DE1492225C3

DE1492225C3 - Verfahren zum Herstellen von Tetracyclin auf biologischem Wege durch Züchten von Streptomycetenstämme

Info

Publication number: DE1492225C3
Application number: DE1965V0027543
Authority: DE
Inventors: Ivan Lissabon Villax
Original assignee: FERMENTFARMA SpA BUCCINASCO CORSICO (ITALIEN)
Current assignee: FERMENTFARMA SpA BUCCINASCO CORSICO (ITALIEN)
Priority date: 1964-01-18
Filing date: 1965-01-13
Publication date: 1974-03-28
Also published as: CH468464A; IL22780A; BE658387A; NL6500482A; ES308241A2; DE1492225A1; FI45667B; DK118814B; AT258470B; BR6566261D0; GB1093801A; SE340990B; FI45667C; FR1434215A; DE1492225B2

Description

USA.-Patentschrift

Zur Herstellung von Tetracyclin sind verschiedene ao Mikroorganismen, wie Streptomyces aureofaciens, Streptomyces sayamaensis, Streptomyces viridifaciens, Streptomyces psammoticus und Streptomyces persimilis, bekannt. Es wurde gefunden, daß Tetracyclin auf biologischem Wege durch Züchten von Streptomyceten-Stämmen auch in der Weise hergestellt werden kann, daß man als Stamm den Mikroorganismus Streptomyces lusitanus var. tetracyclini 106-T verwendet. Dieser Stamm hat die Eigenschaft, Tetracyclin in Gegenwart von Chlorionen, und zwar in größerer Ausbeute als bisher möglich, zu bilden, ohne daß gleichzeitig Chlortetracyclin gebildet wird. Wenn man auch diesen Mutterstamm vorläufig Streptomyces lusitanus var. tetracyclini genannt hat, da viele seiner taxonomischen Eigenschaften denen des Streptomyces lusitanus nahekommen, sollte man die beiden Mikroorganismen doch als unabhängige Species klassifizieren, da der ursprünglich aus dem Boden isolierte Streptomyces lusitanus dornige Sporen hat, die Sporen des Streptomyces lusitanus var. tetracyclini dagegen glatt sind. Von dem Streptomyces lusitanus var. tetracyclini Urstamm wurde nach sorgfältiger Selektion unter ultravioletten Strahlen ein industriell höchst brauchbarer Stamm erhalten und unter dem Namen Streptomyces lusitanus var. tetracyclini 106-T unter der Nummer NCIB 9500 im National Collection of Industrial Bacterial, Aberdeen, Schottland, hinterlegt. In der folgenden Beschreibung und im Anspruch hat dieser Stamm die Bezeichnung 106-T. so

Die Herstellung von Tetracyclin in chlorhaltigen Nährmedien, die billiger als chlorfreie sind, mittels eines speziellen Streptomyceten-Stammes ohne die gleichzeitige Bildung von Chlortetracyclin ist aus der USA.-Patentschrift 3 092 556, besonders Spalte 1, Zeilen 45 bis 50, bekannt. In dieser Patentschrift sind indes nur Ausbeuten an Tetracyclin angegeben, die sich an Hand von Versuchen in Kolben erzielen lassen; Angaben über Ausbeuten, die auf industrieller Basis erzielt worden sind, fehlen völlig. Die höchsten Ausbeuten werden mit den Stämmen S-2308 und S-2589 von S. aureofaciens erzielt, die aber weder hinterlegt noch beansprucht sind. Von den beanspruchten und hinterlegten Stämmen T-143 ergibt gemäß Beispiel 6 der Patentschrift S. aureofaciens ATCC 13 910 die höchste Ausbeute — 5,670 mcg/ml.

Gemäß den Vergleichsversuchen des Beispiels 4 der - ■ - ·"■ ..π.* ίπι/ι·5 Tv,oVir Tetrnr.vr.1in in

Beispiel	mcg/ml	Mikroorganismus
4	6580	S-2308
5	6080	S-2308
6	8770	S-2589
8	8060	S-2589
9	6070	S-2589

Beispiel	mcg/ml	Mikroorganismus
1 2 5 6	11100 12300 12200 10100	106-T 106-T 106-T 106-T

Die Versuche zeigen, daß mit dem Stamm Streptomyces 106-T wesentlich höhere Ausbeuten als mit den bekannten Stämmen erhalten werden.

Streptomyces lusitanus var. tetracyclini wurde in Brive-la-Gaillarde, Frankreich, an einem »Migoul« genannten Ort isoliert. Entsprechend den Kriterien der Klassifikationssysteme von Ettlinger et al. und P r i d h a m et al. wurde ermittelt, daß die isolierte Art von den vorstehend angegebenen Arten unabhängig ist.

