DE2650753B2

DE2650753B2 - Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase

Info

Publication number: DE2650753B2
Application number: DE2650753A
Authority: DE
Inventors: Charles Thomas Rochester Goodhue; Prakash Sharatchandra Webster Masurekar
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1975-11-07
Filing date: 1976-11-05
Publication date: 1979-03-15
Also published as: US4072568A; FR2330766A1; DE2650753A1; CA1069073A; US4035237A; BE848070A; JPS5261288A; GB1545237A; FR2330766B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase durch Züchtung eines Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus in einem Nährmedium und Abtrennung der erzeugten Cholesterin-Oxidase von dem Nährmedium.

Mikroorganismen, die zu einer Cholesterin-Metabolisierung befähigt sind, sind bekanntlich potentielle Enzymlieferanten für die enzy ma tische Bestimmung von Cholesterin in komplexen Mischungen, beispielsweise Blutserum. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn der Mikroorganismus Cholesterin als einzigen Kohlenstofflieferanten verwenden kann, da bei diesem Bestimmungsverfahren Cholesterin durch oxidative Enzyme abgebaut werden muß.

T. C. S t a d t m a η in »Methods in Enzymology«, Band 1, Herausgeber: S. P. Colowick und N. O. Kaplan, Academic Press, N.Y. 1955, Seite 678, sowie T. C. Stadtman, A. Cherkes sowie J. Anfinsen in »Biol. Chem.«, 206 (1954), Seite 510, berichten über die Reinigung eines Enzyms von Nocardia cholesterolicum, einem Organismus, der zuerst von Schatz und Mitarbeitern (vgl. A. Schatz, K. Savard und I.J. P i η t η e r in »). Bacteriol.« [1949], Seiten 117 bis 125) isoliert wurde. Das Enzym von Stadtman, als »Cholesterin-Dehydrogenase« bezeichnet, wurde für die Verwendung im Rahmen einer Cholesterin-Bestimmung gereinigt die auf der Messung des Anstiegs der Absorption bei 250 nm auf Grund der Bildung von Cholest-4-en-3-on beruht Da, wie nunmehr festgestellt wurde, der direkte Akzeptor von Cholesterin-Elektronen bei dieser Oxidation Sauerstoff ist muß das Enzym richtigerweise als Cholesterin-Oxidase bezeichnet werden.

Die Bakterienstämme, die von Stadtman beschrie-

ben werden, erzogen, wenn sie nach den in den zitierten Literaturstellen beschriebenen Verfahren kultiviert werden, nur sehr geringe Enzymkonzentrationen, welche für eine technische Verwertung zu gering sind. Die nach den bekannten Methoden herstellbaren Konzentrationen sind derart gering, daß eine Reinigung des Enzyms für die Praxis praktisch nicht in Frage kommt

Aus der US-PS 39 09 359 ist des weiteren ein verbessertes Verfahren für die Herstellung der Stadtmanschen Cholesterin-Oxidase bekannt, welches aus den folgenden Verfahrensstufen besteht:

(a) Züchtung des Bacteriums Nocardia cholesterolicum Art NRRL 5767 oder NRRL 5768 in einem Medium, in welchem Cholesterin oder ein geeignetes Derivat hiervon als Hilfs-Kohlenstofflieferant wirkt und

(b) Isolierung eines zellenfreien Extrakts mit dem aktiven Enzym aus dem Medium.

Obgleich das in der US-PS 39 09 359 beschriebene Verfahren eine wesentliche Verbesserung des von Stadtman beschriebenen Synthese-Verfahrens darstellt und obgleich das in der US-PS 39 09 359 beschriebene Verfahren technisch anwendbar ist, besitzt es doch den Nachteil, daß das Enzym überwiegend intracellular erzeugt wird. Aus diesem Grund ist für die Extraktion des Enzyms aus dem Nährmedium ein zeitaufwendiges, teures Zellen-Zertrümmerungsverfahren, z. B. eine Homogenisierung u. dgl, erforderlich.

Aus der DT-OS 22 46 695 ist des weiteren ein Verfahren zur Isolierung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms, erzeugt von einer Kultur eines Nocardia-Mikroorganismus mit der Bezeichnung NRRL 5635 und NRRL 5636 bekannt Bei diesem bekannten Verfahren werden die geernteten Zellen mit einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung behandelt und bei Raumtemperatur verrührt, so daß eine vergleichsweise große Menge des Enzyms aus den Zellen in die überstehende Flüssigkeit gelangt, wodurch eine Zellextraktion und Isolierungsmethoden überflüssig werden. Bei Anwendung dieses Verfahrens der Enzymextraktion lassen sich Ausbeuten in der Größenordnung von etwa 40 bis 160 Einheiten pro Liter erhalten.

Aus einer von E. T. R e e s e und A. M a q u i r e unter der Oberschrift »Surfactants as Stimulants of Enzyme Production by Microorganisms« veröffentlichten Arbeit in der Zeitschrift »Applied Micrcbiology«, February 1969, Seiten 242 bis 245, ist des weiteren bekannt, daß der Zusatz von Sorbitanpolyoxiäthylenmonooleat (Handelsprodukt Tween 80, Hersteller Atlas Chemical Company, Wilmington, Delaware, USA) und anderer nichtionogener oberflächenaktiver Verbindungen zu Pilzkulturen, die normalerweise Enzyme extracellular erzeugen, zu einem Anstieg der Enzymausbeute führt.

Aus der GB-PS 13 85 319 ist des weiteren ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase aus Nocardia Art NRRL 5635 und NRRL 5636 bekannt. Während der Fermentation wird langsam eine Suspension von Cholesterin als Auslöser oder Induktionsmittel für Cholesterin-Oxidase zugesetzt Für die Dispergierung des Cholesierins in der Suspension wird eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung (Tween 80) in einer Konzentration von 3 Vol.*% verwendet. Dies fahrt jedoch zu einer nur sehr geringen Menge an nichtionogener oberflächenaktiver Verbindung im Fermentationsmedium.

Die Bakterienkulturen, die dafür bekannt sind, daß sie Cholesterin-Oxidase erzeugen, erzeugen das Enzym normalerweise mtrncellular,

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase anzugeben.

Der Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß man in vorteilhafter Weise Cholesterin-Oxidase extracellular erzeugen kann, indem man dem Nährmedium, in dem ein Cholesterin-Oxidase erzeugender Mikroorganismus gezüchtet wird, eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung in einer Konzentration zusetzt, die selbst nicht toxisch ist und deren Zerfallsprodukte in einer Konzentration erzeugt werden, die nicht so hoch ist, als daß sie für den Cholesterin-Oxidase erzeugenden Organismus toxisch sein könnte. Überraschenderweise wurde gefunden, daß der Zusatz einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung dazu führt, daß die Hauptmenge des erzeugten Enzyms extracellular erzeugt wird. Dies ermöglicht eine wesentliche Einsparung der Zeit und Kosten, die normalerweise für die Enzym-Extraktion nach der Erzeugung des Enzyms aufgewandt werden müssen, indem eine Zellenzerstörung entbehrlich wird, die normalerweise erforderlich ist, wenn das Enzym intracellular erzeuge wird. Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase durch Züchtung eines Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus in einem Nährmedium und Abtrennung der erzeugten Cholesterin-Oxidase von dem Nährmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Choleste rin-Oxidase extracellular in einem Nährmedium, das mindestens 0,5 g einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung pro Liter Nährmedium enthält, erzeugt F i g. 1 veranschaulicht die Cholesterin-Oxidase-Aktivität als Funktion der Fermentierungsdauer sowie die

J5 Erschöpfung des Cholesterin in dem Fermentationsmedium mit der Zeit;

Fig.2 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Cholesterin-Oxidase-Aktivität und der Gegenwart von Cholesterin und Deoxicholat (DOC).

Nach dem Verfahren der Erfindung ist somit eine extracellular Cholesterin-Oxidase-Erzeugung möglich, wenn eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung, die selbst nichttoxisch ist und deren Zerfallsprodukte ebenfalls nichttoxisch für den Mikroorganismus sind, dem Nährmedium zugesetzt wird, das Cholesterin-Oxidase zu erzeugen vermag, Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignet sich in besonders vorteilhafter Weise das Bakterium Nocardia cholesterolicum, Art NRRL 5767 und NRRL 5768. In vorteilhafter Weise können die Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismen in einem Medium erzeugt werden, das Cholesterin, eil: geeignetes Derivat hiervon oder ein 3-jJ-Hydroxysterol als Auslöser oder Induktionsmit;el von Cholesterin-Oxidase enthält

In vorteilhafter Weise Wird als nichtionogene oberflächenaktive Verbindung eine Verbindung verwendet, die einen Polyoxiäthylenrest oder einen hydrophilen Polyglycidolrest sowie einen lipophilen Rest aufweist, der mindestens 9 Kohlenstoffatome enthält In vorteilhafter Weise besteht der lipophile Rest aus einer Fettsäurekette oder enthält eine Fettsäurekette mit mindestens 10 Kohlenstoffatomen.

