DE2800917A1

DE2800917A1 - Verfahren zur zuechtung von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2800917A1
Application number: DE19782800917
Authority: DE
Inventors: Rodolfo Dr Gabellieri
Original assignee: Interox SA
Current assignee: Solvay Chimie SA
Priority date: 1977-01-10
Filing date: 1978-01-10
Publication date: 1978-07-13
Also published as: JPS5388386A; BE862621A; FR2376897B1; DE2800917C2; JPS6127038B2; IT7819138A0; IT1092721B; GB1581403A; US4326035A; LU76547A1; FR2376897A1

Description

_ 4 Be" Schreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von aeroben Mikroorganismen.

Die industrielle Züchtung von Mikroorganismen gewinnt mehr und mehr an Bedeutung. Sie ermöglicht in der Tat die Gewinnung von Mikroorganismen als solchen/ die Bildung von Verbindungen, die von den Mikroorganismen abgeschieden werden, wie beispielsweise Enzymen, Pigmenten oder Toxinen, die Bildung von Stoffwechselprodukten, wie Antibiotika, Vitaminen oder Aminosäuren, oder schließlich die biochemische Umwandlung gewisser wohldefinierter Verbindungen, wie es beispielsweise bei der industriellen Herstellung von Zitronensäure der Fall ist.

Weiterhin stellt die Verwendung gewisser Mikroorganismen als Proteinquelle für die menschliche oder tierische Ernährung eine mögliche Lösung der weltweiten Nahrungsmittelknappheit dar.

Die Mikroorganismen besitzen gegenüber den üblicherweise für die Ernährung verwendeten pflanzlichen oder tierischen Organismen den Vorteil, daß sie eine besonders große Wachstumsgeschwindigkeit zeigen. Diese wesentlich größere Produktivität ermöglicht eine merkliche Steigerung der verfügbaren Nahrungsmittelmengen.

Es wurden bereits verschiedene Verfahren vorgeschlagen, nach denen man die Mikroorganismen mit den unterschiedlichsten Substraten versorgt und aus den in dieser Weise gewonnenen Biomassen Proteinkonzentrate gewinnt, die für die Ernährung nutzbar sind.

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Die Mehrzahl der für diesen Zweck verwendeten Mikroorganismen sind aerobe Mikroorganismen. Man muß die Züchtungsvorrichtungen somit mit Luft oder mit Sauerstoff versorgen, um das Wachstum der Mikroorganismen sicherzustellen. Da die Löslichkeit des Sauerstoffs in Wasser sehr gering ist, wird die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen häufig durch die Lösungsgeschwindigkeit des Sauerstoffs in Wasser begrenzt.

Zur Überwindung dieses Nachteils wurde in der GB-PS 861 784 vorgeschlagen, als Sauerstoffquelle eine wäßrige Wasserstoffperoxidlösung zu verwenden. Die verwendeten Substrate sind die üblicherweise für die Züchtung von Mikroorganismen benützten Substrate, d.h. kohlenhydratreiche Produkte (Melassen, Pepton, Glucose, Lactose) oder Proteine. Diese Produkte besitzen jedoch große Nachteile, die sie aus wirtschaftlichen Gründen für die Verwendung als Substrate wenig interessant machen. In der Tat handelt es sich hierbei um bereits hochwertige Produkte, von denen einige ohne weitere Umwandlung direkt für die tierische oder menschliche Ernährung verwendet werden können.

Andererseits stellen gewisse dieser Produkte Nebenprodukte der Landwirtschaft dar, was zur Folge hat, daß sie komplizierten Vorbehandlungen unterworfen werden müssen, bevor sie als Substrate verwendet werden können.

Aus wirtschaftlichen Gründen ist man bestrebt, Substrate zu verwenden, die aus einfacheren Molekülen aufgebaut sind, wie man sie beispielsweise aus Erdölprodukten gewinnt. So wurde in der GB-PS 914 568 vorgeschlagen, Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff auf Kohlenwasserstoffen, wie Kerosin, wachsen zu lassen. Die Weiterentwicklung dieses Verfahrens auf sehr leichte Substrate, wie Methan, Methanol und Mischungen aus Wasserstoff und Kohlenmonoxid oder Kohlendioxid stößt auf erhebliche Probleme wegen der Entzündbarkeit der Mischungen dieser Produkte mit Sauerstoff.

