DE2650753B2 - Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase durch Züchtung eines Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus in einem
Nährmedium und Abtrennung der erzeugten Cholesterin-Oxidase von dem Nährmedium.
Mikroorganismen, die zu einer Cholesterin-Metabolisierung befähigt sind, sind bekanntlich potentielle
Enzymlieferanten für die enzy ma tische Bestimmung von Cholesterin in komplexen Mischungen, beispielsweise Blutserum. Dies ist insbesondere dann der Fall,
wenn der Mikroorganismus Cholesterin als einzigen Kohlenstofflieferanten verwenden kann, da bei diesem
Bestimmungsverfahren Cholesterin durch oxidative Enzyme abgebaut werden muß.
T. C. S t a d t m a η in »Methods in Enzymology«, Band 1, Herausgeber: S. P. Colowick und N. O. Kaplan,
Academic Press, N.Y. 1955, Seite 678, sowie T. C. Stadtman, A. Cherkes sowie J. Anfinsen in
»Biol. Chem.«, 206 (1954), Seite 510, berichten über die
Reinigung eines Enzyms von Nocardia cholesterolicum, einem Organismus, der zuerst von Schatz und
Mitarbeitern (vgl. A. Schatz, K. Savard und I.J. P i η t η e r in »). Bacteriol.« [1949], Seiten 117 bis 125)
isoliert wurde. Das Enzym von Stadtman, als »Cholesterin-Dehydrogenase« bezeichnet, wurde für
die Verwendung im Rahmen einer Cholesterin-Bestimmung gereinigt die auf der Messung des Anstiegs der
Absorption bei 250 nm auf Grund der Bildung von Cholest-4-en-3-on beruht Da, wie nunmehr festgestellt
wurde, der direkte Akzeptor von Cholesterin-Elektronen bei dieser Oxidation Sauerstoff ist muß das Enzym
richtigerweise als Cholesterin-Oxidase bezeichnet werden.
ben werden, erzogen, wenn sie nach den in den
zitierten Literaturstellen beschriebenen Verfahren kultiviert werden, nur sehr geringe Enzymkonzentrationen,
welche für eine technische Verwertung zu gering sind.
Die nach den bekannten Methoden herstellbaren Konzentrationen sind derart gering, daß eine Reinigung
des Enzyms für die Praxis praktisch nicht in Frage kommt
Aus der US-PS 39 09 359 ist des weiteren ein verbessertes Verfahren für die Herstellung der Stadtmanschen Cholesterin-Oxidase bekannt, welches aus
den folgenden Verfahrensstufen besteht:
(a) Züchtung des Bacteriums Nocardia cholesterolicum Art NRRL 5767 oder NRRL 5768 in einem
Medium, in welchem Cholesterin oder ein geeignetes Derivat hiervon als Hilfs-Kohlenstofflieferant
wirkt und
(b) Isolierung eines zellenfreien Extrakts mit dem aktiven Enzym aus dem Medium.
Obgleich das in der US-PS 39 09 359 beschriebene Verfahren eine wesentliche Verbesserung des von
Stadtman beschriebenen Synthese-Verfahrens darstellt und obgleich das in der US-PS 39 09 359
beschriebene Verfahren technisch anwendbar ist, besitzt es doch den Nachteil, daß das Enzym überwiegend
intracellular erzeugt wird. Aus diesem Grund ist für die
Extraktion des Enzyms aus dem Nährmedium ein zeitaufwendiges, teures Zellen-Zertrümmerungsverfahren, z. B. eine Homogenisierung u. dgl, erforderlich.
Aus der DT-OS 22 46 695 ist des weiteren ein Verfahren zur Isolierung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms, erzeugt von einer Kultur eines Nocardia-Mikroorganismus mit der Bezeichnung NRRL 5635 und
NRRL 5636 bekannt Bei diesem bekannten Verfahren werden die geernteten Zellen mit einer nichtionogenen
oberflächenaktiven Verbindung behandelt und bei Raumtemperatur verrührt, so daß eine vergleichsweise
große Menge des Enzyms aus den Zellen in die überstehende Flüssigkeit gelangt, wodurch eine Zellextraktion und Isolierungsmethoden überflüssig werden.
Bei Anwendung dieses Verfahrens der Enzymextraktion lassen sich Ausbeuten in der Größenordnung von etwa
40 bis 160 Einheiten pro Liter erhalten.
Aus einer von E. T. R e e s e und A. M a q u i r e unter
der Oberschrift »Surfactants as Stimulants of Enzyme Production by Microorganisms« veröffentlichten Arbeit
in der Zeitschrift »Applied Micrcbiology«, February
1969, Seiten 242 bis 245, ist des weiteren bekannt, daß der Zusatz von Sorbitanpolyoxiäthylenmonooleat (Handelsprodukt Tween 80, Hersteller Atlas Chemical
Company, Wilmington, Delaware, USA) und anderer nichtionogener oberflächenaktiver Verbindungen zu
Pilzkulturen, die normalerweise Enzyme extracellular erzeugen, zu einem Anstieg der Enzymausbeute führt.
Aus der GB-PS 13 85 319 ist des weiteren ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase aus
Nocardia Art NRRL 5635 und NRRL 5636 bekannt. Während der Fermentation wird langsam eine Suspension von Cholesterin als Auslöser oder Induktionsmittel
für Cholesterin-Oxidase zugesetzt Für die Dispergierung des Cholesierins in der Suspension wird eine
nichtionogene oberflächenaktive Verbindung (Tween 80) in einer Konzentration von 3 Vol.*% verwendet.
Dies fahrt jedoch zu einer nur sehr geringen Menge an nichtionogener oberflächenaktiver Verbindung im Fermentationsmedium.
Die Bakterienkulturen, die dafür bekannt sind, daß sie Cholesterin-Oxidase erzeugen, erzeugen das Enzym
normalerweise mtrncellular,
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase anzugeben.
Der Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß man
in vorteilhafter Weise Cholesterin-Oxidase extracellular erzeugen kann, indem man dem Nährmedium, in dem
ein Cholesterin-Oxidase erzeugender Mikroorganismus gezüchtet wird, eine nichtionogene oberflächenaktive
Verbindung in einer Konzentration zusetzt, die selbst nicht toxisch ist und deren Zerfallsprodukte in einer
Konzentration erzeugt werden, die nicht so hoch ist, als
daß sie für den Cholesterin-Oxidase erzeugenden Organismus toxisch sein könnte. Überraschenderweise
wurde gefunden, daß der Zusatz einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung dazu führt, daß die
Hauptmenge des erzeugten Enzyms extracellular erzeugt wird. Dies ermöglicht eine wesentliche Einsparung der Zeit und Kosten, die normalerweise für die
Enzym-Extraktion nach der Erzeugung des Enzyms aufgewandt werden müssen, indem eine Zellenzerstörung entbehrlich wird, die normalerweise erforderlich
ist, wenn das Enzym intracellular erzeuge wird.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur
Herstellung von Cholesterin-Oxidase durch Züchtung
eines Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus in einem Nährmedium und Abtrennung der
erzeugten Cholesterin-Oxidase von dem Nährmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Choleste
rin-Oxidase extracellular in einem Nährmedium, das
mindestens 0,5 g einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung pro Liter Nährmedium enthält, erzeugt
F i g. 1 veranschaulicht die Cholesterin-Oxidase-Aktivität als Funktion der Fermentierungsdauer sowie die
J5 Erschöpfung des Cholesterin in dem Fermentationsmedium mit der Zeit;
Fig.2 veranschaulicht die Beziehung zwischen der
Cholesterin-Oxidase-Aktivität und der Gegenwart von Cholesterin und Deoxicholat (DOC).
