DE2650753A1

DE2650753A1 - Verfahren zur herstellung von cholesterin-oxidase

Info

Publication number: DE2650753A1
Application number: DE19762650753
Authority: DE
Inventors: Charles Thomas Goodhue; Prakash Sharatchandr Masurekar
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1975-11-07
Filing date: 1976-11-05
Publication date: 1977-05-18
Also published as: DE2650753B2; US4072568A; US4035237A; CA1069073A; FR2330766B1; GB1545237A; BE848070A; JPS5261288A; FR2330766A1

Description

Dipl.-Chem. Dr. Brandes Dr.-Jng.Held
Dipl-Phys. Wofff

8 München 22,ThierschstraBe 8

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Telex 0523325 (patwo d) Telegrammadresse: wolffpatent, münchen

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28. Oktober 19 76 25/93 Reg.Nr. 125 069

Eastman Kodak Company, 343 State Street, Rochester,
Staat New York, Vereinigte Staaten von Amerika

Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase

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-*- 26507S3

Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Üxidase.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase durch Züchtung eines Cholesterin-Oxidase erzeugenden Microorganismus in einem Nährmedium und Abtrennung der erzeugten Cholesterin-Oxidase von dem Nährmedium.

Microorganismen, die zu einer Cholesterin-Metabolisierung befähigt sind, sind bekanntlich potentielle Enzymlieferanten für die enzymatische Bestimmung von Cholesterin in komplexen Mischungen, beispielsweise Blutserum. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn der Microorganismus Cholesterin als einzigen Kohlenstofflieferanten verwenden kann, da bei diesem Bestimmungsverfahren Cholesterin durch oxidative Enzyme abgebaut werden muß.

T.C. Stadtman in "Methods in Enzymology", Band 1, Herausgeber: S.P. Colowick und N.O. Kaplan, Academic Press, N.Y. 1955, Seite 6 78 sowie T.C. Stadtman, A. Cherkes sowie J. Anfinsen in "Biol. Chem.", 206 (1954), Seite 510 berichten über die Reinigung eines Enzymes von Nocardia cholesterol!cum, einem Organismus, der zuerst von Schatz und Mitarbeitern (vergl. A. Schatz, K. Savard und I.J. Pintner ind "J. Bacteriol," (1949), Seiten 117-125 isoliert wurde. Das Enzym von Stadtman, als "Cholesterin-Dehydrogenase" bezeichnet, wurde für die Verwendung im Rahmen einer Cholesterin-Bestimmung gereinigt, die auf der Messung des Anstieges der Absorption bei 250 nm auf Grund der Bildung von Cholest-4-en-3-on beruht. Da, wie nunmehr festgestellt wurde, der direkte Akzeptor von Cholesterin-Elektronen bei dieser Oxidation Sauerstoff ist, muß das Enzym richtigerweise als Cholesterin-Oxidase bezeichnet werden.

Die Bakterienstämme, die von Stadtman beschrieben werden, erzeugen, wenn sie nach den in den zitierten Literaturstellen beschriebenen Verfahren kultiviert werden, nur sehr geringe Enzymkonzentrationen, welche für eine technische Verwertung zu gering sind. Die nach den bekannten Methoden herstellbaren Konzentrationen sind derart gering, daß eine Reinigung des Enzymes für die Praxis praktisch nicht in Frage kommt.

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Aus der US-PS 3 909 359 ist des weiteren ein verbessertes Verfahren für die Herstellung der Stadtman'sehen Cholesterin-Oxidase bekannt, welches aus den folgenden Verfahrensstufen besteht:

(a) Züchtung des Bacteriums Nocardia cholesterol!cum Art NRRL 5 76 7 oder NRRL 5 76 8 in einem Medium, in welchem Cholesterin oder ein geeignetes Derivat hiervon als Hilfs-Kohlenstofflieferant wirkt und

(b) Isolierung eines zellenfreien Extraktes mit dem aktiven Enzym aus dem Medium.

Obgleich das in der US-PS 3 909 359 beschriebene Verfahren eine wesentliche Verbesserung des von Stadtman beschriebenen Synthese-Verfahrens darstellt und obgleich das in der US-PS 3 909 359 beschriebene Verfahren technisch anwendbar ist, besitzt es doch den Nachteil, daß das Enzym überwiegend intracellular erzeugt wird. Aus diesem Grund ist für die Extraktion des Enzyms aus dem Nährmedium ein zeitaufwendiges, teures Zellen-Zertrümmerungsverfahren, z.B. eine Homogenisierung und dergleicnen, erforderlich.

Aus der DT-OS 2 246 695 ist des weiteren ein Verfahren zur Isolierung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms, erzeugt von einer Kultur eines Nocardia-Microorganismus mit der Bezeichnung NRRL 56 35 und NRRL 5636 bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren werden die geernteten Zellen mit einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung behandelt und bei Raumtemperatur verrührt, so daß eine vergleichsweise große Menge des Enzyms aus den Zellen in die überstehende Flüssigkeit gelangt, wodurch eine Zellextraktion und Isolierungsmethoden überflüssig werden. Bei Anwendung dieses Verfahrens der Enzymextraktion lassen sich Ausbeuten in der Größenordnung von etwa 40 bis 160 Einheiten pro Liter erhalten.

Aus einer von Ε.Ϊ. Reese und A. Maquire unter der Überschrift "Surfactants as Stimulants of Enzyme Production by Microorganisms" veröffentlichten Arbeit in der Zeitschrift "Applied Microbiology", February 1969, Seiten 242 bis 245 ist des weiteren bekannt, daß der

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Zusatz von Sorbitanpolyoxiätcfiylenmonoaleat (Handelsprodukt Tween 8ü, Hersteller Atlas Chemical Company, Wilmington, Delaware, USA) und anderer nicht-ianogener oberflächenaktiver Verbindungen zu Pilzkulturen, die normalerweise Enzyme extra-cellular erzeugen, zu einem Anstieg der Enzymausbeute führt.

Aus der GB-PS 1 385 319 ist des weiteren ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase aus Nocardia Art NRRL 5635 und NRRL 5636 bekannt. Während der Fermentation wird langsam eine Suspension von Cholesterin als Auslöser oder Induktionsmittel für Cholesterin-Oxidase zugesetzt. Für die Dispergierung des Cholesterins. in der Suspension wird eine nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung (Tween 80) in einer Konzentration von 3 Vol.-I verwendet. Dies führt jedoch zu einer nur sehr geringen Menge an nicht-ionogener oberflächenaktiver Verbindung im Fermentationsmedium.

Die Bakterienkulturen, die dafür bekannt sind, daß sie Cholesterin-Oxidase erzeugen, erzeugen das Enzym normalerweise intracellular.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase anzugeben.

Der Erfindung lag die Erkenntnis zugrunde, daß man in vorteilhafter Weise Cholesterin-üxidase extra-cellular erzeugen kann, indem man dem Nährmedium, in dem ein Cholesterin-Oxidase erzeugender Microorganismus gezüchtet wird, eine nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung in einer Konzentration zusetzt, die selbst nicht toxisch ist und deren Zerfallsprodukte in einer Konzentration erzeugt werden, die nicht so hoch ist, als daß sie für den Cholesterin-Oxidase erzeugenden Organismus toxisch sein könnte. Überraschenderweise wurde gefunden, daß der Zusatz einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung dazu führt, daß die Hauptmenge des erzeugten Enzymes extra-cellular erzeugt wird. Dies ermöglicht eine wesentliche Einsparung der Zeit und Kosten, die normalerweise für die Enzym-Extraktion nach der Erzeugung des Enzymes aufgewandt werden müssen, indem eine Zellenzerstörung entbehrlich wird, die normaler-

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weise erforderlich ist, wenn das Enzym intracellular erzeugt wird.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase durch Züchtung eines Cholesterin-Oxidase erzeugenden Microorganismus in einem Nährmedium und Abtrennung der erzeugten Cholesterin-Oxidase von dem Nährmedium, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Cholesterin-Oxidase extracellular in einem Nährmedium, das mindestens 0,5 g einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung pro Liter Nährmedium enthält, erzeugt.

Figur 1 veranschaulicht die Cholesterin-Oxidase-Aktivität als Funktion der Fermentierungsdauer sowie die Erschöpfung des Cholesterins in dem Fermentationsmedium mit der Zeit.

Figur 2 veranschaulicht die Beziehung zwischen der Cholesterin-Oxidase-Aktivität und der Gegenwart von Cholesterin und Deoxicholat (DOC).

