DE2755033C2 - Verfahren zur Herstellung von α-Glycerophosphat-Oxidase - Google Patents

Description

⁸⁶2 ^e Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus In einem Medium ίο züchtet, das zusätzlich Glucose enthält.

3 Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus In einem Medium züchtet das als Auslöser für ct-Glycerophosphat-Oxidase S-Methoxy-l^-propandiol, 1,3-PropandIol; 1,2-Propandlol; 2,3-ButandIol; 1,2,4-Butantriol; Monoacetin; 1-Monopropionin; 1-Monobutyrin; Monostearin; Monoolein und/oder Trilaurin enthält.

Die Erflndup«? betrifft ein Verfahren zur Herstellung von cr-Glycerophosphat-Oxldase durch Züchtung eines 2« Mikroorganismus aus der Familie der Lactobacillaceae in einem Kulturmedium und Extraktion der erzeugten a-Glycerophosphat-Oxidase aus dem Kulturmedium.

Das Enzym a-Glycerophosphat-Oxidase eignet sich für die Oxidation von or-Glycerophosphat in Gegenwart von Sauerstoff unter Erzeugung von Dihydroxyaceton-Phosphat sowie Wasserstoffperoxid.

Verfahren zur Gewinnung von jr-Glycerophosphat-Oxldase sind beispielsweise aus »Journal of Bacteriology«, Band 98, Nr. 3, Seiten 1063 bis 1068 (1969) und »Archives of Biochemistry and Biophysics«, Band 88, Seiten

Auster LUeratureteuT»Jounial of Bacteriology«, Band 98, Nr. 3, Selten 1063 als 1068 (1969) sind ferner die Eigenschaften von sr-Glycerophosphat-Qxidase bekannt. Es wurden verschiedene Bestimmungsmethoden angewandt wozu auch das manometrische Bestimmungsverfahren gehörte. Verwendet wurden Kulturen von Streptococcus faerlum auf einem AC-Agar mit 1% Trypton. \% Hefeextrakt, 0,556 K₁HPO₄. 0,1% Glucose und 1,5'\> Agar (im folgenden gelegentlich als AC-Medium bezeichnet). Die Zellen wurden von diesem Medium abgetrennt, worauf das erzeug!,- Enzy>-. extrahiert wurde.

Auch die Autoren der Ir »Archives of Biochemistry and Biophysics«,· Band 88. Seiten 250 bis 255 (196U) beschriebenen Arbeit die bei lh ,n Studien ebenfalls manometrische Besilmmungsmethoden anwandten, beschreiben die Eigenschaften von ar-Glycerophosphat-Oxldase. Die Autoren züchteten Streptococcus feecalls in einem AC-Medium der beschriebenen Zusammensetzung, jedoch mit 0,2% Glucose. Sie berichten, daß das Enzym von Streptococcus faecalis hoch spezifisch für L-y-Glycerophosphat als Substrat ohne erkennbare Aktivität auf fl-Glycerophosphat, Glycerin, Dihydroxyacetonphosphat oder 1,2-Propandlolphosphal ist.

Die gleichen Autoren diskutieren in einer in »Journal of Bacteriology«, Band 79, Seiisn 53l Ms 538 (1960) veröffentlichten Arbeit den Metabolismus von Glycerin in taxanomischen Studien unter Verwendung von aerob und anaerob gezüchteten Zellen von Streptococcus faecalis. Der Mikroorganismus Streptococcus faecalis wurde in dem beschriebenen AC-Medlum gezüchtet. ... _A u ,.

In einer In der Literaturstelle »Journal of Bacteriology«, 49. Selten 347 bis 357 (1945) beschriebenen Arbeit werden ferner Studien über die Oxidation von Glycerin durch aktive Zeil-Suspensionen von Streptococcus faecalis beschrieben Die Autoren fanden, daß die Zugabe von Pyruvat die Oxidation von höheren Glycerlnkonzentratlonen ermöglicht, da Pyruvat als Abfangmittel für H₂O: wirkt. Über eine ar-Glycerophosphat-Oxldase-Aktlvi-

^elner "weiteren Arbeit, veröffentlicht in »Journal of Bacteriology«. 54. Seit™ 239 bis 244 (1947) wird über die Kultivierung von Streptococcus faecalis In einem Glycerin und bis zu 1% Hefeextrakt enthaltenden Medium 5.1 berichtet. Der Autor beschreibt das Wachstum von Streptococcus faecalis unter Verwendung von Glycerin als gering (aerobes Wachstum) oder schlecht (anaerobes Wachstum).

Aus »Journal of Baceriology«. Band 84. Selten 1181 bis 1186 (1962) ist ferner die Kultivierung von Streptococcus faecalis in einem Medium mit pro Liter 1 g Glucose, ergänzt durch 1% Glycerin (IOg pro Liter) bekannt Eine rr-Glycerophosphat-Oxldase-Aktlvität wird nicht erwähnt

>5 Aufgabe der Erfindung Ist das bekannte Verfahren zur Herstellung von ar-Glycerophosphat-Oxidase so >u verbessern, daß die Ausbeute an Enzym erhöht wird.

Der Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß sich die gestellte Aufgabe beim eingangs genannten Verehren dadurch lösen läßt, daß man den Mikroorganismus bei einer Temperatur von 25 bis 42° C In einem Medium züchtet, das pro Liter Medium als Kohlenstofflieferant 0.5 bis 5.0 g Pyruvat und als Auslöser für 2-Glycerowi phosphat-Oxidase 1,0 bis 10 g Glycerin oder ein Glycerin-Analoges enthält.

Unter »Pyruvat« sind die freie Säure und ihre Salze im üblichen Sinne zu verstehen.

Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn das Kulturmedium zusätzlich Glucose und gegebenenfalls ferner Hefeextrakt, Trypton und K₂HPO₄ enthält.

Es hat sich gezeigt, daß bei Verwendung eines Kulturmediums mit einer Mischung aus Glucose und I yruvai als Kohlenstofflieferant ein synergistischer Effekt bezüglich der Produktion von a-Glycerophosphal-Oxidasc

Als besonders vorteilhaft hat es sich weiterhin erwiesen, wenn man ein Kulturmedium verwendet, das zusätzlich anorganische Salze und Vitamine enthält. Durch Zusatz dieser Stoffe läßt sich die Ausbeute an a-Glyccro-

phosphat-OxIdase welter steigern.