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Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, ein Verfahren zur Züchtung von aeroben Mikroorganismen anzugeben, das nicht an den genannten Nachteilen leidet.

Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Züchtung von aeroben Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das mit mindestens einer Sauerstoffquelle, mindestens einer Kohlenstoffquelle und mindestens einer Wasserstoffquelle versorgt wird, gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Sauerstoffquelle durch die Zersetzung von Wasserstoffperoxid gebildeten Sauerstoff und als Kohlenstoffquelle und Wasserstoffquelle mindestens ein hochbrennbares Produkt verwendet.

Im allgemeinen wählt man die erfindungsgemäß verwendeten hochbrennbaren Produkte aus den leichten Kohlenwasserstoffen, ihren leichten Sauerstoffderivaten und Mischungen aus Wasserstoff und Kohlenmonoxid und Kohlendioxid aus. Unter hochbrennbaren Produkten sind Produkte zu verstehen, deren Flammpunkt bei oder unterhalb 30⁰C liegt. Von den leichten oder niedrigmolekularen Kohlenwasserstoffen verwendet man insbesondere die Verbindungen, die 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthalten und insbesondere gesättigte Verbindungen, die 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthalten. Als Sauerstoffderivate von leichten Kohlenwasserstoffen, die für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind, verwendet man vorzugsweise Alkohole, die 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten, und insbesondere einwertige, aliphatische, gesättigte Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. Die besten Ergebnisse erzielt man mit Methan, Methanol und Mischungen aus Wasserstoff und entweder Kohlenmonoxid oder Kohlendioxid. Die Mischungen aus Wasserstoff und Kohlenmonoxid enthalten variierende Wasserstoffmengen, die im

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allgemeinen zwischen 30 und 99 Vol.-% und vorzugsweise zwischen 60 und 95 Vol.-% liegen. Die Mischungen aus Wasserstoff und Kohlendioxid enthalten Wasserstoffmengen, die im allgemeinen zwischen 40 und 99 Vol.-% und vorzugsweise zwischen 65 und 95 Vol.-% liegen.

Der Begriff "Kulturmedium" steht für Medien, in denen Mikroorganismen wachsen, in denen sie sich reproduzieren oder in denen beide Maßnahmen gleichzeitig ablaufen.

Im allgemeinen sind die Kulturmedien flüssig und die Mikroorganismen sind in ihnen dispergiert. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es besonders bevorzugt, die · Zersetzung des Wasserstoffperoxids in dem Kulturmedium der Mikroorganismen und damit in Gegenwart der Mikroorganismen zu bewirken.

Die Zersetzung des Wasserstoffperoxids erfolgt unter Verwendung mindestens eines Katalysators, der die Zersetzung des Wasserstoffperoxids begünstigt. Hierbei handelt es sich entweder um normale Bestandteile des Kulturmediums oder um Fremdprodukte, die man dem normalen Kulturmedium zusetzt.

So ist es nicht erforderlich, einen fremden Katalysator zuzusetzen, wenn die Mikroorganismen Produkte enthalten, die die Zersetzung des Wasserstoffperoxids begünstigen. Dies trifft beispielsweise auf gewisse Bakterien und gewisse Pilze zu, die reich an Katalase sind. Jedoch ist die Zugabe geringer Mengen des Katalysators nicht ausgeschlossen. Dies trifft auch dann zu, wenn einer der normalerweise in dem Kulturmedium vorhandenen Nährstoffbestandteile eine katalytische Wirkung auf die Zersetzung des Wasserstoffperoxids ausübt.

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Wenn keiner der Bestandteile des Kulturmediums der Mikroorganismen eine Verbindung enthält, die eine katalytische Wirkung auf die Zersetzung von Wasserstoffperoxid ausübt, gibt man dem Medium einen oder mehrere Katalysatoren zu.