Nach dem Verfahren der Erfindung ist somit eine extracellular Cholesterin-Oxidase-Erzeugung möglich, wenn eine nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung, die selbst nicht-toxisch ist und deren Zerfallsprodukte ebenfalls nicht-toxisch für den Microorganismus sind, dem Nährmedium zugesetzt wird, das Cholesterin-Oxidase zu erzeugen vermag. Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignet sich in besonders vorteilhafter Weise das Baktemim Nocardia cholesterolicum, Art NRRL 5767 und NRRL 5 768. In vorteilhafter Weise können die Cholesterin-Oxidase erzeugenden Microorganismen in einem Medium erzeugt werden, das Cholesterin, ein geeignetes Derivat hiervon oder ein 3-ß-Hydroxysterol als Auslöser oder Induktionsmittel von Cholesterin-Oxidase enthält.

In vorteilhafter Weise wird als nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung eine Verbindung verwendet, die einen Polyoxiäthylenrest oder einen hydrophilen Polyglycidolrest sowie einen lipophilen Rest aufweist, der mindestens 9 Kohlenstoffatome enthält. In vorteilhafter Weise besteht der lipophile Rest aus einer Fettsäurekette oder enthält eine Fettsäurekette mit mindestens 10 Kohlenstoffatomen.

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Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung lassen sich alle Kulturen verwenden, die Cholesterin-Üxidase erzeugen. Zu Cholesterin-Oxidase erzeugenden Kulturen gehören beispielsweise Arthobacter crystallopoities , Arthobacter Stamm wP, Corynebacteri um-Stämme, Mycobacterium Stamm MA-7, My cob ac ter ium Stamm L-16, Mycobacterium rhodochrous sowie andere Stämme aus der sogenannten Mycobacterium rhodochrous-Gruppe, Mycobacterium rubrum, Nocardia erythropolis, Nocardia, Art NRRL 56 35 und 56 36, Nocardia cholesterol!cum - glatt und Nocardia cholesterol!cum - rauh.

Zwei Nocardia-cholesterolicum-KuItüren, die Cholesterin-Oxidase liefern und sich besonders für die durchführung des Verfahrens der L-rfindung eignen, sind die "rauhen" und "glatten" Stämme mit der Bezeichnung NRRL 5767 sowie NRRL 5768, hinterlegt im "Agricultural Collection Investigations Fermentation Laboratory", Peoria, Illinois, üSA.

Details dieser Organismen sind: Beschreibung von Nocardia cholesterolicum

Ir Cellular-^Morphologie

A. Glatter Stamm. Gram-positiv, schwach säurefest, coryneform, kein gut entwickeltes Mycel, jedoch wird eine rudimentäre Verzweigung beobachtet. Kokkoide Formen treten in älteren Kulturen auf.

B. Rauher Stamm. Wie oben.

II. Kolonie-Morphologie

A. Nähr-Agar (5 Tage, 30⁰C).

1. Glatter Stamm. Circular, konvex, wässrig, ungeteilt (entire), glatt, glänzend, rosa-weiß. Kein lösliches Pigment.

2. Rauher Stamm. Circular, konvex, ungeteilt (entire), glatt bis rauh, rosa-weiß. Kein lösliches Pigment.

B. Hefe-Glukose-Agar (5 Tage, 30^GC).

1. Glatter Stamm. Kremige bis hellbraune Farbe, wässrig, glatt,

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ORIGINAL INSPECTED

/ο

rund und erhöht.

2. Rauher Stamm. Trocken, kremige bis hellbraune Farbe, rund und erhöht.

C. Kasein-Agar (5 Tage, 30⁰C).

1. Glatter Stamm. Kremige bis hellbraune Farbe, wässrig, rund, glatt, erhöht.

2· Rauhe Kolonie. Hellbraunebis rosa, trocken, erhöht.

D. Gelatine-Agar.

1. Glatter Stamm. Circular, konvex, ungeteilt (entire), glatt, wässrig, kremfarben.

2. Rauher Stamm. Circular, konvex, ungeteilt (entire), trocken, kremfarbig.

III. Wachstum in flüssiger Kultur (Nährbrühe, 5 Tage, 30⁰C)

A. Glatter Stamm. Fast weißer bis hellbrauner flocken-bildender Niederschlag, kein Häutchen.

B. Rauher Stamm. Fast weißer bis hellbrauner flocken-biIdender Niederschlag, kein Fläutchen.

IV. Physiologie (Glatte und rauhe Stämme identisch)

Belüftung aerob

Gelatinehydrolyse

Kaseinhydrolyse

Stärkehydrolyse

Oxidase

Catalase +

Urease

Indol

Methylrot

Phenylalanin-Deaminierung

Lackmusmilch alkalisch

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A»

Verwendung der Verbindungen als einziger Kohlenstofflieferant

Citrat +

Lactat +

Malat +

Succinat +

Fructose +

Glucose +

Sucrose +

Maltose +

Glycerin +

Sorbitol +

Trehalose +

Raffinose

Dulcitol

Lactose

Mannitol +

Stärke

Arabinose

Nach dem aus der US-PS 3 909 359 bekannten Verfahren, bei dem Cholesterin-Oxidase intracellular erzeugt wird, führt die Verwendung eines üblichen primären Kohlenstofflieferanten, wie beispielsweise Glycerin, in Kombination mit einem sekundären oder Hilfs-Kohlenstofflieferanten, wie beispielsweise Cholesterin, Cholest-4-en-3-on oder Cholesteryllinoleat, die sämtlich als Cholesterin-Üxidase-Auslöser oder Induktionsmittel dienen, zu einer Erhöhung der Ausbeute des Cholesterin-Oxidase-Enzyms, die um etwa das 100-fache höher ist als die Ausbeute, die erzeugt wird, wenn kein Cholesterin-Oxidase-Auslöser verwendet wird oder wenn Cholesterin als einziger Kohlenstofflieferant verwendet wird.

Nach dem aus der US-PS 3 909 359 bekannten Verfahren werden erhöhte Ausbeuten dann erhalten, wenn das Bakterium in einem üblichen Nährmedium üblicher bekannter Zusammensetzung gezüchtet wird, d.h. einem Nährmedium, das im allgemeinen enthält: einen Stickstofflieferan-

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ten, wie beispielsweise Ammoniumsulfat, einen Kalium- und einen Phosphorlieferanten, wie beispielsweise Kaliumphosphat, Spuren von Metallionen sowie eine Mischung aus einem primären Kohlenstofflieferanten, z.B. Glycerin, und einem Cholesterin-Oxidase-Auslöser oder Induktionsmittel, bestehend aus Cholesterin, Cholest-4-en-3-on, Cholesteryllinoleat oder Mischungen hiervon. Der pH-Wert des Mediums wird dabei bei 5,0 bis 8,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5 gehalten. Die Temperatur liegt vorzugsweise bei etwa 18 bis etwa 35⁰C, insbesondere bei 25 bis 30⁰C und die Züchtungsdauer liegt bei etwa 18 bis etwa 40 Stunden, vorzugsweise etwa 20 bis 24 Stunden.

Die Mengen an Stickstofflieferanten, Kaliumphosphat und Spurenmetallionen, die bei der Züchtung verwendet werden, sind bekannt. Spezielle Angaben finden sich in den erwähnten Literaturstellen.

Zu den vorteilhaften primären Kohlenstofflieferanten, die in der US-PS 3 909 359 erwähnt werden, und die sich auch zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen,- gehören beispielsweise Glyzerin, Glukose und Lssigsäure. Dabei können übliche bekannte Konzentrationen des oder der primären Kohlenstofflieferanten verwendet werden. Diese Konzentrationen liegen im allgemeinen bei etwa 0,5 bis etwa 5 Gew.-s. Die Konzentration eines Cholesterin-Oxidase-Auslösers liegt im allgemeinen bei etwa 0,05 bis etwa 0,5 Gew.-%. Vorzugsweise wird ein solches Auslöser in einer Konzentration von etwa 0,1 bis etwa 0,2 Gew.-% verwendet.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Herstellung der Cholesterin-Oxidase somit beispielsweise nach dem aus der US-PS 3 909 359 bekannten Verfahren erfolgen mit der Ausnahme jedoch, daß das Nährmedium zusätzlich eine nicht-inhibierende Konzentration einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung enthält, die gegenüber dem Microorganismus nicht-toxisch ist und deren Zerfallsprodukte in entsprechender Weise gegenüber den Microorganismen nicht-toxisch sind. Der Zusatz einer solchen nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung zum Fermentationsmedium führt zu einer

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primär extra-cellularen Cholesterin-Oxidase-Erzeugung, wodurch die Notwendigkeit für die Durchführung einer zeitaufwendigen, komplizierten kostspieligen Zellenextraktion, wie sie bisher erforderlich wax, in Fortfall gerät.

Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen sich die verschiedensten nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindungen, wie beispielsweise Polyäthylenglykole, Polyvinylalkohole, Polyäther, Polyester sowie Polyhalogen!de.

Wesentliche Kriterien sind, daß

(1) weder die im Einzelfalle verwendete nicht-ionogene Verbindung als auch ihre Zerfallsprodukte gegenüber dem Microorganismus in den erforderlichen Konzentrationen zur extracellularen Erzeugung des Enzymes toxisch sind, und daß

(2) die Menge an verwendeter oberflächenaktiver Verbindung die Enzym-Produktion nicht inhibiert.

Die Toxizität einer oberflächenaktiven Verbindung gegenüber einem Microorganismus läßt sich leicht dadurch bestimmen, daß eine Kultur des Microorganismus einer vergleichsweise geringen Konzentration der zu testenden oberflächenaktiven Verbindung ausgesetzt wird, in der Regel von etwa 0,5 g pro Liter, worauf die Einwirkung der Behandlung des Microorganismus beobachtet wird. In den Fällen, in denen ein Kontakt mit einem toxischen Stoff erfolgt, erfolgt eine Inhibierung des Wachstums des Microorganismus und infolgedessen ein unterdrücktes Wachstum der Kultur in einer Petrischale beispielsweise.

Die Toxizität der Zerfallsprodukte der oberflächenaktiven Verbindungen läßt sich, wie im folgenden beschrieben wird, erkennen. Der einzig positive Test für die Ermittlung der Toxizität der Zerfallsprodukte ist jedoch die Züchtung des Microorganismus in einem Nährmedium und die Beobachtung der Effekte der erzeugten Nebenprodukte, wie es in den später folgenden Seispielen gezeigt wird.

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Obgleich der dem erfindungsgemäßen Verfahren zugrundeliegende i-iechanisinus noch nicht restlos geklärt ist, wird angenommen, daß, wie es in den später folgenden Beispielen gezeigt xverden wird, nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindungen, die bekannt sind, daß sie in toxische Reste zerfallen, beispielsweise in Phenole, nicht zur erfolgreichen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind.

Zu den geeigneten,nicht-ionogenen, oberflächenaktiven Verbindungen gehört eine breite Skala von Verbindungen.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindungen verwendet, die einen Polyoxyäthylenrest oder einen hydrophilen Polyglycidolrest sowie einen lipophilen Rest mit mindestens 9 Kohlenstoffatomen aufweisen.

Als besonders vorteilhaft hat sich dabei die Verwendung von Verbindungen erwiesen, deren lipophiler Rest aus einer Fettsäurekette besteht oder eine solche Fettsäurekette aufweist, die mindestens 10 Kohlenstoffatome enthält.

Optimale Ergebnisse lassen sich dann erhalten, wenn die Fettsäurekette mindestens 16 Kohlenstoffatome aufweist und der hydrophile Rest aus etwa 20 Oxiäthyleneinheiten besteht.

Im folgenden sind zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung besonders geeignete oberflächenaktive Verbindungen aufgeführt:

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Oberflächenaktive Verbindung

S-1 S-2 S-3 S-4 S-5 S-6 S-7 S-8

S-9 S-10 S-11 S-12 S-13

Hydrophiler Rest

Anzahl Lipophiler Rest Anzahl Einheiten Einheiten

Sorbitan- Polyoxyäthylen	1 20	Laurinsäure	1
Sorbitan- Poly oxy ä thy len	1 4	Laurinsäure	1
Sorbitan- Polyoxyäthylen	1 20	Palmitinsäure	1
Sorbitan- Polyoxyäthylen	1 20	Stearinsäure	1
Sorbitan- PoIyoxyäthylen	1 4	Stearinsäure	1
Sorbitan- Polyoxyäthylen	1 20	Stearinsäure	3
Sorbitan- PoIyoxyäthylen	1 20	Oleinsäure	1
Sorbitan- Polyoxyäthylen	1 5	Oleinsäure	1
Polyoxyäthylen	10	Nonylphenyl	1
Polyoxyäthylen	15	Nonylphenyl	1
Polyoxyäthylen	30	Nonylphenyl	1
Polyglycidol	6	Nonylphenyl	1
Polyglycidol	10	Nonylphenyl	1

Nicht-ionogene, oberflächenaktive Verbindungen, die sich als nicht geeignet für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung erwiesen haben, sind Octylphenylpolyäthoxyäthanole, wie sie beispielsweise im Handel unter der Handelsbezeichnung Triton (Hersteller Rohm & Haas, Philadelphia, USA) erhältlich sind. Ls wird angenommen, daß diese Verbindungen beim Zerfall oder Abbau toxische Phenole bilden und aus diesem Grunde nicht geeignet sind. Line Verbindung aus 9,5 Polyäthoxyäthyleneinheiten und einer Octylphenyleinheit (S-14: Triton-X-100) wird in den später folgenden Beispielen untersucht.

Die günstigste Konzentration an nicht-ionogener oberflächenaktiver Verbindung in einem speziellen Nährmedium hängt stark von der übrigen Zusammensetzung des Nährmediums ab, der Empfindlichkeit des Mediums gegenüber der im Einzelfalle verwendeten oberflächenaktiven Verbindung und der im Einzelfalle verwendeten Verbindung. Ganz allgemein hat es sich doch als zweckmäßig erwiesen, die oberflächenaktiven Verbindungen in Konzentrationen von etwa 0,5 bis etwa 10,0 g/l Medium anzuwenden. Bei Konzentrationen von über 10 g/l kann die oberflächenaktive Verbindung als Wachs turnsinhibitor wirken, höchstwahrscheinlich auf Grund einer Toxizität der oberflächenaktiven Verbindung oder von Nebenprodukten gegenüber dem Microorganismus. Bei Konzentrationen unterhalb von 0,5 g/l wird demgegenüber keine wesentliche Freisetzung von Cholesterin-Oxidase beobachtet. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, Konzentrationen an oberflächenaktiven Verbindungen von etwa 1 bis 5 g/l Medium zu verwenden.

Als primärer Kohlenstofflieferant kann beispielsweise verwendet werden: Glycerin, Glucose.(insbesondere von Reagens-Reinheit), Maissirup von technischem Reinheitsgrad und dergleichen. Als Auslöser oder Induktionsmittel ist beispielweise Cholesterin-Oxidase geeignet, die auch als HiIfs-Kohlenstofflieferant verwendet werden kann. Als Auslöser können des weiteren beispielsweise Cholesterin, Cholest-4-en-3-on sowie Cholesteryllinoleat verwendet werden sowie andere Sterole und Cholesterinester. Weitere vorteilhafte Auslöser sind beispielsweise ß-Sitosterol und 5a-Cholestan-3-ß-ol sowie

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Cholesterinester, z.B. Cholesteryloleat, Cholesterollinoleat, Cholesterylformiat und Cholesterylpropionat.

Als Stickstofflieferanten können die verschiedensten üblichen Stickstoffverbindungen verwendet werden. Als .besonders vorteilhafte Stickstofflieferanten für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung haben sich handelsübliche Nährbrühen erwiesen, beispielsweise Nutrient Broth, ein Erzeugnis der Firma üifco Laboratories, Detroit, Michigan, mit einem Gehalt von Pepton und Rindfleischextrakt. Andere weitere Stickstofflieferanten sind beispielsweise im Handel erhältliche Erzeugnisse, wie Anatone, Hersteller Cudahy Laboratories, Omaha, Nebraska sowie K-Z/Amin Typ AT, N-Z/Amiη Typ BT, N-Z/Amin Typ LT, N-Z/Amiη Typ TT, Soy Petone Typ T, Fermamin Typ I, Fermamin Typ II und Fermamin Typ III, die sämtlich von der US-Firma Sheffield Chemical Div. von Kraftco Corp., Union, New Jersey, USA in den Handel gebracht werden.

Bei der Herstellung von Cholesterin-Oxidase unter Verwendung eines Nährmediums mit einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung nach dem Verfahren der Erfindung kann ein Schäumen beobachtet werden. Um das Schäumen unter Kontrolle zu halten, insbesondere dann, wenn mit vergleichsweise großen Ansätzen gearbeitet wird, kann die Verwendung eines Schaum-Steuermittels vorteilhaft sein. Derartige Schaum-Steuermittel sind im Handel erhältlich. Ein typisches geeignetes Schaum-Steuermittel ist beispielsweise das Polyglykol P-2000, Hersteller Dow Chemical Co., Midland, Michigan, USA. Weitere geeignete Schaum-Steuermittel sind im Handel erhältlich.

