DE2002200C3

DE2002200C3 - Zweistufiges biotechnisches Verfahren zur Züchtung einer L-Asparaginase-reichen Bakterienzellmasse

Info

Publication number: DE2002200C3
Application number: DE19702002200
Authority: DE
Inventors: Günter Dr.rer.nat; Gramsall Johanna; 8132 Tutzing Holz
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Filing date: 1970-01-19
Publication date: 1977-12-29

Description

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Die L-Asparaginase, ein hydrolytisch wirksames Enzym, das L-Asparagin in Asparaginsäure und Ammoniak spaltet, findet sich in tierischen und pflanzlichen Geweben und Körperflüssigkeiten sowie in. verschiedenen Mikroorganismen. Besonders bemerkenswert ist das Vorkommen einer L-Asparaginase im Meerschweinchenserum, die einen inhibierenden Effekt auf verschiedene transplantierbare Mäuse- und Ratten-Lymphomas aufweist. Sie zeigt auch eine hohe Aktivität gegenüber gewissen leukämischen Zellen beim Menschen. Gleiches ist bekannt bei L-Asparaginasen aus E. coli und einigen anderen Mikroorganismen, wie Serratia marcescens und Erwinia carotovora. Demzufolge werden allenthalben Bemühungen zur Entwicklung optimaler Verfahren zur Deckung des entsprechenden Bedarfs an L-Asparaginase-Präparaten mit antileukämischer Wirksamkeit berichtet.

So ist aus der DT-OS 19 04 330 ein Verfahren bekannt, bei dem ein Mikroorganismus der Genus Serratia bei einer auf einen zum Wachstum des Mikroorganismus ausreichenden Wert begrenzten Belüftung in einem wäßrigen Nährmedium kultiviert wird, welches höchstens 1 Gew.-°/o einer Kohlenstoffquelle enthält Aus der DT-OS 19 04 850 ist ein Verfahren zur Züchtung von L-Asparaginasereichein E. coli bekannt, bei dem die Züchtung in einem glycerinhaltigen Nährrnerlium durchgeführt wird, welches gegebenenfalls noch mit Pankreasferment abgebautes Casein oder Sojabohnenmehl, Natriumchlorid und Dikaliumphosphat enthält. Aus der USA.-Patentschrift 34 40142 ist ein Verfahren bekannt, bei dem E. coli unter heftiger Belüftung 18 Stunden bei 37° C auf einem Medium gezüchtet wird, welches Dextrose, Pepton, Hefeextrakt sowie Kaliumphosphate enthält.

Ferner sind diskontinuierliche Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase durch aerobes Züchten von verschiedenen Mikroorganismen bekannt, bei welchem in größerem Maßstab mit 60-1-Fermentern in 35 Stunden Züchtungsdauer maximal eine Asparaginase-Aktivität von 3,13 U/ml erzielbar ist. Ferner ist aus der DT-OS 19 27118 ein diskontinuierliches einstufiges Verfahren bekannt, welches in einem 400 1 Ansatz bei etwa 12- bis 18stündiger Fermentation etwa 2,95 lU/ml L-Asparaginase liefert. Es hat sich jedoch gezeigt, daß dies nur bei hohem analytischen Aufwand möglich ist und die Behandlung des dabei verwendeten Hauptrohstoffes Maisquellwasser sehr arbeitsintensiv ist.

In der US-PS 35 42 647 wird schließlich auf ein bekanntes Verfahren hingewiesen, bei welchem eine zweistufige Fermentierung durchgeführt wird, die aus einem kurzen aeroben Wachstum und einem 20minütigen anaeroben Altern bei Raumtemperatur besteht. Hierbei handelt es sich nicht um eine echte zweistufige Fermentation, sondern um eine normale aerobe Fermentation mit anschließender kurzer anaerober Alterung. Diesem Verfahren ist wie allen anderen obenerwähnten bekannten Verfahren der Nachteil gemeinsam, daß die Züchtung zu relativ niedrigen Ausbeuten en Asparaginase im geernteten Mikroorganismus führt. Teilweise sind diese Verfahren auch recht arbeitsaufwendig. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß die Verfahren nicht zur kontinuierlichen Züchtung geeignet sind.