Nach dem Verfahren der Erfindung ist somit eine extracellular Cholesterin-Oxidase-Erzeugung möglich,
wenn eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung, die selbst nichttoxisch ist und deren Zerfallsprodukte ebenfalls nichttoxisch für den Mikroorganismus
sind, dem Nährmedium zugesetzt wird, das Cholesterin-Oxidase zu erzeugen vermag, Zur Durchführung des
Verfahrens der Erfindung eignet sich in besonders vorteilhafter Weise das Bakterium Nocardia cholesterolicum, Art NRRL 5767 und NRRL 5768. In vorteilhafter
Weise können die Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismen in einem Medium erzeugt werden,
das Cholesterin, eil: geeignetes Derivat hiervon oder ein 3-jJ-Hydroxysterol als Auslöser oder Induktionsmit;el
von Cholesterin-Oxidase enthält
In vorteilhafter Weise Wird als nichtionogene oberflächenaktive Verbindung eine Verbindung verwendet, die einen Polyoxiäthylenrest oder einen
hydrophilen Polyglycidolrest sowie einen lipophilen Rest aufweist, der mindestens 9 Kohlenstoffatome
enthält In vorteilhafter Weise besteht der lipophile Rest aus einer Fettsäurekette oder enthält eine Fettsäurekette mit mindestens 10 Kohlenstoffatomen.
Zur Durchführung des Verfahrens eier Erfindung
lassen sich alle Kulturen verwenden, die Cholesterin-
Oxidase erzeugen. Zu Cholesterin-Oxidase erzeugenden
Kulturen gehören beispielsweise Arthobacter crystallopoities, Arthobacter Stamm NP, Corynebacterium-Stämme, Mycobacterium Stamm MA-7, Mycobacterium
Stamm E-16, Mycöbaeteflüm rhodochrous sowie andere
Stämme aus der sogenannten Mycobacterium rhodochrous-Gruppe, Mycobacterium rubrum, Nocardia erythropolis,
Nocardia, Art NRRL 5635 und 5636, Nocardia cholesterolicum — glatt und Nocardia cholesterolicum
— rauh.
Zwei Nocardia-cholesterolicum-Kulturen, die Cholesterin-Oxidase
liefern und sich besonders für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen,
sind die »rauhen« und »glatten« Stämme mit der Bezeichnung NRRL 5767 sowie NRRL 5768, hinterlegt
im »Agricultural Collection Investigations Fermentation Laboratory«, Peoria, Illinois, USA.
Details dieser Organismen sind:
Beschreibung von Nocardia cholesterolicum
I. Cellular-Morphologie
I. Cellular-Morphologie
A. Glatter Stamm. Gram-positiv, schwach säurefest, coryneform, kein gut entwickelbares Mycel, jedoch
wird eine rudimentäre Verzweigung beobachtet. Kokkoide Formen treten in älteren Kulturen auf.
B. Rauher Stamm. Wie oben.
II. Kolonie-Morphologie
A. Nähr-Agar(5Tage,30°C).
1. Glatter Stamm. Circular, konvex, wäßrig, ungeteilt (entire), glatt, glänzend, rosa-weiß.
Kein lösliches Pigment.
2. Rauher Stamm. Circular, konvex, ungeteilt (entire), glatt bis rauh, rosa-weiß. Kein lösliches
Pigment.
B. Hefe-Glukose-Agar(5Tage,300C).
1. Glatter Stamm. Kremige bis hellbraune Farbe, wäßrig, glatt, rund und erhöht.
2. Rauher Stamm. Trocken, kremige bis hellbraune Farbe, rund und erhöht.
C. Kasein-Agar(5Tage,30°C).
1. Glatter Stamm. Kremige bis hellbraune Farbe, wäßrig, rund, glatt, erhöht.
2. Rauhe Kolonie. Hellbraun bis rosa, trocken, erhöht.
D. Gelatine-Agar.
!. Glatter Stamm. Circular, konvex, ungeteilt
(entire), glatt, wäßrig, kremfarben.
2. Rauher Stamm. Circular, konvex, ungeteilt (entire), trocken, kremfarbig.
2. Rauher Stamm. Circular, konvex, ungeteilt (entire), trocken, kremfarbig.
III. Wachstum in flüssiger Kultur
(Nährbrühe, 5 Tage, 30° C)
(Nährbrühe, 5 Tage, 30° C)
A. Glatter Stamm. Fast weißer bis hellbrauner, flockenbildender Niederschlag, kein Häutchen.
B. Rauher Stamm. Fast weißer bis hellbrauner, flockenbildender Niederschlag, kein Häutchen.
IV. Physiologie
(Glatte und rauhe Stämme identisch)
(Glatte und rauhe Stämme identisch)
Belüftung
Gelatinehydrolyse
Kaseinhydrolyse
Stärkehydrolyse
Oxidase
Catalase
Urease
aerob
Indol
Methylrot
Phenylalanin-Deaminicrung
Lackmusmilch
alkalisch
Verwendung der Verbindungen als einziger
Kohlenstofflieferant
Kohlenstofflieferant
Citrat
Lactat
Malat
Lactat
Malat
Succinat
Fructose
Glucose
Sucrose
Maltose
Glycerin
Sorbitol
Trehalose
Dulcitol -
Lactose —
Mannitol +
Stärke
Arabinose —
Nach dem aus der US-PS 39 09 359 bekannten Verfahren, bei dem Cholesterin-Oxidase intracellular
erzeug' wird, führt die Verwendung eines üblichen primären Kohlenstofflieferanten, wie beispielsweise
Glycerin, in Kombination mit einem sekundären oder Hilfs-Kohlenstofflicferanten, wie beispielsweise Cholesterin,
ChoIest-4-en-3-on oder Cliolesteryllinoleat, die sämtlich als Cholesterin-Oxidase-Auslöser oder Induktionsmittel
dienen, zu einer Erhöhung der Ausbeute des Cholesterin-Oxidase-Enzyms, die um etwa das JOOfache
höher ist als die Ausbeute, die erzeugt wird, wenn kein Cholesterin-Oxidase-Auslöser verwendet wird oder
wenn Cholesterin als einziger Kohlenstofflieferant verwendet wird.
Nach dem aus der US-PS 39 09 359 bekannten Verfahren werden erhöhte Ausbeuten dann erhalten,
wenn das Bakterium in einem üblichen Nährmedium üblicher bekannter Zusammensetzung gezüchtet wird,
d. h. einem Nährmedium, das im allgemeinen enthält: einen Stickstofflieferanten, wie beispielsweise Ammoniumsulfat,
einen Kalium- und einen Phosphorlieferanten, wie beispielsweise Kaliumphosphat, Spuren von Metallionen
sowie eine Mischung aus einem primären Kohlenstofflieferanten, z. B. Glycerin, und einem Cholesterin-Oxidase-Auslöser
oder Induktionsmittel, bestehend aus Cholesterin, Cholest^-en-S-on, Cholestt.yllinoleat
oder Mischungen hiervon. Der pH-Wert des Mediums wird dabei bei 5,0 bis 8,0, vorzugsweise
zwischen 6,5 und 7,5, gehalten. Die Temperatur liegt
vorzugsweise bei etwa 18 bis etwa 35° C, insbesondere bei 25 bis 30° C und die Züchtungsdauer liegt bei etwa 18
bis etwa 40 Stunden, vorzugsweise etwa 20 bis 24 Stunden.
Die Mengen an Stickstofflieferanten, Kaliumphosphat und Spurenmetallionen, die bei der Züchtung
verwendet werden, sind bekannt Spezielle Angaben finden sich in den erwähnten Literaturstellen.
Zu den vorteilhaften primären Kohlenstofflieferanten,
die in der US-PS 39 09 359 erwähnt werden, und die sich auch zur Durchführung des Verfahrens der
Erfindung eignen, gehören beispielsweise Glyzerin, Glukose und Essigsäure. Dabei können übliche bekannte
Konzentrationen des oder der primären Kohlenstoff-
lieferanten verwendet werden. Diese Konzentrationen
liegen im allgemeinen bei etwa 0,5 bis etwa 5 Gew.-%. Die Konzentration eines Cholesterin-Oxidase-Auslösers liegt im allgemeinen bei etwa 0,05 bis etwa 0,5
Gew.-%. Vorzugsweise wird ein solches Auslöser in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 0,2 Gew.-%
verwendet.
Nii-th dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die
Herstellung der Cholesterin-Oxidase somit beispielsweise nach dem aus der US-PS 39 09 359 bekannten
Verfahren erfolgen mit der Ausnahme jeJoch, daß das Nährmedium zusätzlich eine nichtinhibierende Konzentration
einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung enthält, die gegenüber dem Mikroorganismus
nichttoxisch ist und deren Zerfallsprodukte in entsprechender Weise gegenüber den Mikroorganismen
nichttoxisch sind. Der Zusatz einer solchen nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung zum Fermentalir»ncmf>Hiiim führt 7ij £!i£f 'ίΓΙΓΜί-Γ CXtruCeHulufC"
Cholesterin-Oxidase-Erzeugung, wodurch die Notwendigkeit für die Durchführung einer zeitaufwendigen,
komplizierten kostspieligen Zellenextraktion, wie sie
bisher erforderlich war, in Fortfall gerät.
Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen sich die verschiedensten nichtionogenen oberflächenaktiven
Verbindungen, wie beispielsweise PoIyäthylenglykole, Polyvinylalkohole, Polyether, Polyester
sowie Polyhalogenide.
Wesentliche Kriterien sind, daß
(1) weder die im Einzelfall verwendete nichtionogene Verbindung als auch ihre Zerfallsprodukte gegenüber
dem Mikroorganismus in den erforderlichen Konzentrationen zur extracellularen Erzeugung
des Enzyms toxisch sind und daß
(2) die Menge an verwendeter oberflächenaktiver Verbindung die Enzym-Produktion nicht inhibiert.
Die Toxizität einer oberflächenaktiven Verbindung gegenüber einem Mikroorganismus läßt sich leich".
dadurch bestimmen, daß eine Kultur des Mikroorganismus einer vergleichsweise geringen Konzentration der
zu testenden oberflächenaktiven Verbindung ausgesetzt wird, in der Regel von etwa 0,5 g pro Liter, worauf die
Einwirkung der Behandlung des Mikroorganismus beobachtet wird. In den Fällen, in denen ein Kontakt mit
einem toxischen Stoff erfolgt, erfolgt eine tnhibierung des Wachstums des Mikroorganismus und infolgedessen
ein unterdrücktes Wachstum der Kultur in einer
Die Toxizität der Zerfallsprodukte der oberflächenaktiven Verbindungen läßt sich, wie im folgenden
beschrieben wird, erkennen. Der einzig positive Test für die Ermittlung der Toxizität der Zerfallsprodukte ist
ίο jedoch die Züchtung des Mikroorganismus in einem
Nahrmedium und die Beobachtung der Effekte der erzeugten Nebenprodukte, wie es in den später
folgenden Beispielen gezeigt wird.
Obgleich der dem erfindungsgemäßen Verfahren
r> zugrundeliegende Mechanismus noch nicht restlos geklärt ist, wird angenommen, daß, wie es in den später
folgenden Beispielen gezeigt werden wird, nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen, die bekannt sind,
daß sic
in toxische Rest zerfallen, beispielsweise
Phenole, nicht zur erfolgreichen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind.
Zu den geeigneten nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindungen gehört eine breite Skala von
Verbindungen.
.'"> Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden zur Durchführung des Verfahrens
der Erfindung nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen verwendet, die einen Polyoxyäthylenrest oder
einen hydrophilen Polyglycidolrest sowie einen lipophi-
w len Rest mit mindestens 9 Kohlenstoffatomen aufweisen.
Als besonders vorteilhaft hat sich dabei die Verwendung von Verbindungen erwiesen, deren lipophiler
Rest aus einer Fettsäurekette besteht oder eine
Ji solche Fettsäurekette aufweist, die mindestens 10
Kohlenstoffatome enthält.
Optimale Ergebnisse lassen sich dann erhalten, wenn die Fettsäurekette mindestens 16 Kohlenstoff a tome
aufweist und der hydrophile Rest aus etwa 20
4<> Oxiäthyleneinheiten besteht.
Im folgenden sind zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung besonders geeignete oberflächenaktive
Verbindungen aufgeführt:
Oberflächenaktive | Hydrophiler Rest | Anzahl | Lipophiler Rest | Anzahl |
Verbindung | Einheiten | Einheiten | ||
S-I | Sorbita n- | 1 | Laurinsäure | 1 |
Polyoxyäthylen | 20 | |||
S-2 | Sorbitan- | 1 | Laurinsäure | 1 |
Polyoxyäthylen | 4 | |||
S-3 | Sorbitan | 1 | Palmitinsäure | 1 |
Polyoxyäthylen | 20 | |||
S^ | Sorbitan- | 1 | Stearinsäure | 1 |
Polyoxyäthylen | 20 | |||
S-5 | Sorbitan- | 1 | Stearinsäure | 1 |
Polyoxyäthylen | 4 | |||
S-6 | Sorbitan- | 1 | Stearinsäure | 3 |
Polyoxyäthylen | 20 | |||
S-7 | Sorbitan- | 1 | Oleinsäure | 1 |
Polyoxyäthylen | 20 | |||
S-8 | Sorbitan- | 1 | Oleinsäure | 1 |
Polyoxyäthylen | 5 | |||
S-9 | Polyoxyäthylen | 10 | Nonylphenyl | 1 |
9 Fortsetzung |
26 | Hydrophiler Rest | 50 753 | 10 | Lipophiler Rest | Anzahl Einheiten |
Oberflächenaktive Verbindung |
Polyoxyäthylen Polyoxyäthylen Polyglycidol Polyglycidol |
Anzahl Liinheilen |
Nonylphenyl Nonylphenyl Nonylphenyl Nonylphenyl |
1 1 1 1 |
||
S-IO S-Il s-ii S-13 |
15 30 6 10 |
Nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen, die
sich als nicht geeignet für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung erwiesen haben, sind Octylphenylpolyäthoxyäthanole,
wie sie beispielsweise im Handel unter der Handelsbezeichnung Triton (Hersteller
Rohm & Haas, Philadelphia, USA) erhältlich sind. Es wird angenommen, daß diese Verbindungen beim
Zerfall oder Abbau toxische Phenole bilden und aus
ΐ~* ν Λ ' U* r* * e'rt/4 Εΐϊηο V/ο
9,5 Polyäthoxyäthyleneinheiten und einer Octylphenyleinheit (S-14: Triton-X-100) wird in den später
folgenden Beispielen untersucht.
Die günstigste Konzentration an nichtionogener oberflächenaktiver Verbindung in einem speziellen
Nährmedium hängt stark von der übrigen Zusammensetzung des Nährmediums ab, der Empfindlichkeit des
Mediums gegenüber der im Einzelfall verwendeten oberflächenaktiven Verbindung und der im Einzelfall
verwendeten Verbindung. Ganz allgemein hat es sich doch als zweckmäßig erwiesen, die oberflächenaktiven
Verbindungen in Konzentrationen von etwa 0,5 bis etwa 10,0 g/l Medium anzuwenden. Bei Konzentrationen von
über 10 g/l kann die oberflächenaktive Verbindung als Wachstumsinhibitor wirken, höchstwahrscheinlich auf
Grund einer Toxizität der oberflächenaktiven Verbindung oder von Nebenprodukten gegenüber dem
Mikroorganismus. Bei Konzentrationen unterhalb von 0,5 g/l wird demgegenüber keine wesentliche Freisetzung
von Cholesterin-Oxidase beobachtet. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, Konzentrationen
an oberflächenaktiven Verbindungen von etwa 1 bis 5 g/l Medium zu verwend""J.
Als primärer Kohlenstofflieferant kann beispielsweise
verwendet werden: Glycerin, Glucose (insbesondere von Reagens-Reinheit), Maissirup von technischem
Reinheitsgrad u. dgl. Als Auslöser oder Induktionsmittel ist beispielsweise Cholesterin-Oxidase geeignet, die
auch als Hilfs-Kohlenstofflieferant verwendet werden
kann. Als Auslöser können des weiteren beispielsweise Cholesterin, Cholest-4-en-3-on sowie Cholesteryllinoleat
verwendet werden sowie andere Sterole und Cholesterinester. Weitere vorteilhafte Auslöser sind
beispielsweise ^-Sitosterol und 5ct-Cholestan-3-/}-ol
sowie Cholesterinester, z, B. Cholesteryloleat, Cholesterollinoleat,
Cholesterylformiat und Cholesterylpropionat
Als Stickstofflieferanten können die verschiedensten üblichen Stickstoffverbindungen verwendet werden. Als
besonders vorteilhafte Stickstofflieferanten für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung haben sich
handelsübliche Nährbrühen erwiesen, beispielsweise Nutrient Broth, ein Erzeugnis der Firma Difco
Laboratories, Detroit, Michigan, mit einem Gehalt von Pepton und Rindfleischextrakt Andere weitere Stickstofflieferanten
sind beispielsweise im Handel erhältliche Erzeugnisse, wie Anatone, Hersteller Cudahy
Laboratories, Omaha, Nebraska, sowie N-Z/Amin Typ
AT, N-Z/Amin Typ BT, N-Z/Amin Typ LT, N-Z/Amin Typ TT, Soy Petone Typ T, Fermamin Typ I, Fermamin
Typ Il und Dermamin Typ III, die sämtlich von der
ι > US-Firma Sheffield Chemical Div. von Kraftco Corp.,
Union, New |ersey, USA, in den Handel gebracht werden.