Zur Durchführung des Verfahrens eier Erfindung lassen sich alle Kulturen verwenden, die Cholesterin- Oxidase erzeugen. Zu Cholesterin-Oxidase erzeugenden Kulturen gehören beispielsweise Arthobacter crystallopoities, Arthobacter Stamm NP, Corynebacterium-Stämme, Mycobacterium Stamm MA-7, Mycobacterium

Stamm E-16, Mycöbaeteflüm rhodochrous sowie andere Stämme aus der sogenannten Mycobacterium rhodochrous-Gruppe, Mycobacterium rubrum, Nocardia erythropolis, Nocardia, Art NRRL 5635 und 5636, Nocardia cholesterolicum — glatt und Nocardia cholesterolicum — rauh.

Zwei Nocardia-cholesterolicum-Kulturen, die Cholesterin-Oxidase liefern und sich besonders für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen, sind die »rauhen« und »glatten« Stämme mit der Bezeichnung NRRL 5767 sowie NRRL 5768, hinterlegt im »Agricultural Collection Investigations Fermentation Laboratory«, Peoria, Illinois, USA.

Details dieser Organismen sind:

Beschreibung von Nocardia cholesterolicum
I. Cellular-Morphologie

A. Glatter Stamm. Gram-positiv, schwach säurefest, coryneform, kein gut entwickelbares Mycel, jedoch wird eine rudimentäre Verzweigung beobachtet. Kokkoide Formen treten in älteren Kulturen auf.

B. Rauher Stamm. Wie oben.

II. Kolonie-Morphologie

A. Nähr-Agar(5Tage,30°C).

1. Glatter Stamm. Circular, konvex, wäßrig, ungeteilt (entire), glatt, glänzend, rosa-weiß. Kein lösliches Pigment.

2. Rauher Stamm. Circular, konvex, ungeteilt (entire), glatt bis rauh, rosa-weiß. Kein lösliches Pigment.

B. Hefe-Glukose-Agar(5Tage,30⁰C).

1. Glatter Stamm. Kremige bis hellbraune Farbe, wäßrig, glatt, rund und erhöht.

2. Rauher Stamm. Trocken, kremige bis hellbraune Farbe, rund und erhöht.

C. Kasein-Agar(5Tage,30°C).

1. Glatter Stamm. Kremige bis hellbraune Farbe, wäßrig, rund, glatt, erhöht.

2. Rauhe Kolonie. Hellbraun bis rosa, trocken, erhöht.

D. Gelatine-Agar.

!. Glatter Stamm. Circular, konvex, ungeteilt

(entire), glatt, wäßrig, kremfarben.
2. Rauher Stamm. Circular, konvex, ungeteilt (entire), trocken, kremfarbig.

III. Wachstum in flüssiger Kultur
(Nährbrühe, 5 Tage, 30° C)

A. Glatter Stamm. Fast weißer bis hellbrauner, flockenbildender Niederschlag, kein Häutchen.

B. Rauher Stamm. Fast weißer bis hellbrauner, flockenbildender Niederschlag, kein Häutchen.

IV. Physiologie
(Glatte und rauhe Stämme identisch)

Belüftung

Gelatinehydrolyse

Kaseinhydrolyse

Stärkehydrolyse

Oxidase

Catalase

Urease

aerob

Indol

Methylrot

Phenylalanin-Deaminicrung

Lackmusmilch

alkalisch

Verwendung der Verbindungen als einziger
Kohlenstofflieferant

Citrat
Lactat
Malat

Succinat

Fructose

Glucose

Sucrose

Maltose

Glycerin

Sorbitol

Trehalose

Dulcitol -

Lactose —

Mannitol +

Stärke

Arabinose —

Nach dem aus der US-PS 39 09 359 bekannten Verfahren, bei dem Cholesterin-Oxidase intracellular erzeug' wird, führt die Verwendung eines üblichen primären Kohlenstofflieferanten, wie beispielsweise Glycerin, in Kombination mit einem sekundären oder Hilfs-Kohlenstofflicferanten, wie beispielsweise Cholesterin, ChoIest-4-en-3-on oder Cliolesteryllinoleat, die sämtlich als Cholesterin-Oxidase-Auslöser oder Induktionsmittel dienen, zu einer Erhöhung der Ausbeute des Cholesterin-Oxidase-Enzyms, die um etwa das JOOfache höher ist als die Ausbeute, die erzeugt wird, wenn kein Cholesterin-Oxidase-Auslöser verwendet wird oder wenn Cholesterin als einziger Kohlenstofflieferant verwendet wird.

Nach dem aus der US-PS 39 09 359 bekannten Verfahren werden erhöhte Ausbeuten dann erhalten, wenn das Bakterium in einem üblichen Nährmedium üblicher bekannter Zusammensetzung gezüchtet wird, d. h. einem Nährmedium, das im allgemeinen enthält: einen Stickstofflieferanten, wie beispielsweise Ammoniumsulfat, einen Kalium- und einen Phosphorlieferanten, wie beispielsweise Kaliumphosphat, Spuren von Metallionen sowie eine Mischung aus einem primären Kohlenstofflieferanten, z. B. Glycerin, und einem Cholesterin-Oxidase-Auslöser oder Induktionsmittel, bestehend aus Cholesterin, Cholest^-en-S-on, Cholestt.yllinoleat oder Mischungen hiervon. Der pH-Wert des Mediums wird dabei bei 5,0 bis 8,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5, gehalten. Die Temperatur liegt vorzugsweise bei etwa 18 bis etwa 35° C, insbesondere bei 25 bis 30° C und die Züchtungsdauer liegt bei etwa 18 bis etwa 40 Stunden, vorzugsweise etwa 20 bis 24 Stunden.

Die Mengen an Stickstofflieferanten, Kaliumphosphat und Spurenmetallionen, die bei der Züchtung verwendet werden, sind bekannt Spezielle Angaben finden sich in den erwähnten Literaturstellen.

Zu den vorteilhaften primären Kohlenstofflieferanten, die in der US-PS 39 09 359 erwähnt werden, und die sich auch zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen, gehören beispielsweise Glyzerin, Glukose und Essigsäure. Dabei können übliche bekannte Konzentrationen des oder der primären Kohlenstoff-

lieferanten verwendet werden. Diese Konzentrationen liegen im allgemeinen bei etwa 0,5 bis etwa 5 Gew.-%. Die Konzentration eines Cholesterin-Oxidase-Auslösers liegt im allgemeinen bei etwa 0,05 bis etwa 0,5 Gew.-%. Vorzugsweise wird ein solches Auslöser in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 0,2 Gew.-% verwendet.

Nii-th dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Herstellung der Cholesterin-Oxidase somit beispielsweise nach dem aus der US-PS 39 09 359 bekannten Verfahren erfolgen mit der Ausnahme jeJoch, daß das Nährmedium zusätzlich eine nichtinhibierende Konzentration einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung enthält, die gegenüber dem Mikroorganismus nichttoxisch ist und deren Zerfallsprodukte in entsprechender Weise gegenüber den Mikroorganismen nichttoxisch sind. Der Zusatz einer solchen nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung zum Fermentalir»ncmf>Hiiim führt 7ij £!i£f 'ίΓΙΓΜί-Γ CXtruCeHulufC" Cholesterin-Oxidase-Erzeugung, wodurch die Notwendigkeit für die Durchführung einer zeitaufwendigen, komplizierten kostspieligen Zellenextraktion, wie sie bisher erforderlich war, in Fortfall gerät.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen sich die verschiedensten nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindungen, wie beispielsweise PoIyäthylenglykole, Polyvinylalkohole, Polyether, Polyester sowie Polyhalogenide.