Der Stamm 106-T bildet je nach den Fermentierungsbedingungen 9 bis 12 g Tetracyclin je Liter Fermentierungsbrühe. Die Bezeichnung »g/l« bezieht sich gemäß internationalem Brauch auf Tetracyclinhydrochlorid.

Streptomyces lusitanus var. tetracyclini 106-T hat gerade bis gewellte sympodial verzweigte Sporenträger, die keine Spiralen und keine Quirle, sondern nur offene Haken bilden. Die Oberfläche der Sporen ist glatt, wenn man sie durch ein Elektronenmikroskop ansieht. Die Form der Sporen ist eiförmig mit den Abmessungen 0,6 bis 0,8 μ bzw. 1,3 bis 1,7 μ. Die Farbe der Sporen in Masse reicht vom hellen Grau bis zum Olivbraun.

Gemäß Ettlingers Klassifikation gehört der Stamm 106-T zu der Gruppe: gerade bis gewellte, sympodial verzweigte Sporenträger, »griseus« bis »cinnamoneus«, glatte Sporen, mit Melaninpigment.

Gemäß dem Klassifikationssystem von P r i d h a m et al. gehört Streptomyces lusitanus var. tetracyclini zu der Gruppe: »Retinaculum Apertum«, Serie »Grau« bis »Olivbraun«.

In den folgenden Beispielen ist zur Erläuterung der Erfindung das Verhalten der Stämme 106-T,

Streptomyces aureofaciens, NRRL 2209 und Streptomyces viridifaciens, ATCC 11989 auf vierzehn verschiedenen Medien bei einer Inkubation von 26° C während 26 Tagen beschrieben.

„ ,, . ,,,„,„, ν goldgelben Farbe im Vergleich zu dem dunkelbronze-

1. Maxsquellwasser (0,6 %) farbenen Streptomyces 106-T. , ........

Agar-Agar 10 g

Maisquellwasser 50 °/₀ .......... 3 g 6. Bennett Agar

Glukose.. 15 g 5 Hefeextrakt.. .. ....... 0,5 g

(NHa)₂HPO₄ 2,5g Fleischextrakt. 0,5 g

KH₂PO₄ 7,5 g Hydrolisiertes Kasein Ig

MgSO₄-7H₂O Ig Glukose 5g

MnCl₂ 0,002g Agar-Agar .................... 10g

CuSO₄-SH₂O.. 0,002g io Destilliertes Wasser 500 ecm

ZnSO₄ · 7H₂O 0>^{025 g} Der auf 7 eingestellte pH ergab einen pH von 6,7

^Wasser ···■ 500ecm nach der Sterilisation. :

pH 7 nach der Sterilisation.

I Das Wachstum der drei Kulturen entspricht dem

j Das Luftmyzel von Streptomyces 106-T ist dunkel- 15 mit den Nährlösungen 1 und 2, doch bilden Strepto-

j braun, von Streptomyces aureof aciens dunkelgrau und myces aureof aciens und Streptomyces viridifaciens

1 das von Streptomyces viridifaciens grau bis fast kein Luftmyzel, und die Sporen von 106-T waren

ί schwarz. Streptomyces 106-T bildet ein dunkelbraunes »in der Masse« braun. Streptomyces aureof aciens und

I Diffusionspigment im Vergleich zu dem des Strepto- Streptomyces viridifaciens bilden kein diffundierbares

ί myces viridifaciens, das heller ist. Alle Stämme 20 Pigment, während 106-T ein dunkelbraunes Pigment

ί wuchsen gut. bildet.

I 2. Maisquellwasser (0,4 o/_o) 7. Glyzerin-Asparagin

% „ ,, ,. „ . ■ ., Glyzerin 5 g

j Zusammensetzung wie Medium 1 mit der Ab- Asparagin 0 25 ε

j weichung, daß es nur 2 g Maisquellwasser enthielt. 25 Fleischextrakt' " l'g

! Die drei Stämme wuchsen, wenn auch etwas langsamer, KHPO ' " 0 25e

f entsprechend dem Medium Nr. 1. Agar-Agar . 7*5 g

! 3. Gelatinemedium „ Destilliertes Wasser 5Oo'ccm

pH 6,9 nach der Sterilisation.

