DE2033447C3 - Verfahren zur Herstellung von 7-Chlortetracyclin - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 7-Chlortetracyclin(Aureocyclin) durch Züchten von Streptomyces-Stämmen.

Bekannt ist, daß Antibiotica durch Fermentation mit neuen Mikroorganismen, die natürliche, unter verschiedenen Bedingungen aus den Stammspecies durch Behandlung mit chemischen oder physikalischen Mutationsmitteln ausgewählte oder induzierte Mutanten darstellen, gewonnen werden können. Solche Muianten unterscheiden sich von den Stammspecies durch ihre Fähigkeit, Antibiotica zu erzeugen, ferner durch ihre physiologischen und morphologischen Charakten itika.

Die Verwendung von Antibiotica zur Zuchtwahl des Erzeugers ist ebenfalls bekannt, insbesondere bei solchen Antibiotica, die mit der Synthese der Zellenwand interferieren (Penicillin, Oxamycin, Novobicin, Bacitracin A, Vancomycin, Nistatin A und B).

Bezüglich der Tetracycline ist die Verwendung von Oxytetracyclin als Selektivmittel zur Zuchtwahl der aktiven Varianten des Streptomyces rimosus bekannt. Die dazu benutzten Kulturmedien sind komplex und teuer, erfordern Fleischextrakte, Pepton, Erdnußmehl, ferner Harnstoff, Maisquellwasser, Ammoniumsulfat und andere Salze und auch verschiedene Getreidemehle; die Vorgänge werden bei Temperaturen zwisehen 20 und 37^CC, vorzugsweise zwischen 26 und 28°C, unter Belüftung und Rühren ausgeführt. Die verschiedenen, zur Gewinnung von Tetracyclin verwendeten Stämme oder Mutanten erbringen im Biosyntheseverfahren höchstens 7500 mg/1.

Weiterhin ist aus der deutschen Auslegeschrift 1 185 771 ein Verfahren zur Herstellung von Chlortetracyclin und/oder Tetracyclin bekannt, das auf der Verwendung von Streptomyces lusitanus beruht. Die Arbeitsweise bedient sich des üblichen biologischen Weges; die gewonnenen Antibiotica werden in die Säuresalze übergeführt. Man erhält beide Antibiotica bzw. deren Salze gleichzeitig und nebeneinander. Streptomyces lusitanus wirkt selbst dann, wenn das Reaktionsmedium zusätzlich Chlorionen enthält, nicht spezifisch etwa hinsichtlich der Bildung von Chlortetracyclin, so daß die Ausbeutezahlen kein Übersichtliches Bild ergeben. Daher läßt sich hier auch hinsiehtlieh der Arbeitsgeschwindigkeit (Ausbeute pro Zeiteinheit) nichts Genaues ermitteln.

Die aus der USA.-Patentschrift 2 609 329 bekannte «5 Verwendung von Stfeptomyces aureofaciens wiederum ergibt eine relativ niedrige Ausbeute an Chlortetracyclin.

enthaltenden Nährmedium in Gegenwart emer aus den AJkanoIen, vielwert'genJJdJg »j* O
ausgewählten hydroxylhaltigen Verbindung

Speziell werden vier «^JK£
fadens-StSmme verwendet. Die zwei genannten Anti Motte werden wiederum gleichzeitig und nebeneinander erzeugt, während durch die Zusätze die Bildung von T-Chlortetracyclin bevorzugt und bis etwa 5000 mcg/ml gesteigert werden soll. Hierbei soll dann zwar die Bildung des anderen genannten Antibioticums zurückgedrängt werden; jedoch bedient sich diese Arbeitsweise stimulierender bzw. aktivierender Zusätze an Fremdstoffen, wodurch die Aufarbeitung dtr Medien erschwert und die Reinheit des unrniiieibaren Verfahrensproduktes beeinträchtigt wird.