In den folgenden Beispielen, die das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen sollen, werden die folgenden Definitionen gebraucht

1. Kultur: Sofern nichts anderes angegeben wird, wurde der "rauhe Stamm" (NRRL 576 8) von Nocardia cholesterolicum verwendet.

2. Nährmedium

Die verwendeten Nährmedien hatten folgende Zusammensetzung:

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2650753	Liter	25	,0	g	0,1 N	g	g	g
pro	,0	0	,1	g		g
2	,0	2	,8	ml	g
2	,0	1	,7	g	g
5	,0	O	,06	g
5	,1	0	,6	g
0	,0
1
auf 1 Liter.	pro Liter einer
HCl-Lösung

a) Glyzerin-Medium

Ammoniumsulfat

Kaliumphosphat (dibasisch)

Salzlösung "C"

Glyzerin

Tryρton

Cholesterin

Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

Salzlösung "C"

Magnesiumsulfat · 7H_0
Calciumchlorid · 2H₂O
Ferrosulfat · 7H_?0
Mangansulfat · H„Ü
Zinksulfat · 7H₂O
Natri umchlorid

b) Modifiziertes Glyzerinmedium

Wie unter a) beschrieben mit pro Liter

Inositol 1,0g

Hefeextrakt 1,0 g

c) Glucosemedium

Wie unter a) beschrieben mit der Ausnahme jedoch, daß Glyzerin durch Glucose ersetzt wurde.

d) S-3 Medium pro Liter

Nährbrühe mit Pepton und Rindfleischextrakt 8,0 g

Hefeextrakt 1,0g

Inositol 1,0g

Cholesterin 1,0 g

S-3 (Sorbitan-Polyoxyäthylen) 5,0 g

Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

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e) Hefeextraktmedium

Hefeextrakt Inositol

Natriumphosphat (dibasisch · 7 H₂O) Trypton

Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter.

f) InocuIum-Medium

Glucose

Hefeextrakt Kaliumphosphat (dibasisch) Salzlösung A-1 Salzlösung A-2 Agar

Einstellung des pH-Wertes auf 7,0 und aufgefüllt mit destilliertem Wasser auf 1 Liter.

2650753	Liter
pro	g
1,0	g
1,0	g
2,0	g
5,0
ter.	Liter
pro	g
10,0	g
10,0	g
1,0	ml
2,0	ml
2,0	g
20,0

Salzlösung A-1

pro Liter einer 0,1 N HCl-Lösung

Magnesiumsulfat · 7H₂O 100,0 g

Ferrosulfat · 7H₂O 10,0 g

Mangansulfat · 7H₂O 1,0g

Natriummolybdat · 2H~0 0,5 g

Aufgefüllt auf 1 Liter mit einer 0,1 normalen Chlorwasserstoffsäure.

Salzlösung A-2 pro Liter Lösung

Calciumchlorid 10,0 g

Mit deionisiertem destilliertem Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

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S) Modifiziertes S-5 Medium pro Liter

Nährbruhe 8,0 g

Hefeextrakt 1,5 g

Cholesterin 2,0 g

S-3 5,0 g

Polyglycol P-2000 0,3 g

3. Erhaltung der Kultur

Die Kulturen wurden auf Schrägen eines Glyzerinmediums mit einem Cholesteringehalt erhalten und jeden zweiten Tag übertragen.

4. Herstellung eines Inoculums (Verwendung in kleinem Maßstab)

Eine Schräge des Inoculummediums (f) wurde mit Kocardia cholesterolicum (rauh) von einer zwei Tage alten Glyzerinmedium-Schräge inokuliert und 48 Stunden lang bei 30 C inkubiert. Die Kultur von dieser Schräge wurde dann mit einer urahtschleife entfernt und durch kräftiges Schütteln in 25 ml sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Die Trübung der Suspension liegt im allgemeinen bei 1,8 bis 2,2 optischen Dichteeinheiten (O.D.) bei 660 nm. 60 ml dieser Suspension wurden pro Liter zu inokulierendem Medium verwendet.

5. Herstellung eines Inokulums für eine Fermentation in größerem Maßstab

Sechs 2,8 1 fassende Fernbach-Flaschen mit jeweils 1 Liter des modifizierten S-3 Mediums wurden mit 2 Tage alten Kulturen von Nocardia cholesterolicum (rauh), inokuliert, die auf den Schrägen des Inoculum-Mediums gezüchtet worden waren. Pro-Flasche wurde eine Schräge verwendet. Die Flaschen wurden 19 Stunden lang bei 30⁰C geschüttelt, bei 125 Umdrehungen pro Minute.

6. Fermentation

Die Fermentationen erfolgten in 2,8 Liter fassenden Fernbach-Flaschen sowie in 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben. Die Volumina der Medien in den Fernbach-Flaschen und Erlenmeyer-Kolben lagen

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bei 1 Liter bzw. 25 ml. Die Flaschenmedien wurden in der beschriebenen Weise inokuliert und bei 30⁰C inkubiert. Im Falle der Fernbach-Flaschen wurde die Schüttelgeschwindigkeit auf 125 Umdrehungen pro Minute und im Falle der Lrlenmeyer-Kolben auf 2ÜO Umdrehungen pro Minute eingestellt. Diese Medienvolumina und Schiittelgeschwindigkeiten wurden eingestellt, daß sie zu entsprechenden Sauerstoffübertragungsgeschxiindigkeiten führten. Alle 24 Stunden wurden aseptisch Proben für die Bestimmung der Cholesterin-Oxidase-Aktivitat abgezogen.

7. Isolierung der Zellen

Die Zellen wurden durch 15 Minuten langes Zentrifugieren in einer gekühlten Zentrifuge (I. Sorvall Inc., Norwalk, Conn., USA) von der Fermentationsbrühe abgetrennt, und zwar bei «in$r Zentrifugalkraft von 12350 χ £, d.h. der Schwerkraft.

8. Bestimmung der Cholesterin-Oxidase-Aktivitat

a. Herstellung von Zellenfraktionen für die Bestimmung der Cholesterin-Oxidase.

Cholesterin-Oxidase kann außerhalb der Zellen oder extracellular und innerhalb der Zellen oder intracellular vorhanden sein. Des weiteren kann das intracellulare Enzym als freies oder lösliches Enzym und als gebundenes oder unlösliches Enzym vorliegen. Das extracellular Enzym läßt sich in der Nährbrühe nach der Entfernung der Zellen durch Zentrifugieren bestimmen. Für die Bestimmung des intracellularen Enzyms xfurden die Zellen durch Einwirkung von Ultraschallwellen aufgebrochen.

Die Zellenhaut, die bei der Zentrifugierung anfiel, wurde in 1 ml destilliertem Wasser suspendiert, worauf die Suspension durch Zusatz von 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 7,0) auf 20 ml verdünnt wurde. Die verdünnte Suspension wurde dann 5 Minuten lang der Einwirkung von Ultraschallwellen in einem Eis-ttasserbad ausgesetzt. Dabei wurde die Suspension jeweils 1 Minute lang beschallt, 30 Sekunden lang stehen gelassen, ivieder 1 Minute lang beschallt u.s.w., bis 5 Minuten verstrichen waren.

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ί?

Die Ultraschall-behandelten Suspensionen, wurden dann in der Kälte bei 27000 χ g 15'Minuten lang zentrifugiert. Die Aktivität der überstellenden Flüssigkeit wurde als sogenannte intracellulare, lösliche Aktivität bezeichnet. Die Zellenhaut wurde in einer 2öigen iNatri urndeoxi cholatlösung resuspendiert und 10 Minuten lang auf Lis stehen gelassen. Die Suspension wurde dann in der Kälte 15 Minuten lang bei 27000 χ g/zentrifugiert. Die Cholesterin-Oxidasen-Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit wurde als intracellulare, unlösliche Aktivität bezeichnet. Die Summe der extracellularen, intracellularen löslichen und intracellularen unlöslichen Aktivitäten wurde als Gesamtaktivitat bezeichnet.

