DE2939189C2 - Verfahren zum Züchten von Coriulus versicolor (FR.) Quél. ATCC 20548, Laetiporus sulphureus FERM BP-34, Armilariella mellea FERM BP-281 und Grifola frondosa FERM BP-35 - Google Patents

Verfahren zum Züchten von Coriulus versicolor (FR.) Quél. ATCC 20548, Laetiporus sulphureus FERM BP-34, Armilariella mellea FERM BP-281 und Grifola frondosa FERM BP-35

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DE2939189C2 DE2939189A DE2939189A DE2939189C2 DE 2939189 C2 DE2939189 C2 DE 2939189C2 DE 2939189 A DE2939189 A DE 2939189A DE 2939189 A DE2939189 A DE 2939189A DE 2939189 C2 DE2939189 C2 DE 2939189C2
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Description

Bevorzugt werden von diesen Alkoholen diejenigen, deren Kohlenstoffzahl 28 bis 32 beträgt.
Die Tatsache ist sehr interessant, daß von diesen Alkoholen diejenigen mit einer ungeraden Anzahl von Kohlenstoffatomen kaum in den natürlichen Produkten vorliegen, jedoch für die Basidiomycetss eine Wachstums- und vermehrErigsbeschleunigende Wirkung ausüben. Die meisten der langkettigen aliphatischen Alkohole, die in Pflanzen vorkommen, wie n-Hexacosanol-1. n-Octacosanol-1. n-Triacontanol-l etc, weisen eine gerade Kohlenstoffatomzahl auf. Es wird angegeben (Science, Band 195. 1339 (1977) und Plant Physiol. Band 61, 855 (1978). daß von diesen langkettigen Alkoholen n-Triacontanol-1 allein eine spezifische Wirkung zur Begünstigung des Wachstums von höheren Pflanzen ausübt, es ist jedoch bisher keine Erhöhung der Wachstumsaktivität von Mikroorganismen bekanntgeworden.
Von den langkettigen Alkoholen weist n-Triacontanol-l allein eine spezifische Wirkung zur Begünstigung des Wachstums von höheren Pflanzen auf. während alle langkettigen Alkohole mit einer Kohlenstoffatomzahl von 26 bis 36. die erfindungsgemäß eingesetzt werden, eine das Wachstum begünstigende Wirkung von Basidiomycetes sowie eine Differenzierung der Zellen und eine Organisation derselben bedingen.
Die langkeltigen Alkohole der vorstehend angegebenen allgemeinen Formel (I) vermögen die vorstehend erwähnte wachstumsbegünstigende Wirkung der in Frage stehenden Mikroorganismen bei Zugabe einer Menge des Alkohols, die zwischen 0.01 und 10 ppm liegt, zu bewirken. Aus wirtschaftlichen Gründen sowie im Hinblick auf die Löslichkeit des langkettigen Alkohols in Wasser ist es zweckmäßig, einen derartigen Alkohol in einer Menge von 0,05 bis 10 ppm dem Medium zuzugeben. Es ist ferner möglich, eine Mischung aus zwei oder mehreren der langkettigen Alkohole zu verwenden.
Als Kulturmedium, dem der langkettige Alkohol zugesetzt wird, kann man eine Vielzahl von Medien verwenden, wie sie im allgemeinen zum Züchten von Basidiomycetes verwendet werden. Beispielsweise kann man Medien verwenden, die Kohlenstoffquellen, wie Stärke, Rohrzucker. Maltose, Dextrose. Holzschnitzel etc. enthalten, Stickstoffquellen, wie Reiskleie, Weizenklcic. Maisflüssigkeit, Pepton, Fleischbrühe. Fleischextrakt. Sojabohnenmehl, pulverisierten Baumwollsamen. Hefeextrakt. Malzextrakt. Harnstoff, Nitrate etc..
anorganische Salze, wie Ciflciumsalze, Magnesiumsalze, Natriumsalze, Zinksalze, Kupfersalze, Eisensalze, Mangansalze etc. sowie andere Nährmittel, wie Vitamine.