Es besteht daher ein Bedarf nach einem Züchtungsverfahren für Mikroorganismen, welches den Gehalt an der gewünschten L-Asparaginase steigert. Gewünscht ist außerdem ein Verfahren, welches sich kontinuierlich durchführen läßt.

Diese Nachteile werden durch die Erfindung überwunden.

Bei kinetischen Untersuchungen des Züchtungsverlaufes in Batch-Kultur unter bestimmten Bedingungen wurde ein zweiphasiges Wachstum der Mikroorganismen beobachtet, welches sich in einem scharfen Knick in der linearen Kurve bemerkbar macht, die man erhält, wenn in bekannter Weise die natürlichen Logarithmen der zugewachsenen Zellmassen über der Zeit aufgetragen werden. Überraschend wurde hierbei gefunden, daß je nach den Versuchsbedingungen nach 3- bis 5stündigem anfänglich rapidem Wachstum eine deutliche Verlangsaniung des Zuwachses stattfindet Erst in der zweiten Phase treten beachtliche L-Asparaginasemengen auf, während sich in der ersten Phase reichliche Mengen intrazellulären Asparagine bilden, das in der Phase 2 stark abnimmt.

Das erfindi'ngsgemäße zweistufige biotechnische Verfahren zur Herstellung einer L-Asparaginase-reichen Bakterienzellmasse ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien zuerst unter starker Belüftung in dem Essigsäure und/oder Glutaminsäure enthaltenden Nährmedium bei pH 7 bis pH 8,5 wachsen läßt bis der

Knickpunkt der logarithmischen Wachstumskurve erreicht ist, und daß nach Erreichen des Knickpunktes in Hungerphase weitergearbeitet wird, indem das Wachstumsmedium unter Aufrechterhaltung des μΗ-Wertes an Sauerstoff verarmt und gleichzeitig nicht weiter mit Nährstoff ergänzt wird, abgesehen von zur pH-Wertregelung gegebenenfalls zugesetzter Essigsäure.

Wichtig ist, daß in der ersten Phase stark belüftet, also viel Sauerstoff zugeführt wird. Für die außerordentlichen Syntheseleistungen des Organismus muß genügend intrazelluläres Adenosintriphosphat als Energiedonator gebildet werden.

Ein Zusatz von Glucose wirkt sich überraschenderweise nachteilig aus, auch ein Glycerinzusatz ist nicht erwünscht.

Im Verlauf der Züchtung ist ein Anstieg des pH-Wertes festzustellen, so daß vorzugsweise zur pH-Konstanthaltung Säuren zugegeben werden. Die bevorzugt verwendete Essigsäure wirkt hierbei als sich selbst verbrauchendes Neutralisationsmittel. Milchsäure erwies sich ebenfalls als geeignet, führt jedoch nicht zu den mit Essigsäure erzielbaren Enzymmengen.

Nach Erreichen des Knickpunktes der Wachstumskurve beginnt die zweite Phase des erfindungsgemäßen Verfahrens, die sogenannte Hungerphase. In dieser Hungerphase wird an Sauerstoff verarmt und gleichzeitig der bereits abgemagerte Nährboden nicht weiter ergänzt. Der pH-Wert wird jedoch auch in der zweiten Stufe konstant gehalten.

Das Wachstumsmedium enthält auch Aminosäuren, insbesondere solche aus der sogenannten Asparaginsäurefamilie, zweckmäßig als Eiweißhydrolysat. Sie werden zweckmäßig in solcher Menge zugesetzt, daß keine zu hohe Populationsdichte in der Zellbrühe erhalten wird. Werden zu viel Aminosäuren zugesetzt, so wird die Wachstumsbrühe zu dick und schäumt. Die geeignete Aminosäurekonzentration läßt sich leicht feststellen, da im Bereich des Knickpunktes der erwähnten Wachstumskurve diese Aminosäuren verbraucht sind.