I Fleischextrakt 1,5 g 3<>

I Pepton ... 2,5 g Streptomyces aureof aciens bildet kein Luftmyzel;

! Gelatine 8o'g Streptomyces aureof aciens zeigt ein schwach gelblich-

1 Destilliertes Wasser 500 ecm weißes Wachstum ohne Bildung von Pigment. Strepto-

f: pH 6,2 vor der Sterilisation. myces 106-T wächst gut und bildet ein sehr spärHches, ; 35 hellbraunes Luftmyzel. Streptomyces viridifaciens I Die drei Kulturen wuchsen in gleicher Weise, eine wächst gut mit einem schweren, hellgrauen Luftmyzel I Verflüssigung lag nicht vor. Streptomyces aureofaciens ohne Bildung eines diffundierbaren Pigments. j und Streptomyces viridifaciens erzeugen kein diffundierbares Pigment; dagegen erzeugt Streptomyces 8· Czapek-Dox-Nährlösung

lusitanus ein gelbes und Streptomyces var. tetra- 40 NaNO₃ Ig

cyclini 106-T ein gelblichbraunes Pigment. K₂HPO₄ 0,5 g

_Λ η λ τλ π \· ma- MgSO₄ · 7H₂O''.'............... o',25g

^ 4. Czapek-Dox-Dextrin-Medium jtq q 2< Z

L- Dextrin.. 5g FeSO₄ ein kleines

I NaNO₃....... Ig 45 Kristall

I K₂HPO₄.. 0,5g Agar-Agar .... 7,5 g

I MgSO₄-7H₂O 0,25 g Destilliertes Wasser 500 ecm

KCl... 0,25g pH 7,1 nach der Sterilisation.

FeSO₄ ein kleines

Kristall 5° Streptomyces 106-T wächst nicht auf diesem wie

Agar-Agar 7,5 g auch auf allen anderen Medien, die nur anorganischen

Destilliertes Wasser 500 ecm Stickstoff als einzige Stickstoffquelle enthalten. Strep-

pH 6,8 nach der Sterilisation. '" ' tomyces aureofaciens und Streptomyces viridifaciens

wachsen gut, ohne jedes Luftmyzel, und sie zeigen die

Streptomyces 106-T wächst nicht auf diesem Me- 55 typisch hellgelbe Farbe, dium, wohl aber zeigen Streptomyces aureofaciens

und Streptomyces viridifaciens ein gelbgefärbtes 9 Emerson Asar vegetatives Wachstum, das typisch für diese Tetracyclin bildenden Stämme ist. Hefeextrakt 2 g

60 Lösliche Stärke 7,5 g

5. Kartoffelnährkörper K₂HPO₄ 0,5 g

Ein Kartoffelnährkörper (Durchmesser 1,5 cm, Höhe MgSO₄ · 7 H₂O 0,25 g

3 bis 6 cm) wird mit einer lOprozentigen Lösung von Agar-Agar 10 g

Natriumcarbonat gewaschen und in einem Versuchs- Destilliertes Wasser ....500 ecm

rohr zugleich mit 1,5 ecm destilliertem Wasser sterili- 65 pH 7 nach der Sterilisation, siert.

Streptomyces aureofaciens und Streptomyces viridi- Streptomyces 106-T wächst entsprechend dem ur-

faciens wuchsen gut mit der für diese Stämme typisch sprünglichen Streptomyces lusitanus-Stamm, aber

I 492 225

bildet ein leichtes olivlederbraunes Luftmyzel. Der Streptomyces aureofaciens zeichnet sich durch ein schwaches Wachstum ohne Bildung von Pigment aus; Streptomyces viridifaciens wächst besser und bildet ein spärliches Luftmyzel und ein hellgelbes diffundierbares Pigment.

10. Czapek-Dox-Stärke-Nährlösung

Lösliche Stärke 5 g

NaNO₃ Ig

K₂HPO₄ 0,5 g

MgSO₄-7H₂O 0,25 g

KCl 0,25 g

FeSO₄ ein kleines

Kristall

Agar-Agar 7,5 g

Destilliertes Wasser 500 ecm

pH 7 nach der Sterilisation.

Die Ergebnisse entsprechen denen, welche mit anderen ein Nitrat enthaltenden Nährlösungen erhalten werden. Streptomyces 106-T wächst nicht, während Streptomyces aureofaciens und Streptomyces viridifaciens ohne Pigment oder Luftmyzel mit einer gelborangenen Farbe wachsen.