Wesentliche Kriterien sind, daß

(1) weder die im Einzelfall verwendete nichtionogene Verbindung als auch ihre Zerfallsprodukte gegenüber dem Mikroorganismus in den erforderlichen Konzentrationen zur extracellularen Erzeugung des Enzyms toxisch sind und daß

(2) die Menge an verwendeter oberflächenaktiver Verbindung die Enzym-Produktion nicht inhibiert.

Die Toxizität einer oberflächenaktiven Verbindung gegenüber einem Mikroorganismus läßt sich leich". dadurch bestimmen, daß eine Kultur des Mikroorganismus einer vergleichsweise geringen Konzentration der zu testenden oberflächenaktiven Verbindung ausgesetzt wird, in der Regel von etwa 0,5 g pro Liter, worauf die Einwirkung der Behandlung des Mikroorganismus beobachtet wird. In den Fällen, in denen ein Kontakt mit einem toxischen Stoff erfolgt, erfolgt eine tnhibierung des Wachstums des Mikroorganismus und infolgedessen ein unterdrücktes Wachstum der Kultur in einer

Petrischale beispielsweise.

Die Toxizität der Zerfallsprodukte der oberflächenaktiven Verbindungen läßt sich, wie im folgenden beschrieben wird, erkennen. Der einzig positive Test für die Ermittlung der Toxizität der Zerfallsprodukte ist

ίο jedoch die Züchtung des Mikroorganismus in einem Nahrmedium und die Beobachtung der Effekte der erzeugten Nebenprodukte, wie es in den später folgenden Beispielen gezeigt wird.

Obgleich der dem erfindungsgemäßen Verfahren

r> zugrundeliegende Mechanismus noch nicht restlos geklärt ist, wird angenommen, daß, wie es in den später folgenden Beispielen gezeigt werden wird, nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen, die bekannt sind, daß sic

in toxische Rest zerfallen, beispielsweise

Phenole, nicht zur erfolgreichen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind.

Zu den geeigneten nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindungen gehört eine breite Skala von Verbindungen.

.'"> Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen verwendet, die einen Polyoxyäthylenrest oder einen hydrophilen Polyglycidolrest sowie einen lipophi-

w len Rest mit mindestens 9 Kohlenstoffatomen aufweisen.

Als besonders vorteilhaft hat sich dabei die Verwendung von Verbindungen erwiesen, deren lipophiler Rest aus einer Fettsäurekette besteht oder eine

Ji solche Fettsäurekette aufweist, die mindestens 10 Kohlenstoffatome enthält.

Optimale Ergebnisse lassen sich dann erhalten, wenn die Fettsäurekette mindestens 16 Kohlenstoff a tome aufweist und der hydrophile Rest aus etwa 20

4<> Oxiäthyleneinheiten besteht.

Im folgenden sind zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung besonders geeignete oberflächenaktive Verbindungen aufgeführt:

Oberflächenaktive	Hydrophiler Rest	Anzahl	Lipophiler Rest	Anzahl
Verbindung		Einheiten		Einheiten
S-I	Sorbita n-	1	Laurinsäure	1
	Polyoxyäthylen	20
S-2	Sorbitan-	1	Laurinsäure	1
	Polyoxyäthylen	4
S-3	Sorbitan	1	Palmitinsäure	1
	Polyoxyäthylen	20
S^	Sorbitan-	1	Stearinsäure	1
	Polyoxyäthylen	20
S-5	Sorbitan-	1	Stearinsäure	1
	Polyoxyäthylen	4
S-6	Sorbitan-	1	Stearinsäure	3
	Polyoxyäthylen	20
S-7	Sorbitan-	1	Oleinsäure	1
	Polyoxyäthylen	20
S-8	Sorbitan-	1	Oleinsäure	1
	Polyoxyäthylen	5
S-9	Polyoxyäthylen	10	Nonylphenyl	1

9 Fortsetzung	26	Hydrophiler Rest	50 753	10	Lipophiler Rest	Anzahl Einheiten
Oberflächenaktive Verbindung	Polyoxyäthylen Polyoxyäthylen Polyglycidol Polyglycidol	Anzahl Liinheilen	Nonylphenyl Nonylphenyl Nonylphenyl Nonylphenyl	1 1 1 1
S-IO S-Il s-ii S-13	15 30 6 10

Nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen, die sich als nicht geeignet für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung erwiesen haben, sind Octylphenylpolyäthoxyäthanole, wie sie beispielsweise im Handel unter der Handelsbezeichnung Triton (Hersteller Rohm & Haas, Philadelphia, USA) erhältlich sind. Es wird angenommen, daß diese Verbindungen beim Zerfall oder Abbau toxische Phenole bilden und aus

ΐ~* ν Λ ' U* r* * e'rt/4 Εΐϊηο V/ο

9,5 Polyäthoxyäthyleneinheiten und einer Octylphenyleinheit (S-14: Triton-X-100) wird in den später folgenden Beispielen untersucht.

Die günstigste Konzentration an nichtionogener oberflächenaktiver Verbindung in einem speziellen Nährmedium hängt stark von der übrigen Zusammensetzung des Nährmediums ab, der Empfindlichkeit des Mediums gegenüber der im Einzelfall verwendeten oberflächenaktiven Verbindung und der im Einzelfall verwendeten Verbindung. Ganz allgemein hat es sich doch als zweckmäßig erwiesen, die oberflächenaktiven Verbindungen in Konzentrationen von etwa 0,5 bis etwa 10,0 g/l Medium anzuwenden. Bei Konzentrationen von über 10 g/l kann die oberflächenaktive Verbindung als Wachstumsinhibitor wirken, höchstwahrscheinlich auf Grund einer Toxizität der oberflächenaktiven Verbindung oder von Nebenprodukten gegenüber dem Mikroorganismus. Bei Konzentrationen unterhalb von 0,5 g/l wird demgegenüber keine wesentliche Freisetzung von Cholesterin-Oxidase beobachtet. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, Konzentrationen an oberflächenaktiven Verbindungen von etwa 1 bis 5 g/l Medium zu verwend""J.

Als primärer Kohlenstofflieferant kann beispielsweise verwendet werden: Glycerin, Glucose (insbesondere von Reagens-Reinheit), Maissirup von technischem Reinheitsgrad u. dgl. Als Auslöser oder Induktionsmittel ist beispielsweise Cholesterin-Oxidase geeignet, die auch als Hilfs-Kohlenstofflieferant verwendet werden kann. Als Auslöser können des weiteren beispielsweise Cholesterin, Cholest-4-en-3-on sowie Cholesteryllinoleat verwendet werden sowie andere Sterole und Cholesterinester. Weitere vorteilhafte Auslöser sind beispielsweise ^-Sitosterol und 5ct-Cholestan-3-/}-ol sowie Cholesterinester, z, B. Cholesteryloleat, Cholesterollinoleat, Cholesterylformiat und Cholesterylpropionat

Als Stickstofflieferanten können die verschiedensten üblichen Stickstoffverbindungen verwendet werden. Als besonders vorteilhafte Stickstofflieferanten für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung haben sich handelsübliche Nährbrühen erwiesen, beispielsweise Nutrient Broth, ein Erzeugnis der Firma Difco Laboratories, Detroit, Michigan, mit einem Gehalt von Pepton und Rindfleischextrakt Andere weitere Stickstofflieferanten sind beispielsweise im Handel erhältliche Erzeugnisse, wie Anatone, Hersteller Cudahy Laboratories, Omaha, Nebraska, sowie N-Z/Amin Typ AT, N-Z/Amin Typ BT, N-Z/Amin Typ LT, N-Z/Amin Typ TT, Soy Petone Typ T, Fermamin Typ I, Fermamin Typ Il und Dermamin Typ III, die sämtlich von der

ι > US-Firma Sheffield Chemical Div. von Kraftco Corp., Union, New |ersey, USA, in den Handel gebracht werden.

Bei der Herstellung von Cholesterin-Oxidase unter Verwendung eines Nährmediums mit einer nichtionoge-

Im na» Q^^ff!uchciiuK*!ve" Verbinden** nsch dem Verfahren der Erfindung kann ein Schäumen beobachtet werden. Um das Schäumen unter Kontrolle zu halten, insbesondere dann, wenn mit vergleichsweise großen Ansätzen gearbeitet wird, kann die Verwendung eines

_>-, Schaum-Steuermittels vorteilhaft sein. Derartige Schaum-Steuermittel sind im Handel erhältlich. Ein typisches geeignetes Schaum-Steuermittel ist beispielsweise das Polyglykol P-2000, Hersteller Dow Chemical Co., Midland, Michigan, USA. Weitere geeignete

to Schaum-Steuermittel sind im Handel erhältlich.