In der Fig. wird die erwähnte Wachstumskurve dargestellt. Sie gibt die Bakterientrockenmassen in natürlichen Logarithmen über der Zeit an. Man erkennt deutlich, daß bei etwa knapp 5 Stunden die durch eine Gerade darstellbare Wachstumskurve einen scharfen Knick aufweist und sich mit einer zweiten Wachstumskurve schneidet.

Dieses physiologische Verhalten der Kulturen ermöglicht die Kultivierung von optimal L-Asparaginase-haltigen Zellmassen. Dies ist erfindungsgemäß im Batch-Betrieb möglich, erfordert hierbei jedoch entsprechenden Aufwand an Überwachung. Dies läßt sich vermeiden unter Erzielung eines optimalen Betriebes durch kontinuierliche Züchtung.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung besteht daher darin, daß kontinuierlich gearbeitet wird, indem einem ersten stark belüfteten Fermenter soviel frisches Nährmedium zugeführt wird, daß die Bakteriendichte konstant und nahe dem Wert des kritischen Punktes der Wachstumskurve (Schnittpunkt der beiden Garaden) gehalten wird und gebildete Zellbrühe in gleicher Menge einem zweiten größeren Fermenter zugeführt wird, dessen Zellbrühgehalt so bemessen ist, daß bei konstantem Volumen die Bakteriendichte konstant und über dem Wert des ersten Fermenters gehalten wird.

Die kontinuierliche Kultur bildet ein offenes System, das im Fließgleichgewicht steht. Bei einer kontinuierlichen Kultur werden die Milieubedingungen konstant gehalten, und die Anlage läßt sich damit leicht automatisieren. Der die statische Kultur (Batch-Kultur) beherrschende Zeitfaktor mit Anlaufphase, exponentieller Wachstumsphase und stationärer Phase, der sich die Absterbephase anschließt, wird bei der kontinuierlichen Kultur ausgeschaltet. Die Bedingungen des Fließgleichgewichtes lassen sich aus der Wachstumskurve errechnen:
Veränderung der Bakteriendichte = Wachstum —

ίο Auswachsrate = 0 bzw. in mathematischer Formulierung

dX
dt

= „X - DX = 0 .

Sind also in dieser Differentialgleichung die Wachstumsrate μ und die Verdünnungsrate D einander gleich, so ergibt sich, daß die Bakteriendichte X im Kulturgefäß bzw. Fermenter konstant bleibt. Die exponentiell Vermehrung der Zellen wird durch den negativ exponentiellen Vorgang der Auswäschung kompensiert, μ (l/h) ist die spezifische Wachstumsrate und D(Mh) stellt die Verdünnungsrate, Fließgeschwindigkeit F(l/h) dividiert durch Arbeitsvolumen V(I) dar, d. h., D gibt den Volumenwechsel pro Stunde an. Für den in der beigefügten Zeichnung dargestellten Fall der Wachstumskurve ergibt sich hieraus:

Π. D = μ = tg(/„ =

°'⁷⁴

,It

HnX 0,29

At

= 0,375 ,

= 0,058.

Die obigen Gleichungen für die beiden Stufen des erfindungsgemäßen kontinuierlichen Verfahrens ergeben also, daß man in der gewählten Ausführungsform in der 1. Stufe mit großer Verdünnungsrate D arbeitet und diese in der II. Stufe entsprechend verkleinert. Erfindungsgemäß wird dies bei gleicher Fließgeschwindigkeit F durch Anwendung entsprechender Arbeitsvolumina Verreicht.