Bei der Herstellung von Cholesterin-Oxidase unter Verwendung eines Nährmediums mit einer nichtionoge-
Im na» Q^^ff!uchciiuK*!ve" Verbinden** nsch dem Verfahren
der Erfindung kann ein Schäumen beobachtet werden. Um das Schäumen unter Kontrolle zu halten,
insbesondere dann, wenn mit vergleichsweise großen Ansätzen gearbeitet wird, kann die Verwendung eines
_>-, Schaum-Steuermittels vorteilhaft sein. Derartige
Schaum-Steuermittel sind im Handel erhältlich. Ein typisches geeignetes Schaum-Steuermittel ist beispielsweise
das Polyglykol P-2000, Hersteller Dow Chemical Co., Midland, Michigan, USA. Weitere geeignete
to Schaum-Steuermittel sind im Handel erhältlich.
In den folgenden Beispielen, die das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen sollen, werden die
folgenden Definitionen gebraucht:
r> 1. Kultur
Sofern nichts anderes angegeben wird, wurde der »rauhe Stamm« (NRRL 5768) von Nocardia cholesterolicum
verwendet.
2. Nährmedium | hatten folgende | Mit destilliertem Wasser aufgefüllt | pro Liter einer |
Die verwendeten Nährmedien | auf 1 Liter. | 0,1 N HO-Lösung | |
Zusammensetzung: | pro Liter | Salzlösung »C« | 25,0 g |
4_ a) Glyzerin-Medium | 2,0 g | 0,1g | |
Ammoniumsulfat | 2,0 g | Magnesiumsulfat · 7 H2O | 2,8 g |
Kaliumphosphat (dibasisch) | 5,0 ml | Calciumchlorid · 2 H2O | 1.7 g |
Salzlösung »C« | 5,0 g | Ferrosulfat · 7 H2O | 0,06 g |
Glyzerin | 0,1g | 60 Mangansulfat - H2O | 0,6 g |
ίο Trypton | 1,0 g | Zinksulfat - 7 H2O | |
Cholesterin | Natriumchlorid | pro Liter | |
b) Modifiziertes Glyzerinmedium | 1,0 g | ||
Wie unter a) beschrieben mit | 1,0 g | ||
Inositol | |||
Hefeextrakt | |||
c) f Wucosemedium
Wie unter a) beschrieben mit (!er Ausnahme jedoch,
daß Glyzerin durch Glucose ersetzt wurde.
d) S-3-Medium | pro Liter |
Nährbrühe mit Pepton und | |
Rindfleischextrakt | 8,0 g |
Hefeextrakt | 1,0 g |
Inositol | 1,0 g |
Cholesterin | 1,0 g |
S-3 (Sorbitan-Polyoxyäthylen) | 5.0 g |
Mit destilliertem Wasser aufgefüllt | |
auf 1 Liter. | |
e) Hefeextrrktmedium | pro Liier |
Hefeextrakt | 1.0 g |
Inositol | 1.0g |
Natriumphosphat | |
(dibasisch · 7 H;O) | 2,0" |
Trypton | 5^0 g |
Mit dei filiertem Wasser aufgefüllt | |
auf I Liter. | |
f) Inoculum-Medium | pro Liter |
Glucose | 10,0 g |
Hefeextrakt | 10,0 g |
Kaliumphosphat (dibasisch) | 1,0 g |
Salzlösung A-I | 2,0 ml |
Salzlösung A-2 | 2,0 ml |
Agar | 20,0 g |
10
Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 und aufgefüllt mit destilliertem Wasser
auf 1 Liter.
Salzlösung A-1
Magnesiumsulfat · 7 H2O
Ferrosulfat · 7 H2O
Mangansulfat · 7 H2O
Natriummolybdat ■ 2 H2O
Aufgefüllt auf 1 Liter mit einer
0,1 normalen Chlorwasserstoffsäure.
Ferrosulfat · 7 H2O
Mangansulfat · 7 H2O
Natriummolybdat ■ 2 H2O
Aufgefüllt auf 1 Liter mit einer
0,1 normalen Chlorwasserstoffsäure.
pro Liier einer 0.1 N HCl-Lösung
100,0 g 10,0 g
I.Og 4(1
0,5 g
Stunden lang bei 300C inkubiert. Die Kultur von diese/
Schräge wurde dann mit einer Drahtschleife entfernt und durch kräftiges Schütteln in 25 ml sterilem
destilliertem Wasser resuspendiert. Die Trübung der Suspension liegt im allgemeinen bei 1,8 bis 2,2 optischen
Dichleeinheiten (O.D.) bei 660 nm. 60 ml dieser Suspension wurden pro Liter zu inokulierendem Medium
verwendet.
5. Herstellung eines Inokulums für eine
Fermentation in größerem Maßstab
Fermentation in größerem Maßstab
Sechs 2,8 I fassende Fernbach-Flaschen mit jeweils 1
Liter des modifizierten S-3-Mediums wurden mit 2 Tage alten Kulturen von Nocardia cholesterolicum (rauh)
inokuliert, die auf den Schrägen des Inoculum-Mediums gezüchtet worden waren. Pro Flasche wurde eine
Schräge verwendet. Die Flaschen wurden 19 Stunden lang bei 300C geschüttelt bei 125 Umdrehungen pro
Minute.
6. Fermentation
Die Fermentationen erfolgten in 2,81 fassenden
Fernbach-Fiaschen sowie in 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben. Die Volumina der Medien in den
Fernbach-Flaschen und Erlenmeyer-Kolben lagen bei 1 Liter bzw. 25 ml. Die Flaschenmedien wurden in der
beschriebenen Weise inokuliert und bei 300C inkubiert. Im Falle der Fernbach-Flaschen wurde die Schüttelgeschwindigkeit
auf 125 Umdrehungen pro Minute eingestellt. Diese Medienvolumina und Schüttelgeschwindigkeitcn
wurden eingestellt, daß sie zu entsprechenden Sauerstoffübertragungsgeschwindigkeiten
führten. Alle 24 Stunden wurden aseptisch Proben für die Bestimmung der Cholesterin-Oxidase-Aktivität
abgezogen.
7. Isolierung der Zellen
Die Zellen wurden durch 15 Minuten langes Zentrifugieren in einer gekühlten Zentrifuge (I. Sorvall
Inc., Norwalk, Conn., USA) von der Fermentationsbrühe
abgetrennt, und zwar bei einer Zentrifugalkraft von 12 350 χ g, d.h. der Schwerkraft.
Salzlösung A-2
Calciumchlorid
Mit deionisiertem destilliertem
Wasser aufgefüllt auf 1 Liter.
g) Modifiziertes S-3-Medium
Nährbrühe
Hefeextrakt
Cholesterin
S-3
Polyglycol P-2000
pro Liter Lösung 10,0 g
pro Liter >o
8,0 g 1,5 g 2,0 g 5,0 g 03 g
55
3. Erhaltung der Kultur
Die Kulturen wurden auf Schrägen eines Glyzerinmediums mit einem Cholesteringehalt erhalten unJ jeden
zweiten Tag übertragen.
4. Herstellung eines Inoculums (Verwendung in kleinem Maßstab)
Eine Schräge des Inoculummediums (f) wurde mit Nocardia cholesterolicum (rauh) von einer zwei Tage
alten Glyzerinmedium-Schräge inokuliert und 48
65
8. Bestimmung der Cholesterin-Oxidase-Aktrvität
a. Herstellung von Zellenfraktionen für die
Bestimmung der Cholesterin-Oxidase
Bestimmung der Cholesterin-Oxidase
Cholesterin-Oxidase kann außerhalb der Zellen oder extracellular und innerhalb der Zellen oder intracellular
vorhanden sein. Des weiteren kann das intracellulare Enzym als freies oder lösliches Enzym und als
gebundenes oder unlösliches Enzym vorliegen. Das extracellular Enzym läßt sich in der Nährbrühe nach
der Entfernung der Zellen durch Zentrifugieren bestimmen. Für die Bestimmung des intracellularen
Enzyms wurden die Zellen durch Einwirkung von Ultraschallwellen aufgebrochen.