Das Züchtungsmedium kann entweder flüssig oder fest sein, ferner kann es sich um eine stationäre oder Submerskultur handeln. Die Zugabe des langkettigen Alkohols zu dem Medium kann entweder vor dem Beginn des Züchtens oder im Verlaufe des Züchtens. nachdem der Pilz einen gewissen Wachstumsgrad erreicht hat. erfolgen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Jeweils 20 ml Äthanollösungen, in denen 6 mg-Portionen geradkettiger gesättigter Alkohole mit verschiedenen Kohlenstoffzahlen zwischen 26 und 36 aufgelöst sind, werden jeweils tropfenweise in 21 Wasser gegeben. Nach dem Auflösen wird das Äthanol abgedampft. Auf diese Weise werden die wäßrigen Lösiingcri der Alkohole mit jeweils einer Konzentration von 3 mg/1 hergestellt.
Die Formeln sowie die Schmelzpunkte der in diesem Beispiel eingesetzten geradkettigen gesättigten aliphatischen Alkohole gehen aus der folgenden Tabelle I hervor.
Tabelle I Summen Schmelz- 30
Geradkettiger gesättigter formel punkt
aliphatischer Alkohol (0C)
C26H53OH 78-80 J5
n-Hexacosanol-1 C28H57OH 81-83
n-Octacosanol-1 C79H59OH 82-84
n-Nonacosanol-1 C30H61OH 85-87
n-Triacontanol-1 C31H63OH 86-88
n-Hentriacontanol-1 C32H65OH 87-89 40
n-Dotriacoptanol-1 C14H69OH 90-91
n-Tetratriacontanol-1 CuH71OH 91-92
n-Hexatriacontanol-1
In den auf diese Weise hergestellten Lösungen langkeitiger Alkohole (jeweils 21) werden 120 g Glukose, 15 g Hefeextrakt und 4 g Malzextrakt zur Gewinnung flüssiger Kulturmedien aufgelöst.
Jeweils 75 ml der auf diese Weise erhaltenen Medien werden in 15 Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von 200 ml einpipettiert. Nach einem Verschließen mit einem Baumwollstöpsel wird jeder Kolben bei 1200C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert. Das Medium in jedem Erlenmeyerkolben wird mit 0,8 mg einer zuvor hergestellten Impfkultur von Coriolus Versicolor (Fr.) Quel. ATCC 20 548 beimpft und stationär bei 25"C gezüchtet. Zu Vergleichszwecken wird das Züchten in einem Medium mit der gleichen Zusammensetzung unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, wobei jedoch dem Medium kein langkettiger Alkohol zugesetzt worden ist.
Nach einer gegebenen Züchtungsperiode werden die erzeugten Myzelien in den jeweiligen Kolben abgetrennt, gut mit Wasser, Äthanol und Aceton gewaschen und dann bei 60 bis 8O0C getrocknet.
Die Beziehung zwischen der Züc'-tungszeitspanne in Tagen und der erhaltenen Trockenk'.ihurausbeute geht graphisch aus der Zeichnung hervor.
Wie aus der Zeichnung hervorgeht, wird dann, wenn Coriolus versicolor in den Medien gezüchtet wird, die mit geradkettigen gesättigten aliphatischen Alkoholen gemäb vorliegender Erfindung versetzt worden sind, eine scharfe Zunahme der Myzelausbeute nach dem 14. Tag, gerechnet von dem Start des Züchtens, festgestellt, was auf eine ausgeprägte, das Wachstum und die Vermehrung begünstigende Wirkung der geradkettigen Alkohle auf die Basidiomyceies schließen läßt.
Beispiel 2
Das Züchten wird nach der in Beispiel I beschriebenen Methode durchgeführt, wobei jedoch wäßrige Lösungen von n-Triacontanol-1 in Konzentrationen von 3 ppm. 2 ppm. 1 ppm bzw. 0.1 ppm als geradkettiger gesättigter aliphatischer Alkohol verwendet werden.
Zu Vergleichszwecken wird in ähnlicher Weise eine Züchtung in dem gleichen Medium durchgeführt, mit der Ausnahme, daß kein Alkohol zugesetzt wird.
Die Ergebnisse der Messungen der Veränderung der Züchtungselemente in Abhängigkeit von dem Zeitvcrlauf gehen aus der folgenden Tabelle 11 >-<ervor.