In den folgenden Beispielen, die das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen sollen, werden die folgenden Definitionen gebraucht:

^r> 1. Kultur

Sofern nichts anderes angegeben wird, wurde der »rauhe Stamm« (NRRL 5768) von Nocardia cholesterolicum verwendet.

2. Nährmedium	hatten folgende	Mit destilliertem Wasser aufgefüllt	pro Liter einer
Die verwendeten Nährmedien		auf 1 Liter.	0,1 N HO-Lösung
Zusammensetzung:	pro Liter	Salzlösung »C«	25,0 g
₄_ a) Glyzerin-Medium	2,0 g		0,1g
Ammoniumsulfat	2,0 g	Magnesiumsulfat · 7 H₂O	2,8 g
Kaliumphosphat (dibasisch)	5,0 ml	Calciumchlorid · 2 H₂O	1.7 g
Salzlösung »C«	5,0 g	Ferrosulfat · 7 H₂O	0,06 g
Glyzerin	0,1g	60 Mangansulfat - H₂O	0,6 g
ίο Trypton	1,0 g	Zinksulfat - 7 H₂O
Cholesterin	Natriumchlorid	pro Liter
	b) Modifiziertes Glyzerinmedium	1,0 g
Wie unter a) beschrieben mit	1,0 g
Inositol
Hefeextrakt

c) f Wucosemedium

Wie unter a) beschrieben mit (!er Ausnahme jedoch, daß Glyzerin durch Glucose ersetzt wurde.

d) S-3-Medium	pro Liter
Nährbrühe mit Pepton und
Rindfleischextrakt	8,0 g
Hefeextrakt	1,0 g
Inositol	1,0 g
Cholesterin	1,0 g
S-3 (Sorbitan-Polyoxyäthylen)	5.0 g
Mit destilliertem Wasser aufgefüllt
auf 1 Liter.
e) Hefeextrrktmedium	pro Liier
Hefeextrakt	1.0 g
Inositol	1.0g
Natriumphosphat
(dibasisch · 7 H;O)	2,0"
Trypton	5^0 g
Mit dei filiertem Wasser aufgefüllt
auf I Liter.
f) Inoculum-Medium	pro Liter
Glucose	10,0 g
Hefeextrakt	10,0 g
Kaliumphosphat (dibasisch)	1,0 g
Salzlösung A-I	2,0 ml
Salzlösung A-2	2,0 ml
Agar	20,0 g

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Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 und aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1 Liter.

Salzlösung A-1

Magnesiumsulfat · 7 H2O
Ferrosulfat · 7 H₂O
Mangansulfat · 7 H₂O
Natriummolybdat ■ 2 H₂O
Aufgefüllt auf 1 Liter mit einer
0,1 normalen Chlorwasserstoffsäure.

pro Liier einer 0.1 N HCl-Lösung

100,0 g 10,0 g

I.Og 4(1

0,5 g

Stunden lang bei 30⁰C inkubiert. Die Kultur von diese/ Schräge wurde dann mit einer Drahtschleife entfernt und durch kräftiges Schütteln in 25 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Die Trübung der Suspension liegt im allgemeinen bei 1,8 bis 2,2 optischen Dichleeinheiten (O.D.) bei 660 nm. 60 ml dieser Suspension wurden pro Liter zu inokulierendem Medium verwendet.

5. Herstellung eines Inokulums für eine
Fermentation in größerem Maßstab

Sechs 2,8 I fassende Fernbach-Flaschen mit jeweils 1 Liter des modifizierten S-3-Mediums wurden mit 2 Tage alten Kulturen von Nocardia cholesterolicum (rauh) inokuliert, die auf den Schrägen des Inoculum-Mediums gezüchtet worden waren. Pro Flasche wurde eine Schräge verwendet. Die Flaschen wurden 19 Stunden lang bei 30⁰C geschüttelt bei 125 Umdrehungen pro Minute.

6. Fermentation

Die Fermentationen erfolgten in 2,81 fassenden Fernbach-Fiaschen sowie in 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben. Die Volumina der Medien in den Fernbach-Flaschen und Erlenmeyer-Kolben lagen bei 1 Liter bzw. 25 ml. Die Flaschenmedien wurden in der beschriebenen Weise inokuliert und bei 30⁰C inkubiert. Im Falle der Fernbach-Flaschen wurde die Schüttelgeschwindigkeit auf 125 Umdrehungen pro Minute eingestellt. Diese Medienvolumina und Schüttelgeschwindigkeitcn wurden eingestellt, daß sie zu entsprechenden Sauerstoffübertragungsgeschwindigkeiten führten. Alle 24 Stunden wurden aseptisch Proben für die Bestimmung der Cholesterin-Oxidase-Aktivität abgezogen.

7. Isolierung der Zellen

Die Zellen wurden durch 15 Minuten langes Zentrifugieren in einer gekühlten Zentrifuge (I. Sorvall Inc., Norwalk, Conn., USA) von der Fermentationsbrühe abgetrennt, und zwar bei einer Zentrifugalkraft von 12 350 χ g, d.h. der Schwerkraft.

Salzlösung A-2

Calciumchlorid

Mit deionisiertem destilliertem

Wasser aufgefüllt auf 1 Liter.

g) Modifiziertes S-3-Medium

Nährbrühe

Hefeextrakt

Cholesterin

S-3

Polyglycol P-2000

pro Liter Lösung 10,0 g

pro Liter >o

8,0 g 1,5 g 2,0 g 5,0 g 03 g

55

3. Erhaltung der Kultur

Die Kulturen wurden auf Schrägen eines Glyzerinmediums mit einem Cholesteringehalt erhalten unJ jeden zweiten Tag übertragen.

4. Herstellung eines Inoculums (Verwendung in kleinem Maßstab)

Eine Schräge des Inoculummediums (f) wurde mit Nocardia cholesterolicum (rauh) von einer zwei Tage alten Glyzerinmedium-Schräge inokuliert und 48

65

8. Bestimmung der Cholesterin-Oxidase-Aktrvität

a. Herstellung von Zellenfraktionen für die
Bestimmung der Cholesterin-Oxidase

Cholesterin-Oxidase kann außerhalb der Zellen oder extracellular und innerhalb der Zellen oder intracellular vorhanden sein. Des weiteren kann das intracellulare Enzym als freies oder lösliches Enzym und als gebundenes oder unlösliches Enzym vorliegen. Das extracellular Enzym läßt sich in der Nährbrühe nach der Entfernung der Zellen durch Zentrifugieren bestimmen. Für die Bestimmung des intracellularen Enzyms wurden die Zellen durch Einwirkung von Ultraschallwellen aufgebrochen.

Die Zellenhaut, die bei der Zentrifugierung anfiel, wurde in 1 ml destilliertem Wasser suspendiert, worauf die Suspension durch Zusatz von 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,0) auf 20 ml verdünnt wurde. Die verdünnte Suspension wurde dann 5 Minuten lang der Einwirkung von Ultraschallwellen in einem Eiswasserbad ausgesetzt Dabei wurde die Suspension jeweils 1 Minute lang beschallt, 30 Sekunden lang stehengelassen, wieder 1 Minute lang beschallt usw., bis 5 Minuten verstrichen waren.