Die Zellenhaut, die bei der Zentrifugierung anfiel, wurde in 1 ml destilliertem Wasser suspendiert, worauf
die Suspension durch Zusatz von 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,0) auf 20 ml verdünnt wurde. Die
verdünnte Suspension wurde dann 5 Minuten lang der Einwirkung von Ultraschallwellen in einem Eiswasserbad
ausgesetzt Dabei wurde die Suspension jeweils 1 Minute lang beschallt, 30 Sekunden lang stehengelassen,
wieder 1 Minute lang beschallt usw., bis 5 Minuten verstrichen waren.
Die Ultraschall-behandelten Suspensionen wurden
dann in der Kälte bei 27 000 χ g# 15 Minuten lang
zentrifugiert Die Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde als sogenannte intracellulare, lösliche
Aktivität bezeichnet. Die Zellenhaut wurde in einer 2%igen NatriuprfieoxicholaUosung resuspendiert und
10 Minuten lang auf Eis stehengelassen. Die Suspension
wurde dann in der Kälte 15 Minuten lang bei 27 000 χ g* zentrifugiert Die Cholesteriii-Oxidasen-Aktivität in der Oberstehenden RQssigkeit wurde als
intracellulare, unlösliche Aktivität bezeichnet Die Summe der extracellularen, intracellularen löslichen und
intracellularen unlöslichen Aktivitäten wurde als Gesamtaktivität bezeichnet
9. Enzymbestimmung
10
15
Die Cholesterin-Oxidase-Aktivität wurde nach dem folgenden Verfahren ermittelt:
a. 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 (KP-Puffer):
30,5 ml 02 M K2HPO4 + 19,5 ml 0,2 M KH2PO4
sowie Wasser bis zu einem Endvolumen von 200 ml.
b. O,l°/oige Dianisidin-Lösung:
10 mg S^'-Dimethoxybenzidindihydrochlorid pro
ml Wasser. Keine pH-Werteinstellung. jo
* Zentrifugalkraft entsprechend 27 000 χ Schwerkraft
0,4 ml der Dianisidinlösung und 1,4 mg eines
PeroxidasepuJvers (Sigma Type H, Meerrettich-Peroxjdase, RZ 1,0 bis 1,5 Nr. P 8250) wiirdep
zu 40 ml des KP-Puffers gegeben und hiermit vermischt Durch Zusatz von weiterem KP-Puffer
wurde auf 50 ml verdünnt Die Lösung wird trübe, wenn das Djsnisidin zugesetzt wird, wird jedoch
beim Mischen wieder klar. Die Mischung soll bis zur Verwendung im Kalten aufbewahrt werden.
Der Reagenspuffer ließ sich bei 4° C 3 Tage lang ohne Probleme aufbewahren. Im vorliegenden Fall
wurde der Reagenspuffer jedoch täglich frisch neu bereitet
d. Cholesterin-Lösung:
Zu 10 ml einer oberflächenaktiven Verbindung mit 9,5 Oxiäthyleneinheiten und einer Octylphenyleinheit (Triton-X-100, S-14), erhitzt auf einer heißen
Platte, wurden 300 mg Cholesterinpulver zugesetzt worauf so lange mit einem Rührstab vermischt
wurde, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Dann wurden 90 ml Wasser zugegeben, und es wurde
weiter gerührt Die Lösung wurde dabei trüb. Das Mischen wurde dann fortgesetzt indem der Kolben
unter einem Strom kalten Wassers bewegt wurde. Die Lösung wurde dann wieder klar. Die Trübung
beruht darauf, daß sich die oberflächenaktive Substanz aus der Lösung abscheidet Durch
Abkühlen v*jrd die oberflächenaktive Verbindung
rehydratisiert und das Steroid voll löslich gemacht Die Lösung erwies sich als 1 Woche lang stabil,
wenn sie bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde.
„, , . . _ oberflächenaktive Verbindung _. , . , ,, -.
Oxidase i *
a. 6,7 ml des Reagens-Puffers sowie 03 ml Cholesterin-Lösung d wurden in einem Teströhrchen miteinander vereinigt, vermischt und in ein auf 37° C eingestelltes
Wasserbad gebracht. Nach 5 Minuten wurde 1,0 ml Enzymlösung zugesetzt, so daß uas Endvolumen in dem
Teströhrchen 8 ml betrag. In einem Spektrophotometer vom Typ Spectronic 20 (Hersteller Bausch und Lomb)
wurde bei 430 nm ein erster Wert abgelesen.
Das Röhrchen wurde dann wiederum in das Wasserbad gebracht. Alle 5 Minuten, und zwar 25
Minuten lang, wurden in den Spektrophotometer y, weitere Werte abgelesen. Die Geschwindigkeit der
Farbentwicklung wurde unter Verwendung eines Diagramms ermittelt, in dem die Veränderung der
optischen Dichte in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen wurde, wobei von der Veränderung der bo
optischen Dichte im linearen Teil der Kurve der Mittelwert festgestellt wurde. Die Aktivität wurde
berechnet unter Verwendung einer Konstante, die zunächst für das Farbstoffsystem von einer Standardkurve ermittelt wurde. Die Enzympräparate wurden
derart verdünnt, daß 0,005 bis 0,06 Einheiten von Cholestefin-Oxidase pro Bestimmufigsföhfchen verwendet wurden.
b. Für die kontinuierliche Bestimmung von Cholesterin-Oxidase wurde ein Aufzeichnungsspektrophotometer nach Beckman verwendet Dabei wurden 2JSml
Reagens-Puffer, 0,1 ml Lösung d und Wasser in einer ml fassenden Cuvette miteinander vereinigt Nachdem
ein Temperaturgleichgewicht eingetreten war, wurde Enzym zugesetzt und die Geschwindigkeit der Farbentwicklung bei 430 nm verfolgt. Die Inkubationstemperatur lag bei 37° C. Die Aktivität wurde aus der Neigung
der Kurve der Farbentwicklung ermittelt. Ein geeigneter Enzym-Konzentrationsbereich für dieses Verfahren
liegt bei 0,001 bis 0,02 Einheilen pro Cuvette.
Eine Einheit der Cholesterin-Oxidase-Aktivität entspricht der Enzymmenge, die die Produktion von
μΜοΙ H2O2 pro Minute bei 37°C und einem pH-Wert
von 7,0 katalysiert.
10. Bestimmung des Rest-Cholesterins
Das restliche Cholesterin wurde aus der Fermentationsbrühe und der Zellsuspension mit einer Mischung
aus Äthanol und n-Heptan extrahiert Das Cholesterin in der organischen Phase wurde silanisiert mit
Siliciumhydrid unter Erzeugung eines Cholesterin-Silan-Derivates behandelt und auf gaschromatographischem
Wege bestimmt.
Pie folgenden Beispiele sollen das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes
angegeben wird, beziehen sich die angegebenen
Konzentrationen auf Gewichtsprozent
Nocardia cholesterolicum wurde in Fernbach-Flaschen in den beschriebenen fünf verschiedenen Medien
gezüchtet Ermittelt wurde die extracellulare wie auch die intracellulare unlösliche Cholesterin-Oxidase, die in
jedem Medium erzeugt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt
Die Menge an intracellularer, unlöslicher Cholesterin-Oxidase war etwa gleich in den Zellen, die in den
Glycerin-, Glycose- und Hefeextraktmedien gezüchtet wurden. Der Zusatz von Inositol und Hefeextrakt zum
Glyce.'rinmedium führte zu einer Inhibierung der Enzymproduktion. Es wurde keine intracellulare, unlösliche Cholesterin-Oxidase-Aktivität in den Zellen
festgestellt, die in dem S-3-Medhim gezüchtet wurden.
Unerwarteterweise jedoch trat eine beträchtliche Oxidase-Aktivität in der Fermentationsbrühe dieses
Mediums auf. Im Gegensatz hierzu wurde keine extracellulare Aktivität in den Brühen festgestellt die
von dem modifizierten Glycerinmedium und dem Hefeextraktmedium erhalten wurden, wohingegen in
den Brühen des Glycerinmediums und des Glucosemediums etwa 20 bis 30% der Gesamt-Cholesterin-Oxidase-Aktivität auftraten.
