DE578820C

DE578820C - Verfahren zur Herstellung von Citronensaeure durch Gaerung

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Publication number: DE578820C
Application number: DEM102852D
Authority: DE
Original assignee: MONTAN und INDUSTRIALWERKE VOR
Current assignee: MONTAN und INDUSTRIALWERKE VOR
Priority date: 1927-12-16
Filing date: 1928-01-03
Publication date: 1933-06-17
Also published as: BE349476A; US1779001A; NL30153C; GB302338A

Description

Es ist bekannt, daß bestimmte Schimmelpilze aus den Gruppen Aspergillus, Citromyces, Mucor, Penicillium u. a. imstande sind, aus einer nährstoffhaltigen Zuckerlösung größere Mengen Citronensäure zu bilden und anzuhäufen. Diese Beobachtung (mit Citromyces) geht auf Wehmer (1893) zurück, der auch das erste diesbezügliche Patent (72 957 vom 20. Februar 1894) erhielt. Wehmer arbeitete mit einer Penicilliumart, die er dann als Citromyces bezeichnete. In der Patentschrift 91 891 vom 13. April 1897 ferner ließen sich die Fabriques de produits de Thann et de Mulhouse die Vergärung von Zucker auf Citronensäure mit Hilfe von Mucor piriformis patentieren, B.Zahorski erkannte die citronensäuregärende Wirkung von Sterigmatocystis nigra, einer Aspergülusart, die er sich im amerikanischen Pat. 1066358 vom i. Juli 1913 schützen ließ. Spätere Untersuchungen zeigten, daß die Eigenschaft, Citronensäure aus Zucker unter bestimmten Bedingungen zu bilden, den schwarzen Aspergillusarten, dem Aspergillus niger, allgemein zukommt, und zwar übertreffen diese Pilze die anderen früher genannten bei günstigen Bedingungen um ein Mehrfaches. In der letzten Zeit ist diese Citronensäuregärung Gegenstand vieler wissenschaftlicher Arbeiten -geworden, von welchen hier auf die neuesten Arbeiten, welche auch die Ergebnisse der alten Arbeiten

erwähnen bzw. kritisch besprechen, hingewiesen sei.

(J.N.Curie: »The citric acid fermentation of Aspergillus niger.« The Journal of the Biological Chemistry, Bd. XXXI (1917), S. 15—37. —K. Bernhauer: »Über die Säurebildung durch Aspergillus niger I-III.« Biochemische Zeitschrift Bd. 172 (1926), S. 296—349. — H. Amelung: »Beiträge zur Säurebildung durch Asper- ■■;■ gillus niger«. Hoppe-Seilers Zeitschrift für physiologische Chemie, Bd. 116 (1927), S. 161 bis 209).

Aus dieser Literatur ergibt sich etwa das folgende Bild über den derzeitigen Stand unserer Kenntnisse über die Citronensäuregärung:

Als Gärsubstrat eignet sich Rohrzucker, aber auch Maltose, Invertzucker, Glucose und andere Zuckerarten und Zuckeralkohole mit 3,5 und 6 C-Atomen. Dazu kommen Nährsalze, und zwar anorganische Stickstoffverbindungen (Ammonsalze oder Nitrate), ferner Kalisalze, Phosphorsäure, Schwefel, Magnesiumsalze und Kalksalze, gegebenenfalls neben Spuren von stimulierend wirkenden Schwermetallsalzen.

Eine ziemlich hohe Bedeutung wird dem Stickstoffgehalt der Gärflüssigkeit beigemessen, obzwar die Ergebnisse der verschiedenen Arbeiten nicht übereinstimmend sind. Im allgemeinen folgert man aber, daß relativ hohe Stickstoffmengen im Gärmedium starkes Mycelwachstum

geben und daher hohen Zuckeraufwand für Mycelaufbau und schlechte Citronensäureausbeute zur Folge haben. Manche Autoren machen überhaupt Stickstoffhunger für gute Citronensäureausbeute verantwortlich. Curie hält die nachstehende Zusammensetzung der Lösung für die Vornahme der Citronensäuregärung mit Aspergillus niger in iooo cm³ für die günstigste:

xo Saccharose .'. 125 bis 150 g

NH₄NO₃ 2 - 2,5 -

KH₂PO₄ o,75 - 1.0 -

MgSO₄-7 H₂O 0,20 - 0,25-

angesäuert mit Salzsäure (5—4 cm³ n/5 HCl) bis zu einer anfänglichen Acidität von Ph 3,4 bis 3.5·

Die Temperatur, bei der die Gärung vor sich geht, liegt je nach den angewendeten Schimmeiao pilzen zwischen 10 und 40 ° C.