Beispiele für Katalysatoren der Zersetzung von Wasserstoffperoxid sind beispielsweise in dem Buch von W.C. Schumb, CN. Satterfield und R.L. Wentworth, "Hydrogen Peroxide ",A. CS. Monograph Series No. 128, Reinhold Publishing Corp., N.Y., U.S.A. (1955) Seiten 467 bis 501 angegeben. Sowohl organische als auch biologische Verbindungen sind geeignet. Vorzugsweise verwendet man Katalase und Peroxydase, die für ihre hohe Aktivität gut bekannt sind.

Die zu verwendende Wasserstoffperoxidmenge muß in Abhängigkeit von der maximal bei den Züchtungsbedingungen zu erreichenden Geschwindigkeit der Wasserstoffperoxidzersetzung derart ausgewählt werden, daß das Medium keinen Wasserstoffperoxidüberschuß enthält. Diese zulässige Maximalgeschwindigkeit hängt insbesondere von der Art des Katalysators ab.

Wenn der verwendete Katalysator ausreichend wirksam ist, kann die gebildete Menge Sauerstoff größer als die Menge sein, die für das Wachstum der Mikroorganismen erforderlich ist, so daß die zugeführte Wasserstoffperoxidmenge in Abhängigkeit von den Sauerstoffanforderungen der Mikroorganismen derart ausgewählt wird, daß diese Anforderungen erfüllt werden ohne daß sich ein übertriebener Überschuß ergibt. Diese Sauerstoffanforderungen der Mikroorganismen hängen insbesondere von der Art der Mikroorganismen, ihrer Konzentration in dem Kulturmedium und dem als Nährstoffelement verwendeten Substrat ab.

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Die in das Kulturmedium pro Zeiteinheit eingeführte Wasserstoffperoxidmenge variiert üblicherweise zwischen 10 und 10 000 μΜοΙ pro mg der pro Zeiteinheit gebildeten trockenen Mikroorganismen. In Abhängigkeit von der Art des verwendeten MikroroganismenStammes kann man geringere oder größere Wasserstoffperoxidmengen einsetzen. Die Verwendung von an Kohlenstoff und Wasserstoff reichen und an Sauerstoff armen Substraten bedingt einen höheren Sauerstoff verbrauch .

Das Wasserstoffperoxid wird im allgemeinen in Form von Lösungen in einem Lösungsmittel eingesetzt, das mit dem Wasserstoffperoxid und dem Kulturmedium verträglich ist. Üblicherweise verwendet man Wasser als Lösungsmittel. Wenngleich man Lösungen mit stark variierenden Konzentrationen verwenden kann, benützt man vorzugsweise verdünnte Lösungen, die im allgemeinen weniger als 10 Gew.-% und vorzugsweise 0,005 bis 8 Gew.-% Wasserstoffperoxid enthalten. Natürlich machen sehr geringe Konzentrationen großvolumige Vorrichtungen erforderlich. Höhere Konzentrationen sind nicht empfehlenswert, da man das Risiko der lokalen Ansammlung von Wasserstoffperoxid im Fall einer ungenügenden Bewegung vermeiden muß, da hierdurch die Mikroorganismen abgetötet werden können.

Das Wasserstoffperoxid wird vorzugsweise direkt in das Kulturmedium eingebracht. Man kann auch andere Verfahren anwenden, mit denen man den frisch durch die Zersetzung von Wasserstoffperoxid-gebildeten Sauerstoff mit dem Kulturmedium in Kontakt bringt.

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Man kann beispielsweise Wasserstoffperoxid in dem Nährmedium lösen/ bei dem es sich üblicherweise um eine wäßrige Lösung handelt, und die erhaltene Lösung direkt in das Kulturmedium einbringen. Man kann jedoch auch andere Verfahrensweisen anwenden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf die Züchtung sämtlicher strikt oder fakultativ aerober Mikroorganismen anwendbar, die die erfindungsgemäß verwendbaren Substrate zu assimilieren vermögen. Solche Mikroorganismen sind chemotroph,da sie die für die Biosynthese erforderliche Energie aus Fermentationsreaktionen von organischen Verbindungen oder durch Oxidation von organischen oder anorganischen Verbindungen schöpfen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise auf chemoorganotrophe Mikroorganismen angewandt. Mikroorganismen dieser Art umfassen eine große Vielzahl von Bakterien, wie beispielsweise die Mehrzahl der Pseudomonas-und Actinomycesarten, viele Pilze, beispielsweise die Mehrzahl der Phycomyceten und Ascomyceten und davon insbesondere die Saccharomyceten oder Hefen, Protozoen sowie verschiedene Arten von Tierzellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders gut geeignet zur Züchtung von einzelligen Mikroorganismen.

