DE3022250A1 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums cephamycin c - Google Patents

Description

Otsuka Pharmaceutical Co.. Ltd., Tokyo / Japan

Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephamycin C

Die Erfindung betrifft ein'Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephamycin C.

Cephamycin C ist ein bekanntes Antibiotikum, nämlich 7-(5-Amino-5-carboxyvalerylamino)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure der folgenden planen Formel

OCH

H₇N-CH(CH., "W -CHN
-: COOH 0

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Eine Reihe von Verfahren ist bereits zur Herstellung von Cephamycin C unter Verwendung verschiedener Streptomyces-Stärame bekannt. Z.B. wird S. jumonjiensis, S. laetamgenes, S. sp. P 6621, S. clavuiigerus, S. lactamduians in den US-Patentschriften 3 770 590, 3 865 693 und 3 977 942, in der GB-PS 1 425 081, in den japanischen Patentschriften 69294/75 und 11Q97/76 und in der japanischen Offenlegungsschrift 49071/77 beschrieben.

Es besteht ein Bedürfnis, Cephamycin C unter Verwendung von Mikroorganismen in wesentlich besseren Ausbeuten und nach einfacheren Verfahren herzustellen.

Nach gründlichen Untersuchungen wurde nun ein neuer Stamm Streptomyces sp. OFR 1022 aus dem Boden in Kenia isoliert, der grosse Mengen Cephamycin C in einem Kulturmedium bildet und vorteilhaft die technische Herstellung von Cephamycin C ermöglicht. Auf dieser Forschung beruht die neue Erfindung.

Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Cephamycin C und ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm Streptomyces sp. OFR 1022 in einem Kulturmedium kultiviert und darin Cephamycin C ansammelt und daraus Cephamycin C gewinnt.

Fig. 1 ist ein Ultraviolett-Adsoprtionsspektrum von Cephamycin C, das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten wurde.

Fig. 2 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum des erwähnten Cephaymcin C, und

Fig. 3 ist ein protonen-kernmagnetisches Resonanzspektrum (NMR) von Cephamycin C.

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Der erfindungsgemäss verwendete neue Stamm Streptomyces sp. OFR 1022 hat eine aussergewöhnliche Produktivität für Cephamycin C im Vergleich zu den bekannten Cephaymcin C produzierendem Stämmen und hat eine hohe optimale KuI-tivierungsteinperatur im Vergleich zu den bekannten Stämmen. Infolge dessen ist es mit dem erfindungsgemässen Verfahren möglich, Cephamycin C herzustellen, ohne dass man irgendwelche Kühlverfahren anwenden muss, unter Anwendung von einfachen Verfahrensweisen und Vorrichtungen, wobei man das Produkt in grossen Mengen zu niedrigen Kosten und in guten Ausbeuten erhält«

Die Erfindung stellt somit einen ganz erheblichen Fortschritt bei der Herstellung von Cephamycin' C dar.

Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes Streptomyces sp. OFR 1022,der erfindungsgemäss verwendet wird/ sind die folgenden:

(T) Morphologische Eigenschaften

"Die Beobachtungen wurden gemacht nachdem man den Stamm bei 28°€ während 3 Wochen wie folgt kultiviert hat.

Das Oberflächenmycel besteht aus einer Hauptachse und einfachen Verzweigungen entlang der Hauptachse. Diese Verzweigungen bilden häufig Agglomerate. Auf dem Kulturmedium, auf dem die Sporenbildung stattfindet, liegt die Verzweigung nur etwas in Kreisform vor, und im allgemeinen bildet sie eine vollständige Spirale, in welcher sie mehrere Male aufgewunden ist. Die Sporen haben eine spinal« oberfläche und sand kreisförmig oder elliptisch in Form und haben eine Grosse von 0,7 bis 1,0 μΐη χ 1,1 1,3 {im. It): oder mehr Sporen bilden eine Kette.