Die Cholesterin-Oxidase, erzeugt durch Kulturen, die im S-3-Medium gezüchtet wurden, erreichte einen
maximalen Wert von 17,5 internationalen Einheiten (U)
pro Liter (Fig. 1). Diese Konzentration ist um etwa lOmal so hoch wie die Konzentration, die im Falle des
Glycerinmediums erhalten wurde. Die Menge des extracellularen Enzyms nahm nach 48 Stunden ab. Die
Kulturen erwiesen sich als wirksame Verbraucher des Cholesterins (mehr als 90% des Cholesterin wurden in
3 Tagen verbraucht).
Wenn die Konzentration des Cholesterins in dem Medium vermindert wird, nimmt die Menge an
extracellular Cholesterin-Oxidase ab und die Geschwindigkeit des Cholesterinverbrauchs fällt
unlöslich menge
Glycerin | 1,1 | 0,5 | 1,6 |
Modifiziertes | 0,4 | 0 | 0,4 |
Glycerin | |||
Glucose | 1,1 | 0,3 | 1,4 |
S-3 | 0 | 1,5 | 1,5 |
Hefeextrakt | 1,5 | 0 | 1,5 |
Um zu zeigen, daß die extracellulare Cholesterin-Oxidase die gleichen funktioneilen Eigenschaften hat wie
die Chplesterin-Oxidase, dje aus der teilchenförmigen
Fraktion extrahiert wurde (d,h, der intrftcelluJaren,
unlöslichen Fraktion), wurde die Substrat-Spezifizität
qualitativ bestimmt Wie sich aus der folgenden Tabelle
s 2 ergibt, zeigte das extracellulare Enzym keine Aktivität
bezüglich ^-Sitosterol und Ergosterol, Es wirkte jedoch
auf Cholesterin, Es zeigte sich keine Aktivität in Abwesenheit you Cholesterin oder im Falle von
aufgekochter Brühe, Aus Fig,2 ergibt sich, daß die
to extracellulare Cholesterin-Oxidase-Aktivität abhängig
war von dem Cholesterin und Deoxicholat (DOC). Sämtliche dieser Charakteristika waren identisch mit
den Charakteristika des Enzyms, das erhalten wurde durch Extraktion der teilchenförmigen Fraktion,
Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß das
Medium für die Herstellung von Cholesterin-Oxidase geeignet war, da die Ausbeute um das 1Ofache höher
war und da das extracellulare Enzym ganz offensichtlich die gleichen Eigenaschaften hatte wie die intracellulare,
unlösliche Cholesterin-Oxidase.
Kennzeichnung der extracellularen C hol esteri n-Oxidase
Substrat
Aktivität*)
Ungekochte Brühe
Gekochte Brühe
Ungekochte Brühe
Ungekochte Brühe
Ungekochte Brühe
Ungekochte Brühe
jß-Sitosterol
*) + = Vorhandene Aktivität
- = Abwesenheit einer Aktivität
In den folgenden Beispielen wurde, sofern nichts anderes angegeben ist, als gezüchtete Kultur Nocardia
cholesterolicum - rauher Stamm und als Medium das S-3-Medium verwendet.
Zunächst wurden mehrere Medien ähnlich dem Nährmedium 2 (d) hergestellt, jedoch mit einem Gehalt
von 0, 0,1, OA 5 und 10 g S-3 pro Liter Medium. Die
so Medien wurden in Fernbach-Raschen ir. der beschriebenen Weise inokuliert und inkubiert. Jedes Medium
wurde nach einer Inkubationszeit von 24, 48 und 72 Stunden auf die Cholesterin-Oxidase-Aktivität untersucht Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden
Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß der Anstieg in der Erzeugung der Cholesterin-Oxidase im
S-3-Medium teilweise auf der reichen Zusammensetzung des Mediums und teilweise auf der oberflächenak-
bo tiven Verbindung selbst beruht. Wird beispielsweise aus dem Medium S-3 fortgelassen, so nimmt die Erzeugung
des Enzyms um 50% ab. Aus Tabelle 3 ergibt sich, daß sich das S-3 vorteilhaft für die Herstellung von
extracellular Oxidase in einem Konzentrationsbereich
von 2 bis 10 g/l Medium, vorzugsweise 3 bis 8 g/l
Medium, auswirkt. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Konzentrationen von S-3 von 4 bis
6 g/l erwiesen.
909 611/385
z | 17 | Tabelle 3 | 26 50 | 753 | 18 | Stelle und Menge der Chplesterin-Aktivillit (U/I)*) | *) nicht bestimmt | - | Intmceiiulor, | lntrace||u|ar, Extracellular | in einer | I des in -to | 10,0 g/l 45 | Optimale | <■· | :iner Erhöhung der | U./Liter | beobachtet, wenn |
Konzentration Zeit | Die oberflächenaktiven Verbind ngen S-I1 | unlöslich | löslich | Reihe von Fermentationen in 250 ml fassenden Erlen | getestet | Medium) auf die Ausbeute an extracellular Choleste- | ?«. Ganz allgemein | 4,4 | Verbindungen auf | |||||||||
vonS-3 | meyer-Kolben unter Verwendung von 25 m | mit der | rin-Oxidase. | zeigte sich, daß eine Konzentration von 5 g der | 3,7 | |||||||||||||
(g/1) (Stdn,) | 3,8 | -*) 0 | Beispiel 2 beschriebenen Mediums pro Kolben | oberflächenaktiven Verbindung S-3 mitgetestet Ermit | Gesamt | oberflächenaktiven Verbindung oder weniger pro Liter | 9,8 | |||||||||||
0 24 | 1,4 | 4,5 3,0 | Zu Vergleichszwecken wurde ein Kolben | telt wurden der Effekt der Konzentration der | In der folgenden Tabelle 4 ist für jede oberflächenak- | optimal für die Erzeugung von extracellularem Enzym | 3,1 | |||||||||||
48 | 1,6 | 2,9 1,0 | oberflächenaktiven Verbindung (1,0, 5,0 und | Tabelle 4 | war. Mit Ausnahme der Verbindung S-I wurde eine | 4,6 | ||||||||||||
72 | 2,5 | -*) 0 | Oberflächenaktive | 3,8 | Inhibierung der Enzym-Produktion | 17,8 | ||||||||||||
0,1 24 | -*) | -*) 4,1 | Verbindung | 9,8 | die Menge an oberflächenaktiver | 4,5 | ||||||||||||
48 | 2,1 | 2,2 1,3 | 5,5 | über 10 g pro Liter erhöht wurde. |
9,1
1.6 |
|||||||||||||
72 | 2,6 | -*) 0 | 2,5 | |||||||||||||||
0,5 24 | 1,3 | 3,8 3,1 | S-I | 4,1 | ||||||||||||||
48 | 1,6 | 2,3 1,3 | S-2 | 5,6 | Konzentra- Extraccllulare | |||||||||||||
72 | 0,5 | -*) 0 | S4 | 2,6 | tion der oberflächen- C hol esterin | |||||||||||||
§,a 24 | 1,3 | 3,1 17,2 | S-5 | 8,2 | aktiven Verbindung Oxidase | |||||||||||||
48 | 1,4 | 1,S 14,0 | S-6 | 5,2 | g/l | |||||||||||||
72 | 0,2 | -*) 0 | S-7 | 0,5 | 10,0 | |||||||||||||
10,0 24 | 0 | 1,3 6,6 | S-8 | 21,6 | 1,0 | |||||||||||||
48 | 0 | 0,5 10,5 | 17,2 | 5,0 | ||||||||||||||
72 | 0,2 | 1,0 | ||||||||||||||||
Beispiel 3 | 7,° ■ | 5,0 | ||||||||||||||||
S-2, S-4, | 11,0 | 5,0 | ||||||||||||||||
S-5, S-6, S-7 und S-8 wurden anstelle der Verbindung S-3 | 1,0 | |||||||||||||||||
in dem in Beispiel 2 beschriebenen Medium | 5,0 | |||||||||||||||||
tive Verbindung die optimale Konzentration für die | ||||||||||||||||||
maximale Ausbeute an extracellularer Cholesterin-Oxi- | ||||||||||||||||||
dase angegeben. Sämtliche der getesteten oberflächen | ||||||||||||||||||
aktiven Verbindungen führten zu c | ||||||||||||||||||
Ausbeute an extracellularer Oxid? |
Wirkung von anderen oberflächenaktiven
Verbindungen
Es wurden die oberflächenaktiven Verbindungen S-9, S-IO, S-U, S-12, S-13 sowie S-H getestet, die sämtlich
Alkylphenolreste aufweisen. Untersucht wurde ihre Eignung zur Verbesserung der Ausbeute an extracellularer Cholesterin-Oxidase, Die Verbindungen wurden in
Erlenmeyer-Kolben in drei verschiedenen Konzentrationen von 0,05, 0,5 und 5,0 g/I Medium nach dem in
Beispiel 3 beschriebenen Verfahren getestet In der folgenden Tabelle 5 sind für jede oberflächenaktive
Verbindung die optimale Konzentration und die Menge an extracellular erzeugter Cholesterin-Oxidase angegeben.