Als Bakterien, für die das erfindungsgemäße Verfahren von besonderer Bedeutung ist, kann man die Bakterien der folgenden Arten nennen: Acetobakter,Acetomonas, Arthrobakter, Brevibakterium, Corynebakterium, Hydrogemonas, Mikrokokkus, Mykobakterium, Nokardia, Pseudomonas, Streptomyces, Vibrio, etc..Als Plize oder Hefen kann man insbesondere die folgenden Arten nennen:Aspergillus, Candida, Kryptokokkoideae, Penicillium, Saccharomyces und Torulopsis etc.

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Die Art der zu züchtenden Mikroorganismen hängt natürlich direkt von der Art des Substrats ab, das man zu verwenden wünscht. Wenn man Methan als Substrat zur Herstellung von Proteinen einsetzen will, verwendet man mit Vorzug Mikro-Organismen vom Typ der Bakterien, wie Pseudomonas. Wenn man als Substrat Methanol verwendet, erzielt man die besten Ergebnisse mit Hefen des Typs Candida oder Bakterien des Typs Pseudomonas. Wenn man als Substrat eine Mischung aus Wasserstoff und Kohlenmonoxid oder Kohlendioxid verwendet, erhält man die besten Ergebnisse mit Bakterien des Typs Hydrogenomonas.

Die Nährmedien, in denen man die Züchtung der Mikroorganismen bewirkt, sind ziemlich komplex und verschiedenartig. Neben dem Substrat und dem Sauerstoff enthalten sie insbesondere eine gewisse Anzahl von mineralischen Nährstoffprodukten, die Elemente wie beispielsweise Stickstoff, Kalium, Calcium, Magnesium, Schwefel und Phosphor enthalten, sowie geringe Mengen anderer Spurenelemente, die für die Entwicklung notwendig sind, wie beispielswiese Zink, Eisen, Kupfer oder Kobalt.

Die Art des Mikroorganismus bestimmt auch die Temperatur und den pH-Wert, bei denen die Züchtung durchgeführt wird. Im allgemeinen liegt die optimale Züchtungstemperatur bei einer großen Zahl von Bakterien bei etwa 37⁰C und bei einer großen Zahl von Pilzen bei etwa 28°C, Gewisse Mikroorganismen erfordern jedoch höhere oder niedrigere Züchtungstemperaturen. Die pH-Werte variieren üblicherweise zwischen 4 und 8, wobei die Bakterien ein optimales Wachstum bei einem pH-Wert von etwa 7 zeigen, während Pilze einen pH-Wert von 4 bis 5 benötigen. Da man im Verlaufe der Züchtung der Mikroorganismen die Bildung verschiedener Produkte beobachtet, die dazu geeignet sind, den pH-Wert

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des Kulturmediums zu modifizieren, ist es häufig erforderlich, dem Medium Puffer oder andere Mittel zuzusetzen, die den pH-Wert auf dem optimalen Wert halten.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durchgeführt werden. Hierzu kann man verschiedenartige Vorrichtungen verwenden. Sie sind im allgemeinen mit Einrichtungen zur Bewegung und zur Steuerung der Temperatur des Kulturmediums versehen, um jedes Ansteigen der Temperatur zu verhindern, das für die Kulturen fatal sein könnte.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Züchtung der Mikroorganismen mit einem ausgezeichneten Wachstumsgrad. Weiterhin ermöglicht es jedes Risiko der Entzündung der verwendeten Substrate auszuschließen.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung und verdeutlichen die bemerkenswerten Ergebnisse, die man gemäß einer Ausführungsform der Erfindung erzielt.