Neben den bereits einleitend erwähnten Patentschriften beschäftigen sich mit der Durchführung der Citronensäuregärung noch die nachstehenden Patentschriften: Osterr. Patentschrift 101 009 (vom 28. Februar 1925, Dr. Josef Szuecs, s. auch deutsche Patentschrift 461356), laut welchen besonders ausgewählte Stämme der tauglichen Schimmelpilze Melasse als Nährlösung vergären; Patentschrift 426 926 (vom 29. März 1926, Dr. Richard Falck), welches als Gärsubstrat stärkeenthaltende feste Substrate verwendet, und englische Patentschriften 266 414 und 266415 (vom 28. Februar 1927, Auguste Fernbach, John Lewis Yuil andBowntree und Co. Ltd.), nach welchen Lösungen von Saccharose oder Zuckerarten mit anfänglicher hoher Acidität, die durch Zusatz von starken Säuren herbeigeführt wird, vergoren werden.

Wie man sieht, wurde es bereits angestrebt, den Vorgang der Citronensäuregärung zu einem gesicherten, wirtschaftlichen, technischen Verfahren auszugestalten. Dies ist auch der Zweck der vorliegenden Erfindung.

Um die gewerbsmäßige Darstellung der Citronensäure wirtschaftlich auszubilden, ist es notwendig, neben der zweckmäßigen Auswahl eines billigen Rohstoffes den Vorgang so zu gestalten, daß der Zucker in möglichst hoher Ausbeute zu Citronensäure umgesetzt wird, daß die gebildete Citronensäure nicht weiter abgebaut wird, daß die Verarbeitung des Zuckers zu Citronensäure möglichst rasch vor sich geht, also in hoher Zeitausbeute, und daß die Herstellung der Citronensäure in derartigen technischen Einrichtungen vor sich gehen kann, daß für die Einheit des aufgewendeten Investitionskapitals die Ausbeute an Citronensäure eine möglichst hohe wird. Diesen wirtschaftlichen Momenten muß vorausgestellt werden die Forderung der dauernden Sicherheit und Gleichmäßigkeit der Betriebsausbeuten. Hier spielt die Auswahl und die Dauererhaltung des Pilzes mit gärgünstigen Eigenschaften die wichtigste Rolle.