Oberflächenaktive
Verbindung
Optimale Konzentra- Extracellulare
tion der oberflächen- C hol esterinaktiven Verbindung Oxidase
g/l U/Liter
S-9
S-10
S-Il
S-12
S-13
S-14
S-3
0,5
0,5
0,5
0,5
0,05
0,05
5,0
5,2
3,9
4,0
6,8
4,9
2,4
6,0
3,0
Die Verbindung S-14 inhibierte die Erzeugung des Enzyms. Die Ausbeuten an Cholesterin-Oxidase bei
Verwendung der Verbindungen S-10 und S-U waren etwas besser als im Falle eines Mediums ohne
oberflächenaktive Verbindung. Im Falle der Verbindung S-9, S-12 und S-13 wurde die Erzeugung des
extracellularen Enzyms stark verbessert, pie Konzentrationen
an erhaltener Cholesterin-Oxidase waren vergleichbar mit den Konzentrationen, die im Falle der
Verbindung S-3 erhalten wurden. Pie Konzentrationen
■> dieser oberflächenaktiven Verbindungen, die optimal
für die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase waren, lagen um 1 bis 2 Größenordnungen unter der optimalen
Konzentration (5 g/l) der Verbindung S-3. Diese oberflächenaktiven Verbindungen inhibierten das
to Wachstum von Nocardia cholesterolicum bei Konzentrationen von über etwa 0,5 g pro Liter.
751 eines sterilisierten modifizierten S-3-Mediums,
wurde mit 6 Litern einer 19 Stunden alten Kultur von Nocardia cholesterolicum inokuliert. Das Inokulum
wurde in der beschriebenen Weise gezüchtet. Das Medium wurde 24 Stunden lang bewegt und kräftig
belüftet In vorteilhafter Weise wurde das Medium mit einem Rührer mit einer Rührgeschwindigkeit von 250
Umdrehungen pro Minute gerührt <Luft wurde mit einer
Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 V&Aimenteilen Luft
pro Volumenteilen Medium pro Minute eingeführt Die
Fermentationstemperatur betrug 30° C. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in einer gekühlten kontinuierlich
arbeitenden Zentrifuge abzentrifugiert Die zentrifugierte Brühe enthielt die extracellulare Cholesterin-Oxidase.
Zur Durchführung der Versuche wurden verschiedene Stämme verwendet, von denen bekannt war, daß sie
zur Erzeugung von Cholesterin-Oxidase befähigt sind. Die Stämme wurden in einem S-3-Medium gezüchtet.
Bestimmt wurde die eneugte Cholesterin-Oxidasemenge nach 24, 48 sowie 72 Stunden. In der folgenden
Tabelle 6 sind die maximalen Ausbeuten angegeben.
Stamm | Cholesterin-Oxidase*) | Inlracellular | U/Liter |
Extracellulai | -**) | Gesamt | |
Arthrobacter crystallopoites | 0,9 | -**) | -**) |
Arthrobacter Stamm NP | 0,4 | 0,0 | -**) |
Mycobactetium Stamm MA-7 | 0,6 | 0,0 | 0,0 |
Mycobacterium Stamm E-16 | 1,7 | 0,0 | 1,7 |
Mycobacterium rhodochrous | 1,1 | 0,0 | 1,1 |
Corynebacterium-Art | 4,0 | 52,4 | 4,0 |
Nocardia cholesterolicum - glatt | 20,3 | 6,7 | 32,7 |
Nocardia cholesterolicum - rauh | 16,5 | 23,2 |
*) Die angegebenen Zahlenwerte stellen die maximal erzeugte Menge dar.
**) Nicht bestimmt.
Beispiel 7
Einfluß eines Antischaummittels
Da der Zusatz einer oberflächenaktiven Verbindung, wie beispielsweise S-3 entscheidend für die extracellulare Erzeugung von Cholesterin-Oxidase ist, erwies es sich
als zweckmäßig, die durch Zusatz einer solchen oberflächenaktiven Verbindung erzeugte Sehiiumung
bj zu vermindern.
Untersucht wurd» der Einfluß der Zugabe verschiedener Konzentrationen eines bekannten Antischaummittels, nämlich Polyglykol P-2000.
J(I
Es zeigte sich, daß ein geringer Anstieg der Menge an extracellular Cholesterin-Oxidase sowie der Gesamt-Cholesterin-Oxidase zu verzeichnen war bei Verwendung einer Polyglykolkonzentration von bis zu 0,05%.
In diesem Konzentrationsbereich (von bis zu 0,05%) wurden etwa 60% des Gesamtenzyms extracellular
erzeugt. Eine weitere Erhöhung der Konzentration des Antischaummittels führte zu einer Inhibierung der
Enzymsynthese und zu einer Verschiebung der Enzymverteilung in Richtung von intracellular erzeugtem
Enzym.
Versuche in einem 1501 fassenden Fermentationsgerät zeigten, daß eine Konzentration von 0,03% des
Polyglykols P-2000 zu einer vorteilhaften Steuerung der Schaumbildung, verursacht durch die oberflächenaktive ι '>
Verbindung S-3 im Medium führte.
Beispiel 8
F.inflnR von Chnlpstrrin
F.inflnR von Chnlpstrrin
Der Einfluß der Menge an Cholesterin im Medium wurde untersucht. Ermittelt wurden die erzeugten
Enzymmengen bei ansteigender Cholesterinkonzentration. Es wurde gefunden, daß ein 13facher Anstieg der
Cholesterin-Oxidase-Konzentration stattfand, wenn die Konzentration des Cholesterins von 0 auf 0,5% erhöht
wurde.
Einfluß von Inositol
Ermittelt wurde der Einfluß von Inositol auf die Erzeugung des Enzyms. Es wurde festegestellt, daß
Inositol die Erzeugung des Enzyms inhibierte.
Im Hinblick auf den 3fachen Anstieg der Enzym-Produktion,
der ohne Inositol erreicht wurde, wurden die in den folgenden Beispielen 10 bis 12 beschriebenen
Versuche unter Verwendung eines zweiten modifizierten S-3-Nährmediums der im folgenden angegebenen
Zusammensetzung durchgeführt:
Modifiziertes S-3-Medium Nr. 2
Nährbrühe 8,0 g
S-3 5.0 g
Hefeextrakt 1,0 g
Cholesterin I1Og
Aufgefüllt mit destilliertem Wasser
auf 1 Liter.
auf 1 Liter.
Beispiel 10
Untersuchung von anderen Steroiden und
Cholesterin-Estern als Auslöser von
Cholesterin-Oxidase
a. Es wurde eine Anzahl von Steroiden auf ihre Eignung zur Induzierung von Cholesterin-Oxidase
untersucht Wie sich aus der folgenden Tabelle 7 ergibt ist die Wirksamkeit verschiedener Steroide bezüglich
der Enzyminduzierung sehr unterschiedlich. Die Untersuchungen erfolgten unter Verwendung von 250 ml
fassenden Erlenmeyer-Kolben, die 25 ml des beschriebenen modifizierten S-3-Mediums Nr. 2 enthielten. An
Stelle des Cholesterins wurde jeweils 1 g des zu untersuchenden Steroides pro Liter Nährmedium
angewandt
Cholesterin induzierte eine extracellular Enzymaktivität
von 14,7 Einheiten pro Liter. Der Zusatz einer vermahlenen Soja-Steroid-Mischung zum Medium
führte zu einer Enzymerzeugung von 65% der Menge, die durch Cholesterin induziert wurde. Die durch
jJ-Sitosterol und 5«-Cholestan-3/?-ol induzierte Enzymkonzentration lag bei 65 bzw. 59% der durch
Cholesterin induzierten Enzymmenge.