Die im folgenden angegebenen Untersuchungen wurden im Auftrag der Anmelderin von Dr. Bernhard Schink unter Professor Dr. H.G. Schlegel, dem Direktor des Instituts für Mikrobiologie der Universität Göttingen, Grisebachstr. 8, 3400 Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, durchgeführt.

Die Beispiele 1,2 und 3 wurden unter Verwendung von Methanol als Substrat, das Beispiel 4 unter Verwendung einer Mischung aus Wasserstoff und Kohlendioxid als Substrat durchgeführt.

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Beispiel 1

Man beschickt einen Weithals-Erlenmeyerkolben mit 30 ml einer wäßrigen Lösung/ die Mineralverbindungen/ 0,2% Hefeextrakt (DIFCO), 0,5 % Methanol, 0,1 mg/1 Biotin, 1,0 mg/1 Thiamin und 0,09 ml/ml Katalase, d.h. 90 000 internationale Einheiten Katalase enthält.

Der Gehalt der wäßrigen Lösung an Mineralelementen ist der folgende:

1 g/l NH₄Cl

9,0 g/l Na₃HPO₄-12H₂O
1,5 g/l KH₂PO₄
0,2 g/l MgSO₄.7H₂O

5 mg/1 FeNH₄-Zitrat
10 mg/1 CaCl₂-2H₂O

Man impft das Medium mit Hefen des Typs Candida biodinii

in solchen Mengen an, daß die anfängliche optische Dichte der Suspension, die bei 436 nm gemessen wird, 0,7 beträgt.

Dann spült man mit einem sauerstofffreien Stickstoffstrom den freien Raum des Kulturbehälters.

Man hält die Temperatur der Kultur mit Hilfe eines Thermostats bei 30⁰C und bewegt das Kulturmedium mit einem Rührer, der bei'100 min betrieben wird.

Man bringt eine 0,3 prozentige wäßrige Wasserstoffperoxidlösung in einer Menge von 2,5 ml pro Stunden (Versuch 1) bzw. in einer Menge von 5 ml pro Stunde (Versuch 2) in das

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Medium ein. Mit Hilfe einer in das Medium eingetauchten Sauerstoffelektrode bestimmt man den Gehalt an freiem Sauerstoff.

Alle Stunden entnimmt man eine Probe des Kulturmediums und berechnet die Zunahme des Gewichts der anfänglich eingesetzten Mikroorganismen durch die Bestimmung der optischen Dichte der entnommenen Proben.

Bei beiden Versuchen beträgt die Zeit zur Verdopplung des Gewichts der Mikroorganismen 3,5 Stunden. Das exponentielle Wachstum wurde während 7 Stunden fortgesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 1 (Kurven 1 und 2) dargestellt, in denen auf der Abszisse χ die Zeit in Stunden und auf der Ordinate y die optische Dichte aufgetragen sind.

Zu Vergleichszwecken wird ein Versuch (Versuch 3R) durchgeführt, bei dem kein Wasserstoffperoxid und keine Katalase zugegeben werden, während sämtliche anderen Bedingungen identisch mit den Bedingungen der Versuche 1 und 2 sind. Hierbei ist kein Wachstum der Mikroorganismen festzustellen. Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Fig. 1 aufgeführt (Kurve 3R).

Zu Vergleichszwecken wurde ein weiterer Versuch (4R) ohne die Zugabe von Wasserstoffperoxid und Katalase durchgeführt. Der freie Raum des Kulturbehälters wird mit einem Luftstrom in einer Menge von 0,5 1 pro Minute durchströmt. Die übrigen Bedingungen sind identisch mit denen der Versuche 1,2 und 3R. Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Fig. 1 dargestellt (Kurve 4R).

Die Untersuchung der in der Fig. 1 dargestellten Ergebnisse zeigt, daß der Ersatz des Sauerstoffs durch Wasserstoffperoxid das Wachstum der Hefe des Typs Candida biodinii nicht modifiziert.

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Beispiel 2

Man beschickt einen 1 Liter-Weithals-Erlenmeyerkolben mit 200 ml einer wäßrigen Lösung/ die die gleichen Mineralverbindungen in den gleichen Mengenverhältnissen/ wie sie in Beispiel 1 angegeben sind/ sowie 0,5 % Methanol, 0,1 mg/1 Biotin, 1,0 mg/1 Thiamin, 0,63 ml Katalase und 0,2 % Hefeextrakt (DIFCO) enthält.