Zu den Arten der Familie Lactobacillaceae, die erfindungsgemäß verwendet werden können, gehören beispielsweise Mikroorganismen der Gattung Streptococcus: S. faecalis, S. cremoris, S. faecium, S. salivarius; von der Gattung Lactobacillus: L. plantarum, L. casei, L. delbrueckii, L. fennentum, L. pentoaceticus, L. lactis, L. buchneri, L. Ieichmannii; von der Gattung Leuconostoc: L. mesenteroides und von der Gattung Pediococcus: P. cerevisiae.

Gemäß »Sergey's Manual of Determ. Bact.« 1957, S. 506 gehören die Streptococcaceae zur Familie der Lactobacillaceae.

Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung der Gattung S. faecalis erwiesen, und zwar insbesondere S. faecalis ATCC 12755.

Mikroorganismen der Gattung Streptococcus lassen sich beispielsweise in einem Medium züchten, das hier als »STP-Medium« bezeichnet wird, !ind welches in »Journal of Bacteriology« Band 44, Seiten 333 bis 341 (1942) beschrieben wird. Dieses Medium enthält pro Liter 1,Qg Glucose, 10 g Hefeextrakt, 10 g Trypton und 5 g K₂HPO₄.

Züchtet man Streptococcus faecalis ATCC 12755 in dem STP-Medium, das im folgenden näher beschrieben wird, so werden 60 bis 80 Einheiten st-Glycerophosphat-Oxidase pro Liter Medium erzeugt.

Der Mikroorganismus Streptococcus faecalis ATCC 12755 ist bei der American Type Culture Collection hinterlegt worden und wird in dem Katalog der Hinterlegungsstelle von 1974, 11. Ausgabe unter der angegebenen Bezeichnung aufgeführt. In der 12. Ausgabe des Kataloges findet sich der gleiche Mikroorganismus unter der Bezeichnung Streptococcus faecium ATCC 12755.

Die Erfindung ermöglicht somit die Erzeugung von 2-G!ycerophosphat-Qx!dase in hohen «-«beuten durch Züchtung eines Mikroorganismus der FamiVs Lactobacillaceae, insbesondere Streptococcus faecalis, in Nährmedien, insbesondere vom Typ des STP-Mediums, die durch Zusatz von Pyruvat und vorzugsweise Glucose als Kohlenstofflieferanten und Glycerin als Auslöser für ar-GIycerophosphat-Oxidase modifiziert worden sind.

Der Zusatz von Glycerin als Auslöser erhöht die Ausbeute an ar-Glycerophosphat-Oxidase im Vergleich zu ^⁵ einem Medium, das kein Glycerin enthält, um das etwa 3fache. Andere vorteilhafte Auslöser für a-Glycerophosphat-Oxidase sind außer Glucose und Glycerin Glycerin-Analoge, z. B.: 3-Methyl-l,2-propandiol; 1,3-Propandiol; 1,2-PropandIol; 2,3-ButandIol; 1,2,4-Butantriol; Monoacetln; 1-Monopropionln; 1-Monobutyrin; Monostearin; Monoolein und Trilaurin.

Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn der Auslöser in einer Konzentration von 2,0 bis 5,0 g pro Liter Medium verwendet wird.

In vorteilhafter Weise lassen sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Medien verwenden, die pro Liter Medium enthalten: Glucose: 0,1 bis 3,0 g; Hefeextrakt: 1,0 bis 20 g, vorzugsweise 2,0 bis 10 g; Trypton: 5 bis 20 g und K₂HPOj: mindestens 3,0 g, vorzugsweise 3,0 bis 5,0 g.

Anstelle von Trypton lassen sich auch andere handelsübliche Proteinhydrolysate verwenden. ³ⁱ

Wird anstelle von Trypton ein anderes Protelnhydrolysat verwendet, so können je nach Zusammensetzung dieses Hydrolysates die optimalen Konzentrationen des Hydrolysates etwas von der optimalen Konzentration an Trypton abweichen.

Andere vorteilhafte Kohlenstofflieferanten, die in dem Kulturmedium anstelle von Glucose verwendet werden können, sind beispielsweise Zitronensäure, Milchsäure, Natriumacetat, Natrlumsucclnat, Aspartlnsäure, Glutaminsäure, Kornsirup, Melasse, Fructose, Lactose, Maltose un> Sucrose.

In besonders vorteilhafter Weise werden dem Kulturmedium erfindungsgemäß 0,5 bis 3,0 g Glucose und 0,5 bis etwa 2,0 g Natriumpyruvat pro Liter zugesetzt.

Die Kombination von Glucose und Natriumpyruvat im Kulturmedium hat ganz offensichtlich einen synergistischen Effekt auf die Ausbeute von ar-Glycerophosphat-Oxidase. Bei Verwendung dieser Kombination als Kohlenstofflieferant läßt sich die Ausbeute an Enzym um das bis zu 8fache steigern, im Vergleich zu der Ausbeute, die erhalten wirü. wenn als Kohlenstofflieferant 1 g Glucose pro Liter Kulturmedium verwendet wird.

Ein bei der Züchtung von Mikroorganismen, wie beispielsweise Streptococcus faecalis In größerem Maßstabe auftretendes Schäumen kann durch Zusatz eines das Schäumen steuernden Mittels unterdrückt werden. Derartige Mittel sind im Handel erhältlich. Bei Durchführung des Verfahrens der Erfindung lassen sich beispielsweise bis zu 0,5 g eines Antischaummittel zusetzen, ohne daß dabei die Erzeugung dss Enzymes beeinträchtigt wird. Normalerwelse sind jedoch etwa 0,1 g Antischaummittel pro Liter Medium ausreichend, um das Schäumen unter Kontrolle zu bringen.

Als ganz besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, bei Temperaturen von etwa 30° C zu arbeiten. Nach der Züchtung der Zellen läßt sich die at-Glycerophosphat-Oxldase nach üblichen bekannten Methoden extiahieren.

In den folgenden Beispielen, die der näheren Erläuterung der Erfindung dienen, wurden verwendet:

1. Kultur:

Streptococcus faecalis ATCC 12755.