Tabelle I/
Zeitspanne des Triacon- Zucker Reduzie pH •2 *3 *4
Züchtens, Tage tanol- gehalt im rende Enzym- Trocken- Index
kon/en- Filtrat. % Zucker aktivitäl. kullur-
tration. *1 konzentra μ/mg ausbeutc.
ppm tion im g/100 ml
Fiitrat, %
Vergleichsbeispiel
Erfindungsgemäß
O
Ü.l
6,0
6,0 6.2 6.2 5.6
5,97 5,97 6,05 5,97 5.60 5,00
5,10
5,10
5.10
5.15
2,09 0,559
0,86 0.563
0,83 0,492
0,91 0,531
0,10 0,505
100
101
88
95
90
21 Erfindungsgemäß 5 Zucker 29 39 1 89 pH 6 •2 •3 •4
gehalt im Enzym- Trocken- Index
l-'ortset/uni; Triacon- Filtrat, % aklivitiit. kultur-
Zeitspanne des tanol- •1 Reduzie ;i/mg »usbeulc.
Züchtens, Tage konzen- rende g/100 ml
tration. Zucker-
ppm kon/cnlra-
4,6 tion im 4,32 9,69 1,451 100
4,4 Filtrat. % 4,40 8,82 1,469 101
14 0 4,6 4,40 7,06 1,670 115
Vergleichsbeispiel 0,1 4,6 4,57 4,50 8,00 1,629 112
Erfindungsgemiiß 1 4.6 4,40 4,50
4 4f> 		6,81
I I ΙΩ 		1,643
I 944		 113
mn
2 2,8 4,65 4,40 10,46 2,261 116
3
η 		3,0' 4,30 4,40 10,11 2,323 120
0,1 3,0 4,59
1 "In		 4,45 7,78 2,375 122
1 2,7 2,76 4,40 8,52 2,671 137
2 2,98
3 3,02
2,56
Bemerkungen: *l: Gemessen mit einem Refraktionssaccharimeter. *2: Phenoloxidaseaktivität in dem Kulturfiltrat. •3: Trockenkulturausbeute pro 100 ml des Mediums.
*4: Die Trockenkulturausbeute aus dem Medium, dem kein Triacontanol zugesetzt worden ist, wird bei jeder Probeentnahme zu 100 angenommen.
Wie aus der vorstehenden Tabelle ersichtlich ist, steuert n-Triacontanol-l in der frühen Züchtungsphase kaum das Wachstum von Myzelien von Coriolus versicolor. entwickelt jedoch seine Aktivilät bezüglich der Begünstigung des Wachstums der Myzeln nach ungefähr Mtagigem Züchten. Man stellt ferner fest, daß der Zuckergehalt und die Konzentration an reduziertem Zucker in dem verwendeten Medium sowie der Filtrat-pH nicht merklich von den entsprechenden Werten der Vergleichsprobe differieren, während die Phenoloxiduseenzymaktivität. die mit intrazellularen Faktoren verknüpft ist. sich sehr schnell spezifisch durch das Vorliegen von n-Triacontanol-l in dem Medium verändert.
Es ist ferner darauf hinzuweisen, daß die bei dem erfindungsgemäßen Züchten erhaltenen Myzelien ein kleineres spezifisches Gewicht besitzen und ein festeres Gewebe aufweisen als die Myzelien der Vergleichsbeispiele.
Beispiel 3
Es werden wäßrige Lösungen hergestellt, in denen n-Triacontanol-l in Konzentrationsn von I ppm. 3 ppm bzw. 10 ppm aufgelöst ist. und zwar nach der in Beispiel I beschriebenen Methode. In jeder der Lösungen (I I) werden 60 g Glukose und 7.5 g Hefeextrakt zur Bildung von flüssigen Medien aufgelöst. Zu Vergleichszwecken wird in ähnlicher Weise ein Medium durch Auflösen von 60 g Glukose und 7,5 g Hefeextrakt in 1 1 Wasser, das jedoch kein n-Triacontanol-1 enthält, hergestellt.
Jeweils 100 ml der auf diese Weise hergestellten Medien einschließlich des Verglcichsmediums werden in 500 ml-Erlenmeyer-Kolben pipettiert. Außerdem werden 10 Inkubatoren für jedes Medium, und zwar insgesamt 40 Inkubatoren, hergestellt. Nach einem Sterilisieren wird das Medium in jedem Erlenmeyer-Kolben mit 120,8 mg der Impfkultur von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. ATCC 20 548 beimpft und dann bei 25° C unter Schütteln gezüchtet. Nach 5tägigem Züchten unter Schütteln werden die in den jeweiligen Kulturen erzeugten Myzeln abgetrennt, gewaschen, getrocknet und gewogen. Ferner wird die Phenole .idaseaktivität eines jeden Kulturfiltrats ermittelt. Die Ergebnisse gehen aus der Tabelle 111 hervor.