Dann impft man das Medium mit Hefen des Typs Candida biodinii in solchen Mengen an, daß die anfängliche optische Dichte der Suspension, die man bei 436 nm mißt, 3,9 beträgt.

Man hält die Temperatur der Kultur mit Hilfe eines Thermostaten bei 30⁰C und bewegt das Kulturmedium mit einem Rührer, der bei 800 min" betrieben wird.

Man versetzt das Medium mit einer vierprozentigen wäßrigen Wasserstoffperoxidlösung in einer Menge von 3,8 ml/h und schließlich von 5,4 ml/h (Versuch 5). Mit Hilfe einer in das Medium eingetauchten Sauerstoffelektrode wird es möglich, den Gehalt an freiem Sauerstoff bei 2 mg Sauerstoff pro Liter zu halten.

Alle Stunde überprüft man in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise die Entwicklung des Gewichts der Mikroorganismen.

Die Zeit, die Zur Verdopplung des Gewichts der Mikroorganismen erforderlich ist, beträgt 4,8 Stunden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig.2 (Kurve 5) dargestellt,

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in der χ und y die bezüglich der Fig. 1 angegebenen Bedeutungen besitzen.

Es wurden 2 Vergleichsversuche in dem gleichen Medium wie dem für den Versuch 5 verwendeten durchgeführt, wobei jedoch in Abwesenheit von Wasserstoffperoxid und Katalase unter Spülen mit Stickstoff (Versuch 6R) bzw. unter Spülen mit Luft (Versuch 7R) gearbeitet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Fig. 2 als Kurven 6R und 7R angegeben.

Die Untersuchung der in der Fig. 2 dargestellten Ergebnisse zeigt eine leichte Überlegenheit der Wirksamkeit von Wasserstoffperoxid im Vergleich zu Sauerstoff bezüglich des Wachstums der Mikroorganismen.

Beispiel 3

Man beschickt einen 1 Liter-Weithals-Erlenmeyerkolben mit 200 ml einer wäßrigen Lösung, die die gleichen anorganischen Verbindungen in den gleichen Verhältnissen, wie sie in Beispiel 1 angegeben sind, sowie 1,0 % Methanol, 0,1 mg/1 Biotin und 0,63 ml Katalase enthält.

Man impft das Medium mit Pseudomonas des Stammes Finn an.

Die angewandten Bedingungen sind identisch mit denen von Beispiel 2, Versuch 5. Die vierprozentige wäßrige Wasserstoffperoxidlösung wird dem Medium in einer Menge von 3,5 ml pro Stunde zugesetzt (Versuch 8). Mit Hilfe einer in das Medium eingetauchten Sauerstoffelektrode wird es möglich, den Gehalt an freiem Sauerstoff bei 2 mg Sauerstoff pro Liter zu halten.

Die Zeit zur Verdopplung des Gewichts der Mikroorganismen beträgt etwa 5 Stunden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in

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der Pig. 3 dargestellt, in der χ und y die bezüglich der Fig. 1 angegebenen Bedeutungen besitzen.

Es wurden 2 Vergleichsversuche in dem gleichen Medium, wie es für den Versuch 8 benützt wurde, durchgeführt, wobei jedoch in Abwesenheit von Wasserstoffperoxid und Katalase und unter Spülen mit Stickstoff (Versuch 9R) bzw. unter Spülen mit Luft (Versuch 10R) gearbeitet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 3 als Kurven 9R bzw. 10R dargestellt.

Die in der Fig. 3 dargestellten Ergebnisse lassen eine geringfügige Überlegenheit der Wirksamkeit des Wasserstoffperoxids im Vergleich zu der von Sauerstoff hinsichtlich des Wachstums der Mikroorganismen erkennen.

Beispiel 4

Man beschickt einen Weithals-Erlenmeyerkolben mit 200 ml einer wäßrigen Lösung, die die gleichen anorganischen Verbindungen in den gleichen Verhältnissen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind, und 0,45 ml Katalase enthält.