11. Lackmusmilch pH 6,45 vor der Sterilisation.

Alle drei Kulturen wachsen sehr langsam in einem Ring längs des Versuchsrohres, ohne die Milch zu verdauen oder zu koagulieren. Es liegt ein kleiner, aber eindeutiger Unterschied in dem pH des Streptomyces 106-T einerseits und dem des Streptomyces aureofaciens und Streptomyces viridifaciens andererseits vor.

12. Nährlösung der Zusammensetzung

Fleischextrakt 1,5 g

Pepton 2,5g

Agar-Agar 7,5 g

Destilliertes Wasser ...: 500 ecm

pH ist nach der Sterilisation 6,8.

Die drei Kulturen verhielten sich gleich, aber Streptomyces 106-T bildet ein diffundierbares Pigment,

10

das dunkler als das von Streptomyces aureofaciens und Streptomyces viridifaciens ist.

13. Glukose-Asparagin-Nährlösung

Glukose Ig

Asparagin 0,25 g

Fleischextrakt ... Ig

K₂HPO₄ 0,25 g

Agar-Agar 7,5 g

Destilliertes Wasser 500 ecm

Der pH nach der Sterilisation ist 6,9.

Streptomyces aureofaciens und Streptomyces viridifaciens wachsen in gleicher Weise mit Luftmyzel, aber Streptomyces viridifaciens bildet ein schmutziges dunkelgelbes diffundierbares Pigment; Streptomyces 106-T bildet kein Luftmyzel.

14. Rohrzucker-Dex-trin-Nitrat-Nährlösung

Dextrin 5 g

NaNO₃ Ig

MgSO₄-7H₂O 0,25 g

KCl .·■ 0,25 g

Dextrose 15 g

FeSO₄ ein kleines

Kristall

Destilliertes Wasser 500 ecm

pH 7 nach der Sterilisation.

Streptomyces 106-T wächst nicht auf diesem Medium, während Streptomyces aureofaciens ein schwachgelbes vegetatives Wachstum zeigt; das vegetative Wachstum des Streptomyces viridifaciens ist dunkelorange.
Um die Unterschiede zwischen diesen drei Stämmen noch zu verfeinern und da 106-T in Gegenwart von anorganischem Stickstoff als alleiniger Stickstoffquelle nicht wächst, wurden Versuche mit sechs Kohlenstoffquellen nach der Methode von P r i d h a m und G ο 111 i e b durchgeführt, die von Z ä h η e r und Ettlinger im Arch. f. Mikrobiol., Vol. 26, S. 307, 1957, beschrieben ist. Die Beobachtungen wurden am zehnten Tage gemacht. Was die Verwertung einer Kohlenstoffquelle angeht, gehören nach der Klassifikation von Zähner und Ettlinger Streptomyces 106-T zur Gruppe HIe und Streptomyces aureofaciens zur Gruppe IHa.

Kohlenstoffquelle

Streptomyces 106-T

Verwertung von Kohlenstoff durch
Streptomyces aureofaciens gemäß

Villax

(Stamm

NRRL 2209) Zähner

und
Ettlinger

Benedict

Stämme:

NRRL-B1286,

1287,1288,

2209 ²)

Streptomyces
viridifaciens
³)

Rhamnose
Raffinose
d-Xylose .

d-Fructose

1-Arabinose
d-Mannitol

— Keine Verwertung.

+ Positive Verwertung.

.. Keine Versuchsergebnisse erhältlich. (—) Verwertung unwahrscheinlich. (+) Verwertung wahrscheinlich. +/— Positive oder negative Verwertung je nach den -bis(-)

(+) bis +

^x) Zähηer und Ettlinger, Arch. f. Mikrobiol., 26, 307, 1957.

²) B e η e d i c t et al., Appl. Microbiol. 3,1,1955.

³) USA.-Patent 2 886 595.

Was die vom Standpunkt der Klassifikation unspezifischen Kohlenstoffquellen angeht, so zeigen alle Stämme eine positive Verwertung von Glukose und Dextrose. Streptomyces 106-T wächst nicht in Gegenwart von Lactose, wohl aber Streptomyces aureofaciens und Streptomyces viridifaciens. Streptomyces 106-T wächst auf Cellulose, aber nicht Streptomyces aureofaciens und viridifaciens.

Streptomyces 106-T ist ein für industrielle Zwecke gezüchteter (selektionierter) Stamm, dessen taxonomisches Studium entsprechend den heute gültigen Klassifikationsbedingungen für sich allein nicht genügt. Aus dem gleichen Grund hat man Kulturen des Streptomyces lusitanus und Streptomyces lusitanus var. tetracyclini, wie ursprünglich aus dem Boden isoliert (Urstämme), aufbewahrt und bei verschiedenen Kultursammlungen hinterlegt.