Wirksamkeit von anderen Steroiden als Auslöser
(Induktionsmittel) von Cholesterin-Oxidase
50
Extra- | Enzym- |
ccllularc | Aktivität |
Aktivität | (des Vergleichs |
mediums*) | |
(U/Liter) |
Cholesterin 14,7 100
B-Sitoslerol 9,54 65
Ver:ii::h!ene Mischi,'"" 9 99 68
von Soja-Steroiden
von Soja-Steroiden
5-Cholestan-3./f-o! 8,70 59
Cholest-4-cn-3-on 6,27 43
Gemischtes Soja-Steryl- 5,03 34
2-Carbamato-Glutarsäure,
Kaliumsalz**)
7-Dehydrocholesterin 2,19 14
*) Das Vergleichsmedium enthielt Cholesterin als Auslöser
oder Induktionsmitlel.
**) Nicht getrenntes Gemisch von Steroidderivaten von Sojabohnen. Die Konzentration der Steroide lag bei 0,1 %.
**) Nicht getrenntes Gemisch von Steroidderivaten von Sojabohnen. Die Konzentration der Steroide lag bei 0,1 %.
b. Es wurden insgesamt 12 Cholesterinester auf ihre Fähigkeit zur Induktion von Cholesterin-Oxidase
getestet. Die Versuche wurden in der gleichen Weise wie im Falle der Steroide durchgeführt. In dem
modifizierten S-3-Medium Nr. 2 wurde das Cholesterin jeweils durch den zu testenden Cholesterinester ersetzt
Vier der insgesamt 12 getesteten Ester des Cholesterins,
nämlich das Linoleat, Oleat, Ilexanoat und Propionat
induzierten eine Cholesterin-Oxidase-Konzentration, die vergleichbar war mit der Konzentration, die bei
Verwendung von Cholesterin in einem entsprechenden Medium erhalten wurde (Tabelle 8). Cholesterylbutyrat,
Cholesteryldecanoat und Cholesteryllinoleat erwiesen sich als mäßig erfolgreich in der Induzierung des
Enzyms. Die übrigen Ester induzierten Cholesterin-Oxidase zu weniger als 50%, bezogen auf den Vergleichsversuch mit Cholesterin. Bei Verwendung von Estern
mit aromatischen Seitenketten war die Wirksamkeit eher noch geringer.
Wirksamkeit von Cholesterinestern als Auslöser
(Induktionsmittel) von Cholesterin-Oxidase
Cholesterinester*) | Konzen | Enzym- |
tration | Aktivität | |
%des | ||
Vergleichs | ||
(m-Mole) | versuches**) | |
Cholesterin | 2,6 | 100,0 |
Cholesterylpropionat | 2,3 | 79,7 |
Cholesterylbutyrat | 2,2 | 64,1 |
Cholesterylhexanoat | 2,1 | 99,7 |
Choleslerinester*) I | 10 | Enzym- |
t | ,9 | Aktivität |
,9 | % des | |
,8 | Vergleichs· | |
<onzen- | ,7 | Versuches**) |
ration | ,6 | 45,0 |
,5 | 13,6 | |
,5 | 63,0 | |
(m-Mole) | ,6 | 54,2 |
Chclesterylbenzoat : | 49,9 | |
C holesteryl^p-ni trobenzoat | 41,3 | |
C hol esteryl-decanoat | 86,4 | |
Cholesteryllaurat | 112,0 | |
Cholesterylmyristat | 64,6 | |
Cholesterylpalmitat | ||
Cholesteryloleat | ||
Cholesteryllinoleat | ||
Cholesteryllinolenat |
I".
*) Die Konzentration der Ester lag bei 0,1 %.
**) Das Vergleichsmedium enthielt Cholesterin als Auslöser.
Beispiel 11
Einfluß von Hefeextrakt
Durch Fortlassen des Hefeextraktes aus dem modifizierten S-3-Medium Nr. 2 wurden die Konzentrationen an extracellularem Enzym um 50% (Tabelle 9)
vermindert Die Enzym-Synthese stieg mt steigenden Konzentrationen von Hefeextrakt von bis zu 0,15% an.
Bei Hefeextraktkonzentrationen von mehr als 0,15% w:rde kein weiterer Anstieg in der Enzymproduktion
festgestellt Im Gegenteil, es ergab sich eine Unterdrükkung der Enzymproduktion in einem Medium mit einem
Gehalt an Hefeextrakt von 1,0%. Das Verhältnis von freigesetztem Enzym nahm von 81 auf 26% ab, wenn die
Konzentration an Hefeextrakt von 0,0 auf 1,0% erhöht wurde.
Einfluß von Hefeextrakt auf die Erzeugung von
Cholesterin-Oxidase
Ergebnisse erhalten, die besser sind als bei Abwesenheit von Hefeextfaki, jedoch weniger gut sind als im Falle
optimaler Hefeextrakt-Konzentrationen.
Beispiel 12 Einfluß der Nährbrühen-Konzentration
Um die optimale Konzentration an Nährbrühe zu ermitteln, wurde die Synthese des Enzyms in einem
modifizierten S-3-Medium Nr. 2, das verschiedene Konzentrationen dieses hauptsächlichen Stickstofflieferanten enthielt, durchgeführt. Aus Tabelle 10 ergeben
sich die relativen Enzymausbeuten, die bei steigenden Konzentrationen von Nährbrühe gegenüber einem
Vergleichsversuch mit 0,8% Nährbrühe erzielt wurden.
Einfluß der Nährbrühe auf die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase
Konzentration
von Hefeextrakt
Extracellular
Enzym in % des
Vergleichsversuches*)
Verhältnis von freigesetztem
Enzym in %
50
100
116
108
113
100
116
108
113
81
60
41
40
40
26
*) Das Vergleichsmedium enthielt 0,1 % Hefeextrakt
Der Hefeextrakt läßt sich in vorteilhafter Weise teilweise durch Riboflavin und/oder Biotin ersetzen. Bei
Verwendung von Riboflavin und Biotin werden
Konzentration der Nährbrühe
in% |
Beispiel |
Relative Ausbeute ;
an extracellular ■ Cholesterin-Oxidase |
0,0
0,2 0,4 0,8*) 1,6 |
18% i
50% I; 80% H 100% s 169% " |
|
*) Vergleichsversuch. | ||
13 I | ||
Einfluß von Spuren-Salzen | |
Um den Einfluß von Spuren-Salzen zu ermitteln, wurden die folgenden Salze einem modifizierten
S-3-Medium Nr. 2 zugesetzt:
4r>
MgSO4 · 7 H2O
CaCI2 · 2 H2O
FeSO4 · 7 H2O
MnSO4 · H2O
ZnSO4 · 7 H2O
NaCl
pro Liter
125,0 mg
0,5 mg
40,0 mg
8,5 mg
0,3 mg
3,0 mg
Es wurde ein 2facher Anstieg der Erzeugung der Cholesterin-Oxidase ermittelt.
Die Ergebnisse der Beispiele zeigen, daß das Nährmedium für die Erzeugung von extracellularer
Cholesterin-Oxidase von Nocardia cholesterol icum als optimale Konzentrationen pro Liter beispielsweise
enthalten soll: Nährbrühe 8,0 g, Tween40 5,0 g.
Hefeextrakt 1,5 g, Cholesterin 5,0 g. Versuche in einem
1501 fassenden Fermentationsgerät zeigten, daß die Cholesterinkonzentration in vorteilhafter Weise bei
etwa 1,0 g pro Liter liegt Im Falle der Verwendung derartiger Medien lassen sich beispielsweise bis zu 30
μ Einheiten von extracellularer Cholesterin-Oxidase erzeugen.
Claims (1)
1.) mindestens 8 g pro Liter einer Nährbrühe,
2.) 1,0 bis 5,0 g Hefeextrakt und
3.) 0,5 bis 5,0 g pro Liter eines Cholesterin-Oxidase-Auslösers.
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