Die Aufgabe der Erfindung liegt daher in der Schaffung eines solchen Verfahrens fur die Herstellung vor, 7-Chlortetracyclin, wobei man nicht nur ein reines Produkt erhält, sondern dieses auch in hohen Ausbeuten und zur Auslastung der technischen Einrichtungen bei verbesserter Arbeitsgeschwindigkeit (Ausbeute pro Zeiteinheit).

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man als Stamm den Streptomyces aureofaciens Mutant A-900 (hinterlegt beim Institutul de Cercetari Chimico-Farmaceutice, Bukarest) verwendet.

Bei der Zuchtwahl dieses neuen Mutanten wird als Impfmaterial das im Inokulatormedium und im Zwischenmaterial erhaltene Mycelium in der Phase verwendet, in der das Mycelium einen Gesamtzuckerverbrauch von 25 bis 30% aufweist und die Biomasse nach 10 Minuten langem Zentrifugieren bei 3000 Umdrehungen/Minute 14 bis 16% der Gesamtflüssigkeit beträgt und ferner die Flüssigkeit und das Mycelium eine goldgelbe Farbe zeigen; als Fermentationsmedium wird eine Mischung aus 3,8% Proteinstoffen, 7% Zukker und 0,1% Harnstoff benutzt; in der Fermentationsphase wird mit einer Belüftung von 0.8 Liter Luft/Liter Medium pro Minute, einem Druck von 0,8 Atm. und einer Temperatur von 29 bis 30 C in den ersten 24 Stunden und von 27 n I C nach 24 Stunden und bis zum Ende der Fermentation gearbeitet.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand eines Beispiels näher erläutert:

. . .
beispie

Der neue A-900-Mutant wurde durch die folgende Arbeitsweise gewonnen:

Es wurden verschiedene Konzentrationen an Chlortetracyclin, nämlich 250, 500, 750, 1000 bzw. 1500 mg/!, in das Zuchtwahlmedium auf Petri-Platten und in die untere Schicht des Mediums eingebracht; als Mutanten wurden diejenigen ausgewählt, die bei den entsprechenden Konzentrationen gewachsen waren und Sporen gebildet hatten.

Von den ausgewählten Mutanten ist der Mutant A-900 durch folgende morphologische und biochemische Merkmale charakterisiert: gewölbte Kolonien mit einem zentralen Nabel und feinen radiären Riffeln, reichliche Sporenbildung von dunkelgrauer Farbe, die eine intensive Wirkung bei der Stärkehydrolyse und ein hohes Biosynthesepotential aufweisen.

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Der so ausgewählte Mutant mit der Bezeichnung A-90Q wird dem Wachstum in einer ersten Phase unterworfen, nämlich einer Beimpfungsphase auf einem Medium mit folgender Zusammensetzung:

Malzextrakt 0,8 g

Maismehl 0,5 g

Ammoniumsulfat 0,4 g

Calciumcarbonat 0,5 g

Stärke 2,5 g

Gehärtetes öl 0,5 g

Glucose 0,5 g

Monokaliumphosphat 0,02 g

Wasser 100 ml

pH-Wert 6,6 bis 6,7

Inokulatorleistung 2001 Medium

In dieses im Inokulationsgefäß befindliche Medium wird eine Spoiensuspension von der Oberfläche von 6 bis 8 Probiergläsern mit dem den neuen Mutanten enthaltenden und mit Agar-Agar behandelten Medium eingebracht; die Temperatur wird auf 29±!"C gebracht, uns es wird eine Belüftung mit 1 Liter Luft/ Liter Medium/Minute bei einem Druck von 0,8 Atm. ausgeführt.

Es wurden Proben zur Bestimmung genommen; diese Phase wird als beendet betrachtet und die Biosynthese wird unterbrochen, wenn die Biomasse 14 bis 16% nach \L Minuten langem Zentrifugieren bei 3000 Umdrehungen/Minute und der Gesamtzuckerverbrauch 25 bis 30% betragen und die Farbe des Myceliums und der Lösung g Idgelb ist; dies wird innerhalb einer Zeitdauer von 28 bis 35 Stunden erreicht.