Die Ultraschall-behandelten Suspensionen wurden dann in der Kälte bei 27 000 χ g^# 15 Minuten lang zentrifugiert Die Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde als sogenannte intracellulare, lösliche Aktivität bezeichnet. Die Zellenhaut wurde in einer 2%igen NatriuprfieoxicholaUosung resuspendiert und 10 Minuten lang auf Eis stehengelassen. Die Suspension wurde dann in der Kälte 15 Minuten lang bei 27 000 χ g* zentrifugiert Die Cholesteriii-Oxidasen-Aktivität in der Oberstehenden RQssigkeit wurde als intracellulare, unlösliche Aktivität bezeichnet Die Summe der extracellularen, intracellularen löslichen und intracellularen unlöslichen Aktivitäten wurde als Gesamtaktivität bezeichnet

9. Enzymbestimmung

10

15

Die Cholesterin-Oxidase-Aktivität wurde nach dem folgenden Verfahren ermittelt:

Reagentien

a. 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 (KP-Puffer): 30,5 ml 02 M K₂HPO₄ + 19,5 ml 0,2 M KH₂PO₄ sowie Wasser bis zu einem Endvolumen von 200 ml.

b. O,l°/oige Dianisidin-Lösung:

10 mg S^'-Dimethoxybenzidindihydrochlorid pro ml Wasser. Keine pH-Werteinstellung. jo

* Zentrifugalkraft entsprechend 27 000 χ Schwerkraft

C Reagens-Puffer:

0,4 ml der Dianisidinlösung und 1,4 mg eines PeroxidasepuJvers (Sigma Type H, Meerrettich-Peroxjdase, RZ 1,0 bis 1,5 Nr. P 8250) wiirdep zu 40 ml des KP-Puffers gegeben und hiermit vermischt Durch Zusatz von weiterem KP-Puffer wurde auf 50 ml verdünnt Die Lösung wird trübe, wenn das Djsnisidin zugesetzt wird, wird jedoch beim Mischen wieder klar. Die Mischung soll bis zur Verwendung im Kalten aufbewahrt werden. Der Reagenspuffer ließ sich bei 4° C 3 Tage lang ohne Probleme aufbewahren. Im vorliegenden Fall wurde der Reagenspuffer jedoch täglich frisch neu bereitet

d. Cholesterin-Lösung:

Zu 10 ml einer oberflächenaktiven Verbindung mit 9,5 Oxiäthyleneinheiten und einer Octylphenyleinheit (Triton-X-100, S-14), erhitzt auf einer heißen Platte, wurden 300 mg Cholesterinpulver zugesetzt worauf so lange mit einem Rührstab vermischt wurde, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Dann wurden 90 ml Wasser zugegeben, und es wurde weiter gerührt Die Lösung wurde dabei trüb. Das Mischen wurde dann fortgesetzt indem der Kolben unter einem Strom kalten Wassers bewegt wurde. Die Lösung wurde dann wieder klar. Die Trübung beruht darauf, daß sich die oberflächenaktive Substanz aus der Lösung abscheidet Durch Abkühlen v*jrd die oberflächenaktive Verbindung rehydratisiert und das Steroid voll löslich gemacht Die Lösung erwies sich als 1 Woche lang stabil, wenn sie bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde.

Reaktionen:

„, , . . _ oberflächenaktive Verbindung _. , . , ,, -.

Cholesterin + O₂ —7^ — Cholest-4-en-3-on + H₂O₂

Oxidase ⁱ *

H₂O₂ + Dianisidin ^PcrOX'^da-2H₂O + Farbstoff Bestimmungsverfahren

a. 6,7 ml des Reagens-Puffers sowie 03 ml Cholesterin-Lösung d wurden in einem Teströhrchen miteinander vereinigt, vermischt und in ein auf 37° C eingestelltes Wasserbad gebracht. Nach 5 Minuten wurde 1,0 ml Enzymlösung zugesetzt, so daß uas Endvolumen in dem Teströhrchen 8 ml betrag. In einem Spektrophotometer vom Typ Spectronic 20 (Hersteller Bausch und Lomb) wurde bei 430 nm ein erster Wert abgelesen.

Das Röhrchen wurde dann wiederum in das Wasserbad gebracht. Alle 5 Minuten, und zwar 25 Minuten lang, wurden in den Spektrophotometer y, weitere Werte abgelesen. Die Geschwindigkeit der Farbentwicklung wurde unter Verwendung eines Diagramms ermittelt, in dem die Veränderung der optischen Dichte in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen wurde, wobei von der Veränderung der bo optischen Dichte im linearen Teil der Kurve der Mittelwert festgestellt wurde. Die Aktivität wurde berechnet unter Verwendung einer Konstante, die zunächst für das Farbstoffsystem von einer Standardkurve ermittelt wurde. Die Enzympräparate wurden derart verdünnt, daß 0,005 bis 0,06 Einheiten von Cholestefin-Oxidase pro Bestimmufigsföhfchen verwendet wurden.

b. Für die kontinuierliche Bestimmung von Cholesterin-Oxidase wurde ein Aufzeichnungsspektrophotometer nach Beckman verwendet Dabei wurden 2JSml Reagens-Puffer, 0,1 ml Lösung d und Wasser in einer ml fassenden Cuvette miteinander vereinigt Nachdem ein Temperaturgleichgewicht eingetreten war, wurde Enzym zugesetzt und die Geschwindigkeit der Farbentwicklung bei 430 nm verfolgt. Die Inkubationstemperatur lag bei 37° C. Die Aktivität wurde aus der Neigung der Kurve der Farbentwicklung ermittelt. Ein geeigneter Enzym-Konzentrationsbereich für dieses Verfahren liegt bei 0,001 bis 0,02 Einheilen pro Cuvette.

Eine Einheit der Cholesterin-Oxidase-Aktivität entspricht der Enzymmenge, die die Produktion von μΜοΙ H₂O₂ pro Minute bei 37°C und einem pH-Wert von 7,0 katalysiert.

10. Bestimmung des Rest-Cholesterins

Das restliche Cholesterin wurde aus der Fermentationsbrühe und der Zellsuspension mit einer Mischung aus Äthanol und n-Heptan extrahiert Das Cholesterin in der organischen Phase wurde silanisiert mit Siliciumhydrid unter Erzeugung eines Cholesterin-Silan-Derivates behandelt und auf gaschromatographischem Wege bestimmt.

Pie folgenden Beispiele sollen das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben wird, beziehen sich die angegebenen Konzentrationen auf Gewichtsprozent

Beispiel 1

Nocardia cholesterolicum wurde in Fernbach-Flaschen in den beschriebenen fünf verschiedenen Medien gezüchtet Ermittelt wurde die extracellulare wie auch die intracellulare unlösliche Cholesterin-Oxidase, die in jedem Medium erzeugt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt

Die Menge an intracellularer, unlöslicher Cholesterin-Oxidase war etwa gleich in den Zellen, die in den Glycerin-, Glycose- und Hefeextraktmedien gezüchtet wurden. Der Zusatz von Inositol und Hefeextrakt zum Glyce.'rinmedium führte zu einer Inhibierung der Enzymproduktion. Es wurde keine intracellulare, unlösliche Cholesterin-Oxidase-Aktivität in den Zellen festgestellt, die in dem S-3-Medhim gezüchtet wurden. Unerwarteterweise jedoch trat eine beträchtliche Oxidase-Aktivität in der Fermentationsbrühe dieses Mediums auf. Im Gegensatz hierzu wurde keine extracellulare Aktivität in den Brühen festgestellt die von dem modifizierten Glycerinmedium und dem Hefeextraktmedium erhalten wurden, wohingegen in den Brühen des Glycerinmediums und des Glucosemediums etwa 20 bis 30% der Gesamt-Cholesterin-Oxidase-Aktivität auftraten.

Die Cholesterin-Oxidase, erzeugt durch Kulturen, die im S-3-Medium gezüchtet wurden, erreichte einen maximalen Wert von 17,5 internationalen Einheiten (U) pro Liter (Fig. 1). Diese Konzentration ist um etwa lOmal so hoch wie die Konzentration, die im Falle des Glycerinmediums erhalten wurde. Die Menge des extracellularen Enzyms nahm nach 48 Stunden ab. Die Kulturen erwiesen sich als wirksame Verbraucher des Cholesterins (mehr als 90% des Cholesterin wurden in 3 Tagen verbraucht).

Wenn die Konzentration des Cholesterins in dem Medium vermindert wird, nimmt die Menge an extracellular Cholesterin-Oxidase ab und die Geschwindigkeit des Cholesterinverbrauchs fällt

Tabelle I Effekt des Mediums auf die Erzeugung von C hol esteri n-O xidase Cholesterin-Oxidase U/Liter Medium Intracellular, Extracellular Gesamt

unlöslich menge

Glycerin	1,1	0,5	1,6
Modifiziertes	0,4	0	0,4
Glycerin
Glucose	1,1	0,3	1,4
S-3	0	1,5	1,5
Hefeextrakt	1,5	0	1,5

Beschreibung der Cholesterin-Oxidase

Um zu zeigen, daß die extracellulare Cholesterin-Oxidase die gleichen funktioneilen Eigenschaften hat wie die Chplesterin-Oxidase, dje aus der teilchenförmigen Fraktion extrahiert wurde (d,h, der intrftcelluJaren, unlöslichen Fraktion), wurde die Substrat-Spezifizität qualitativ bestimmt Wie sich aus der folgenden Tabelle

s 2 ergibt, zeigte das extracellulare Enzym keine Aktivität bezüglich ^-Sitosterol und Ergosterol, Es wirkte jedoch auf Cholesterin, Es zeigte sich keine Aktivität in Abwesenheit you Cholesterin oder im Falle von aufgekochter Brühe, Aus Fig,2 ergibt sich, daß die

to extracellulare Cholesterin-Oxidase-Aktivität abhängig war von dem Cholesterin und Deoxicholat (DOC). Sämtliche dieser Charakteristika waren identisch mit den Charakteristika des Enzyms, das erhalten wurde durch Extraktion der teilchenförmigen Fraktion,

Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß das Medium für die Herstellung von Cholesterin-Oxidase geeignet war, da die Ausbeute um das 1Ofache höher war und da das extracellulare Enzym ganz offensichtlich die gleichen Eigenaschaften hatte wie die intracellulare, unlösliche Cholesterin-Oxidase.