In der I. Stufe des kontinuierlichen Verfahrens wird vorzugsweise turbidostatisch gearbeitet, d.h. unter Konstanthaltung einer bestimmten Bakteriendichte oder Trübung bei einer Verdünnungsrate mit maximalem Bakterienertrag. Als Arbeitspunkt der Bakteriendichte dient der Schnittpunkt der beiden logarithmischen Kurven, entsprechend dem Knick in der Figur.
Die so erhaltene Bakterienkultur wird nun dem zweiten Fermenter zugeführt, dessen Arbeitsvolumen so bemessen ist, daß bei gleicher Fließgeschwindigkeit (l/h) die errechnete niedrige Verdünnungsrate erzielt wird. In diesem zweiten Fermenter reift die Kultur unter Bildung der hohen L-Asparaginaseaktivität. Das Verfahren wird bei konstanten pH-Werten durchgeführt. Die pH-Werte liegen zwischen 7 und 8,5, vorzugsweise zwischen 7,5 und 7,8. Zweckmäßig wird der pH-Wert in beiden Verfahrensstufen getrennt reguliert. Diese pH-Wertregulierung erfolgt vorzugsweise durch Essig-Säurezusatz.

Die in der Zeichnung dargestellte Wachstumskurve gilt für E. coli. Bei Verwendung eines anderen Mikroorganismus ändern sich die Winkel φ' und φ" etwas, wie sich durch Versuche ohne weiteres feststellen läßt. Das Prinzip bleibt jedoch in jedem Falle gleich und beruht darauf, daß eine starke Bildung von L-Asparaginase immer erst in der Hungerphase, d. h. im zweiten Ast der Wachstumskurve stattfindet.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet eine erhebliche Steigerung des L-Asparaginasegehalts in den Mikroorganismen. Im Batch-Verfahren wurden hierbei Werte bis zu 1,5 internationale Einheiten pro mg Protein erreicht. Als eine Einheit ist hierbei diejenige Menge definiert, die in einer Minute aus Asparagin ΙμΜοΙ Ammoniak freisetzt unter den gegebenen Testbedingungen. Bezogen auf das Volumen liegen die erzielbaren Aktivitäten bei 3 IU/ml. Demgegenüber werden für das Verfahren der DT-OS 19 04 330 maximal 0,66 I U/mg Protein und für das Verfahren der DT-OS 19 04 850 maximal 1,62 IU/ml angegeben. Erfindungsgemäß wird also eine Ausbeutesteigerung um mindestens 100% erzielt.

Beispiel 1

Es wird eine Anlage verwendet, die zwei Fermenter enhält. Das Arbeitsvolumen des ersten beträgt 201, das des zweiten 801. Die Fermenter sind mit Belüftungseinrichtung und Rührern ausgerüstet. Die Füllung des ersten Fermenters beträgt 10 !,die des zweiten 601.

In einem gesonderten Behälter werden 7501 eines Nährmediums folgender Zusammensetzung hergestellt und sterilisiert:

Essigsäure 0,5%

Glutaminsäure 0,3%

Hefeextrakt 0,1% Eiweißhydrolysat (hoher Gehalt an

Methionin, Threonin, Alanin und Lysin) 2,0% geringe Mengen Phosphat

Die Substanzen werden in der angegebenen Menge Leitungswasser gelöst, der pH-Wert mit KOH auf 7,0 gestellt und die Lösung sterilisiert.

Zunächst werden 601 des Nährmediums im zweiten Fermenter mit einer Impfkultur von E. coli MRE 600 beimpft, die gesondert als Schüttelkultur auf gleichem Nährboden in 15 Stunden herangezogen wurde. Diese Kultur wird 10 Stunden ohne äußeren Zufluß durch kräftige Belüftung (600 1 Luft pro Stunde) anwachsen gelassen. Der pH-Wert des Fermentationsmediums beträgt nun 7,2. Nun werden 101 der erhaltenen Kulturbrühe in den ersten Fermenter eingeführt. Durch Trübungsmessung wird festgestellt, ob der kritische Punkt in der Wachstumskurve schon erreicht ist. Sobald dies der Fall ist, wird mit dem Pumpen frischer Nährlösung begonnen. Gleichzeitig wird kräftig belüftet (6001 pro Stunde). Bei einer mittleren Fließgeschwindigkeit von 31 Nährlösung pro Stunde lassen sich in 230 Stunden 6901 vollautomatisch durchsetzen. Bei den gewählten Arbeitsvolumina ergibt sich damit für die 1.