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(II) Kultureigenschaften auf verschiedenen Agarmedien

Die Beobachtungen wurden mit Stämmen gemacht, nachdem diese drei Wochen bei 2ß°C auf den in Tabelle 3 gezeigten Medien kultiviert worden waren. Die Farbtönung wird im Vergleich zu dem Color Harmony Manual^ Container Corporation of America, Chicago, bestimmt*

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Tabelle

O If» G

Kultur	Wachstum	Oberfläche-	Substrat-
medium		mycel	mycel
Saccharose	massig	massig, pulve	hell elfen
Nitrat-Agar		rig, natürlich	bein 2ca
		2dc
Glucose-	massig	reichlich,	perlrosa
Asparagin-		samtähnlich,	3ca
Agar		gelb-braun
		gefärbt, 2ge
		beige, 3ge
Glycerin-	gut, etwas	reichlich, samt	senffarben
Asparagin-	spärlich	ähnlich, silber	21 g
Agar	(kreisförmig)	grau, 3fe, beige-
		baun, 3ig
Stärke-	gut	reichlich,	senffarben
anorgani		samtähnlich,	21 g
sche Salze-		silbergrau,
Agar		3fe

Rückseite lösliches

Pigment

bambus, 2gc kein

perlrosa, 3ca kein

ziegelbraun, Spur gelb 31g

ziegelbraun, kein 31 g

Fortsetzung Tabelle

Kulturmedium

Tyorin-Agar

Nähr-Agar

Hefe-Malz-Agar

Hafermehl-Agar '

Wachstum massig

schlecht

CfUt

Oberflächenmycel

reichlich, samtähnlich, natürlich, 2dc

kein

Substratmycel

ziegelbraun 31g

bambus, 2gc

reichlich, samt- camel, 3ie ähnlich, weiss

cjut, spar- samtähnlich, Elfenbeinlich (kreis- pulverig, beige- tönung, 2cb förmig) braun 3ig Rückseite

nelkenbraun, 3ni

zimt, 31e

lösliches Pigment

ziegelbraun, 31g

Elfenbein- kein tönung, 2cb

kein

silberbrau, kein 3fe

Pepton-Hefe-Eisen- Agar

massig schlecht

kein

beige-braun 3 ig gelb-braun tiefbraun 2ge 3pl

(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Wachstumstemperaturbereich 15°C bis 46°C (optimale Wachstumstemperatur etwa 37°C)

(2) Wachstums-pH-Bereich pH 4,5 bis 8,5 (optimaler WachstumspH etwa 6,5)

(3) Verflüssigung von Gelatine (in einem Glucose-Pepton-Gelatine-Medium, 20⁰C) negativ

(4) Hydrolyse von Stärke (in einem Stärke-anorganische Salze -Agar-Medium) positiv

(5) Koagulierung und Peptonisierung von entrahmter Milch

Peptonisierung

(6) Produktion von Melanoidin-Pigment

positiv (in Tyrosin-Agar, einem Pepton-Hefe-Eisen-Agar und einer Trypton-Hefeextraktbrühe)

(7) Reduktion von Nitraten negativ

(8) Zersetzung von Cellulose negativ

(9) NaCl-Toleranz

wächst bei 3 % und wächst nicht bei 5

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(IV) Verwendung von Kohlenstoffquellen (in einem Pridham-Gottlieb-Agar-Medium)

L-ÄrabinoDG +_

D-Xylose +

D-Glucose ++

D-Fructose +

Saccharose ++

Inosit ++

L-Rhamnose -

Raffinose j+

D-Mannit ++

Anmerkung: ++: gute Verwertung; +: Verwertung;

_+: etwas Verwertung; -: keine Verwertung.

(V) Diaminopimelinsäure in der Zellwand LL-Diaminopimelinsäure

Der erfindungsgemässe Stamm OFR 1022 gehört zum Genus Streptomyces; aufgrund der internationalen Streptomyces Project-Methode (ISP), der Morpholgy der .sporenbildenden Mycele gehört er zu der Sektion Spiralis; die Oberflächen der Sporen ist spinal und die Farbe des ausgewachsenen Oberflächenmycels entspricht der Graufarbreihe und es wird ein Melanoidpigment, aber sonst praktisch kein anderes Pigment gebildet. Berücksichtigt man fernerhin die Tatsache, dass das Substratmycel und die Rückseite schwach gelb-gelbbraun oder hellbraun sind and die verschiedenen vorher beschriebenen Daten, wie die physiologischen Eigenschaften und die Verwendung von Kohlenstoffquellen, so ist die Einteilung des vorliegenden Stammes derart, dass dieser Stamm am ähnlichsten Streptomyces filipinensis

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und Streptomyces gannmycicus ist, entsprechend Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1974), S.A. Waksman, The Actinomycetes, Band 2 (1961) und E.B. Shirling and D. Gottlieb, International Lournal of Systematic Bacteriology, Band 18, S-. 69 bis 189 (1968), Band 18, S. 279 bis 392 (1968, Band 19, S. 391-512 (1969) und Band 22, S. 265 bis 394 (1972).