9. Hnzymbes timmung

Die Cholesterin-üxidase-Aktivität wurde nach dem folgenden Verfahren ermittelt:

Reagentien:

a. 50 inM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0 (KP-Puffer) :

30,5 ml 0,2 U K₂H PO₄ + 19,5 ml 0,2 M KH₂PO₄ sowie Wasser bis zu einem Endvolumen von 200 ml.

b. 0,1aige Dianisidin-Lösung: 10 mg 3,3'-Dimethoxybenzidindihydrochlorid pro ml Wasser. Keine pH-Werteinstellung.

c. Reagens-Puffer: 0,4 ml der Dianisidinlösung und 1,4 mg eines Peroxidasepulvers (Sigma Type II, Meerrettich-Peroxidase, RZ 1,0 bis 1,5 Nr. P825O) wurden zu 40 ml des KP-Puffers gegeben und hiermit vermischt. Durch Zusatz von weiterem KP-Puffer wurde auf 50 ml verdünnt. Die Lösung wird trübe, wenn das Dianisidin zugesetzt wird, wird jedoch beim Mischen wieder klar. Die Mischung soll bis zur Verwendung im Kalten aufbewahrt werden. Der Reagenspuffer ließ sich bei 4⁰C 3 Tage lang ohne Probleme aufbewahren. Im vorliegenden Falle wurde der Reagenspuffer jedoch täglich frisch neu bereitet.

Zentrifugalkraft entsprechend 27000 χ Schv/erkraft

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Cholesterin-Lösung: Zu 10 ml einer oberflächenaktiven Verbindung mit 9,5 Oxiäthyleneinheiten und einer Octylphenyleinheit (Triton-X-100, S-14), erhitzt auf einer heißen Platte, wurden 300 mg Cholesterinpulver zugesetzt, worauf solange mit einem Rührstab vermischt wurde, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Dann wurden 90 ml Wasser zugegeben und es wurde weiter gerührt. Die Lösung wurde dabei trüb. Das Mischen wurde dann fortgesetzt, indem der Kolben unter einem Strom kalten Wassers bewegt wurde. Die Lösung wurde dann wieder klar. Die Trübung beruht darauf, daß sich die oberflächenaktive Substanz aus der Lösung abscheidet. Durch Abkühlen wird die oberflächenaktive Verbindung rehydratisiert und das Steroid voll löslich gemacht. Die Lösung erwies sich als 1 Woche lang stabil, wenn sie bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde.

Reaktionen:

oberflächenaktive

Cholesterin + 0 ; Cholest-4-en-3-on

Oxidase

Peroxidase
+ Dianisidin 2H₂O + Farbstoff

Bestimmungsverfahren:

rin-Lösung d a. 6,7 ml des Reagens-Puffers sowie 0,3 ml Qhöleste/wurden in einem Teströhrchen miteinander vereinigt, vermischt und in ein auf 37⁰C eingestelltes Wasserbad gebracht. Nach 5 Minuten wurde 1,0 ml Enzymlösung zugesetzt, so daß das Endvolumen in dem Teströhrchen ml betrug. In einem Spektrophotometer vom Typ Spectronic 20 (Hersteller Bausch und Lomb) wurde bei 430 nm ein erster Wert abgelesen.

Das Röhrchen wurde dann wiederum in das Wasserbad gebracht. Alle

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5 Hinuten, und zwar 25 Minuten lang, wurden in den Spektrophotometer weitere fterte abgelesen. Die Geschwindigkeit der Farbentwicklung wurde unter Verwendung eines üiagrammes ermittelt, in dem die Veränderung der optischen dichte in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen wurde, wobei von der Veränderung der optischen Dichte im linearen Teil der Kurve der Mittelwert festgestellt wurde. Die Aktivität wurde berechnet unter Verwendung einer Konstante, die zunächst für das Farbstoffsys tem von einer Standardkurve ermittelt wurde. Die Enzympräparate wurden derart verdünnt, daß 0,005 bis 0,06 Linheiten von Cholesterin-0xidase pro Bestimmungsröhrchen verwendet wurden.

b. Für die kontinuierliche Bestimmung von Cholesterin-0xidase wurde ein Aufzeichnungsspektrophotometer nach Beckman verwendet. Dabei wurden 2,5 ml Reagens-Puffer, 0,1 ml Lösung d und Wasser in einer 3 ml fassenden Cuvette miteinander vereinigt. Nachdem ein Temperaturgleichgewicht eingetreten war, wurde Enzym zugesetzt und die Geschwindigkeit der Farbentwicklung bei 430 nm verfolgt. Die Inkubationstemperatur lag bei 37°C. Die Aktivität wurde aus der Neigung der Kurve der Farbentwicklung ermittelt. Ein geeigneter Enzym-Konzentrationsbereich für dies Verfahren liegt bei 0,001 bis 0,02 Einheiten pro Cuvette.

Eine Einheit der Cholesterin-Oxidase-Aktivitat entspricht der Enzymmenge, die die Produktion von 1 u Mol H_0_ pro Minute bei 37°C und einem pH-Wert von 7,0 katalysiert.

lü. Bestimmung des Rest-Cholesterins

Das restliche Cholesterin wurde aus der Fermentationsbrühe und der Zellsuspension mit einer Mischung aus Äthanol und n-Heptan extrahiert. Das Cholesterin in der organischen Phase wurde silanisiert/und auf gaschromatographisclieni Wege bestimmt.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der Erfindung näher veranschaulichen. Sofern nichts anderes angegeben wird, beziehen sich die angegebenen Konzentrationen auf Gewichtsprozent.

mit Siliciuüüiydrid unter Erzeugung eines Cholesterin-Silan-Derivates behandelt. 7Q982Q/0940

SS"

Beispiel 1

Xocardia cholesteroIi cum wurde in Fernbach-Flaschen in den beschriebenen fünf verschiedenen -ledien gezüchtet, Ermittelt wurde die extracellular wie auch die intracellulare, unlösliche Cholesterin-Oxidase, die in jedem Medium erzeugt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgefünrt.

Die I-ienge an intracellularer, unlöslicher Cholesterin-uxidase war etwa gleich in den Zellen, die in den Glycerin-, Glycosc- und Hefeextraktmedien gezüchtet wurden. Der Zusatz von inositol und Hefeextrakt zum Glycerinmedium führte zu einer Inhibierung der Enzynvproduktion. Es wurde keine intracellulare, unlösliche Cholesterin-Oxidase-Aktivität in den Zellen festgestellt, die in dem S-3 Medium gezüchtet wurden. Unerwarteterweise jedoch trat eine beträchtliche Üxidase-Aktivität in der Fermentationsbrühe dieses Mediums auf. Im Gegensatz hierzu wurde keine extracellulare Aktivität in den Brühen festgestellt, die von dem modifizierten Glycerinmedium und dem Hefeextraktmedium erhalten wurden, wohingegen in den Brühen des Glycerinmediums und des Glucosemediums etwa 20 bis 30 % der Gesamt-Cholesterin-Oxidase-Aktivitat auftraten.

Die Cholesterin-Oxidase, erzeugt durch Kulturen, die im S-3 iledium gezüchtet wurden, erreichte einen maximalen Wert von 17,S internationalen Einheiten (U) pro Liter (Fig. 1). Diese konzentration ist um etwa 10 mal so hoch wie die Konzentration, die im Falle des Glycerinmediums erhalten wurde. Die klenge des extracellularen Enzyms nahm nach 48 Stunden ab. Die Kulturen erwiesen sich als \tfirksame Verbraucher des Cholesterins (mehr als 90 % des Cholesterins wurden in 3 Tagen verbraucht).

Wenn die Konzentration des Cholesterins in dem ,iedium vermindert viird, nimmt die bienge an extracellularer Cholesterin-Oxidase ab und die Geschwindigkeit des Cholesterinverorauchs fällt.

BAD ORIGINAL

709820/09ΛΟ

Tabelle 1

Effekt des Mediums auf die Erzeugung von Cholesterin Üxidase

Cholesterin-Üxidase U/Liter

,•iediuni	Intraceilular,	Extracellular	Gesamt
	unlosli eh		menge
Glycerin	1,1	υ, 5	1,6
.'iccli i'i ziertes
Glyceri η	ü,A	U	0,4
Glucose	1, 1	0,3	1,4
S-3	υ	1,5	1,5
Hefe extrakt	1,5	ü	1,5

Beschreibung der Cholesterin-Üxidase

Um zu zeigen, daß die extracellular Cholesterin-Oxidase die gleichen funktioneilen Eigenschaften hat wie die Cholesterinüxidase, die aus der teilchenformigen Fraktion extrahiert wurde (d.h. der intracellularen, unlöslichen Fraktion), wurde die banstrat-bpezifizitat qualitativ bestimmt. Wie sich aus der folgenden Tabelle 2 ergibt, zeigte das extracellular Enzym keine Aktivität bezüglich ß-Sitosterol und Ergosterol. Es wirkte jedoch auf Cholesterin. Es zeigte sich keine Aktivität in Abwesenheit von Cholesterin oder im Falle von aufgekochter Brühe. Aus Fig. 2 ergibt sich, daß die extracellular Cholesterin-Üxidase-Aktivitat abhängig war von dem Cholesterin und Deoxicholat (DOC). Sämtliche dieser Charakteristika waren identisch mit den Charakteristika des Enzyms, das erhalten wurde durch Extraktion der teilchenförmigen Fraktion

Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß das Medium für die Herstellung von Cholesterin-Oxidase geeignet war, da die Ausbeute um das 10-fache höher war und da das extracellular Enzym ganz offensichtlich die gleichen Eigenschaften hatte wie die intracellulare unlösliche Cholesterin-Oxidase.