Dementsprechend ist eine taxonomische Differenzierung von anderen bekannten Tetracyclin erzeugenden Stämmen in der Weise vorgenommen worden, daß man sowohl die Urstämme als auch die industriellen Stämme, die Gegenstand vorliegender Erfindung sind, miteinander verglichen hat. Eine taxonomische Tabelle befindet sich am Schluß der Beschreibung.

Da die verschiedenen selektierten Typen der industriellen Stämme nicht oder nur sehr ungenügend auf dem Ettlinger melaminfarbiges Pigment bildenden Nährboden (Hefeextrakt 0,5 g, L-Tyrosin 0,5 g, NaCl 4,25 g, Agar 8 g, Leitungswasser 500 ecm) wachsen, war eine Bewertung der melaminfarbigen Pigmentbildung mit Streptomyces 106-T nicht möglich. Die ursprünglich isolierten Streptomyces lusitanus und Streptomyces lusitanus var. tetracyclini (Urstämme oder Mutterstämme der industriell verwertbaren Stämme) wurden besonders auf diesem Medium geprüft. Streptomyces lusitanus bildete innerhalb von zwei Tagen auf diesem Tyrosin-Medium ein rötliches Pigment (das höchstwahrscheinlich entweder aus Hallochrom oder 5,6 Dihydroxyindol besteht), das langsam zu einem dunklen Pigment oxydiert, dessen

Farbe mit der Änderung des pH nicht verändert wird. Die Ultraviolett-Absorptions-Kurve des extrahierten Pigments ist identisch mit der, die von S c h m i d 1 i für Melaninpigment in Helvetica Quimica Acta, 38, S. 1078, 1955, beschrieben worden ist. Streptomyces

ίο lusitanus var. tetracyclini bildet unmittelbar nach drei bis vier Tagen (ohne Bildung des roten Pigments als Zwischenprodukt) ein schwarzes Pigment, das in jeder Beziehung dem »synthetischen Melanin« entspricht, das durch Oxydation von Dopa(/9-(3,4-dihydroxyphenyl)-«-alanin) gewonnen wird.

Sowohl Streptomyces lusitanus als auch Streptomyces lusitanus var. tetracyclini bilden auf Tyrosin-Medium ein melaninfarbiges Pigment, wenn auch auf zwei verschiedenen Wegen; während weder

ao Streptomyces aureofaciens noch Streptomyces viridifaciens melaninfarbiges Pigment auf einem dieser Wege bilden.

Der Mutterstamm von Streptomyces lusitanus var. tetracyclini hat die Neigung, auf gewissen Medien, wie z. B. auf Ettlingers Tyrosin-Agar, Sklerotium zu bilden.

Streptomyces 106-T wie auch der Mutterstamm wächst bei 5O⁰C. Es wurde weder mit Streptomyces lusitanus noch mit Streptomyces lusitanus var. tetracyclini eine Quirlbildung beobachtet, während bei reifen Kulturen sowohl von Streptomyces aureofaciens und Streptomyces viridifaciens oft Quirle gefunden wurden.

In der folgenden Tabelle sind die wichtigsten taxonomischen Unterschiede zwischen Streptomyces lusitanus und Streptomyces aureofaciens zusammengefaßt

Wesensmerkmal der Unterscheidung

Streptomyces 106-T

Streptomyces aureofaciens

Morphologie der Sporenträger

Farbe der Sporen en masse

Bildung von melaninfarbigem Pigment auf Tyrosin-Nährboden

Verwertung einer anorganischen Stickstoffquelle

Verwertung von Kohlenstoff quellen nach Zähner und Ettlinger

Der vorstehende Vergleich zeigt, daß sich Streptomyces 106-T beachtlich von Streptomyces aureofaciens bzw. Streptomyces viridifaciens unterscheidet.

Die einzige Verschiedenheit zwischen den Urstämmen und Streptomyces 106-T ist, daß die Sporenträger des Urstammes zur Gruppe »Spira« gehören, während Streptomyces 106-T zur Gruppe »Rectinaculum apertum« gehören. Doch die Sporenträger sind in allen vier Stämmen sympodial verzweigt.

Die einfache Tatsache, daß Streptomyces 106-T 2 bis 5 g/l Tetracyclin mehr bildet, als dem höchsten Wert entspricht, der in der Literatur für einen Tetracyclin bildenden Mikroorganismus gefunden wird, zeigt mittelbar ebenfalls die Unabhängigkeit dieses Stammes.