Tabelle III n-Triacon Trockenkultur Index Phenoloxidaseaktivität,
tanol-l- ausbeute, μ/mg *2
Zusatz, ppm g/100 ml ·1
1 0,221 119 10,74
Erfindungsgemäß 3 0,225 121 10,85
10 0,218 117 13,03
0 0.186 100 9.95
Vercleichsbeispiel
Bemerkungen:
*1: Trockenkulturausbeute pro 100 ml des Mediums.
*2: Phenoloxidaseaktivität des Kulturfiltrats.
Wie aus den vorstehenden Ergebnissen ersichtlich ist. wird die crfindungsgemäß ausgeprägte Wirkung auch in einer Schüttelkultur festgestellt.
Beispiel 4
25 ml einer Äthanollösung.die 7,5 mg n-Triacontanol-1 enthäli -vird tropfenweise zu 2,5 I Wasser gegeben. Das n-Triacontanol-1 wird dabei vollständig in Wasser aufgelöst. Das Äthanol wird dann abgedampft. Dabei erhält man wäßrige Lösungen, die n-Triaco.Hanoi-1 in einer Konzentralion von 3 ppm enthalten. Ein Teil dieser Lösung wurde mit Wasser auf einen Gehalt von I ppm n-Triacontanol-1 verdünnt. In den auf diese Weise erhaltenen Lösungen (jeweils I Liter) werden 60 g Glukose. 3 g Hefeextrakt, 3 g Malzextrakt und 5 g l'epton zur Herstellung flüssiger Kulturmedien aufgelöst, jeweils 50 ml der auf diese Weise hergestellten
Tabelle IV
Medien werden dann in 10 200 ml-Erlenmeyer-Kolben cinpipettiert. Nach einem Verstopfen mit einem Baum wollstopfen wird jeder der Kolben bei 120° C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert.
ϊ Die Medien in den jeweiligen Erlenmeycr-Koiben werden mit 0.8 mg von Impfktilturen von Laetiporus sulphurous FERM Ul'-34, Armillarielle mellea FERM BP-281 und Grifola frondosa FERM BP 35 beimpft und stationär bei 25 ± I0C gezüchtet. Zu Vcrgleichszwecken
ίο .wird eine ähnliche Züchtung unter Einsatz eines Mediums durchgeführt, das kein n-Triacontanol-1 enthält. Nach einer gegebenen Züchtungsperiode werden die erzeugten Myzeln abgetrennt, gut mit Wasser. Äthanol und Aceton gewaschen und bei 60 bis
Ii 80"C getrocknet. Die Züchtungsperiode in Tagen, die Trockenkulturausbcutcn sowie die Indices der jeweiligen Myzelprodukte gehen aus der folgenden Tabelle IV hervor.
Pilzspezies
Züchtungsperiode, Tage
n-Triacontanolkonzentration (ppm) erfindungsgemäß
Vergleichsbeispiel 0
Trocken-
kultur-
ausbeute*
Index* Trockenkultur ausbeute
Index
Trockenkultur ausbeute
Index
Laetiporus 19 0,174 100 0,240 sulphureus
FERM BP-34 29 0,278 100 0,362
Armillariella mellea 18 1,147 100 1,377
FERM BP-281 28 L445 100 1.941
Grifola frondosa 26 0,887 100 1,034
FERM BP-35 32 1,514 100 1,565
138
130
0,258
0,418
120 1,648
134 2,663
117 1,044
103 1,640
148
150
135
157
118
108
Bemerkungen:
• Trockenkulturausbeute (g/100 ml) pro 100 ml des Mediums.
** Die Trockenkulturausbeute aus dem Medium, dem kein Triacontanol zugesetzt worden ist, wird bei jeder Probeentnahme zu 100 angenommen.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß das n-TriacontanoI-l eine ausgezeichnete Wachstums- und vermehrungsbegünstigende Wirkung auf die vorstehend angegebenen Basidiomycetes ausübt.
Ferner ist festzustellen, daß die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Myzeln sich in ihrer Farbe von denen der Vergleichsbeispiele unterscheiden, und zwar zeigen im Falle von Laetiporus sulphureus die erzeugten Myzelien eine rötlich-orange Farbe, die weitgehend analog der Farbe von natürlichen Fruchtkörpern ist. im Falle von Armillarielle mellea man eine auffällige Bildung von Myzelansammlungen beobachtet, und im Falle von Grifola frondosa das Myzelprodukt eine Farbe besitzt, die weitgehend derjenigen von natürlichen Produkten ähnelt.