Bei der technischen Erzeugung von Citronensäure durch Gärung müssen daher zwei voneinander grundsätzlich verschiedene Vorgänge unterschieden werden, und zwar einerseits die Züchtung des Pilzes, andererseits die großtechnische Gärung selbst. Die Aufgabe des ersten Teilvorganges ist es, die für die Aussaat bei der technischen Gärung benötigten Pilzsporen in den notwendigen Mengen zu erzeugen. Wenn es auch nicht ausgeschlossen erscheint, daß man zur Aussaat für eine neue Gärung den bei der vorangegangenen beendeten Gärung gewachsenen Pilz mit seinen gebildeten Sporen benutzen kann, so wird man es aus Gründen der Sicherheit des Gärbetriebes wohl vorziehen, die Züchtung von der technischen Gärung vollkommen getrennt vorzunehmen. Die Züchtung wird unter strengsten Bedingungen der Sterilität im Laboratorium durchgeführt. Das Ziel dieser Züchtung besteht immer darin, möglichst erne Reinzucht des gärtüchtigsten Pilzes zu bekommen, ohne jede Infektionsgefahr und ohne dabei nach einer günstigen Ausbeute an Citronensäure während des Züchtungsaktes zu streben. Die Züchtung wird also neben der eigentlichen Gärung vorgenommen. Bei der technischen Gärung besteht das Ziel darin, billige gärfähige go Rohmaterialien mit Hilfe der bei der Züchtung gewonnenen Sporen wirtschaftlich auf Citronensäure umzusetzen, die dann aus den Laugen gewonnen wird. Da die Laugen meist noch andere, die unmittelbare Kristallisation der Citronensäure störende Stoffe enthalten, wird die Citronensäure daraus als ein unlösliches Salz abgeschieden und so von den anderen Bestandteilen der Gärlauge getrennt. Dieses Salz ist meistens das in der Hitze schwerlösliche Calciumcitrat, welches dann nach den üblichen Methoden weiter auf reine Citronensäure verarbeitet wird. Die Auswahl und die Zucht des Pilzes hat mit Hilfe der bekannten Methoden der mykologischen Analyse bzw. mykologischen Züchtung stets so zu erfolgen, daß der Pilz unter den Bedingungen der späteren Arbeitsweise die Höchstleistung erlangt. Es wurde gefunden, daß für die Durchführung der Citronensäuregärung bestimmte reingezüchtete Stämme von Aspergillus niger am besten geeignet sind. Bei der Aufzüchtung bzw.' Dauerzüchtung des Pilzes wurde erkannt, daß es notwendig ist, in zweckmäßiger Weise in die Züchtung auf Gelatine oder Agar-Agar oder festen Nährböden, von denen das Ernten der Sporen für die Aussaat bei der technischen Gärung vorgenommen wird, zeitweise Kleingärungen unter den gewerbsmäßig günstigen Bedingungen vorzunehmen und ferner Wachsturnszyklen einzuschalten, bei denen als Nährboden bestimmte organische Säuren enthaltende Früchte oder Teile von Pflanzen, die

gleichzeitig vitaminreiqh sind, angewendet werden. Als solche eignen sich z. B. Zitronen, Orangen, Tomaten und ähnliches. Es hat sich gezeigt, daß gerade bei dieser Art Umzüchtung die erhaltenen Sporen äußerst rein säuern. Auch wird bei dieser Art der Züchtung die Gärkraft des Stammes dauernd erhalten.

Bei der gewerbsmäßigen Citronensäuregärung wird man als Zuckerlösungen technische Gärmaischen verwenden, etwa von gleicher Art, wie sie zur Spirituserzeugung als Rohstoff der alkoholischen Gärung dienen. Sofern man von Rohstoffen ausgeht, welche polymere Kohlenhydrate (Stärke, höhere Zucker arten usw.) enthalten, ist es für den wirtschaftlichen Verlauf der Citronensäuregärung nicht unwichtig, in richtiger Art und Weise den Abbau dieser polymeren Kohlenhydrate zu Zuckern vorzunehmen.. Man bedient sich dabei zweckmäßigerweise der Abbauwirkung des für die Citronensäuregärung verwendeten Pilzes selbst, und zwar allein oder in Kombination mit anderen bekannten Verzuckerungsverfahren.
Neben dem Zucker sind für die Durchführung der Citronensäuregärung die schon eingangs erwähnten Nährstoffe wichtig, deren Menge so gewählt wird, daß das Wachsen der Pilzkörper unter Berücksichtigung der durch die Art der Durchführung des Verfahrens bedingten Strömung der Bestandteile der Gärmaische an und in die Zelle auf ein notwendiges Minimum herabgesetzt wird. Dadurch werden Bedingungen geschaffen, um eine optimale Verarbeitung des Zuckers auf Citronensäure zu erzielen.

Die günstigste Menge der Nährstoffe, die diesen optimalen Verlauf der Gärung zur Folge hat, hängt von dem verwendeten Pilz (etwa Beschaffenheit der Zellwand usw.) sowie auch von der Art der Gärung (ruhende Oberflächengärung, Oberflächengärung mit bewegter Maische, Tiefengärung usw:)' ab und muß durch systematische Versuche ermittelt werden.