709820/0940 bad

Tabelle 2

Kennzeichnung der extracellularen Cholesterin-Oxidase

Enzym-Lieferant Substrat Aktivität

Ungekochte Brühe Cholesterin +

Gekochte Brühe Cholesterin

Ungekochte Brühe Kein Zusatz

Ungekochte Brühe ß-Sitosterol

Ungekochte Brühe Ergosterol

Ungekochte Brühe Cholestanol +

+ = Vorhandene Aktivität

- = Abwesenheit einer Aktivität

In den folgenden Beispielen wurde, sofern nichts anderes angegeben ist, als gezüchtete Kultur Nocardia cholesterolicum - rauher Stamm und als Medium das S-3 Medium verwendet.

Beispiel 2

Zunächst wurden mehrere Medien ähnlich dem Nährmedium 2 (d) hergestellt, jedoch mit einem Gehalt von O, 0,1, 0,5, 5 und 10 g S-3 pro Liter Medium. Die Medien wurden in Fernbach-Flaschen in der beschriebenen Weise inokuliert und inkubiert. Jedes Medium wurde nach einer Inkubationszeit von 24, 48 und 7 2 Stunden auf die Cholesterin-Oxidase-Aktivität untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt.

Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß der Anstieg in der Erzeugung der Cholesterin-Oxidase im S-3 Medium teilvieise auf der reichen Zusammensetzung des Mediums und teilweise auf der oberflächenaktiven Verbindung selbst beruht. Wird beispielsweise

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aus dem Medium S-3 fortgelassen, so nimmt die Erzeugung des Enzyms um 50 % ab. Aus Tabelle 3 ergibt sich, daß sich das S-3 vorteilhaft für die Herstellung von extracellularer Oxidase in einem Konzentrationsbereich von 2 bis 10 g/l Medium, vorzugsweise 3 bis 8 g/l Medium auswirkt. Als besonders vorteilhaft hat sich die Verwendung von Konzentrationen von S-3 von 4 bis 6 g/l erwiesen.

Tabelle 3

Stelle und Menge der Cholesterin-Aktivität QVD ⁺

Konzentra	Zeit	Intracel-	Intracel-	+	Extracel	Gesamt
tion von	(Stdn.)	IuIar, un	lular, lös	4,5	lular
S-3 (g/l)		löslich	lich	2,9
0	24	3,8	+	0	3,8
	48	1,4	+	3,9	9,8
	72	1,6	— » "	1,0	5,5
0,1	24	2,5	+	0	2,5
	4ΓΪ	+	3,8	4,1	4,1
	72	2,1	2,5	1,5	ο , 6
0,5	24	2,6	+	ü	2,6
	48	1,3	3,1	3,1	8,2
	72	1,6	1,8	1,3	5,2
5,0	Ί Λ t- ■+	C, 5	+	0	0,5
	4 3	1,5	1,3	17,2	21 ,6
	72	1,4	0,5	14,0	17,2
10,0	24	0,2	U	G, 2
	4 8	ü	6,6	7 9
	72	0	10,5	11 Ιό

nicht bestimmt

Beispiel 5

Die oberflächenaktiven Verbindungen S-1, S-2, S-4, S-5, S-6, S-7 und S-3 imrden anstelle der Verbindung S-3 in dem in Beispiel 2 beschriebenen Medi um in einer Reihe von Fermentationen in 250 ml fassenden lirlenmeyer-Kolben unter Verwendung von 25 ml des in Beispiel 2 beschriebenen Mediums pro Kolben getestet. Zu Vergleichs zwecken wurde ein Kolben i..i t der oberflächenaktiven Verbindung S-3 r.n tge-

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testet. Ermittelt wurden der liffekt aer Konzentration der oberflächenaktiven Verbindung (1,0, 5,0 und 1U,O g/l Medium) auf die Ausbeute an extracellularer Cholesterin-Oxidase.

In der folgenden Tabelle 4 ist für jede oberflächenaktive Verbindung die optimale Konzentration für die maximale Ausbeute an
extracellularer Cholesterin-Oxidase angegeben. Sämtliche der getesteten oberflächenaktiven Verbindungen führten zu einer Erhöhung der Ausbeute an extracellularer Oxidase. Ganz allgemein zeigte sich, daß eine Konzentration von 5 g der oberflächenaktiven Verbindung
oder weniger pro Liter optimal für die Lirzeugung von extracellularem Enzym war. Mit Ausnahme der Verbindung S-1 wurde eine Inhibierung der Enzym-Produktion beobachtet, wenn die Menge an oberflächenaktiver Verbindungen auf über 10 g pro Liter erhöht wurde.

Tabelle 4

Oberflächenaktive Optimale Konzentra- Lxtracellulare Cho-Verbindung tion der oberflächen- lesterin-Oxidase

aktiven Verbindung g/1 U./Liter

S-1	10,0	4,4
S-2	1,0	3,7
S-4	5,0	9,8
S-5	1,0	3,1
S-6	5,0	4,6
S-7	5,0	17,8
S-8	1,0	4,5
S-3	5,0	9,1
	—	1,6
Beispiel 4:	Wirkung von anderen oberflächenaktiven	Ver,U indungen.

Es wurden die oberflächenaktiven Verbindungen S-9, S-10, S-11,
S-12, S-13 soivie S-14 getestet, die sämtlich Alkylphenolreste aufweisen. Untersucht wurde ihre Eignung zur Verbesserung der Ausbeute an extracellularer Cholesterin-Oxidase. Die Verbindungen wurden in Erlenmeyer-Kolben in drei verschiedenen Konzentrationen von
0,05, 0,5 und 5,0 g/Liter Medium nach dem in Beispiel 3 beschrie-

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20

benen Verfahren getestet. In der folgenden Tabelle 5 sind für jede oberflächenaktive Verbindung die optimale Konzentration und die Menge an extracellular erzeugter Cholesterin-Cxidase angegeben.

Tabelle 5

Oberflächenaktive Optimale Konzentra- Extracellulare Cho-Verbindung tion der oberflächen- lesterin-Oxidase

aktiven Verbindung g/l U./Liter

S-9	ü,5	5,2
S-10	0,5	3,9
S-II	0,5	4,0
S-12	0,5	6,8
S-13	0,05	4,9
S-U	0,05	2,4
S-3	5,0	6,0
-	-	3,0

Die Verbindung S-U inhibierte die Erzeugung des Enzymes. Die Ausbeuten an Cholesterin-Oxidase bei Verwendung der Verbindungen S-10 und S-I1 waren etwas besser als im Falle eines Mediums ohne oberflächenaktive Verbindung. Im Falle der Verbindungen S-9, S-12 und S-13 wurde die Erzeugung des extracellularen Enzyms stark verbessert. Die Konzentrationen an erhaltener Cholesterin-Oxidase waren vergleichbar mit den Konzentrationen, die im Falle der Verbindung S-3 erhalten wurden. Die Konzentrationen dieser oberflächenaktiven Verbindungen, die optimal für die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase waren, lagen um 1 bis 2 Größenordnungen unter der optimalen Konzentration (5 g/l) der Verbindung S-3. Diese oberflächenaktiven Verbindungen inhibierten das Wachstum von Nocardia cholesterolicum bei Konzentrationen von über etwa 0,5 g pro Liter.