2. Medium:

a) Kulturmedium: Micro Assay Culture Agar, Hersteller DIfco Laboratories, Detroit, Michigan, USA, mit 0,2% Glycerin; 6S

b) Fermentationsmedium g/Liter I. STP-Medluxn (Journal of Bacterllogy, Band 44, Seite 333 bis 341 (1942)]

Glukose 1,0

Hefeextrakt 10,0

Trypion 10,0

K₂HPO₄ 5,0

mil destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

< II. Modifiziertes. STP-Medlum-1 g/Liter

Glukose UO

Trypton 10,0

Hefeextrakl 10,0

K₂HPO₄ 5,0

i" Glycerin 5,0

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

IiI. Modifiziertes STP-Medlum-2 |/Llter

Natrlumpyruvat 2,0

Hefeextrakt 2,0

Trypton UO

K₂HPO₄ 5,0

Glycerin 2,0

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

Iv. Modifizierte!! STP-Medtum-3 ' »/Liter

Natrlumpyruvat 2,0

Hefeextrakt 12.0

Trypton 10,0

K₂HPO₄ 5.0

Glycerin 2.0

Salzlösung C 5,0

Vitaminlösung UO

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

v. Modifiziertes STP-Medium-4 g/Lltcr

Natrlumpyruvat 2,0

3D Hefeextrakt . 2,0

Trypton 10,0

K₂HPO₄ 5,0

Glycerin 2,0

Salzlösung F¹YS 20 ml

Vitaminlösung UOmI

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

vl. Modifiziertes; STP-Medlum-5 f/Liier

Glukose 2,0

Natriumpyruvat 2,0

Hefeextrakt 2,0

Trypton 10,0

K₂HPO₄ 5,0

Glycerin 2,0

Salzlösung F¹YS ' 20,0 ml

4> Vitaminlösuing 1,0 ml

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

vli. Modifizierte·; STP-Medlum-6 g/Llter

Natriumpyniivat 2,0

Hefeextrakt 2,0

Tryptr-i 10,0

K₂HPO₄ 5,0

Glycerin 2,0

Salzlösung F¹YS 5 ml

Vitaminlösung 1 ml

mit destillieiitem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

viii. Modifiziertes STP-Medlum-7 g/Liter

Natriumpynivat 2,0

Hefeextrakt 2,0

Trypton 10,0

6Ii K₂HPO₄ 5,0

Glycerin 2,0

Salzlösung PYS 2,5 ml

Vitaminlösung 1 ml

mit Leitungswasser aufgefüllt auf 1 Liter

c) Salzlösungen:

1. Salzlösung A

Die Im folgenden angegebenen Teile 1 und 2 wurden In gleichen Volumina zur Salzlösung A vereinigt:

g/Lltcr einer

Tell I 0,1 N HCl-Lösung

MgSO₄ · 7HiO 100,0

FeSO₄ ■ 7H₂O 10,0

MnSO₄-HjO 1,0

NaMoO₄ ■ 2HjO 0,5 mit O₁IN HCl-Lösung aufgefüllt auf 1 Liter

Teil 2

CaCl₂ ■ · 10,0 Ό

mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

II. Salzlösung C

g/Liter einer O₁IN HCl-Lösung

MgSO₄ ■ 7H₂O 25,0

CaCIj · 2H₂O 0,1

FeSO₄ ■ 7H₂O 2,8

MnSO₄-H₂O 1,7

ZnSO₄ · /H₂U ϋ,ϋό

NaCl 0,6

III. Salzlösung PYS g/Liter Na₁CH₅O, ■ 2H₂O [Natriumeitrat] 5,0 MnCI₂ · 4HjO 3,0 ZnCI 2,0 FeCi₁-OH₂O 2,0 ^ MgCI₂ · 6HjO 50,0 CuCI₂ · 2H₂O 0,2 CaCI₂ · 2H₂O 0,75 CoCI₂ · 2H₂O 0,2 NaMoO₄ · 2H₂O 0,1 Na₂B₄O₁ ■ 1OH₂O 0,1 destilliertes Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

d) VItamlnlösung mg/Liter Thlamln ■ HCI 200 p-Aminobenzoesäure 200 ^}i

Pyridoxin · HCI 200

n ti η i_ inn

i\iuuitaYiii *.uv

D-Pantolhensäure (Calclumsalz) 200

Folsäure 2,0

Biotin 2,0 «*

Riboflavin ging beim Erwärmen In Lösung. Die VItamlnlösung wurde Fllter-sterlllsert und wurde dem Medium nach der Sterilisation zuge'setzt.

e) Bei Fermentationen im größeren Maßstab enthielt das Medium des weiteren ein Antischaummittel in einer -^ Konzentration von 0,01%. Verwendet wurde Polyglykol P-2000.

3. Aufbewahrung der Kultur:

Die Kultur wurde auf sog. »Stabs« eines Mflcro-Kultur-Agars mit 0,296 Glycerin aufbewahrt. Die Kultur wurde mindestens einmal pro Woche auf einen frischen »Stab« übertragen. Unter einem '»Stab« Ist ein In einem Teströhrchen geliertes Nährmedium zu verstehen, In das eine'Nadel, die zuvor mit einer Kultur des zu züchtenden Mikroorganismus in Kontakt gebracht wurde, eingeführt wurdt;.

Nach einer 48stündlgen Inkubation bei 30" C wurden die »Stabs« bei 4° C aufbewahrt.

Ein anderes Verfahren fQr die Aufbewahrung des Mikroorganismus ist die Aufbewahrung In flüssigem Stick- *⁵ stoff. Zu diesem Zweck wurde die Kultur 20 Stunden lang im STP-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden dann abgetrennt und in einer sterilen 1096Igen wäßrigen Glycerinlösung mit Allen's Salzlösung [vgl. M. B. Alien, Archives of Mikroblology, Band 32, Selten 270 bis 277 (1959)] suspendiert. Ein kleines Volumen von 0,5 bis 2,0 ml der Suspension wurde dann !n eine sterile Glas-Ampulle gegeben, die versiegelt und In flüssigem Stickstoff aufbewahrt wurde. ^

4. Fermentation in kleinem Maßstab: a) Herstellung des Inoculums:

Die auf dem Kultur-Agar innerhalb eines Zeltraumes von 48 Stunden gezüchtete Kultur wurde In 50 ml STP-Medlum oder modiziflertem STP-MedIum-2 In einem 250 ml fassenden Erienmeyerkolben überführt. Der Kolben wurde dann bei 30⁰C pro Minute 200 mal gedreht. Nach einer Inkubationsdauer von 20 Stunden

wurden die Inhalte der Kolben In einer Kühl-Zentrlfuge 15 Minuten bei 4⁰C bei 12 000 X/g zentrifugiert.

Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, während die Zellen in einem gleichen Volumen von sterilem Wasser wie das Ursprungsvolumen, resuspendiert wurden. Diese Suspension wurde als Inoculum verwendet.

b) Erzeugung des Enzyms:

25 ml des Fermentationsmediums In einem 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben wurden mit 1,5 ml Inoculum Inoccullect, das wie unter 4.a) hergestellt worden war. Die Kolben wurden bei 30° C 200 mal pro Minute gedreht. Nach 20stündiger Bewegung der Kolbeninhalte wurden aus jedem Kolben Proben von 2,5 ml abgezo-I» gen. Die Proben wurden dann 15 Minuten lang bei 19 000 X/g in einer Kühl-Zentrlfuge des beschriebenen Typs zentrifugiert. Die Zellen wurden dann In 2,5 ml deionisiertem Wasser resuspendiert. Die Suspension wurde auf das lOfache verdünnt. Die verdünnte Suspension wurde dann für die Bestimmung des Trockenzellengewlchtes und für die Bestimmung von a-Glycerophosphat (or-GP)-Oxldase verwendet.

I^ 5. Fermentation In größerem Maßstab:

a) Herstellung des Inoculums:

Das Inoculum für einen 150 Liter fassenden Fermentationsapparat wurde nach drei verschiedenen Methoden hergestellt.

1) Sechs 2,8 Liter fassende Fernbach-Kolben mit 500 ml modifiziertem STP-Medlum-2 wurden mit Streptococcus faecalis ATCC 12755, erhalten durch 48 Stunden lange Züchtung auf »Stabs« eines Mlkro-Kullur-Agar mit 0,2% Glycerin Inocullert. Ein »Stab« wurde zur Inocullerung eines jeden Fernbach-Kolbens verwendet.

Die Kolben wurden dann bei 30⁰C pro Minute Ί25 mal gedreht. Nach einer 20siündIgen Inkubation wurden die Inhalte der Kolben aseptisch bei 6000 X/g in einer Kühl-Zentrlfuge 15 Minuten lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen, während die Zellen In sterilem destillierten Wasser resuspendiert wurden. Zur Resuspendlerung der Zellen von sechs Kolben wurden insgesamt 500 ml destilliertes Wasser verwendet. Die erhaltene Zellsuspension wurde zur Inoculierung eines 150 Liter fassenden

■^V) Fermentationsapparates verwendet.

2) Das Verfahren war das gleiche wie beschrieben, mit der Ausnahme jedoch, daß die Kolbeninhalte nicht zentrifugiert wurden. Zur Inoculierung des Fermentationsapparates wurde die gesamte Fermentationsbrühe der sechs Kolben verwendet.

3) Diese Methode der Inoculum-Herstellung wurde in den meisten Fällen der hler beschriebenen Versuche -¹S angewandt.

STP-,Medium-2 wurde mil Str

j« faecal Is ATCC 12755 Inocullert. Der Mikroorganismus wurde erhalten durch 48 Stunden langes züchten auf

jl einem »Stab« eines Mlkro-Kultur-Agars, dem 0,2% Glycerin zugesetzt worden waren. Der Kolben wurde bei

40 30° C pro Minute 200 mal gedreht. Nach 12stündlgem Drehen wurden die Inhalte der Kolben zur Inoculierung

<' eines 14 Liter fassenden Fermentationsapparates verwendet. Vor der Inoculierung wurde der Fermentationsappa-

mit 10 Liter Fermentationsmedium beschickt und 1 Stunde lang sterilisiert. Das Medium wurde auf 30° C abgekühlt und In der beschriebenen Welse inoculiert. Das Medium wurde mit einem 3-Blattrührer, der mit einer Geschwindigkeit von 1300 Umdrehungen pro Minute umlief, in Bewegung gehalten. Für die Belüftung wurde

■*> ein ringförmiges Belüftungsgerät verwendet. Die Luft-Zufuhrgeschwlndlgkelt betrug 0,2 Volumentelle Luft pro Volumenteil Medium pro Minute oder 2 Liter pro Minute. Dies ergab einen Massen-Übertragungskoefflzlenten K_L · a von 8 Min"¹. Die Temperatur wurde bei 30⁰C gehalten. Nach 12 Stunden wurde die gesamte Brühe zur Inoculierung eines 150 Liter fassenden Fermentationsapparates verwendet. Die Reinheit der Kultur wurde wahrend der Entwicklung des Inoculums überwacht. Zu diesem Zweck erfolgte eine mikroskopische Überprü-

5u fung und Impfung eines Nährmediums in einer Petri-Schale mit einem Draht, der zuvor mit einer Kultur des zu züchtenden Microorganismus in Kontakt gebracht wurde.

b) Erzeugung von sr-GP-Oxidase

Ein 150 Liter fassender Fermentationsapparat wurde mit 100 Litern Fermentationsmedium beschickt und I Stunde sterilisiert. Das Medium wurde auf 30° C gekühlt. Es wurde durch aseptische Übertragung des Inhaltes des 14 Liter fassenden Fermentationsapparates, hergestellt wie unter Methode 3 beschrieben, inocullert. Das Medium wurde mittels eines 3-Blattrührers in Bewegung gehalten, der mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute umlief. Die Belüftung erfolgte mittels eines ringförmigen Belüftungsgerätes. Die

«) Luftzufuhrgeschwindigkeit betrug 0,18 Volumenteile Luft pro Volumenteil Medium pro Minute oder 20 Liter Luft pro Minute. Unter diesen Bedingungen lag der K₁ · a-Wert bei 1,15 Min"¹. Die Temperatur wurde bei 30° C behalten. Jede Stunde wurden mittels eines automatisch arbeitenden Probeentnahmegerätes Proben aseptisch abgezogen. Bestimmt wurde das Zellwachstum wie auch die cr-GP-Oxidase-Erzeugung. Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde mit einer Membran-Elektrode überwacht. Des weiteren wurde der pH-Wert gemes-

&5 sen. Das Fermentätionsgefäi wurde mit kaltem Wasser auf 10° C abgekühlt, wenn die Enzym-Konzentration den erwünschten Wert erreicht hatte. Die Zeilen wurden In einer Kühlzentrifuge geerntet. Die durchschnittliche Fermentationsdauer betrug 9 bis IG Stunden.