Deshalb wurde der vorliegende Stamm und die Art der Stämme, die diesem Stamm am meisten entsprechen, unter gleichen Bedingungen kultiviert und dann verglichen.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

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Tabelle 2

Streptomvces sp. OFR 1022

Streptomyces filiplnensis ISP 5112

Streptomyces gannmycicus
ISP 5572

O
U
O
O

Form des Oberfla-'.·
chenmycels

Wachstum auf

Saccharose-Nitrat-

Agar

Oberflächenmycel

Rückseite
lösliches Pigment

einfache Verzweigungen werden entlang d. Hauptachse gebildet, Oberflächenmycele, bilden oft Kreise und geschlossene Spirale, die sich mehrere Male in der Spitze ' winden,und die selten in geschlossener Form vorliegen

büschelig, enge Spiralkreise oder hakenähnlich am oberen Ende

einfache Verzweigung. Das obere Ende ist hauptsächlich RF, liegt selten in einer offenen Spirale oder einer engen Spirale vor

massig, hell-elfen- bein 2ca	2gc	gut, pastellgelb, 1db	pulverig,	schlech
massig, pulverig, natürlich, 2dc		massig, weiss	2 ge	nicht
bambus,	bambus,		farblos
nicht	nicht	nicht

Fortsetzung Tabelle

Glucose-Asparagin-Agar-Wachstum

Oberflächenmycel

Rückseite
lösliches Pigment Nähr-Agar-Wachstum

Oberflächenmycel Rückseite
lösliches Pigment

massig, perlrosa, 3ca

reichlich, samtähnlich, gelbbraun, 2ge bis beige, 3ge

perlsosa, 3ca nicht

schlecht bambus, 2gc

nicht

elfenbein, 2cb nicht

gut,
senfbraun

gut
senf, 21e

reichlich, pulve- massig, pulverig rig, natürlich, 2dc oberflächengrau,2fe bis oberflächengrau,2fe

beige-braun, 3ig
Spur gelb

massig, schlecht
stroh, 2fb

nicht

elfenbein,2db
nicht

O O <5>	Pepton-Hefe-Eiisen- Agar-Wachstum	massig bis beige-braun	schlecht , 3ig	massig, hei farbig, 2ie	lsen
**^	Oberflächenmycel	nicht		nicht
•U	Rückseite	gelbbraun,	2 ge	gelbbraun,	2 ge
09	lösliches Pigment	dunkelbraun	, 3pl	gelb-ahorn,	3ng

gelb-ahorn, 3ng Spur gelb

massig, bambus, 2gc

schlecht, weiss

creme, 1^- ca

nicht

gut, bambus, 2gc

schlecht, weiss hell-aprikot, 2ea Spur braun

Fortsetzung Tabelle

Physiologische Eienschaften

Obere Grenze der Wachstumstemperatur

Wachstums-pH-Bereich

Verflüssigung von Gelatine

Hydrolyse von Stärke

wächst bei 26⁰C und wächst nicht bei 60⁰C

4,5 - 8,5 negativ

positiv

Peptonisierurig von entrahmter Milch positiv

Melanoidpigment. Bildungsfähigkeit

Trypton-Hefe-Extraktbrühe +

Peton-Hefe-Eisen-Agar

Tyrosin-Agar

Reduktion von Nitraten

Wächst bei 46⁰C und wächst nicht bei 6O⁰C

4,5 - 10,5 negativ

positiv positiv

wächst bei 42⁰C und wächst nicht bei 46°C

4,5 - 11,0 positiv

positiv (stark) positiv (stark)

negativ positiv

positiv (schwach)

in

Fortsetzung Tabelle 2

Verwendung von Kohlenstoffquellen

L-Arabinose

P-Xylose

D-Glucose

D-Fructose

Saccharose

Inosit

L-Rhamnose

Raffinose

D-Mannit

Anmerkung: ++: gut ausgenutzt; +: ausgenutzt; _+ wenig ausgenutzt; -: nicht ausgenutzt.

