は第12表に示す通りであつた。
ズは10であつた。 例 10 窒素源の変更の効果 我々はトリプトンに代えて他の窒素源を評価し
た。トリプチカーゼ（triptcase）ペプトンが良
好な基質であることを見出した。トリプチカーゼ
ペプトンを含んだ媒質におけるα―GPオキシダ
ーゼの生成はトリプトンを含む媒質の場合に匹敵
した。ただし、トリプチカーゼペプトンはストレ
プトコカスの生長を同様には支持しなかつた。結
果は第12表に示す通りであつた。
【表】
これらの研究における使用媒質は改良STP媒質
―７であつた。トリプトンは同濃度のトリプチカ
ーゼペプトンで置換えた。接種剤は14発酵器で
生長させた。 例 11 α―GPオキシターゼ生成の動力学 酵素の生成は生長と明らかに相関する結果が得
られた。第１図は、発酵中の改良STP媒質４―の
生長、α―GPオキシダーゼの生成、溶存酸素濃
度及びPHを示す。生長は６時間で最大に達し、酵
素の生成は９時間で最大に達した。酵素濃度は最
大に達した後約２時間安定である。好ましい発酵
時間は６〜12時間である。 例 12〜20 ストレプトコカス フエカリスに代えて他のラ
クトバシラチエエ科の微生物を用いた場合の結
果 ストレプトコカス フエカリスATCC12755に
代えて第13表に掲げた、他の様々なラクトバシラ
チエエ科の微生物を用いて、α―グリセロホスフ
エート オキシダーゼの製造実験を行なつた。使
用媒質は改良STP媒質―７で、培養物は30℃及び
37℃で生長させた。結果を第13表に示す。
―７であつた。トリプトンは同濃度のトリプチカ
ーゼペプトンで置換えた。接種剤は14発酵器で
生長させた。 例 11 α―GPオキシターゼ生成の動力学 酵素の生成は生長と明らかに相関する結果が得
られた。第１図は、発酵中の改良STP媒質４―の
生長、α―GPオキシダーゼの生成、溶存酸素濃
度及びPHを示す。生長は６時間で最大に達し、酵
素の生成は９時間で最大に達した。酵素濃度は最
大に達した後約２時間安定である。好ましい発酵
時間は６〜12時間である。 例 12〜20 ストレプトコカス フエカリスに代えて他のラ
クトバシラチエエ科の微生物を用いた場合の結
果 ストレプトコカス フエカリスATCC12755に
代えて第13表に掲げた、他の様々なラクトバシラ
チエエ科の微生物を用いて、α―グリセロホスフ
エート オキシダーゼの製造実験を行なつた。使
用媒質は改良STP媒質―７で、培養物は30℃及び
37℃で生長させた。結果を第13表に示す。
【表】
セリヴイジイエ
例 21及び22 以下の例は検定STP媒質―Ｃ中におけるペデイ
オコカス（Pediococcus）微生物のα―GPO生産
性を試験したものである。 結果を30℃及び37℃において生長せしめた培養
によつて媒質１中に生産された酵素の単位で以
下の第14表に示した。
例 21及び22 以下の例は検定STP媒質―Ｃ中におけるペデイ
オコカス（Pediococcus）微生物のα―GPO生産
性を試験したものである。 結果を30℃及び37℃において生長せしめた培養
によつて媒質１中に生産された酵素の単位で以
下の第14表に示した。
【表】
例 23〜28
これらの例は種々の炭素源を用いたペデイオコ
カス微生物によるα―GPOの生産を示す。媒質
は炭素源を変えた以外は改良STP媒質Ｂ（媒質Ｂ
中の炭素源は通常グルコース）と同じとした。結
果を以下の第15表に示す。
カス微生物によるα―GPOの生産を示す。媒質
は炭素源を変えた以外は改良STP媒質Ｂ（媒質Ｂ
中の炭素源は通常グルコース）と同じとした。結
果を以下の第15表に示す。
【表】
【表】
比活性は660nmにおける光学濃度によつて媒質
中で製造されたＵ／Ｌを除すことによつて得られ
た生長量を補正した活性。光学濃度は生長量の指
標である。各例において表示したデータは１個以
上の実験の平均値である。
中で製造されたＵ／Ｌを除すことによつて得られ
た生長量を補正した活性。光学濃度は生長量の指
標である。各例において表示したデータは１個以
上の実験の平均値である。
Claims (1)
- １ ペデイオコカス属に属するα―グリセロホス
フエートオキシダーゼ生産性微生物を培地におい
て生長せしめ、次いで生成α―グリセロホスフエ
ートオキシダーゼを抽出することを特徴とするα
―グリセロホスフエートオキシダーゼの製造方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US74965076A | 1976-12-10 | 1976-12-10 | |
| US749650 | 1976-12-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58216687A JPS58216687A (ja) | 1983-12-16 |
| JPS62675B2 true JPS62675B2 (ja) | 1987-01-08 |
Family
ID=25014618
Family Applications (4)
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|---|---|---|---|
| JP14667077A Granted JPS5372892A (en) | 1976-12-10 | 1977-12-08 | Production of alphaa glycerophosphate oxidase |
| JP9509883A Granted JPS58216688A (ja) | 1976-12-10 | 1983-05-31 | α−グリセロホスフエ−トオキシダ−ゼの製法 |
| JP9509683A Granted JPS58216686A (ja) | 1976-12-10 | 1983-05-31 | α−グリセロホスフエ−トオキシダ−ゼの製造法 |
| JP58095097A Granted JPS58216687A (ja) | 1976-12-10 | 1983-05-31 | α−グリセロホスフエ−トオキシダ−ゼの製造方法 |
Family Applications Before (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14667077A Granted JPS5372892A (en) | 1976-12-10 | 1977-12-08 | Production of alphaa glycerophosphate oxidase |
| JP9509883A Granted JPS58216688A (ja) | 1976-12-10 | 1983-05-31 | α−グリセロホスフエ−トオキシダ−ゼの製法 |
| JP9509683A Granted JPS58216686A (ja) | 1976-12-10 | 1983-05-31 | α−グリセロホスフエ−トオキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (5)
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Citations (2)
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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Also Published As
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