6. Bestimmung des Trockenzellgewichtes:

Es wurde eine Fichkurve hergestellt, aus der sich die Beziehung von Trockenzellgewicht zur Absorption bei 660 nm ergab. Die Absorption wurde unte; Verwendung eines Spektrophotometers ermittelt. Das Trockenzellgewicht wurde aus der Elchkurve errechnet.

7. Bestimmung der a-Glycerophosphat-Oxldase-Aktlvllat:

DIc a-GP-Ox!dase-Aktlvität wurde bestimmt durch Messung tier durch Peroxldase katalysierten Oxidation eines Leucofarbstoffes durch H2O2, das bei der Oxidation von a-Giycerophosphat durch er-GP-OxIdase frelge- ^|0 setzt wurde. Eine Einheit der Enzym-Aktlvltäi (E) wurde definiert als die Enzymmenge, die ein μΝίοΙ Substrat pro Minute bei 37° C und einem pH-Wert von 7,0 in Reaktionsprodukt überführt. Das Reaktionsprodukt bestand aus Wasserstoffperoxid und Dlhydroxyacetonphosphat.

a) Reagenzien: ^IS

i) KP-Puifer: 0,1 M Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0.

IH Substratlösung: erhalten durch Lösung von 17,288 g ar-Glycerophosphat in 100 ml KP-Puffer.

VA) Färbstoff!ösung: erhalten durch LOscn ^von 1 g 3,3'-D!me'hⁿ*yb?n7idind!hy;jrochlnriri (O-Dianisidin) in 100 ml deionisiertem Wasser. ^2f)

Iv) Lösui 3 von oberflächenaktiver Verbindung: erhalten durch Lösen von 1 g einer oberflächenaktiven Verbindung vom Typ des Polyäthoxyäthylens In 10 ml KP-Puffer.

v) Pufferlösung: erhalten durch Lösen von 3,3 mg Meerrettlch-Peroxidase vom Typ Il in 50 ml KP-Puffer sowie Zusatz von 1,1 ml Farbstofflösung und 6,6 ml der Lösung der oberflächenaktiven Verbindung und schließlich Auffüllen auf ein Gesamtvolumen von 100 ml m'.t KP-Puffer.

b) Verfahren:

6 ml Pufferlösung und 1 m¹ Substratlösung wurden In einem Teströhrchen zur Gleichgewichtseinstellung 15 Minuten lang in ein Wasser-Schüttelbad von 37° C gebracht.

Die Proben wurden soweit verdünnt, daß sie 5 bis 25 mE ar-GP-Oxidase pro ml enthielten. 1 ml einer entsprechend verdünnten Probe wurde dann In die Röhrchen gegeben. Zu Vergleichszwecken wurde einem Röhrchen lediglich 1 ml deionisiertes Wasser anstelle der Probe zugesetzt. Die Röhrchen wurden dann in einem Wasser-Schüttelgerät bei 37° C geschüttelt. Ermittelt wurde die Farbentwicklung alle 5 Minuten unter Verwendung eines Spektrometer bei einer Wellenlänge von 430 nm. Die Bestimmungen wurden 1 Stunde lang durchgeführt. Des weiteren wurde der Extinktlons-Koefflzlent für den Farbstoff bestimmt, mit dessen Hilfe die optische Dichte in die Konzentration des verwendeten Substrates umgerechnet wurde.

8. Bestimmung des Massen-Übertragungskoeffizienten (K_t · -v):

Der Massen-Übertragungskoeffizient wurde bestimmt durch Überwachung der Konzentration an gelöstem

Sauerstoff und der Konzentration an Sauerstoff, die nach Einleiten einer bestimmten 02-Menge in die Probe

wieder aus der Probe austrat.
Die Konzentration an gelöstem Sauerstoff wurde mittels einer Membran-Elektrode bestimmt, wie a,e in

Abschnitt 5 b) Im Zusammenhang mit der Herstellung von α-GP-Oxldaso beschrieben wurde. Die Außen-Sauer- ^4S Stoffkonzentration wurde mittels eines paramagnetischen Analyslergerätes gemessen. Zur Berechnung von K_t ■ a wurde die folgende Gleichung verwendet:

j N₁ = Kt

* .

worin bedeuten:

N₄ = Geschwindigkeit der Massenübertragung

K_L = Massen-Übertragungskoefflzlent

a = Grenzflächenbereich ^5S

C⁺ = Sättigungskonzentration an gelöstem Sauerstoff

C₁ = momentane Konzentration an gelöstem Sauerstoff.

Die Beispiele 1 bis 4 beschreiben die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in kleinem Maßstab.

Beispiel 1

a. Einfluß von Glukose:

Wie sich aus der folgenden Tabelle 1 ergibt, ist das Wachstum der Kultur stark von der Konzentration an ^6S Glukose abhängig. Ein 3facher Anstieg des Trockenzellgewichts trat dann auf, wenn 3 g Glukose pro Liter Medium zugesetzt wurden, im Vergleich zu einem Medium, das keine Glukose enthielt. Die Glukose-Konzentration hatte des weiteren einen wesentlichen Einfluß auf die Produktion von ar-GP-Oxidase. Durch Weglassen

von Glukose aus dem Medium wurde eine 38%ige Verminderung der Enzymproduktion Festgestellt. Die Produktion des Enzymes stieg mit steigenden Glukosekonzentrationen bis zu 1,0 g pro Liter an. Eine weitere Erhöhung der Glukose-Konzentration führte zu einer Unterdrückung der ar-GP-Oxidase-Synthese.

Tabelle 1

Einfluß von Glukose

Konzentration der Trockenzellgewicht a-GP-Oxidase-Produktion Glukose

g/Liter

g/Liter

E/Liter

% des Vergleichsversuches

0	0,22	52	62
0,5	0,29	62	76
1,0 (Vergleich)	0,32	82	100
2,0	0,57	30	36
3,0	0,61	39	47

Die Ki'kur wurde gebuchtet in einem air-Medium der angegebenen ZusannVienseizüiig, wöbe! die Konzentration an Glukose wie angegeben verändert wurde.

b. Einfluß von Natriumpyruvat:

Der Ersatz von Glukose durch Natriumpyruvat führte zu einer beträchtlichen Steigerung des Wachstums und der Produktion an ar-GP-Oxldase, wie sich aus der folgenden Tabelle 2 ergibt. Bei hohen Konzentrationen an Pyruvat (>3g/Liter) wurde die Enzymproduktion wieder vermindert. Die optimale Konzentration von 2,0 g pro Liter ersetzte Glukose als Kohlenstofflieferant in den modifizierten STP-Medien 2,3,4.