Tabelle 2

Kennzeichnung der extracellularen C hol esteri n-Oxidase

Enzym-Lieferant

Substrat

Aktivität*)

Ungekochte Brühe Gekochte Brühe Ungekochte Brühe Ungekochte Brühe Ungekochte Brühe Ungekochte Brühe

Cholesterin Cholesterin Kein Zusatz

jß-Sitosterol

Ergosterol Cholestanol

*) + = Vorhandene Aktivität - = Abwesenheit einer Aktivität

In den folgenden Beispielen wurde, sofern nichts anderes angegeben ist, als gezüchtete Kultur Nocardia cholesterolicum - rauher Stamm und als Medium das S-3-Medium verwendet.

Beispiel 2

Zunächst wurden mehrere Medien ähnlich dem Nährmedium 2 (d) hergestellt, jedoch mit einem Gehalt von 0, 0,1, OA 5 und 10 g S-3 pro Liter Medium. Die

so Medien wurden in Fernbach-Raschen ir. der beschriebenen Weise inokuliert und inkubiert. Jedes Medium wurde nach einer Inkubationszeit von 24, 48 und 72 Stunden auf die Cholesterin-Oxidase-Aktivität untersucht Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden

Tabelle 3 zusammengestellt.

Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß der Anstieg in der Erzeugung der Cholesterin-Oxidase im S-3-Medium teilweise auf der reichen Zusammensetzung des Mediums und teilweise auf der oberflächenak-

bo tiven Verbindung selbst beruht. Wird beispielsweise aus dem Medium S-3 fortgelassen, so nimmt die Erzeugung des Enzyms um 50% ab. Aus Tabelle 3 ergibt sich, daß sich das S-3 vorteilhaft für die Herstellung von extracellular Oxidase in einem Konzentrationsbereich von 2 bis 10 g/l Medium, vorzugsweise 3 bis 8 g/l Medium, auswirkt. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Konzentrationen von S-3 von 4 bis 6 g/l erwiesen.

909 611/385

_z

17

Tabelle 3

26 50

753

18

Stelle und Menge der Chplesterin-Aktivillit (U/I)*)

*) nicht bestimmt

-

Intmceiiulor,

lntrace||u|ar, Extracellular

in einer

I des in -to

10,0 g/l 45

Optimale

<■·

:iner Erhöhung der

U./Liter

beobachtet, wenn

Konzentration Zeit

Die oberflächenaktiven Verbind ngen S-I₁

unlöslich

löslich

Reihe von Fermentationen in 250 ml fassenden Erlen

getestet

Medium) auf die Ausbeute an extracellular Choleste-

?«. Ganz allgemein

4,4

Verbindungen auf

vonS-3

meyer-Kolben unter Verwendung von 25 m

mit der

rin-Oxidase.

zeigte sich, daß eine Konzentration von 5 g der

3,7

(g/1) (Stdn,)

3,8

-*) 0

Beispiel 2 beschriebenen Mediums pro Kolben

oberflächenaktiven Verbindung S-3 mitgetestet Ermit

Gesamt

oberflächenaktiven Verbindung oder weniger pro Liter

9,8

0 24

1,4

4,5 3,0

Zu Vergleichszwecken wurde ein Kolben

telt wurden der Effekt der Konzentration der

In der folgenden Tabelle 4 ist für jede oberflächenak-

optimal für die Erzeugung von extracellularem Enzym

3,1

48

1,6

2,9 1,0

oberflächenaktiven Verbindung (1,0, 5,0 und

Tabelle 4

war. Mit Ausnahme der Verbindung S-I wurde eine

4,6

72

2,5

-*) 0

Oberflächenaktive

3,8

Inhibierung der Enzym-Produktion

17,8

0,1 24

-*)

-*) 4,1

Verbindung

9,8

die Menge an oberflächenaktiver

4,5

48

2,1

2,2 1,3

5,5

über 10 g pro Liter erhöht wurde.

9,1
1.6

72

2,6

-*) 0

2,5

0,5 24

1,3

3,8 3,1

S-I

4,1

48

1,6

2,3 1,3

S-2

5,6

Konzentra- Extraccllulare

72

0,5

-*) 0

S4

2,6

tion der oberflächen- C hol esterin

§,a 24

1,3

3,1 17,2

S-5

8,2

aktiven Verbindung Oxidase

48

1,4

1,S 14,0

S-6

5,2

g/l

72

0,2

-*) 0

S-7

0,5

10,0

10,0 24

0

1,3 6,6

S-8

21,6

1,0

48

0

0,5 10,5

17,2

5,0

72

0,2

1,0

Beispiel 3

7,° ■

5,0

S-2, S-4,

11,0

5,0

S-5, S-6, S-7 und S-8 wurden anstelle der Verbindung S-3

1,0

in dem in Beispiel 2 beschriebenen Medium

5,0

tive Verbindung die optimale Konzentration für die

maximale Ausbeute an extracellularer Cholesterin-Oxi-

dase angegeben. Sämtliche der getesteten oberflächen

aktiven Verbindungen führten zu c

Ausbeute an extracellularer Oxid?

Beispiel 4

Wirkung von anderen oberflächenaktiven Verbindungen

Es wurden die oberflächenaktiven Verbindungen S-9, S-IO, S-U, S-12, S-13 sowie S-H getestet, die sämtlich Alkylphenolreste aufweisen. Untersucht wurde ihre Eignung zur Verbesserung der Ausbeute an extracellularer Cholesterin-Oxidase, Die Verbindungen wurden in Erlenmeyer-Kolben in drei verschiedenen Konzentrationen von 0,05, 0,5 und 5,0 g/I Medium nach dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren getestet In der folgenden Tabelle 5 sind für jede oberflächenaktive Verbindung die optimale Konzentration und die Menge an extracellular erzeugter Cholesterin-Oxidase angegeben.

Tabelle 5

Oberflächenaktive Verbindung

Optimale Konzentra- Extracellulare tion der oberflächen- C hol esterinaktiven Verbindung Oxidase

g/l U/Liter

S-9

S-10

S-Il

S-12

S-13

S-14

S-3

0,5

0,05

5,0

5,2 3,9 4,0 6,8 4,9 2,4 6,0 3,0

Die Verbindung S-14 inhibierte die Erzeugung des Enzyms. Die Ausbeuten an Cholesterin-Oxidase bei Verwendung der Verbindungen S-10 und S-U waren etwas besser als im Falle eines Mediums ohne oberflächenaktive Verbindung. Im Falle der Verbindung S-9, S-12 und S-13 wurde die Erzeugung des extracellularen Enzyms stark verbessert, pie Konzentrationen an erhaltener Cholesterin-Oxidase waren vergleichbar mit den Konzentrationen, die im Falle der Verbindung S-3 erhalten wurden. Pie Konzentrationen

■> dieser oberflächenaktiven Verbindungen, die optimal für die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase waren, lagen um 1 bis 2 Größenordnungen unter der optimalen Konzentration (5 g/l) der Verbindung S-3. Diese oberflächenaktiven Verbindungen inhibierten das

to Wachstum von Nocardia cholesterolicum bei Konzentrationen von über etwa 0,5 g pro Liter.

Beispiel 5 Ein 1501 fassendes Fermentationsgerät, enthaltend

751 eines sterilisierten modifizierten S-3-Mediums, wurde mit 6 Litern einer 19 Stunden alten Kultur von Nocardia cholesterolicum inokuliert. Das Inokulum wurde in der beschriebenen Weise gezüchtet. Das Medium wurde 24 Stunden lang bewegt und kräftig belüftet In vorteilhafter Weise wurde das Medium mit einem Rührer mit einer Rührgeschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute gerührt <Luft wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 V&Aimenteilen Luft pro Volumenteilen Medium pro Minute eingeführt Die Fermentationstemperatur betrug 30° C. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in einer gekühlten kontinuierlich arbeitenden Zentrifuge abzentrifugiert Die zentrifugierte Brühe enthielt die extracellulare Cholesterin-Oxidase.