Die bisherigen Angaben in der Literatur und die patentierten Verfahren nehmen auf die qualitative Art der Nährstoffe keine besondere Rücksicht. Es hat sich gezeigt, daß unter sonst gleichen Bedingungen die Art der Bindungsform von Stickstoff, der als Nährstickstoff fungiert, von sehr großer Bedeutung ist. Es hat sich gezeigt, daß bestimmte organische Bindungsformen des Stickstoffes am günstigsten sind, da sie allem Anschein nach in einem bestimmten günstigen Verhältnis mit dem Zucker in die Zelle einwandern, dort ohne wesentlichen Energieaufwand zum Protoplasma aufgebaut werden un'd dabei auch zu Stoffen (Fermenten), welche auf die Bildung der Citronensäure günstig wirken. Derartige Stickstoffnährstoffe sind vor allem Aminosäuren und andere Spaltungs- und Abbauprodukte von Eiweißstoffen. Die günstige Wirkung der Eiweißstoffe bzw. deren Spaltungsprodukte und des organisch gebundenen Stickstoffes als Nährstoff von Mikroorganismen ist an und für sich bekannt. So sei in diesem Zusammenhange auf die Patentschrift 223 757 Klasse 30h von Dr. Löloff und Dr. Meyer-Breslau hingewiesen, in welchem ein Verfahren zum Züchten von Bakterienkulturen geschützt wird, bei dem große Mengen von Aminosäuren bzw. Eiweißspaltprodukten angewendet werden. Auch die technische Herstellung der Hefe in der Preßhefefabrikation benützt mit Vorteil organischen Stickstoff. Es wurde früher angenommen, daß man Preßhefe mit rein mineralischem Stickstoff kaum erzeugen kann. Während es sich aber bei diesen Vorgängen um die günstige Wirkung des organischen Stickstoffs auf das Züchten von Mikroorganismen, .d. h. Aufbau der Zellsubstanz, handelt, war die günstige Wirkung dieser Stoffe auf die Citronensäuregärung mit Hilfe der Schimmelpilze bisher nicht bekannt gewesen. Diese Stoffe können in beistimmten technischen Zuckerlösungen von vornherein vorkommen oder werden denselben in Form von Eiweißspaltungslaugen, die nach bekannten Verfahren gewonnen werden (z.B. Hydrolyse von Leim u. dgl.), oder in Form von Ablaugen von vorhergehenden Gärungen zugesetzt.· Man kann auch den Lösungen, die organisch gebundenen Stickstoff enthalten, mehr go oder weniger kleine Mengen anorganisch gebundenen Stickstoffs in Form von Ammonsalzen oder Nitraten oder beiden zusammen zusetzen. Die Menge und die Art des Stickstoffzusatzes richtet sich nach den Gärbedingungen selbst, vor allem nach der Art, in welcher der zu verarbeitende Zucker der Zelle zugeführt wird'.

Ferner hat es sich gezeigt, daß es für die Anhäufung von Citronensäure, um dieselbe in wirtschaftlichen Konzentrationen zu erhalten, d. h. den Zucker möglichst vollständig zu Citronensäure zu verarbeiten, ohne dabei die letztere weiter anzugreifen, zweckmäßig ist, der gärenden Lösung Stoffe zuzusetzen, welche, ohne den Gärverlauf sonst nachteilig zu beeinflüssen, das Vermögen besitzen, Citronensäure komplett zu binden oder sie in ihrer Säureeigenschaft abzupuffern. We hm er und andere haben bereits vorgeschlagen, bei der Gärung zur Neutralisation der Säure Kreide zuzusetzen, was j edoch mit einer Reihe von Nachteilen verbunden war (Entwicklung der Kohlensäure, alkalische Wirkung des hydrolysierten Calciumcarbonates, welche zur Ammoniakentwicklung führt usw.). Diese Nachteile entfallen vollständig, wenn man für den oben angegebenen Zweck organische Stoffe, die stickstoffhaltig oder stickstoffrei sein können, verwendet, so daß es zur Bildung von Niederschlagen nicht kommt. Solehe Stoffe können gelöst oder kolloidgelöst von vornherein in technischen Zuckerlösungen enthalten sein, oder sie können künstlich zugesetzt werden.