Der Organismus wurde in einem modifizierten STP-Medlum-1 der angegebenen Zusammensetzung gezüchtet, mit der Ausnahme, daß die Glukose des Mediums durch Natriumpyruvat in den angegebenen Konzentrationen ersetzt v/urde.

Tabelle 2

Einfluß von Natriumpyruvat

KohlenstofT-	Konzentration	Trockenzell	Produktion an	a-GP-Oxidase
lieferant	des Kohlenstoff-	gewicht
	lieferanten
	g/Liter	g/Liter	E/Liter	% des Vergleichs
				versuches
ohne	0,0	0,19	176	88
Glukose	1,0	0,33	199	100
(Vergleich)
Natriumpyruvat	0,5	0,36	352	176
Natriumpyravat	1,0	0,46	386	193
Natriumpyruvat	2,0	0,60	484	242
Natriumpyruvat	5,0	0,55	314	157

c. Kombinierter Effekt von Glukose und Natriumpyruvat:

Die kombinierte Zugabe von 2,0 g Glukose und 2,0 g von Natriumpyruvat pro Liter Medium führte zu einer Steigerung des Wachstums der Kultur und überraschenderweise gleichzeitig zu einem sehr starken Anstieg der Enzymproduktion, wie sich aus der folgenden Tabelle 3 ergibt. Dieses modifizierte Kulturmedium, als modifiziertes STP-Medium-5 bezeichnet, stellt ein bevorzugtes Medium für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dar.

Tabelle 3

Einfluß des Zusatzes von Glukose und Natriumpyruvat

Konzentration	Konzentration	Trockenzell	a-GP-Oxidase-Produktion	% des Vergleichs
von Glukose	von Na-Pyruvat	gewicht		versuches
g/Liter	g/Liter	g/Liter	E/Liter	30
				40
0	0	0,33	237	48
O	0,5	0,48	314	100
0	1,0	0,63	384	36
0	2,0 (Vergleich)	0,58	794	52
0,5	0	0,51	282	73
0,5	0,5	0,68	412	133
0.5	1.0	0,80	580	24
0,5	2,0	0,74	1052	63
1,0	0	0,49	194	68
1,0	0,5	0,81	500	135
1,0	1,0	0,81	540	53
1,0	2,0	0,79	1069	62
2,0	0	0,62	418	82
2,0	0,5	0,95	490	194
2,0	1,0	0,99	651	3
2,0	2,0	1,00	1539	40
3,0	0	0,72	27	46
3,0	0,5	1,05	315	123
3,0	1,0	1,13	369
3,0	2,0	1,06	998

Verwendet wurde ein modifiziertes STP-Medium-4 mit den angegebenen Konzentrationen an Glukose und Natriumpyruval.

Beispiel 2

Vitamine stimulierten die Enzymproduktion um bis zu 30%, obgleich kein Effekt auf das Wachstum der Kultur zu beobachten ist (Tabelle 4). Es ergab sich des weiteren, daß der Anstieg an Enzymproduktion nicht proportional zur Erhöhung der Vitaminkonzentration erfolgte.

Tabelle 4

Effekt der Vitaminzugabe Volumen an züge- Trockenzellgewicht a-GP-Oxid^se-Produktion

setzter Vitaminlösung

ml/Liter g/Liter E/Liter % des Vcrgleichsvcfsuches

0,0 (Vergleich)	0,64	766	100
1,0	0,63	808	106
2,0	0,66	939	123
3.0	0,63	882	116
5,0	0,62	908	119
10,0	0,65	1011	133

⁵⁰ I

Verwendet wurde ein modifiziertes STP-Medlum-3. Die Konzentration der Vltamlniösung wurde wie In der Tabelle angegeben verändert. Bezüglich der Zusammensetzung der verwendeten Vltamlniösung wird auf Abschnitt 2 d) verwiesen.

65

Beispiel 3

Die Stimulierung der Enzymproduktion durch Zusatz von Spurenelementen zeigte, daß Spurenelemente andere steuernde Nährstoffe des Fenr.entatlonsmediums sein können.

Spurenelemente sind solche, welche die Kultur in vergleichsweise sehr geringen Spurenmengen in der Größenordnung von Gewichtsteilen pro Million Gewichtstell oder weniger benötigt Die Kultur benötigt eine Anzahl von Elementen in Spurenmengen und umso mehr dieser Spurenmengen zugesetzt werden, um so besser werden die Enzymausbeuten. Die Tabellen 5 A, 5 B und 5 C veranschaulichen, daß die Salzlösung PYS. die mehr Spurenelemente als die Salzlösung C enthält, zu besseren Ergebnissen führt als die Salzlösung C bezüglich der Steigerang der jr-GP-Oxidase-Produktion. Die Salzlösung C wiederum führte zu besseren Ergebnissen als die Salzlösung A.

Tabelle 5 A

Effekt von verschiedenen Mischungen von Spurenelementen:
Effekt der Salzlösung C

Zugesetztes Volumen Trockenzellgewicht o-GP-Oxidase-Produktion

an Salzlösung C

tai/Liter g/Liter E/Liter % des Vergleichsversuches

0,0 (Vergleich)	0,49	439	100
0,5	0,62	630	143
1,0	0,59	598	136
2,5	0,60	669	152
5,0	0,61	729	165
10,0	0,64	747	170

Verwendet v<urde ein modifiziertes STP-Medium-2, das durch Zusatz von Salzlösung C in den angegebenen Konzentrationen ergänzt wurde.

Tabelle 5B

Effekt von verschiedenen Mischungen von Spurenelementen:
Effekt der Salzlösung A

Zugesetzte Mischung Zugesetztes Volumen Trockenzell- a-GP-Oxidase-Produktion
von Spurenelementengewicht

g/Liter g/Liter E/Liter % des Vergleichs

versuches

-(Vergleich) - 0,57

Salzlösung C 5,0 0,57

Salzlösung A 2,0*) 0,61

*) = optimale Konzentration an Salzlösung A.

541	100
1037	192
837	155

Das verwendete Medium bestand aus einem modifizierten STP-Medium-2, das in der aus Tabelle 5B ersichtliehen Weise ergänzt worden war.