Beispiel 6 Einfluß der Kultur

Zur Durchführung der Versuche wurden verschiedene Stämme verwendet, von denen bekannt war, daß sie zur Erzeugung von Cholesterin-Oxidase befähigt sind. Die Stämme wurden in einem S-3-Medium gezüchtet. Bestimmt wurde die eneugte Cholesterin-Oxidasemenge nach 24, 48 sowie 72 Stunden. In der folgenden Tabelle 6 sind die maximalen Ausbeuten angegeben.

Tabelle 6 Erzeugung von Cholesterin-Oxidase im S-3 Medium

Stamm	*Cholesterin-Oxidase)**	Inlracellular	U/Liter
	Extracellulai	-)**	Gesamt
Arthrobacter crystallopoites	0,9	-)**	-)**
Arthrobacter Stamm NP	0,4	0,0	-)**
Mycobactetium Stamm MA-7	0,6	0,0	0,0
Mycobacterium Stamm E-16	1,7	0,0	1,7
Mycobacterium rhodochrous	1,1	0,0	1,1
Corynebacterium-Art	4,0	52,4	4,0
Nocardia cholesterolicum - glatt	20,3	6,7	32,7
Nocardia cholesterolicum - rauh	16,5	23,2

*) Die angegebenen Zahlenwerte stellen die maximal erzeugte Menge dar. **) Nicht bestimmt.

Beispiel 7 Einfluß eines Antischaummittels

Da der Zusatz einer oberflächenaktiven Verbindung, wie beispielsweise S-3 entscheidend für die extracellulare Erzeugung von Cholesterin-Oxidase ist, erwies es sich als zweckmäßig, die durch Zusatz einer solchen oberflächenaktiven Verbindung erzeugte Sehiiumung bj zu vermindern.

Untersucht wurd» der Einfluß der Zugabe verschiedener Konzentrationen eines bekannten Antischaummittels, nämlich Polyglykol P-2000.

J(I

Es zeigte sich, daß ein geringer Anstieg der Menge an extracellular Cholesterin-Oxidase sowie der Gesamt-Cholesterin-Oxidase zu verzeichnen war bei Verwendung einer Polyglykolkonzentration von bis zu 0,05%. In diesem Konzentrationsbereich (von bis zu 0,05%) wurden etwa 60% des Gesamtenzyms extracellular erzeugt. Eine weitere Erhöhung der Konzentration des Antischaummittels führte zu einer Inhibierung der Enzymsynthese und zu einer Verschiebung der Enzymverteilung in Richtung von intracellular erzeugtem Enzym.

Versuche in einem 1501 fassenden Fermentationsgerät zeigten, daß eine Konzentration von 0,03% des Polyglykols P-2000 zu einer vorteilhaften Steuerung der Schaumbildung, verursacht durch die oberflächenaktive ι '> Verbindung S-3 im Medium führte.

Beispiel 8
F.inflnR von Chnlpstrrin

Der Einfluß der Menge an Cholesterin im Medium wurde untersucht. Ermittelt wurden die erzeugten Enzymmengen bei ansteigender Cholesterinkonzentration. Es wurde gefunden, daß ein 13facher Anstieg der Cholesterin-Oxidase-Konzentration stattfand, wenn die Konzentration des Cholesterins von 0 auf 0,5% erhöht wurde.

Beispiel 9

Einfluß von Inositol

Ermittelt wurde der Einfluß von Inositol auf die Erzeugung des Enzyms. Es wurde festegestellt, daß Inositol die Erzeugung des Enzyms inhibierte.

Im Hinblick auf den 3fachen Anstieg der Enzym-Produktion, der ohne Inositol erreicht wurde, wurden die in den folgenden Beispielen 10 bis 12 beschriebenen Versuche unter Verwendung eines zweiten modifizierten S-3-Nährmediums der im folgenden angegebenen Zusammensetzung durchgeführt:

Modifiziertes S-3-Medium Nr. 2

Nährbrühe 8,0 g

S-3 5.0 g

Hefeextrakt 1,0 g

Cholesterin I₁Og

Aufgefüllt mit destilliertem Wasser
auf 1 Liter.

Beispiel 10

Untersuchung von anderen Steroiden und

Cholesterin-Estern als Auslöser von

Cholesterin-Oxidase

a. Es wurde eine Anzahl von Steroiden auf ihre Eignung zur Induzierung von Cholesterin-Oxidase untersucht Wie sich aus der folgenden Tabelle 7 ergibt ist die Wirksamkeit verschiedener Steroide bezüglich der Enzyminduzierung sehr unterschiedlich. Die Untersuchungen erfolgten unter Verwendung von 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben, die 25 ml des beschriebenen modifizierten S-3-Mediums Nr. 2 enthielten. An Stelle des Cholesterins wurde jeweils 1 g des zu untersuchenden Steroides pro Liter Nährmedium angewandt

Cholesterin induzierte eine extracellular Enzymaktivität von 14,7 Einheiten pro Liter. Der Zusatz einer vermahlenen Soja-Steroid-Mischung zum Medium führte zu einer Enzymerzeugung von 65% der Menge, die durch Cholesterin induziert wurde. Die durch jJ-Sitosterol und 5«-Cholestan-3/?-ol induzierte Enzymkonzentration lag bei 65 bzw. 59% der durch Cholesterin induzierten Enzymmenge.

Tabelle 7

Wirksamkeit von anderen Steroiden als Auslöser (Induktionsmittel) von Cholesterin-Oxidase

50

Extra-	Enzym-
ccllularc	Aktivität
Aktivität	(des Vergleichs
	mediums*)
(U/Liter)

Cholesterin 14,7 100

B-Sitoslerol 9,54 65

Ver:ii::h!ene Mischi,'"" 9 99 68
von Soja-Steroiden

5-Cholestan-3./f-o! 8,70 59

Cholest-4-cn-3-on 6,27 43

Gemischtes Soja-Steryl- 5,03 34

2-Carbamato-Glutarsäure,

Kaliumsalz**)

7-Dehydrocholesterin 2,19 14

*) Das Vergleichsmedium enthielt Cholesterin als Auslöser

oder Induktionsmitlel.
**) Nicht getrenntes Gemisch von Steroidderivaten von Sojabohnen. Die Konzentration der Steroide lag bei 0,1 %.

b. Es wurden insgesamt 12 Cholesterinester auf ihre Fähigkeit zur Induktion von Cholesterin-Oxidase getestet. Die Versuche wurden in der gleichen Weise wie im Falle der Steroide durchgeführt. In dem modifizierten S-3-Medium Nr. 2 wurde das Cholesterin jeweils durch den zu testenden Cholesterinester ersetzt Vier der insgesamt 12 getesteten Ester des Cholesterins, nämlich das Linoleat, Oleat, Ilexanoat und Propionat induzierten eine Cholesterin-Oxidase-Konzentration, die vergleichbar war mit der Konzentration, die bei Verwendung von Cholesterin in einem entsprechenden Medium erhalten wurde (Tabelle 8). Cholesterylbutyrat, Cholesteryldecanoat und Cholesteryllinoleat erwiesen sich als mäßig erfolgreich in der Induzierung des Enzyms. Die übrigen Ester induzierten Cholesterin-Oxidase zu weniger als 50%, bezogen auf den Vergleichsversuch mit Cholesterin. Bei Verwendung von Estern mit aromatischen Seitenketten war die Wirksamkeit eher noch geringer.

Tabelle 8

Wirksamkeit von Cholesterinestern als Auslöser

(Induktionsmittel) von Cholesterin-Oxidase

Cholesterinester*)	Konzen	Enzym-
	tration	Aktivität
		%des
		Vergleichs
	(m-Mole)	versuches**)
Cholesterin	2,6	100,0
Cholesterylpropionat	2,3	79,7
Cholesterylbutyrat	2,2	64,1
Cholesterylhexanoat	2,1	99,7

Fortsetzung

*Choleslerinester) I**	10	Enzym-
t	,9	Aktivität
	,9	% des
	,8	Vergleichs·
<onzen-	,7	Versuches)**
ration	,6	45,0
	,5	13,6
	,5	63,0
(m-Mole)	,6	54,2
Chclesterylbenzoat :	49,9
C holesteryl^p-ni trobenzoat	41,3
C hol esteryl-decanoat	86,4
Cholesteryllaurat	112,0
Cholesterylmyristat	64,6
Cholesterylpalmitat
Cholesteryloleat
Cholesteryllinoleat
Cholesteryllinolenat

I".

*) Die Konzentration der Ester lag bei 0,1 %. **) Das Vergleichsmedium enthielt Cholesterin als Auslöser.

Beispiel 11 Einfluß von Hefeextrakt

Durch Fortlassen des Hefeextraktes aus dem modifizierten S-3-Medium Nr. 2 wurden die Konzentrationen an extracellularem Enzym um 50% (Tabelle 9) vermindert Die Enzym-Synthese stieg mt steigenden Konzentrationen von Hefeextrakt von bis zu 0,15% an. Bei Hefeextraktkonzentrationen von mehr als 0,15% w:rde kein weiterer Anstieg in der Enzymproduktion festgestellt Im Gegenteil, es ergab sich eine Unterdrükkung der Enzymproduktion in einem Medium mit einem Gehalt an Hefeextrakt von 1,0%. Das Verhältnis von freigesetztem Enzym nahm von 81 auf 26% ab, wenn die Konzentration an Hefeextrakt von 0,0 auf 1,0% erhöht wurde.

Tabelle 9

Einfluß von Hefeextrakt auf die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase

Ergebnisse erhalten, die besser sind als bei Abwesenheit von Hefeextfaki, jedoch weniger gut sind als im Falle optimaler Hefeextrakt-Konzentrationen.

Beispiel 12 Einfluß der Nährbrühen-Konzentration

Um die optimale Konzentration an Nährbrühe zu ermitteln, wurde die Synthese des Enzyms in einem modifizierten S-3-Medium Nr. 2, das verschiedene Konzentrationen dieses hauptsächlichen Stickstofflieferanten enthielt, durchgeführt. Aus Tabelle 10 ergeben sich die relativen Enzymausbeuten, die bei steigenden Konzentrationen von Nährbrühe gegenüber einem Vergleichsversuch mit 0,8% Nährbrühe erzielt wurden.

Tabelle 10

Einfluß der Nährbrühe auf die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase

Konzentration von Hefeextrakt

Extracellular Enzym in % des Vergleichsversuches*)

Verhältnis von freigesetztem Enzym in %

50
100
116
108
113

81 60 41 40 40 26

*) Das Vergleichsmedium enthielt 0,1 % Hefeextrakt

Der Hefeextrakt läßt sich in vorteilhafter Weise teilweise durch Riboflavin und/oder Biotin ersetzen. Bei Verwendung von Riboflavin und Biotin werden

Konzentration der Nährbrühe in%	Beispiel	Relative Ausbeute ; an extracellular ■ Cholesterin-Oxidase
0,0 0,2 0,4 *0,8) 1,6**	18% i 50% I; 80% H 100% s 169% "
*) Vergleichsversuch.
13 I
Einfluß von Spuren-Salzen \|

Um den Einfluß von Spuren-Salzen zu ermitteln, wurden die folgenden Salze einem modifizierten S-3-Medium Nr. 2 zugesetzt:

4^r> MgSO₄ · 7 H₂O CaCI₂ · 2 H₂O FeSO₄ · 7 H₂O MnSO₄ · H₂O ZnSO₄ · 7 H₂O NaCl

pro Liter

125,0 mg

0,5 mg

40,0 mg

8,5 mg

0,3 mg

3,0 mg

Es wurde ein 2facher Anstieg der Erzeugung der Cholesterin-Oxidase ermittelt.

Die Ergebnisse der Beispiele zeigen, daß das Nährmedium für die Erzeugung von extracellularer Cholesterin-Oxidase von Nocardia cholesterol icum als optimale Konzentrationen pro Liter beispielsweise enthalten soll: Nährbrühe 8,0 g, Tween40 5,0 g.

Hefeextrakt 1,5 g, Cholesterin 5,0 g. Versuche in einem 1501 fassenden Fermentationsgerät zeigten, daß die Cholesterinkonzentration in vorteilhafter Weise bei etwa 1,0 g pro Liter liegt Im Falle der Verwendung derartiger Medien lassen sich beispielsweise bis zu 30

μ Einheiten von extracellularer Cholesterin-Oxidase erzeugen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche; 1T Verfahren *m Herstellung von Cbo|e$terin-Oxidase tJurch Zflchtung ejnes Cholesterin-Qxjdase ι erzeugenden Mikroorganismus in einem Nährmedium und Abtrennung der erzeugten Cholesterin-Oxidase vondem Nährmedium, dadurchgekennze ich net, daß man die Cholesterin-Oxidase extracellular in einem Nährmedium, das mindestens in 0,5 g einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung pro Liter Nährmedium enthält, erzeugt 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung verwendet, die einen hydrophilen ι ί Polyoxyäthylen- oder Polyglycidölrest und einen üpophilen Rest mit mindestens 9 Kohlenstoffatomen aufweist 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß man eine nichtionogene oberflächen- aktive Verbindung verwendet, deren lipophiler Rest aus einer Pettsäurekette oder einem Fettsäurerest mit mindestens 10 Kohlenstoffatomen besteht 4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nichtiogene oberflächenakti- ve Verbindung verwendet, deren hydrophiler Rest etwa 20 Oxyäthyleneinheiten aufweist und deren lipophiler Rest eine Fettsäurekette mit mindestens16 Kohlenstoffatomen ist 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man als nichtiogene oberflächenaktive Verbindung verwendet: a) eine Verbindung mit einem hydrophilen Rest aus einer Sorbitaneinhei; und 20 Oxyätbjyleneinheiten sowie einen lipophilen Rest mit einer η Paimitinsäureeinhcit; b) eine Verbindung mit einem hydrophilen Rest aus einer Sorbitaneinheit und 20 Oxyäthyleneinheiten sowie einem lipophilen Rest mit einer Stearinsäureeinheit; -ιο c) eine Verbindung mit einem hydrophilen Rest mit einer Sorbitaneinheit und 20 Oxyäthyleneinheiten und einem lipophilen Rest mit einer Oleinsäureeinheit; d) eine Verbindung mit einem hydrophilen Rest -n mit 10 Oxyäthyleneinheiten und einem lipophilen Rest mit einer Nonylphenyleinheit; e) eine Verbindung mit einem hydrophilen Rest aus 6 Glycidoleinheiten und einem lipophilen Rest aus einer Nonylphenyleinheit und/oder w f) eine Verbindung mit einem hydrophilen Rest mit 10 Glycidoleinheiten und einem lipophilen Rest mit einsr Nonylphenyleinheit 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cholesterin-Oxidase erzeu- genden Mikroorganismus Nocardia cholesterolicum, Art NRRL 5767 und/oder NRRL5768, verwendet. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium verwendet, das einen Cholesterin-Oxidase-Auslöser enthält 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet) daß man als Cholesterin-Oxidase-Auslöser Cholesterin, ein Cholesterinderivat und/oder ein 3-ji-Hydroxysterol verwendet 9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium mit einer Kultur eines Bakteriums Nocardia cholesterolicum NRRL 5767 oder NRRL 5768 inokuliert,das enthält: I,) Hefeextrakt, 2,) einen Cholesterin-Oxidase-Auslöser, bestehend aus Cholesterin, ^-Sitosterol, vermehlene Sojasterole, Sw-Cholestan^-ol, Cbo!est-4-en-3-on oder einen Cholesterinester und 3.) eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung des beschriebenen Typs, to. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man 4as Medium während der Wachstumsperiode des Ch.->Iesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus belüftet 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Nährmedium mit mindestens 0,6 Volumina Luft pro Volumina Medium/Minute belüftet 12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cholesterin-Oxidase-Auslöser Cholesterin, Cholesterinlinoleat, Cholesterinoleat, Cholesterinhexanoat oder Cholesterinpropionat verwendet 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet daß man als Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus ein Nocardia cholesterolicum bacterium der Art NRRL 5767 oder NRRL 5768 verwendet und dieses in einem Medium züchtet das enthält:

1.) mindestens 8 g pro Liter einer Nährbrühe, 2.) 1,0 bis 5,0 g Hefeextrakt und 3.) 0,5 bis 5,0 g pro Liter eines Cholesterin-Oxidase-Auslösers.