Es wurde gefunden, daß die Anwendung eines Hydrolyseproduktes von Stärke die Menge der je sympodiale Verzweigung;

keine Quirle
cinnamoheus bis griseus

kein Wachstum

(Urstamm positiv)
negativ

gehört zur Gruppe HIe

monopodiale Verzweigung;

Quirle liegen vor cinereus

negativ positiv gehört zur Gruppe lila

Liter Brühe zur Verfügung stehenden Kohlenstoffquelle zu steigern vermag, wobei eine solche Steigerung von einer wesentlichen Ausbeutesteigerung hinsichtlich der antibiotischen Aktivität je Liter fermentierter Brühe begleitet ist, obwohl sowohl Streptomyces lusitanus als auch Streptomyces lusitanus var. tetracyclini Stärke hydrolysieren.
Die besten Ergebnisse werden mit einem Hydrolyseprodukt erzielt, das nicht mehr als 20% nicht hydrolysierter Maisstärke und nicht mehr als 20% des Di- und Monomeren enthält, wobei der Rest von 60% aus Oligomeren besteht. Wenn man ein solches HaIb-Hydrolysat von Stärke verwendet, kann man dem Medium bis 65 g/l zusetzen, ohne daß es zu viskos wird. Wenn man — um einen Vergleich zu geben — 65 g/l Maisstärke oder sogar wesentlich kleinere Mengen zusetzt, führt dies fast zu einer Verfestigung

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des Mediums, was eine submerse Fermentierung undurchführbar macht. Die Ausbeuten an Tetracyclin liegen unter solchen Bedingungen im allgemeinen über 12 g/l. Die Erhöhung der Kohlenstoffquelle erlaubt andererseits, von der Verwendung von Schmalzöl als Kohlenstoffquelle abzusehen, ohne daß ein beachtlicher Ausbeuteverlust eintritt, was wiederum einen großen Vorteil für die Länder, wie die mohammedanischen bedeutet, in welche Schmalzöl eingeführt werden muß. Die Schaumbildung kann dann durch die Anwendung einer kleinen Menge eines Silikons als Antischaummittel gesteuert werden.

Das für die industrielle Fermentierung durch Streptomyces 106-T dienende wäßrige Nährmedium enthält assimilierbare Quellen organischen Stickstoffs, Kohlenstoff und Mineralsalze einschließlich Chloride, die das Wachstum des Mikroorganismus fördern.

Als Stickstoffquelle kann man ein Hydrolysat von Kasein, einen Extrakt von Malz, Gerste oder Mais, Maisquellwasser, Erdnußmehl, Sojamehl u. dgl. verwenden.

Als Kohlenstoffquelle kann man verschiedene Kohlehydrate, wie Glukose, Dextrose, Maltose, Trehalose, Stärke, Stärkehydrolysat, Dextrin, tierische oder pflanzliche Fette oder Fettsäuren verwenden.

Die Mengen und Anteile der Nährstoffe sind in den Beispielen angegeben.

Die Ausbeute an Tetracyclin kann durch einen Zusatz von Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin (DBÄD) als Acetat oder Lactat zur Brühe in einer Menge von 0,01 bis 1,5 g/l erhöht werden, im Vergleich zu der, welche bei gleichzeitig laufenden Parallelversuchen ohne Zusatz von DBÄD erhalten wird. DBÄD wird der Brühe vorzugsweise in verschiedenen Mengen während der Fermentierung zugesetzt. Die Fermentierung wird bei einer Temperatur zwischen 24 und 30⁰C unter Rühren und starker Belüftung durchgeführt, die zwischen 0,1 und 4,0 Teile je Minute des zu fermentierenden Volumens je nach der Phase der Fermentierung erfordert. Die zur Erzielung der höchsten Ausbeute erforderliche Fermentierungszeit schwankt je nach den Fermentierungsbedingungen zwischen 96 und 150 Stunden. Die fermentierte Brühe enthält keine meßbare Menge von Chlortetracyclin, so selektiv ist die Herstellung von Tetracyclin.