Tabelle 5 C

Effekt von verschiedenen Mischungen von Spurenelementen:
Effekt der Salzlösung PYS

Zugesetzte Mischung Zugesetztes Volumen Trockenzell- a-GP-Oxidase-Produktion
von Spurenelementen gewicht

ml/Liter g/Liter E/Liter % des Vergleichs

versuches

-(Vergleich)	-	0,62	582	100
Salzlösung C	5,0	0,63	811	140
Salzlösung PYS	5,0	0,69	923	158
Salzlösung PYS	10,0	0,70	1000	171
Salzlösung PYS	20,0	0,67	978	168
Salzlösung PYS	50,0	0,75	1130	194

10

Im Falle des Vergleichsversuches wurde ein modifiziertes STP-Medium ohne Salzlösung C verwendet. Im übrigen wurde modifiziertes STP-Medium-3 verwendet. Die Salzlösung C wurde durch die Salzlösung PYS in den angegebenen Konzentrationen ersetzt.

Beispiel 4 ^s

Wie bereits dargelegt, steigt die Enzymproduktion an, wenn dem Medium entweder eine Vitaminmischung oder Mischungen von Spurenelementen zugesetzt werden. Ein synergistischer Effekt wurde bei der Enzymproduktion beot&chtet, wenn sowohl eine Vitanänlösung wie auch Salzlösung C zugesetzt wurde. (Vgl. Tabelle 6.) Demgegenüber wurde kein wesentlicher Effekt auf das Wachstum der Kultur festgestellt.

Tabelle 6

Effekt des Zusatzes von Vitaminen und Spurenelementen

Zusätze

Trockenzellgewicht a-GP-Oxidase-Produktion.
g/Liter E/Liter % des Vergleichs

versuches

-(Vergleich) 0,60

5,0 ml Salzlösung C pro Liter 0/5

1,0 ml Vitaminlösung pro Liter 0,59

5,0 ml Salzlösung C 0,63 1,0 ml Vitaminlösung pro Liter

530	100
577	109
582	110
811	153

Verwendet wurde ein modifiziertes STP-Medium-2. Das Medium wurde in der angegebenen Weise ergänzt.
In den folgenden Beispielen wurde ein 150 Liter fassender Fermentationsapparat zur Durchführung des Verfahrens in größerem Maßstab verwendet.

Beispiel 5 Einfluß der Größe des Inoculums

Es wurden die drei beschriebenen Verfahren der Incculurn-Herstellung getestet. Die Größe des Inoculums (6 bis 10 Liter) beeinflußte das Wachstum der Kultur oder die Produktion des Enzymes nicht. Jedoch wurde bei Erhöhung der Größe des Inoculums festgestellt, daß die Zeltspanne, die zur Erreichung des maximalen W&chslums und der Enzymproduktion erforderlich war, um 30% vermindert wurde. Aus den in der Tabelle 7 zusammengestellten Ergebnissen ergibt sich, daß die Gesamtbrühe ein zufriedenstellendes Inoculum im Vergleich zu zentrlfugierten und resuspendierten Zellen war.

Tabelle 7

Effekt der Größe des Inoculums

Größe des	Wachstum	Zur Erzielung	a-GP-Oxidase	Zur Erzielung
Inoculums	Trockenzell	des Maximums	Durch	maximaler Aus
	gewicht	erforderliche	schnittliche	beuten erforderliche
		Zeitspanne in	Ausbeute	Zeitspanne in
		Stunden		Stunden
	g/Liter	E/Liter

6 Liter 0,61 10,5 837

zentrifugiert

6 Liter 0,65 9,25 787

unzentrifugiert

10 Liter 0,62 7,75 844

(14 Liter Fermehtations-
apparat)

Verwendet wurde ein modifiziertes STP-Medlum-3.

11,3
9,25
7,75

11

in

Beispiel 6
Effekt der Glycerlnzugabe

Glycerlnkonzentratlonen über 2 g/Llter führen ganz offensichtlich zu keiner weiteren Steigerung der Enzymausbeute, sei es nun, ob In Kolben oder In einer größeren Fermentleranlage gearbeitet wird. Es zeigte sich jedoch, daß erhöhte Glycerlnkonzentratlonen von über 2g/Llter einen Einfluß auf das Wachstum der Zellen Im Falle der Verwendung von größeren Fermentationsapparaten hatten. Im Gegensatz zu den Versuchen Im Kolben, bei denen eine Beeinflussung des Wachstums nicht beobachtet wurde, wurde das Wachstum der Kultur In dem Fermentatlonspiiarat um 48% erhöht, wie sich aus der folgenden Tabelle 8 ergibt. Die optimale Konzentration an Glycerin für die Enzymsynthese lag bei ungefähr 2 g/Llter.

Tabelle 8

Effekt des Glycerinzusatzes

20

3D

5Ii

55

60

Konzentration an Glycerin

g/Liter

Trockenzellgewicht a»GP-Oxidase g/Liter E/Liter

2,0 (Vergleich) 0,63 3,0 0,93

1054 1039

Verwendet wurde ein modifiziertes STP-Medium-6 sowie eine 150 Liter fassende Fermentationsapparatur. Die Glycerlnkonzentratlon wurde in der angegebenen Weise verändert. Das Inoculum wurde In einer 14 Liter fassenden Fermentationsapparatur hergestellt.

Beispiel 7
Effekt von Glycerln-Analogen

Wie gezeigt wurde, 1st a-GP-Oxldase ein Induzierbares Enzym, das durch Glycerin induziert wird.

Da Glycerin eine Vurläuferverbindung des Substrates ar-Glycerophosphat ist, sowie ein leicht zugänglicher Kohlenstofflieferant, muß die Konzentration des Glycerins wöhrend der Fermentation abnehmen. Infolgedessen wäre ein Auslöser von Vorteil, dessen Konzentration während der Fermentation nicht abnimmt. Aus diesem Grund wurde eine Anisahi von Giycsriri-Äria'.csert und Monaglyseriden getestet. Die Im folgenden beschriebenen Versuche wurden In Schüttelkolben durchgeführt. Eine induktion von ct-GP-Oxldase wurde Im Falle sämtlicher getesteter Glycerin-Analogen erhalten (vgl. Tabelle 9). Die Enzymkonzentration wurde auf 38« des Vergleichsversuches vermindert, wenn Glycerin aus dem Medium fortgelassen wurde. Diese Konzentration wurde auf 50% des Verglelchsiversuches erhöht, wenn die Glycerln-Analogen mit Ausnahme von Äthylenglykol zugesetzt wurden. Es zeigte sich, daß Äthylenglykol die Enzymsynthese stark unterdrückte.