Hierher gehören ζ. Β. Eiweißstoffe oder deren Spaltungsprodukte, ferner hochmolekulare Kohlenhydrate, die an und für sich nicht gärfähig sind, Pektinstoffe, Ligninsubstanzen oder deren Abbauprodukte und ähnliche Verbindungen. Die nach obigen neuen Erkenntnissen gewonnenen Gärsubstrate werden in dem bekannten Verfahren auf Citronensäure vergoren, worauf aus den Laugen die Citronensäure in bekannter Weise gewonnen wird. Die Ablaugen können wieder in an sich bekannter Weise weiterverarbeitet werden.

Ausführungsbeispiele

Der Einfluß der Züchtungsart der Schimmelpilze und der zur Gärung praktisch verwendeten Maischen soll durch folgende Ausführungsbeispiele klargestellt werden:

Versuch 1:

Verwendet wurde als Gärmaische ein Preßsaft aus Zuckerrüben, der durch Kalken und nachherige Saturation mit Kohlensäure entsprechend geklärt wurde, so daß eine Zuckerlösung analog einem Dünnsaft der Zuckerfabriken entstand. Die Maische enthielt in 1000 cm³ 150 g Rohrzucker, wozu noch zugesetzt wurden 2 g Ammonnitrat, 1 g Kaliumphosphat und 0,2 g Magnesiumsulfat. Die Lösung (1000 cm³ = 150 g Rohrzucker) wurde steril in das flache Gärgefäß eingefüllt. Nach Abkühlen wurdemit den Sporen eines frisch aus Galläpfeln eingefangenen Aspergillus niger, der in einer einzigen Reinkultur zwecks Sporenabernte gezüchtet wurde, beimpft. Die Gärung erfolgte bei 25 ° C. Nach 15 Tagen wurde die Gärung unterbrochen, die saure, klare Maische und der Preßsaft aus den Pilzdecken heiß mit heißer Kalkmilch und gepulvertem Calciumcarbonat gefällt und das ausgeschiedene Calciumcitrat abnitriert. Es wurde eine Ausbeute von 42 g citronensaurem Kalk, d. s. 28% des vorgelegten Zuckers, gewonnen. Nach der Gärung verblieben in der vergorenen Lösung noch 14 g Restzucker.

Versuch 2 (soll die Auswirkung der nach Anspruch 1 vorgenommenen Züchtungsart des Pilzes dartun):

Verwendet wurde die gleiche Gärmaische wie beim Versuch 1, nur erfolgte die Beimpfung mit Sporen von Aspergillus niger, der aus der ursprünglichen, beim Versuch 1 verwendeten Spore in folgender Weise weitergezüchtet wurde: Die Sporen aus Versuch 1 wurden auf einem Agarnährboden umgezüchtet, bei dem man dem Agar die Gärmaische zusetzte. Die auf diesem Nährboden steril abgeernteten Sporen machten dann eine Gärung, wie in Beispiel 1 beschrieben, unter vollkommen sterilen Bedingungen durch. Die Sporen von dieser Gärung wurden auf den Agarnährböden umgeimpft und diese Züchtungsweise abwechselnd auf festen und flüssigen Nährböden fünfmal wiederholt. Nach der zweiten und vierten Umzüchtung wurde eine Züchtung auf steril bereiteten Scheiben von frischen Zitronen eingeschaltet. Von der letzten Züchtung auf festem Agarnährboden wurden die Sporen zur Aussaat auf die Gärmaische verwendet und die Gärung unter gleichen Bedingungen wie beim Versuch 1 durchgeführt. Es wurde eine Ausbeute von 70 g citronensaurem Kalk entsprechend 46,6% erreicht, wobei noch 12 g Restzucker verblieben. Der gewonnene citronensäure Kalk enthielt neben 6¹J⁰I₀ Citronensäure noch 2% Oxalsäure gebunden.