Man impft das Medium mit einem Bakterienstamm des Typs

-4 Alcaligenes eutrophus (= Hydrogenomonas) H16 mutante PHB an.

Dann spült man den freien Raum des Kulturbehälters mit einem Gasstrom, der 90 % Wasserstoff und 10 % Kohlendioxid enthält.

Die Temperatur der Kultur wird mit Hilfe eines Thermostaten bei 30⁰C gehalten, wobei man das Kulturmedium mit einem Rührer rührt, der mit einer Drehzahl von 800 min" betr: wird.

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Man führt in das Medium eine 4,8 prozentige Wasserstoffperoxidlösung in einer Menge von 2ml pro Stunde ein (Versuch 11). Mit Hilfe einer in das Medium eingetauchten Sauerstoffelektrode kann man den Gehalt an freiem Sauerstoff bestimmen.

Alle Stunde entnimmt man eine Probe des Kulturmediums und berechnet die Gewichtsentwicklung der anfänglich eingesetzten Mikroorganismen durch Messen der optischen Dichte der entnommenen Proben.

Die Zeit, die zur Verdopplung des Gewichts der Mikroorganismen notwendig ist, beträgt etwa 5 Stunden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 1 (Kurve 11) dargestellt, in der χ und y die gleichen Bedeutungen besitzen, wie sie bezüglich der Fig. 1 definiert wurden.

Weiterhin wurde ein Vergleichsversuch (Versuch 12R) in dem gleichen Medium, wie dem bei Versuch 11 verwendeten, durchgeführt, wobei jedoch in Abwesenheit von Wasserstoffperoxid und Katalase und unter Spülen mit einem Gasstrom, der 70 % Wasserstoff, 10 % Kohlendioxid und 20 % Sauerstoff enthält, gearbeitet wird. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Fig. 4 als Kurve 12R angegeben.

Die in der Fig. 4 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß der Ersatz des Sauerstoffs durch Wasserstoffperoxid bezüglich der Züchtung des Alkaligenes/eutrophus H16 PHB~ im wesentliehen die gleichen Ergebnisse liefert.

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Claims

Patentanwälte Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl.-Phys. Dr.K. Fincke Dipl.-In'g. F. A-Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr.-Ing.H.Liska 8 MÜNCHEN 86, DEN POSTFACH 860 820 MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 3921/22 Case INT. 76/7 INTEROXx rue du Prince Albert, 33, B - 1050 Brüssel, Belgien Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen. Patentansprüche

1. Verfahren zur Züchtung von aeroben Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das mit mindestens einer Sauerstoff quelle, mindestens einer Kohlenstoffquelle und mindestens giner Wasserstoffquelle versorgt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als Sauerstoffquelle Sauerstoff, der durch die Zersetzung von Wasserstoffperoxid gebildet worden ist,und als Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle mindestens ein hochbrennbares Produkt verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle leichte Kohlenwasserstoffe, deren leichte Sauerstoffderivate und/oder Mischungen aus Wasserstoff und Kohlenmonoxid und Kohlendioxid verwendet.

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ORSGINAL INSPECI

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle einen leichten Kohlenwasserstoff verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle einen gesättigten Kohlenwasserstoff, der 1 bis 8 Kohlenstoffatome enthält, verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß man als Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle Methan verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man als Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle ein leichtes Sauerstoffderivat eines leichten Kohlenwasserstoffs verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle einen einwertigen, gesättigten, aliphatischen Alkohol, der 1 bis 4 Kohlenstoff atome enthält, verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß man als Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle Methanol verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlenstoff- und Wasserstoffquelle eine Mischung aus Wasserstoff und Kohlendioxid verwendet, die 40 bis 99 Vol.-? Wasserstoff enthält.

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10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zersetzung des Wasserstoffperoxids in dem Kulturmedium bewirkt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man das Wasserstoffperoxid direkt in Form einer wäßrigen Lösung in das Kulturmedium einbringt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung verwendet, die mindestens 10 Gew.-% Wasserstoffperoxid enthält.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zersetzung des Wasserstoffperoxids unter Verwendung eines die Zersetzung des Wasserstoffperoxids begünstigenden Katalysators bewirkt.

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