Dann folgt die zweite Wachstumsphase, nämlich intermediär auf einem Medium derselben Zusammensetzung mit einem pH-Wert nach Sterilisierung von 6,7, wobei eine 10%ige Menge dieses Kulturmediums verwendet wird. In dieser Phase wird die Züchtung 20 bis 25 Stunden bei einer Temperatur von 29 ± ! ^CC mit einer Belüftung von 0,8 Liter Luft/Liter Medium/ Minute bei einem Druck von 0,8 Atm. ausgeführt. Wenn die Biomasse 14 bis 16% und der Gesamtzuckerverbrauch 25 bis 30% betragen und die Farbe des Myceliums und der Flüssigkeit goldgelb ist, nämlich nach einer Zeitdauer von 20 bis 25 Stunden, wird die gesamte Masse in einen Fermentator mit 35-Tonnen-Leistung eingebracht, wobei ein Medium mit folgender Zusammensetzung verwendet wird:

447 V)

Sojabohnenmehl , 3,8 kg

Maisextrakt 0,25 kg

als Trockenstoff berechnet

Maismehl I kg

Harnstoff 0,1 kg

Ammom'umsulfat 0,8 kg

Ammoniumchlorid 0,2 kg

Mangansulfat , 0,w05 kg

Kobaltchlorid 0,0005 kg

Calciumcarbonat ...,.,..,... 0,8 kg

Stärke 7 kg

BenzylrhodanJil .... 0,0004 kg

Gehärtetes öl 2 kg

Wasser 1001

pH-Wert (nach Sterilisierung).. 6,7

Γη dieser Phase wird eine Temperatur von 29⁰C 24 Stunden lang gehalten, dann 27°C bis zum Ende des Fermentationsvorganges mit einer Belüftung von 0,8 Liter Luft/Liter Medium/Minute bei einem Druck von 0,8 Atm.

Nach 80 Stunden Fermentation werden 8000 mg/1 Chlortetracyclin bei einer mittleren Biosynthese-Geschwindigkeit von 100 mg/1 pro Stunde und einer höchsten Biosyi?ihese-Geschwindigkeit von 150 mg/1 pro Stunde erhalten.

Dieses Verfahren ist durch den großen Vorteil ausgezeichnet, daß in kurzer Zeit eine beachtliche Menge des erwünschten reinen Produktes gebildet wird. Dadurch werden die technischen Anlagen optimal ausgenutzt.

Ein derartiges günstiges Ergebnis läßt sich im Vergleich dazu gernäß der genannten deutschen Auslegeschrift 1 185 771 nicht erzielen, da dort Tetracyclin und Chlortetracyclin nach viel längerer Reaktionszeit und dann auch noch gleichzeitig und nebeneinnader entstehen sollen, sofern man d,;rch Chlorionenzusatz, dessen Quantität nicht einmal erläutert ist, überhaupt zu Chlortetracyclinanteilen gelangt. Die praktische Nacharbeitung dieser Arbeitsweise erbrachte diesbezüglich negative Ergebnisse. Selbst wenn aber letzteres zum Teil erhalten würde, wäre die Aufarbeitung und Trennung des Produktgemisches aufwendig und ausbeutevermindernd.

Ersichtlich bringt das erfindungsgemäße Verfahren bei der 7-Chlortetracyclinherstellung demgegenüber wesentliche Vorteile in Form der Erzielung reiner Produkte in kürzerer Arbeitszeit mit hoher Ausbeute.

Claims (1)

1. Ein weiteres Verfahren zur Herstelliing von 7-ChIor

   Patentanspruch,

   m dad u r c h g e k e η t

   t daß man als Stamm den Streptomvces aureofaeiens Mutant A-900 (hinterlegt STnsSdT CerceS Chimico-FarmaceS- «ce, Bukarest) verwendet.