55
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

1 Patentansprüche: Die Verwendung von Basidiomycetespilzen als Grundmaterial für Arzneimittel und Gesundheitsnah- -5 rungsmittel ist in neuerer Zeit stark angestiegen, die geringe Wachstumsgeschwindigkeit dieser Pilze bei ihrem Züchten im Vergleich zu der Wachstumsgeschwindigkeit von anderen Mikroorganismen, wie Bakterien oder Hefe, stellt jedoch ein Hindernis für den industriellen Einsr.tz dieser Pilze dar. Die Zugabe von Nährmitteln, wie anorganischen Salzen. Extrakten von natürlichen Produkten etc, zu dem Medium ist als Maßnahme zur Beschleunigung des Wachstums der Basidiomycetespilze jei ihrem Züchten bekanntgeworden. Die Zugabe derartiger Nährmittel zu dem Züchtungsmedium bewirkt tatsächlich eine Begünstigung der Zellteilung der Basidiomycetes, es wird jedoch keine Differenzierung der Zellen und eine entsprechende Organisation derselben in gleichem Ausmaße erzielt, so daß nicht die gewünschte Wachstums- und Vermehrungsbeschleunigung erreicht wird. Daher ist es mit derartigen Maßnahmen nicht möglich, hochqualitative Myzelien der vorstehend erwähnten Pilze mit einer hohen Geschwindigkeit zu 4^ erzeugen. Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zum Züchten von Coriulus versicolor, ATCC 20 548, Laetiporus sulphurous FERM BP-34, Armilariel-Ie mellea FERM BP-281 und Grifola frondosa FERM BP-35 zu schaffen, bei dessen Durchführung das Wachstum dieser Basidiomycetes merklich begünstigt und auch eine Differenzierung und Organisation der Zellen gefördert wird. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung, also durch das Verfahren gemäß dem Patentanspruch !.gelöst. Die Patentansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen der Erfindung. Die Zeichnung ist eine graphische Darstellung von Versuchsergebnissen, welche die Beziehung zwischen der Art des eingesetzten langkeuigen Alkohols und der Trockenkuiturausbeute zeigt. In der Zeichnung bedeuten die Bezugszahlen 1, 2 und 3 die Ergebnisse, die bei einem einwöchigen Züchten, zweiwöchigen Züchten bzw. dreiwöchigen Züchten erzielt werden. b5 Die Erfindung wird nachfolgend näher erläutert. Der dem Medium zum erfindungsgemäßen Züchten der genannten Mikroorganismen zugesetzte geradkettige gesättigte aliphatische Alkohol entspricht der allgemeinen Formel
1. Verfahren zum Zuchten von Coriulus verstcolor (Fr.) Quel. ATCC 20 548, Laetiporus sulphureus FERM BP-34, Armilariella mellea FERM BP-281 und Grifola frondosa FERM BP-35 in einem Medium und Gewinnen des Mycels, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Medium einsetzt, das wenigstens einen geradkettigen gesättigten aliphatischen Alkohol der allgemeinen Formel C„H2n+iOH, worin π für eine ganze Zahl von 26 bis 36 steht, in einem Bereich zwischen 0,01 und 10 ppm enthält.
2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß man das Medium als flüssiges Medium einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete geradkettige gesättigte aliphatische Alkohol eine Kohlenstoffanzahl von 28 — 32 besitzt.
20 CnH2n + 1OH
worin η eine ganze Zahl von 26 bis 36 ist. Beispiele für derartige geradkettige gesättigte aliphatische Alkohole sind folgende:
n-Hexacosanol-1,
n-Heptacosanol-I,
n-Octacosanol-1.
n-Nonacosanol-1,
n-Triacontanol-l,
n-Hentriacontanol-1,
n-Dotriacontanol-,
n-Tritriacontanol-l,
n-Tetratriacontanol-1,
n-Pentatriacontanol-1 sowie
n-Hexatriacontanol-1.
DE2939189A 1978-10-03 1979-09-27 Verfahren zum Züchten von Coriulus versicolor (FR.) Quél. ATCC 20548, Laetiporus sulphureus FERM BP-34, Armilariella mellea FERM BP-281 und Grifola frondosa FERM BP-35 Expired DE2939189C2 (de)

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