Als indirekter Beweis dafür, daß Streptomyces lusitanus var. tetracyclini ein von Streptomyces aureofaciens unabhängiger Stamm ist, kann die Tatsache angesehen werden, daß die während der Fermentation entwickelte Farbe des gesamten fermentierten Maisches, welcher kein Chlortetracyclin enthält, wesentlich verschieden ist von der für Streptomyces aureofaciens in der USA.-Patentschrift 3 092 556 beschriebenen Farbe. Die spektrophotometrischen Reflexionswerte des gesamten fermentierten Maisches von Streptomyces 106-T werden in 1-cm-Glaszellen bei Wellenlängen von 400 bis 700 πιμ bestimmt unter Benutzung von Magnesiumcarbonat als Vergleich. Die Werte der Reflexionsstärke (R) sind nach den in der USA.-Patentschrift 3 092 556 beschriebenen Versuchen für Streptomyces aureofaciens immer größer als ^R₄₃₀ und für Streptomyces 106-T immer kleiner als ^R₄₃₀, obwohl keine nachweisbare Menge von Chlortetracyclin (<50mcg/ml) in dem Maisch des Streptomyces 106-T enthalten ist.

Das als Tetracyclin-Hydrochlorid gewonnene Endprodukt hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften: Zersetzung bei etwa 214°C; optische Drehung /tx/f -258 (C, 0,5 in 0,1 N HCl); es ist sehr löslich in Wasser, Methanol und Äthanol. Die Elementaranalyse der Trihydratbase entspricht der Formel C₂₂H₂₄N₂O₈-SH₂O, der Schmelzpunkt liegt bei 170 bis 175° C unter Zersetzung.

Das erhaltene Produkt entspricht sowohl in der Form einer Base als auch als Hydrochlorid in allen physikalischen chemischen und biologischen Merkmalen denen, die in der Literatur für Tetracyclin beschrieben sind.

ίο Das Verfahren vorliegender Erfindung bietet für eine industrielle Anwendung des Streptomyces 106-T den großen Vorteil, daß sehr hohe Ausbeuten mit einem sehr billigen Kulturmedium erzielt werden.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, jedoch nicht zu ihrer Beschränkung.

Beispiele

1. Alle Medien wurden mit Leitungswasser hergestellt. 1 Liter eines sterilisierten Mediums hatte die folgende Zusammensetzung:

Maisquellwasser 50 % 10 g

Zucker 10 g

CaCO₃ Ig

(NH₄)₂HPO₄ 2 g

KH₂PO₄ 2 g

MgSO₄-7H₂O 0,25 g

Wasser, aufgefüllt bis auf 1000 ecm

,₀ pH 6,4 nach der Sterilisation.

1 Liter Kulturmedium wurde in einem Kolben mit

1 ml einer Suspension reifer Sporen von Streptomyces 106-T in physiologischer Kochsalzlösung geimpft und auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung 36 Stunden bei 26° C gehalten.

Dann wurde ein Vorfermenter, der ein Fassungsvolumen von 150 1 hatte und ein Medium folgender Zusammensetzung enthielt:

Maisquellwasser 50 % 35 g

CaCO₃ 13g

Zucker 5 g

Wasser, aufgefüllt bis auf 1000 ecm

pH 6,7 nach der Sterilisation,
45

mit der vorstehend angegebenen 36-Stunden-Kultur geimpft und bei 26° C 24 Stunden unter Rühren und steriler Belüftung fermentiert.

Schließlich wurde ein Fermenter, der ein Fassungsvermögen von 6000 1 hatte und ein Medium folgender Zusammensetzung enthielt:

Maisquellwasser 50°/o ■·· 28g

Calciumcarbonat 14 g

Stärke 38 g

(NH₄)₂SO₄ 5,7g

NH₄Cl 1,5g

MnSO₄-4H₂O 0,05 g

CoCl₂-OH₂O 0,002g

ZnSO₄ 0,05 g

Erdnußmehl 25 g

Schmalzöl je Liter Leitungswasser 35 g
pH 6,7 bis 6,8 nach der Sterilisation,

mit der vorstehend angegebenen 24-Stunden-Kultur geimpft und 24 Stunden bei 30° C und einer Belüftung von 1,5 1/1 je Minute fermentiert. Dann wurde die Temperatur auf 26⁰C erniedrigt und die Belüftung

11 12

langsam in der Weise gesteigert, daß am Ende von Maisquellwasser 50% ......... 31g

140 Stunden eine Belüftung von 41/1 pro Minute Calciumcarbonat .... 14 g

erreicht war. Semi-hydrolysat von Stärke, das

Nach einer Fermentierung von 140 Stunden erhält nicht mehr als 20 % nicht hy-

man 11,1 g Tetracyclin je Liter; Chlortetracyclin war 5 drolysierter Maisstärke und nicht