Stufe eine Verdünnungsrate D von 0,3, in der II. Stufe von 0,05. Man gewinnt einen Ausstoß mit einer L-Asparaginaseaktivität von 2800 bis 3000 lU/l und einer spezifischen Aktivität (IU/mg Protein) zwischen 1,3 und 1,5. Die Ausbeute beträgt 4 bis 4,5 g

ίο Bakterientrockenmasse pro 1. Die Kulturlösung wird in einem kühlbaren Lagerbehälter gesammelt und die Bakterienmasse daraus auf einer Durchlaufzentrifuge abgetrennt. Die pH-Wertregelung wird in der 1. und II. Stufe getrennt durchgeführt, wobei insgesamt pro

ι s Stunde etwa 10 g 100%ige Essigsäure benötigt werden.

Beispiel 2

Auf dem in Beispiel 1 angegebenen Nährboden wurde Serratia marcescens ATCC 60 in einem 2,5-1-Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Unter kräftiger Belüftung wurde 23 Stunden gezüchtet, anschließend 20 Minuten anaerob altern gelassen. Man erhielt so 3000 lU/l Kulturlösung bei einem Trockenmassegehalt von 2 g/l. Hieraus ergeben sich 1500 lU/g Bakterientrockenmasse mit einer spezifischen Aktivität zwischen 2,8 und 3,3 IU/mg Protein.

Beispiel 3

Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren und unter den dort angewendeten Bedingungen wurde Serratia marcescens ATCC 60 gezüchtet. Die mittlere Fließgeschwindigkeit betrag 3,41 Nährlösung pro Stunde. Die L-Asparaginase-Aktivität im Produkt betrug 6500 bis 7000 IU/1. Der Trockenmassegehalt betrug 2 g/l. Hieraus ergeben sich 3250 bis 3500 lU/g Bakterientrockenmasse sowie eine spezifische Aktivität von 4,5 bis 5 IU/mg Protein.

Beispiel 4

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde unter Verwendung von Serratia marcescens ATCC 60 wiederholt. Dem Nährboden wurden jedoch zusätzlich 1% Glutaminsäure zugegeben. Der Durchsatz betrug 5 1 Nährlösung pro Stunde. Man erhielt so eine L-Asparaginase-

Aktivität von 24 000 IU/1 bei 6 g Bakterientrockenmasse pro 1. Dies entspricht einer Aktivität von 4000 lU/g Bakterientrockenmasse mit einer spezifischen Aktivität von 5 IU/mg Protein.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

if

Patentansprüche:

J. Zweistufiges biotechnisches Verfahren zur Herstellung einer L-Asparaginasereichen Bakterienzellmasse, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bakterien zuerst unter starker Belüftung in dem Essigsäure und/oder Glutaminsäure enthaltenden Nährmedium bei pH 7 bis pH 8,5 wachsen läßt, bis der Knickpunkt der logarithmischen Wachstums- ι ο kurve erreicht ist, und daß nach Erreichen des Knickpunktes in Hungerphase weitergearbeitet wird, indem das Wachstumsmedium unter Aufrechterhaltung des pH-Wertes an Sauerstoff verarmt und gleichzeitig nicht weiter mit Nährstorf ergänzt wird, abgesehen von zur pH-Wertregelung gegebenenfalls zugesetzter Essigsäure.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß kontinuierlich gearbeitet wird, indem einem ersten stark belüfteten Fermenter soviel frisches Nährmedium zugeführt wird, daß die Bakteriendichte konstant und nahe dem Wert des Knickpunktes der logarithmischen Wachstumskurve gehalten wird und gebildete Zellbrühe in gleicher Menge einem zweiten größeren Fermenter zügeführt wird, dessen Zeilbrühgehalt so bemessen ist, daß bei konstantem Volumen die Bakteriendichte konstant und über dem Wert des ersten Fermenters gehalten wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Arbeitsvolumen des zweiten Fermerters das 3- bis 1Ofache, vorzugsweise 5- bis 7fache, des ersten Fermenters beträgt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man E. coli einsetzt und in erster bzw. zweiter Stufe eine Verdünnungsrate von 0,3 bzw. 0,05 anwendet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert durch Essigsäurezusatz konstant gehalten wird.