Tabelle 9

Effekt der Glycerin-Analogen

Glycerin-Analoge·)

Konzentration Trockenzellgewicht a-GP-Oxidase-Produktion M g/Iiter % des Vergleichsversuchs

ohne	-	0,31	38
Glycerin !"Vergleich)	0,002	0,41	100
Äthylengllykol	0,032	0,30	17
3-Methox y-1,2-propandiol	0,019	0,30	19
1,3-Propandiol	0,026	0,30	12
1,2-Propandiol	0,026	0,30	17
2,3-Butarjidiol	0,022	0,30	52
1,2,4-ButantrioI	0,019	0,31	49
Monoacer.in	0,015	0,40	98
1-Monopropionin	0,13	0,38	70
1-Monobutyrin	0,012	0,37	92
Monostearin	0,006	0,34	34
Monoolein	0,006	0,28	41
Trilaurin	0,003	0,32	46

·) = Sämtliche Glycerin-Analoge wurden in einer Konzentration von 2,0 g/Uler getestet.

12

Verwendet wurde ein modifiziertes STP-Mcdlum-1 mit 2 g Hefeextrakt pro Liter. Anstalt Glycerin wurden die angegebenen Glycerln-Analogen verwendet.

Beispiel 8 Effekt der Temperatur

Duräh Verminderung der Fermentationstemperatur von 30° C auf 25° C wurde die Enzymproduktion um 22% vermindert. Das Wachstum wurde nur schwach erhöht. Die Verminderung der Temperatur hatte jedoch einen drastischen Effekt auf die Zeltspanne, rUe erforderlich war, um das maximale Wachstum und die maximale Enzymproduktion zu erreichen. Bei einer Temperatur von 25° C war eine zweimal so lange Zeltspanne erforderlich als bei Durchführung des Verfahrens bei 30" C, wie sich aus der folgenden Tabelle 10 ergibt.

Tabelle 10

Effekt der Temperatur

Temperatur
-C

Wachstum
Trockenzellgewicht

g/Liter

Zeitspanne, erforderlich zur Erzielung des Maximums in Stunden

a-GP-Oxidase

Durchschnittliche
Ausbeute

E/Liter

Zeitspanne, ertorderlich zur Erzielung des Maximums
in Stunden

30 0,63

(Vergleich)
25 0,71

6,5 1054 6,5

12,0 822 13,0

Verwendet wurde ein modifiziertes STP-Medlum-6. Die Größe des Inoculums betrug 10 Liter.

Beispiel 9
Effekt der Veränderung des Stickstofflieferanten

Anstelle von Trypton wurden andere Stlckstofflieferanten verwendet. Beispielsweise zeigte sich, daß Trypticase-Pepton ein guter Ersatz für Trypton !st. Die ar-GP-Oxidase-Produktlon im Medium mit Tryptlcase-Pepton war vergleichbar mit der α-GP-Oxidase-Produktlon in einem Medium mit Trypton, obgleich Tryptlcase-Pepton das Wachstum von S. faecalis nicht so gut unterstützte. Die erhaltenen Ergebnisse sind In der folgenden Tabelle 11 zusammengestellt.

Tabelle 11

Effekt der Veränderung des Stickstofflieferanten

StickstotTlieferant	Trockenzellgewicht	e-GP-Oxidase
Lieferant	g/Liter	E/Liter
Trypsin digest.	0,63	755
Casein
Pancreatische	0,54	788
Digestion von
Casein*)

*) = mit vermahlenem Panlcreas-MateriaJ behandeltes Casein.

Trypton wurde durch die gleiche Konzentration an Tryptlcase-Pepton ersetzt. Das Inoculum wurde in einem 14 Liter fassenden Fermentationsapparat gezüchtet.

Beispiel 10
Kinetische Studien der a-GP-OxIdase-Produktion

Es zeigte sich, daß die Enzymproduktion wachstumsabhängig ist.

Aus Fig. 1 ergibt sich das Wachstum einer Kultur bei 30°C in einem modifizierten STP-Medium-4, die Erzeugung von a-GP-Oxidase, die Konzentration an gelöstem Sauerstoff und der pH-Wert während der Fermentation. Das Wachstum erreicht ein Maximum in 6 Stunden, während die Enzymproduktion ein Maximum in 9 Stunden erreicht. Die Enzymkonzentration bleibt etwa 3 Stunden lang stabil, nachdem ein Maximum erreicht isL Die bevorzugte Fermentationsdauer liegt bei 6 bis 10 Stunden.

13

Beispiele 11 bis

Die folgenden Kulturen, sämtlich Mitglieder der Familie der Lactobaclllacdaen, wurden auf Ihre Fähigkeit, a-Giycerophosphat-Oxldase In einem modifizierten STP-Medlum zu erzeugen, überprüft.

Die verwendeten Kulturen sowie die erzeugten Enzymeinheiten pro Liter Medium, gezüchtet bei 30⁰C und 37° C, sind In der folgenden Tabelle 13 zusammengestellt:

Tabelle	13	Einheiten/Liter	37° C
Beispiel	Kultur	Medium	_
		30° C
		270	28
12	Streptococcus faecium,
	ATCC 12755	157	-
13	Streptococcus faecium,
	ATCC 8043	143	110
14	Streptococcus faecalis,
	ATCC 19433	41	107
15	Streptococcus cremoris,
	NRRL B634	116	54
16	Lactobacillus casei,
	ATCC 7469	141	105
17	Lactobacillus delbrückii,
	NRRL B445	107	41
18	Lactobacillus fermenti.
	NRRL B338	33	24
19	Pediococcus cerevisiae.
	ATCC 8081	83
20	Pediococcus cerevisiae,
	ATCC 8043	Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

14

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1 Verfahren zur Herstellung von a-Glycerophosphat-Oxidase durch Züchtung eines Mikroorganismus aus

   der Familie der Lactobacillaceae in einem Kulturmedium und Extraktion der erzeugten ar-Glycerophosphat-

   Oxldase aus dem Kulturmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus bei einer

   Temperatur von 25 bis 42° C In einem Medium züchtet, das pro Liter Medium als Kohlenstofflleferant 0,5 bis

   5,0 g Pyruvat und als Auslöser für cr-Glycerophosphat-Oxidase 1,0 bis 10 g Glycerin oder ein Glycerin-Analo-