nicht nachzuweisen (<50mcg/ml). mehr als 20% Mono- und Di-

2. Es wurde gemäß Beispiel 1 verfahren, aber dem meres aufwies, der Rest bestand

letzten Kulturmedium 0,5 g/l Ν,Ν'-Dibenzyläthylen- aus Oligomeren 63 g

diamindiacetat in vier gleichen Anteilen nach 0, 36, (NH₄)₂SO₄ · ·.· · 5,7 g

72 und 98 Stunden der Fermentierung zugesetzt. Nach io NH₄Cl 1,5 g

140 Stunden wurde Tetracyclin in einer Menge von MnSO₄ · 4H₂O 0,05 g

12,3 g/l erhalten. CoCl₂ · 6H₂O 0,002 g

3. Der nach Beispiel 1 erhaltene fermentierte Maisch ZnSO₄ 0,05 g

wurde mit 25prozentiger Schwefelsäure auf einen pH FeSO₄ 0,04 g

von 1,5 angesäuert, mittels eines Drehfilters filtriert 15 Erdnußmehl 25 g

und das Myzelium dann zweimal mit Wasser bei einem Schmalzöl 28 g

pH von 1,5 extrahiert. Dem vereinigten Filtrat wurde Erdnußöl 4 g

18 kg Äthylendiamintetraacetat (Sequesteringmittel) ph 6 7 bis 6 8

und 16,5 kg DBÄD-Diacetat zugesetzt, und dann ' '

wurde das pH langsam mit 12prozentigem Ammoniak 20 Die Endausbeute betrug 12,2 g/l. Chlortetracyclin

auf 9,7 eingestellt. Nach dreistündigem Rühren wurde konnte im Brei nicht festgestellt werden. (< SOmcg/cc).

die Fällung abfiltriert, die im wesentlichen aus einem Aus der Reflexionskurve des gesamten fermentierten

unreinen DBÄD-Tetracyclinkomplex bestand, der die Maischs erhäls man für ZlR₄₂₀ den Wert 18 und für

Formel DBÄD · Ca · (Tetracyclin).; hatte. Der feuchte ZlR₄₃₀ den Wert 92,4.

Niederschlag wurde dann unter Rühren in Wasser 25 6. Das Beispiel 5 wurde ohne Schmalz und Erdnußöl suspendiert, das mit einer lOprozentigen wäßrigen wiederholt und die Schaumbildung durch ein Silikon-Lösung von Oxalsäure auf ein pH von 1,5 ange- Antischaummittel gesteuert. Die Ausbeute betrug säuert war. Die Lösung wurde dann filtriert und das nach einer Fermentierung von 136 Stunden 10,1 g/l. pH auf 5,8 mit einer lOprozentigen wäßrigen Natrium- In dem Brei konnte kein Chlortetracyclin festgestellt hydroxydlösung eingestellt. Die Tetracyclinbase fiel 30 werden.

aus und wurde abfiltriert, gewaschen und unter Va- 7. 40 ecm des sterilisierten Kulturmediums der im

kuum bei 65° C getrocknet. Tatsächliche Ausbeute Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung wurde für

83,5 %> berechnet in Aktivität. die Endfermentierung mit sich entwickelnden Sporen

4. Das Beispiel 3 wurde wiederholt, aber an Stelle von Streptomyces 106-T in einem 300-ccm-Erlenmeyervon DBÄD 16 kg N,N'-Dibenzyläthylendiimin 35 Kolben geimpft und der Kolben 7 Tage bei 28°C in (C₆H₅ · CH = N · CH₂ · CH₂ · N = CH · C₆H₅) bei einer rotierenden Schüttelvorrichtung stehengelassen. pH 6 zugesetzt. Nutzbare Ausbeute als Base, berechnet Die Reflexionskurve des gesamten fermentierten in Aktivität, 86%· Maisches wurde ermittelt und die Δ R-Werte berechnet,

5. Das Beispiel 1 wurde wiederholt, aber für den und es wurden gefunden: ZlR₄₂₀ = 3,8 und ZlR₄₃₀ Hauptfermenter folgendes Medium verwendet: 40 = 34,2.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zum Herstellen von Tetracyclin auf biologischem Wege durch Züchten von Streptomyceten-Stämmen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Stamm den Mikroorganismus Streptomyces lusitanus var. tetracyclini 106-T verwendet.

IO einem Medium, das nur eine beschränkte Menge Chloridionen enthält, als in einem Medium mit einer Höchstmenge an Chloridionen.

Vergleichsversuche mit den in der USA,-Patentschrift genannten Stämmen S. aureofaciens S-2308 und S-2589 sowie mit den in den unten folgenden Beispielen 1, 2, 5 und 6 aufgeführten Stämmen von Streptomyces lusitanus var. tetracyclini 106-T ergaben folgende Ausbeuten an Tetracyclin: