AT216451B

AT216451B - Verfahren zur Herstellung von Gibberellin-Säure

Info

Publication number: AT216451B
Application number: AT630658A
Authority: AT
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1957-09-09
Filing date: 1958-09-09
Publication date: 1961-07-25

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur Herstellung von   Gibberellin-Säure   
Die Erfindung betrifft antibiotische Herstellungsverfahren und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Gibberellin-Säure. 



   Gibberellin-Säure ist ein das Pflanzenwachstum förderndes Stimulans, das aus den Kulturfiltratengewisser aktiver Stämme des Pilzes Gibberella fujikuroi (Fusarium moniliforme) erhalten werden kann. Es ist bekannt, Gibberellin-Säure herzustellen, indem ein aktiver Stamm des Pilzes Gibberella fujikuroi in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet wird, das eine Kohlenstoffquelle, z. B. Glukose, eine Stickstoffquelle, z. B. Ammoniumnitrat, gewisse Metallsalze, z. B. Magnesiumsulfat und   Kaliumdihydrogen-   phosphat, und Spuren von Metallen, wie z. B. Eisen, Kupfer, Zink, Mangan und Molybdän, enthält. Die bekannten Nährmedien, die bei diesem Verfahren verwendet werden können, sind die sogenannten synthetischen Kulturmedien, in welchen die Stickstoffquelle, z. B. ein Ammoniumsalz oder ein Nitrat, nicht organischen Ursprungs ist. 



   Es wurde nun gefunden, dass sich zur   Herstellul1gvonGibberellin-Säure durch   Züchtung eines aktiven Stammes von Gibberella fujikuroi ein Nährmedium eignet, das als Stickstoffquelle eine organische Substanz enthält. 



   Gemäss vorliegender Erfindung wird demnach ein Verfahren zur Herstellung von Gibberellin-Säure angegeben, das darin besteht, dass die Stickstoffquelle eine organische Substanz pflanzlichen Ursprungs ist, wie pflanzliche Nährstoffe, z. B. Sojamehl oder Sojanährstoff, Baumwollsamen-, Erdnuss-, Weizen- 
 EMI1.1 
 sche Substanz in solchen Anteilen eingesetzt wird, dass die Stickstoffkonzentration in dem Medium 0,   l-l,   0 g/100   cm3,   im allgemeinen in Form von 0,5 bis 10   100 cm3 der   organischen Substanz, beträgt. Die optimale Konzentration der eingesetzten organischen Substanz ist bei den obengenannten Substanzen   verschieden.

   Sojanährmittel   ist der leicht erhältliche mehlige Rückstand, der vom Sojamehl nach Extraktion des Fettes übrig bleibt, Leinsamenmehl (linseed expeller cake meal) ist gleichfalls der mehlige Rückstand, der von Leinöl nach Entfernung des Fettes zurückbleibt. 



   Bevorzugt wird eine Kohlenstoffkonzentration in dem Nährmedium von 0,7 bis 13   g ! 100 cm3,   insbesondere von 1, 75 bis 10,8 g/100 cm3, z. B. in Form von 5 bis 30 g/100 cm3 Glucosemonohydrat. 



   Ein geeigneter Stamm des Gibberella fujikuroi, der in diesem Herstellungsverfahren verwendet werden kann, ist der Stamm 917, der von der Erfinderin zur Herstellung von   Gibberellin-Säure   schon früher eingesetzt wurde. Es können aber auch andere geeignete Stämme oder Abkömmlinge derselben verwendet werden. Muster der aktiven Stämme des Gibberella fujikuroi sind in den Sammlungen von Kulturen des Commonwealth Mycological Institute, Kew, des Bureau   voor Schimmelcultures,   Baarn und des Northern Utilisation Research and Development Division of the United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois,   U. S.

   A. hinterlege  
Die in dem Fermentationsmedium gebildete Gibberellin-Säure kann durch Filtration des Mediums und Extraktion des Filtrats mit einem organischen Lösungsmittel oder durch Adsorption an Aktivkohle isoliert werden. 



   Wenn die zuvor beschriebenen organischen Substanzen an Stelle der synthetischen Substanzen, z. B. 



  Ammoniumnitrat, als Stickstoffquelle bei der   fermentativenHerstel1ung   von Gibberellin-Säure eingesetzt werden, wird die Ausbeute an Gibberellin-Säure vergrössert, wobei bei Verwendung bestimmter dieser 

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 EMI2.1 
 in Form von Aminosäuren, sondern auch andere   Substanzen,   z.B. Kalzium. Maguesium, Kalium und Spuren anderer Metalle, so dass daher die Wahrscheinlichkeit, dass der Pilz wähvend des Fermentationsprozesses mangels eines bestimmten wesentlichen Elementes in dem   Nährmedium   in seiner Entwicklung gehemmt wird, geringer wird. 



   Die als Stickstoffquelle verwendete organische Substanz kann, wenn gewincht, durch anorganische Stickstoffquellen, z.B. Ammouiumnitrat, ergänzt werden. 



   Die Erfindung wird an Hand folgender Beispiele erläutert. 



   Beispiel 1 : 
Herstellung des   InokulaEB:   
Ein Nährmedium folgender Zusammensetzung wird hergestellt: 
 EMI2.2 
 
<tb> 
<tb> Glucosemonohydrat <SEP> 180 <SEP> g <SEP> 
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> 4 <SEP> S <SEP> g <SEP> 
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Kaliumdihydrogenphosphat <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Ferrosulfatheptahydrat <SEP> 0. <SEP> 01g
<tb> Mangansulfattetrahydrat <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> g <SEP> 
<tb> Zinksulfatheptahydrat <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb> Kupfersulfatpentahydrat <SEP> 0,01 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> ad <SEP> l <SEP> l <SEP> 
<tb> 
 
 EMI2.3 
 versetzt, die dann sterilisier, ab-turn, das dann für die   HauptfermeRtation   verwendet wird. 



   Hauptfermentation :
Es wird ein Ausgangsmedium folgender Zusammensetzung   hergesteHts   
 EMI2.4 
 
<tb> 
<tb> Glucosemonohydrat <SEP> 6000 <SEP> g
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 30 <SEP> g
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> 30 <SEP> g
<tb> kallumhydrogenphosphat <SEP> 150 <SEP> g
<tb> Ferrosulfatheptahydrat <SEP> 0,3 <SEP> g
<tb> Mangansulfattetrahydrat <SEP> 0,3 <SEP> g
<tb> Zinksulfatheptahydrat <SEP> 0,3 <SEP> g
<tb> Kupfersulfatpentahydrat <SEP> 0,3 <SEP> g
<tb> Wasser <SEP> ad <SEP> 30 <SEP> 1 <SEP> 
<tb> 
 
Dieses Medium wird in zwei gleiche Teile geteilt und jeder dieser Anteile in einen Fermentator aus rostfreiem Stahl eingebracht, der mit einem Rührwerk und einer Luftzuleitung versehen ist. Zu einem Fermentator werden 21 g Ammoniumnitrat und zu dem andern Maisquellflüssigkeit (die 225 g an Festsubstanz enthält), als zusätzliche Stickstoffquelle zugesetzt.

   Die Fermentatoren werden sterilisiert, bei 24  C gehalten und drei Kolben des oben beschriebenen Inokuiums jedem der Fermentatoren zugesetzt   Das Rührwerk wird dann mit einer Geschwindigkeit von 450 U/min laufen gelateen und während der Fermentation Luft durch jeden der Fermentatoren mit einer Geschwindigkeit vca 20 1/min durchgeleiter.   

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 Wenn erforderlich, wird das Schäumen desFermentationsmediums durch Zusatz kleiner Anteile von Pflanzenöl zu den Fermentatoren eingedämmt.

   Gibberellin-Säure wird in Intervallen bestimmt, wobei folgende Resultate erhalten werden : 
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Alter <SEP> Fermentation <SEP> mit <SEP> Ammoniumnitrat <SEP> Fermentation <SEP> mit <SEP> Ammoniumnitrat
<tb> (Tage) <SEP> und <SEP> Maisquellflüssigkeit
<tb> PH <SEP> Gibberellin-Säure <SEP> (mg/l) <SEP> PH <SEP> Gibberellin-Säure <SEP> (mg/I)
<tb> 5 <SEP> 3. <SEP> 75 <SEP> 107 <SEP> 4, <SEP> 90 <SEP> 146
<tb> 7-196-294
<tb> 10 <SEP> 3, <SEP> 66 <SEP> 278 <SEP> 4,35 <SEP> 458
<tb> 12 <SEP> 3, <SEP> 65 <SEP> 431 <SEP> 4,52 <SEP> 547
<tb> 
 
Aus der Tabelle ist zu ersehen, dass die Ausbeute anGibberellin-Säure höher ist und auch der PH-Wert des Fermentationsmediums höher ist, wenn das Medium, zusätzlich zu dem Ammoniumnitrat, Maisquellflüssigkeit als Stickstoffquelle enthält. 



   Beispiel 2: Das Inokulum wird gemäss dem am Beginn des Beispiels 1 angegebenen Verfahrer hergestellt. 



   Die Fermentation wird gemäss dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren vorgenommen, wobei das Ausgangsmedium (15 1), zu welchem als zusätzliche Stickstoffquelle Maisquellflüssigkeit zugesetzt ist (die 225g Festsubstanz entspricht), verwendet wird. Das Medium wird nach acht Tagen, wenn das filtrierte Kulturmedium 372 mg/l Gibberellin-Säure enthält, weiter aufgearbeitet. Der pH-Wert des Filtrats wird auf 2,5 eingestellt, worauf der Reihe nach mit 8,4 und 2 1 Äthylazetat extrahiert wird. Der Äthylazetatextrakt wird im Vakuum auf 1270 ems eingeengt und dieses Konzentrat zweimal mit 250   cm   Wasser, das 9 g Kaliumbikarbonat (PH des Extraktes = 6, 5) enthält und hierauf mit 250   cm3   Wasser extrahiert.

   Die wässerigen Extrakte werden vereinigt und nach Einstellung des pH-Wertes auf 3,   e.   dreimal mit 250 cm3 Äthylazetat extrahiert. Der erhaltene   Äthylazetatextrakt   wird im Vakuum auf 10   ems eingeengt.   wonach Gibberellin-Säure (2, 3 g) in charakteristischen weissen Kristallen,   F = 233-2350 C, unter   Zersetzung auskristallisiert. Eine zweite kleine Ausbeute an Säure wird nach weiterem Einengen der Mutterlauge erhalten. 



   Beispiel3 :DieFermentationenwerdenunterSchüttelninKolben,inwelchenfolgendesAusgangsmedium enthalten ist, vorgenommen : 
 EMI3.2 
 
<tb> 
<tb> Glucosemonohydrat <SEP> 10 <SEP> g/100 <SEP> cm3
<tb> Kaliumdihydrogenphosphat <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> g/loo <SEP> cm3
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0,1 <SEP> g/100 <SEP> cm3
<tb> Konzentrat <SEP> nicht <SEP> wesentlicher <SEP> Zusätze <SEP> 0,2 <SEP> Vol./Vol.-%
<tb> Das <SEP> Konzentrat <SEP> hat <SEP> folgende <SEP> Zusammensetzung <SEP> :

   <SEP> 
<tb> Ferrosulfatheptahydrat <SEP> 16,3 <SEP> g
<tb> Kuprisulfatpentahydrat <SEP> 2, <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Zinksulfatheptahydrat <SEP> 16,3 <SEP> g
<tb> Manganosulfattetrahydrat <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> g
<tb> Kaliummolybdatpentahydrat <SEP> 1, <SEP> 6 <SEP> g
<tb> (KzMo. <SEP> 5H <SEP> O)
<tb> Wasser <SEP> 1, <SEP> 21
<tb> 
 
Zu Anteilen des Mediums werden organische Produkte in den in der folgenden Tabelle angegebenen Konzentrationen hinzugefügt :

   

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 EMI4.1 
 
<tb> 
<tb> Material <SEP> g/MO <SEP> Fermentadoc <SEP> nach <SEP> 7 <SEP> Tagen
<tb> cm3 <SEP> Gibberellin-Säure
<tb> PH <SEP> mgli
<tb> Ammoniumnitrat
<tb> (Kontrollversuch) <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP> 231
<tb> Maisquellflüssigkeit
<tb> (als <SEP> Trockensubstanz) <SEP> 2 <SEP> 5. <SEP> 7 <SEP> 318 <SEP> 
<tb> Sojamehl <SEP> 3 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 528
<tb> Sojamehl <SEP> 2 <SEP> 3, <SEP> 9 <SEP> 420
<tb> Extrahierter
<tb> Sojanährstoff <SEP> 3 <SEP> 4,8 <SEP> 580
<tb> Extrahierten
<tb> Sojanährstoff <SEP> 2 <SEP> 4,0 <SEP> 298
<tb> Liensamenmehl <SEP> 3 <SEP> 4,0 <SEP> 422
<tb> Leinsamenmehl <SEP> 2 <SEP> 3,8 <SEP> 408
<tb> Weizenmehl <SEP> (weiss) <SEP> 5 <SEP> 2, <SEP> 95 <SEP> 451
<tb> Weizenmehl <SEP> (weiss) <SEP> 7,5 <SEP> 3. <SEP> 4 <SEP> 324
<tb> 
 
 EMI4.2 
 pension gebracht wird). 



   Die inokulierten Kolben werden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung   iEksiert.   Nach sieben Tagen werden Paare der Kolben entfernt, die Kulturen vereinigt und der   pH-Wert Hnd   die Konzentration an Gibberellin-Säure gemessen. Die Resuitate dieses Experimentes werden in obiger Tabelle angeführt. Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, dass die Ausbeute an   Gibberellin-Säme,   wenn die   Stickstoffquelle 0, 75"   7,5 g/100 cm3 eines der genannten organischen Produkte   ist, höher liegt,   als   vie-mi   die Stickstoffquelle aus 0, 25 g/100 cm3 Ammoniumnitrat gebildet wird. 



   Beispiel4 :EinMediumFolgenderZusammensetzungwirdhergestellt: 
 EMI4.3 
 
<tb> 
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> g <SEP> ! <SEP> 100 <SEP> cm'd <SEP> 
<tb> Leinsamenmehl <SEP> 2 <SEP> gizmo <SEP> cm3
<tb> Kaliumdihydrogenphosphat <SEP> 0,3 <SEP> g/100 <SEP> cm3
<tb> Magnesiumsulfatheptahydrat <SEP> 0,1 <SEP> g/100 <SEP> cm3
<tb> Konzentrat <SEP> nicht <SEP> wesentlicher <SEP> Zusätze <SEP> 0,2 <SEP> Vol./Vol.-' <SEP> ? <SEP> a <SEP> 
<tb> wie <SEP> in <SEP> Beispiel <SEP> 3.
<tb> 
 



   151 dieser Lösung werden in einen Fermentator, der in Beispiel 1 beschriebenen Art eingebracht. 



  Nach Sterilisation wird das Medium gemäss Beispiel 1 inokuliert, gerührt und belüftet. Nach sieben Tagen wird die   Gibberellin-Säure-Konzentration   gemessen ; sie beträgt 186 mg/l. 
 EMI4.4 
 

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3,0 1 filtrierte Nährbrühe von der acht Tage alten Kultur wird mit wässeriger Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt und zweimal mit 600 ems Anteilen von Methylisobutylketon extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und mit 100 cm3 Wasser, das einen geringen Überschuss an Natriumbicarbonat enthält, extrahiert, wobei ein wässeriger Extrakt mit einem PH von 7 erhalten wird. Das organische Lösungsmittel wird noch zweimal mit je 50 cms Äther gewaschen. Der vereinigte wässerige Extrakt und die Waschflüssigkeiten werden filtriert und das Filtrat mit Äthylazetat extrahiert.

   Hierauf wird der Extrakt auf einen PH-Wert von 3,0 eingestellt und dreimal mit 50   cm   Äthylazetat extrahiert. Die drei Äthylazetatextrakte werden vereinigt und mit 10   cm   Wasser gewaschen, hierauf wird abgetrennt und   überNa-   triumsulfat getrocknet. Es wird unter vermindertem Druck auf ungefähr 3   cams   eingeengt, wonach sich Gibberellin-Säure-Kristalle abscheiden. Nach Filtrieren, Waschen mit Äthylazetat und Trocknen an der Luft werden 0,633 g Gibberellin-Säure (F = 233 - 2350 C unter Zersetzung) erhalten. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung von Gibberellin-Säure durch Vermehrung eines aktiven Stammes des Pilzes Gibberella fujikuroi in einem belüfteten, für das Pilzwachstum geeignete C- und N-Quellen enthaltenden Nährmedium, aus dem die gebildete Säure isoliert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Stickstoffquelle eine organische Substanz pflanzlichen Ursprungs ist, wie pflanzliche Nährstoffe, z. B. 



  Sojamehl oder Sojanährstoff, Baumwollsamen-, Erdnuss-,   Weizenkeim- öder Leinsamenmehl,   oder Pflanzenabfallprodukte, z. B. Maisquellflüssigkeit, wobei die organische Substanz in solchen Anteilen eingesetzt wird, dass dieStickstoffkonzentration in   dem Medium 0, 1-1,   0 g/100 cm3, im allgemeinen inForm von 0,5 bis 10 g/100   cms   der organischen Substanz, beträgt.

Claims

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffkonzentration innerhalb des Nährmediums 0, 7-13 g/100 cm3 beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kohlenstoffkonzentration innerhalb des Nährmediums 1, 75-10 g/100 cm beträgt, z. B. in Form von 5-30 g/100 crn Glucosemonohydrat.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die als Stickstoffquelle verwendete organische Substanz durch eine anorganische Stickstoffquelle, z. B. Ammoniumnitrat, ergänzt wird.