Beispiel 5

Ein 150 1 fassendes Fermentationsgerät, enthaltend 75 1 eines sterilisierten modifizierten S-3 Mediums wurde mit 6 Litern einer 19 Stunden alten Kultur von Nocardia cholesterolicum inokuliert. Das Inokulum wurde in der beschriebenen Weise gezüchtet. Das Medium wurde 24 Stunden lang bewegt und kräftig belüftet. In vorteilhafter Weise wurde das Medium mit einem Rührer mit einer Rührgeschwin-

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digkeit von 250 Umdrehungen pro Minute gerührt. Luft wurde mit
einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 Volumenteilen Luft pro
Volumenteilen Medium pro Minute eingeführt. Die Fermentationstemperatur betrug 30⁰C. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in einer
gekühlten kontinuierlich arbeitenden Zentrifuge abzentrifugiert.
Die Zentrifugierte Brühe enthielt die extracellular Cholesterin-Oxidase.

Eeispiel 6: Einfluß der Kultur

Zur Durchführung der Versuche wurden verschiedene Stämme verwendet, von denen bekannt war, daß sie zur Erzeugung von Cholesterin-Oxidase befähigt sind. Die Stämme wurden in einem S-3 iledium gezüchtet. Bestimmt wurde die erzeugte Cholesterin-Ox idasenienge nach
24, 48 sowie 72 Stunden. In der folgenden Tabelle. 6 sind die maximalen .Ausbeuten angegeben.

709820/GS40 bad original

Tabelle 6 Erzeugung von Cholesterin-Oxidase im S-3 Medium

Cholesterin-Oxidase U/Liter

Stamm

Arthrobacter crystallopoites

Arthrobacter Stamm NP O Mycobacterium Stamm MA-7 op Mycobacterium Stamm E-16 ** Mycobacterium rhodochrous ' "·» Corynebacterium-Art

(D Nocardia cholesterolicum - glatt

^ Nocardia cholesterolicum - rauh

Extracellular	Intracellular	Gesamt
0,9	+ +	+ +
0,4	⁺⁺	^{+ +}
0,6	0,0	0,6
1,7	0,0	1,7
1,1	0,0	1,1
4,0	0,0	4,0
20,3	12,4	32,7
16,5	6,7	23,2

Die angegebenen Zahlenwerte stellen die maximal erzeugte Menge dar.
Nicht bestimmt.

Beispiel 7: Einfluß eines Antischaummittel

D*³ der Zusatz einer oberflächenaktiven Verbindung, wie beispielswt "se S-3 entscheidend für die extracellular Erzeugung von Choleslerin-Oxidase ist, erwies es sich als zweckmäßig, die durch Zusatz einer solchen oberflächenaktiven Verbindung erzeugte Schäumung zu vermindern.

Untersucht wurde der Einfluß der Zugabe verschiedener Konzentrationen eines bekannten Antischauiumittels , nämlich Polyglykol P-2OOO.

Es zeigte sich, daß ein geringer Anstieg der Menge an extracellularer Cholesterin-Oxidase soitfie der Gesamt-Cholesterin-Oxidase zu verzeichnen war bei Verwendung einer Polyglykolkonzentration von bis zu 0,05 β. In diesem Konzentrationsbereich (von bis zu 0,05 r>) wurden etwa 60 % des Gesamtenzymes extracellular erzeugt. Eine weitere Erhöhung der Konzentration des Antischaummittel führte zu einer Inhibierung der Enzymsynthese und zu einer Verschiebung der Enzymverteilung in Richtung von intracellulär erzeugtem Enzym.

Versuche in einem T50 1 fassenden Fermentationsgerät zeigten, daß eine Konzentration von 0,03 % des Polyglykols P-2O00 zu einer vorteilhaften Steuerung der Schaumbildung, verursacht durch die oberflächenaktive Verbindung S-3 im "tedium führte.

Beispiel 8:, Einfluß von Cholesterin.

Der Einfluß der Menge an Cholesterin im Iledium wurde untersucht. Ermittelt ivurden die erzeugten Enzymmengen bei ansteigender Cholesterinkonzentration. Ls wurde gefunden, daß ein 13-facher Anstieg der Cholesterin-Oxidase-Konzentration stattfand, wenn die Konzentration des Cholesterins von 0 auf 0,5 % erhöht wurde.

Beispiel 9: Einfluß von Inositol.

Ermittelt wurde der Einfluß von Inositol auf die Erzeugung des Enzyms. Es wurde festgestellt, daß Inositol die Erzeugung des En-

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inhibierte.

Iiii Kinblick auf den 5-fachen Anstieg der Enzym-Produktion, der ohne Inositol erreicht wurde, wurden die in den folgenden Beispielen 10 bis 12 beschriebenen Versuche unter Verwendung eines zweiten modifizierten S-3 Nährmediums der im folgenden angegebenen Zusammensetzung durchgeführt:

Modifiziertes S-3 Hedium Nr. 2

Nährbrühe ■ 8,0 g

S-3 5,0 g

Ilefeextrakt 1 ,0 g

Cholesterin 1,0 g

Aufgefüllt mit destilliertem V/asser auf 1 Liter.

Beispiel 10: Untersuchung von anderen Steroiden und Cliolesterin-Estern als Auslöser von Cholesterin-Oxidase.

a. Es wurde eine Anzahl von Steroiden auf ihre Eignung zur Induzierung von Cholesterin-Oxidase untersucht. Wie sich aus der folgenden Tabelle 7 ergibt, ist die Wirksamkeit verschiedener Steroide bezüglich der Enzyminduzierung sehr unterschiedlich. Die Untersuchungen erfolgten unter Verwendung von 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben, die 25 ml des beschriebenen modifizierten S-3 Mediums Nr. 2 enthielten. Anstelle des Cholesterins wurde jeweils 1 g des zu untersuchenden Steroides pro Liter Nährmedium angewandt.

Cholesterin induzierte eine extracellular Enzymaktivität von 14,7 Einheiten pro Liter. Der Zusatz einer vermahlenen Soja-Steroid- Mischung zum Medium führte zu einer Enzymerzeugung von 65 % der Menge, die durch Cholesterin induziert wurde. Die durch ß-Sitosterol und 5a-Cholestan-3ß-ol induzierte Enzymkonzentration lag bei 65 bzw. 59 % der durch Cholesterin induzierten Enzymmenge.

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Tabelle 7

Wirksamkeit von anderen Steroiden als Auslöser (Induktionsmittel) von Cholesterin-Üxidase	Extracellulare Aktivität (U/ Liter)	Enzym-Aktivität ( des Vergleichs mediums ⁺
	14,7	100
Cholesterin	9,54	65
ß-Sitosterol	9,99	68
Vermahlene Mis ellung von Soja-Steroiden	8,70	59
5 -Cholestan-3ß-ol	6,27	43
Cholest-4-en-3-on	5,03	34
Gemischtes Soja-Steryl- 2-Carbamato-Glutarsäure, Kaliumsalz⁺⁺	2,19	14
7-Dehydrocholesterin

Das Vergleichsmedium enthielt Cholesterin als Auslöser oder Induktionsmittel.

nicht getrenntes Gemisch von Steroidderivaten von Sojabohnen Die Konzentration der Steroide lag bei 0,1 %.

b. Es wurden insgesamt 12 Cholesterinester auf ihre Fähigkeit zur Induktion von Cholesterin-Oxidase getestet. Die Versuche wurden in der gleichen Weise wie im Falle der Steroide durchgeführt. In dem. modifizierten S-3 Medium Nr. 2 wurde das Cholesterin jeweils durch den zu testenden Cholesterinester ersetzt. Vier der insgesamt 12 getesteten Ester des Cholesterins, nämlich das Linoleat, Oleat, Ilexanoat und Propionat induzierten eine Cholesterin-Oxidase-Konzentratibn, die vergleichbar war mit der Konzentration, die bei Verwendung von Cholesterin in einem entsprechenden Medium erhalten wurde (Tabelle 8). Cholesterylbutyrat, Cholesteryldecanoat und Cholesteryllinoleat erwiesen sich als mäßig erfolgreich in der Induzierung des Enzyms. Die übrigen Ester induzierten Cholesterin-Oxidase zu weniger als 50 %, bezogen auf den Vergleichsversuch mit Cholesterin. Bei Verwendung von Estern mit aromatischen Seitenketten

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war die Wirksamkeit eher noch geringer.