Versuch 3 (soll die Auswirkung des organischen Stickstoffes und gleichzeitig die Wirkung der Abpufferungsstoffe nach den Patentansprüchen 2 und 3 dartun):

Als Stickstoffsubstanz, die gleichzeitig die Eigenschaft der Säureabpufferung der Citronensäure aufweist, wurde eine teilweise hydrolysierte Knochenleimlösung verwendet. Der Versuch wurde in folgender Weise durchgeführt:

Es wurde als Gärmaische der Rübenzuckersaft wie im Versuch 1 angewendet. Diesem Rübenzuckersaft wurden auf 1000 cm³ entsprechend 150 g Zucker 25 cm³ teilweise hydrolysierter Leimlösung (entsprechend 2¹J₂ g Stickstoff), ferner 0,4 g Kaliumbiphosphat, 0,2 g Magnesiumsulfat und 1 g Kaliumsulfat zügesetzt. Die Gärmaische wurde mit verdünnter Schwefelsäure und Natronlauge auf eine Wasserstoffionenkonzentration von ph-6 eingestellt, sterilisiert und in das Gärgefäß eingefüllt. Nach dem Abkühlen wurde sie mit Sporen von Aspergillus niger beimpft, welche ähnlich wie im Versuch 2 gezüchtet wurden. Die Züchtung bestand hier aus 5 Cyklen, wobei nacheinander der Pilz auf stark citronensaurer Agar-Agar-Nährlösung, dann auf der Gärmaische selbst und schließlich auf Orangenscheiben unter den absolut sterilen Bedingungen der Reinkultur , wachsen gelassen wurde. Die unter gleichen Bedingungen wie früher durchgeführte Gärung ergab nach 13 Tagen bei einem Restzucker von 10 g 104 g citronensauren Kalk, entsprechend einer Ausbeute von 69,3 °/₀ Calciumcitrat. auf vorgelegten Zucker. Das gewonnene Calciumcitrat enthielt 68°/o Citronensäure neben 0,5 °/₀ Oxalsäure, war also weitgehendst rein.

Beim Vergleich der Ausbeute gemäß dem Beispiel 2 gegenüber dem Beispiel 1 ersieht man die günstige Wirkung der besonderen Züchtungsart des Pilzes nach dem Anspruch 1. Das Beispiel 3 zeigt in gleicher Weise die Wirkung der besonderen Zusätze, wobei die dort verwendeten Zusätze der aminosäurenhaltigen hydrolysierten Leimlösung den Ansprüchen 2 und 3 entsprechen.

Claims

Patentansprüche:

i. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch Gärung von Lösungen

von Zucker oder anderen Kohlenhydraten oder gärfähigen Kohlenstoffverbindungen mit Hilfe von Schimmelpilzen, dadurch gekennzeichnet, daß man zwecks Gewinnung von Sporen für die Aussaat bei der technischen Großgärung mit dauernd erhaltenem starken Gärvermögen zur Erzeugung reiner Citronensäure die ausgewählten Schimmelpilze in der Weise züchtet, daß man bei der Züchtung der Pilzstämme auf Gelatine, Agar-Agar oder festen Nährböden, von denen man die Aberntung der aussaatfähigen Sporen vornimmt, Arbeitszyklen einschaltet, bei denen man den Pilz auf flüssigem Nährmedium wachsen läßt, welches dem der gewerbsmäßigen Gärung entspricht, und ferner Wachstumszyklen auf derartigen natürlichen festen Nährböden, wie z. B. Früchten, die organische Säuren (z. B. Citronensäure oder Gerbsäure) enthalten und gleichzeitig vitaminreich sind, wie z. B. Zitronen, Orangen u. dgl.
2. Verfahren zur Herstellung von Citronensäure durch Gärung von Zucker oder anderen Kohlenhydraten oder andere gärfähige Kohlenstoffverbindungen enthaltenden technischen Gärmaischen mit Hilfe von nach Anspruch 1 gezüchteten Schimmelpilzen, dadurch gekennzeichnet, daß in der Gärlösung der Nährstickstoff ganz oder teilweise in Form von auf den Säuerungsvorgang günstig einwirkenden organischen Stickstoffverbindungen, vor allem organischen Aminosäuren, in wesentlichen Mengen enthalten ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gärlösung organische Stoffe enthält, welche die Säureeigenschaft der Citronensäure abpuffern bzw. die letztere zu höher molekularen Komplexen, die nicht in die Zelle rasch einwandem können, binden, wie etwa Eiweißstoffe oder deren Spaltungsprodukte, hochmolekulare Kohlenhydrate, die an und für sich nicht gärfähig sind, Pektinstoffe und Ligninsubstanzen, deren Abbauprodukte und ähnliche Verbindungen.