Tabelle 8

Wirksamkeit von Cholesterinestern als Aus	Konzentration	löser (In
duktionsmittel) von Cholesterin-OxiJase	(m-.Hole)
Cholesterinester		Enzym-Aktivität
	2,6	% des Vergleichs-
	2,3	versuches⁺⁺
Cholesterin	2,2	100,0
Cholesterylpropionat	2,1	79,7
Cholesterylbutyrat	2,0	64,1
Cholesterylhexanoat	1,9	99,7
Cholesterylbenzoat	1,9	45,0
Cholesteryl-p-nitrobenzoat	1,8	13,6
Cholesteryl-decanoat	1,7	63,0
Cholesteryllaurat	1,6	54,2
Cholesterylmyristat	1,5	49,9
Cholesterylpalmi tat	1,5	41,3
Cholesteryloleat	1,6	86,4
CholesterylIi noleat	Lag bei 0.1 %.	112,0
Cholesteryllinolenat	64,6
T)i e Konzentration der Ester 1

⁺⁺Das Vergleichsmedium enthielt Cholesterin als Auslöser.

Beispiel 11: Einfluß von Hefeextrakt.

Durch Fortlassen des Hefeextraktes aus dem modifizierten S-3 Medium Nr. 2 wurden die Konzentrationen an extracellularem Enzym um 50% (Tabelle 9) vermindert. Die Enzym-Synthese stieg mit steigenden Konzentrationen von Hefeextrakt von bis zu 0,15 % an. Bei Hefeextraktkonzentrationen von mehr als 0,15 % wurde kein weiterer Anstieg in der Enzymproduktion festgestellt. Im Gegenteil, es ergab sich eine Unterdrückung der Enzymproduktion in einem Medium mit einem Gehalt an Hefeextrat von 1,0 %. Das Verhältnis von freigesetztem Enzym nahm von 81 % auf 26 % ab, wenn die Konzentration an Hefeextrakt von 0,0 % auf 1,0 % erhöht wurde.

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Tabelle 9

Einfluß von Hefeextrakt auf die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase

Extracellulares	Verhältnis von	thielt 0.1 % Hefeextrakt.
Enzym in % des	freigesetztem
Vergleichsversu che S⁺	Enzym in %
50	81
100	60
116	41
108	40
113	40
54	26

Konzentration von Hefeextrakt

0,0 0,1 0,15 0,2 0,5 1,0

Das Vergleichsmedium enthielt 0,1

Der Hefeextrakt läßt sich in vorteilhafter Weise teilweise durch Riboflavin und/oder Biotin ersetzen. Bei Verwendung von Päboflavin und Biotin werden Ergebnisse erhalten, die besser sind als bei Abwesenheit von Hefeextrakt, jedoch weniger gut sind als im Falle optimaler Hefeextrakt-Konzentrationen.

Beispiel 12: Einfluß der Nährbrühen-Konzentration

Um die optimale Konzentration an Nährbrühe zu ermitteln, wurde die Synthese des Enzyms in einem modifizierten S-3 Medium Nr. 2, das verschiedene Konzentrationen dieses hauptsächlichen Stickstofflieferanten enthielt, durchgeführt. Aus Tabelle 10 ergeben sich die relativen Enzymausbeuten, die bei steigenden Konzentrationen von Nährbrühe gegenüber einem Vergleichsversuch mit 0,8 % Nährbrühe erzielt wurden.

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Tabelle 10

Einfluß der Nährbrühe auf die Urzeugung von Choles terin-Oxidase

Konzentration der Nährbrühe in *

0,0
0,2
0,4
0,8
1,6

Relative Ausbeute an extracellularer Cholesterin-Oxidase

18

50

80

100

169

Vergleichsversuch

Beispiel 15: Einfluß von Spuren-Salzen.

Um den Einfluß von Spuren-Salzen zu ermitteln, vurden die folgenden Salze einem modifizierten S-3 Medium Nr. 2 zugesetzt:

MgSO^ CaCl, FeSo' MnSO^ ZnSO^ NaCl

7H₂O 2H₂O

^H2°

pro Liter

125,0 mg 0,5 mg 40,0 mg 8,5 mg 0,3 mg 3,0 mg

Es wurde ein 2-facher Anstieg der Erzeugung der Cholesterin-Oxidase ermittelt.

Die Ergebnisse der Beispiele zeigen, daß das Nährmedium für die Erzeugung von extracellularer Cholesterin-Oxidase von Nocardia cholesterolicum als optimale Konzentrationen pro Liter beispielsweise enthalten soll: Nährbrühe 8,0 g, Tween 40 5,0 g, Hefeextrakt 1,5 g, Cholesterin 5,0 g. Versuche in einem 150 1 fassenden Fermentationsgerät zeigten, daß die Cholesterinkonzentration in vorteilhafter Weise bei etwa 1,0 g pro Liter liegt. Im Falle der Verwendung derartiger Medien lassen sich beispielsweise bis zu 30 Einheiten von extracellularer Cholesterin-Oxidase erzeugen.

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Leerseite

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Jxiaase durch Züchtung eir.es Cholesterin-OxiJase erzeugenden .-iikroorganisinus in einem i'i äli r rued ium und Abtrennung der erzeugten Cholesterin-Uxidase von dem Mährmedium, dadurch gekennzeichnet» daß inan die Cholesterinüxidase extracellular in einem !,'ährnedium, das mindestens 0,5 g einer nicht-ionogenen oberflächenaktiven Verbindung pro Liter Nähr medium enthält, erzeugt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung verwendet, die einen hydrophilen Polyoxyäthylen- oder Polyglycidolrest und einen lipo-

Rest mit mindestens 9 Kohlenstoffatomen aufweist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung verwendet, deren lipopliiler Rest aus einer Fettsäurekette oder einem Fettsäurerest mit mindestens 10 Kohlenstoffatomen besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung verwendet, deren hydrophiler Rest etwa 20 Oxyäthyleneinheiten aufxireist und deren lipophiler Rest eine Fettsäurekette mit mindestens 16 Kohlenstoffatomen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung verwendet:

a) eine Verbindung mit einem hydrophilen Rest aus einer Sorbitaneinheit und 20 Oxyäthyleneinheiten sowie einem lipophilen Rest mit einer Palmitinsäureeinheiti

b) eine Verbindung mit einem hydrophilen Rest aus einer Sorbitaneiiiheit und 20 Oxyäthyleneinlieiten sowie einem lipophilen Rest mit einer Stearinsäureeinheit,

BADORiGlNAL

c) eine Verbindung mit einem hydrophilen Rest mit einer Sorbitaneinheit und 20 Üxyäthyleneinheiten und einem lipophilen R.est mit einer Oleinsäureeinheit;

d) eine Verbindung mit einem nydrophilen Rest mit 10 Oxyäthyleneiniieiten und einem lipophilen Rest mit einer Nonylphenyleinheit;

e) eine Verbindung mit einem hydrophilen Rest aus 6 Glycidoleinheiten und einem lipophilen Rest aus einer Nonylphenyleinheit und/ oder

£) eine Verbindung mit einem nydrophilen Rest mit 10 Glycidoleinheiten und einem lipophilen Rest mit einer Konylpheny!einheit.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cholesterin-Cxidase erzeugenden Mikroorganismus iNocardia cholesterolicum, Art NRRL 5767 und/oder KRRL 5768 verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium verwendet, das einen Cholesterin-Oxidase-Auslöser enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cholesterin-Oxidase-Auslöser Cholesterin, ein Cholesterinderivat und/oder ein 3-ß-Hydroxysterol verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein vledium mit einer Kultur eines Bakteriums Nocardia cholesterolicum NRRL 5767 oder NRRL 5768 inokuliert, das enthält:

1.) Hefeextrakt,

2.) einen Cholesterin-Oxidase-Auslöser bestehend aus Cholesterin, ß-Sitosterol, vermahlene Sojasterole, 5a-Cholestan-3ß-ol, Cholest-4-en-3-on oder einen Cholesterinester und

3.) eine nicht-ionogene oberflächenaktive Verbindung des beschriebenen Typs.

BAD ORIGINAL

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ΊΟ. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß liian das Medium während der !Vachstumsperiode des Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus belüftet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Nährmedium mit mindestens 0,6 Volumina Luft pro Volumina Kedium/ Minute belüftet.

12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Choles teriii-Oxidase-Auslöser Cholesterin, Cholesterinlinoleat, Cholesterinoleat, Cholesterinhexanoat oder Cholesterinpropionat verwendet.

13. Verfahren nach eineia der Ansprüche 1 bis 12, dadurcn gekennzeichnet, daß man als Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus ein Nocardia cholesterolicum bacterium der Art NRRL 5707 oder KRRL 5768 verwendet und dieses in einem Medium züchtet, das enthält:

1.) mindestens 8 g pro Liter einer Nährbrühe, 2.) 1 »° bis 5,0 g llefeextrakt und

3.) 0,5 bis 5,0 g pro Liter eines Cholesterin-Oxidase-Auslösers.

BAD ORIGINAL

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