Tabelle 2 sagt folgendes aus:

(1) Der vorliegende Stamm OFR 1022 unterschiedet sich von Streptomyces filipinensis ISP 5112 darin, dass itreptomyces filipinensis ISP 5112 ein büscheliges Oberflächenmycel hat, und dass deren Enden enge Spiralen bilden oder kreis- oder hakenförmig sind, und dass die Farbe des Substratmycels auf dem Glucose-Asparagin-Agar-Medium senfbraun 2pl und die Rückseite beige-braun 3ig ist, dass es die Fähigkeit hat, Nitrat zu reduzieren, und dass es L-Arabinose und Raffinose gut verbraucht.

(2) Der vorliegende Stamm OFR 1022 unterscheidet sich von Streptomyces gannmycicus ISP 5572 darin, dass der Hauptteil des Oberflächenmycels von Streptomyces gannmycicus ISP 5572 in Form der Sektion RF (Rectiflexibiles) vorliegt und kaum in der etwas offenen Spiral- oder in der engen Spiralform, dass das Wachstum"auf einem Saccharose-Nitrat-Agar-Medium schlecht ist, und dass man keine Ausbildung von Oberflächenmycelen feststellt, und dass man andererseits Entwicklung von Oberflächenmycelen auf Nähr-Agar-Medium und auf Pepton-Hefe-Eisen-Agar-Medium feststellt und dass er ausserdem nicht bei 46⁰C wachsen kann, dass er Gelatine verflüssigt, und dass er die Fähigkeit hat, als Kohlenstoffquelle besonders gut L-Arabinose, L-Rhamnose und Raffinose zu verwenden, während er Saccharose nicht verbrauchen kann.

Somit wird ersichtlich, dass der vorliegende Stamm OFR 1022 ein neuer Stamm ist, der sich von Streptomvces filipinensis und Streptomyces crannmycicus, denen er am ähnlichsten ist, unterscheidet.

Der vorliegende Stamm OFR 1022 wurde als Streptomyces

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— i *7 — ι

NACHGEREiOHT!

sp.OFR 10 22 bezeichnet und beim Fermentation Research
Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, Ibaragi,.Japan, unter der Mikroorganismus-Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 4985 und bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, USA,unter der Hinterlegungsnummer ATCC
31 666 hinterlegt.

Für die vorliegende Erfindung ist es wesentlich, Streptomyces sp. OFR 1022 oder einen natürlichen oder künstlichen Mutanten davon zu verwenden. Die Kultivierung des vorliegenden Stammes oder eines Mutanten davon kann nach üblichen Kultivierungsverfahren erfolgen, und zwar vorzugsweise in einem flüssigen Kulturmedium mittels einer Schüttelkultur oder einer belüfteten gerührten Kultur.

Eine Reihe bekannter Nährmittel für Actinomycetes kann zur Kultivierung des vorliegenden Stammes verwendet werden. Nährmittel, die als Kohlenstoffquelle verwendet werden können, schliessen Glucose, Saccharose, Glycerin, Maltose, Dextrin,. Stärke, Sojabohnenöl, Bauirwollsamenöl und dergleichen ein. Nährmittel, die als Stickstoffquelle verwendet werden können, schliessen Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Baumwohlsamenmehl, Hefe, Fischmehl, Maismaische, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Hafermehl, Kaseinhydrolysat, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen ein. Anorganische Salze schliessen Magnesiumsulfat, Phosphor säuresalze, Kaliumcarbonat und dergleichen ein.

Notwendigerweise oder gewünschtenfalls kann man zu dem Kulturmedium eine geringe Menge eines Metallsalzes und geeignete Mengen an Aminosäure, wie a-Aminoadipinsäure, Natriumthiosulfat, Natriumdithionit, Glycin, L-Phenylalnin, Arginin und Ornithin und Diamine, wie 1,3-Diaminopropan,

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1 , S-Diamino^-hydroxypropan. Polyamine, wie Spermidin und dergleichen zugeben. Im Falle einer Flüssigkultivierung kann man als Entschäumungsmittel Silikon, Pflanzenöl, oberflächenaktive Stoffe und dergleichen zugeben.

Der pH des Kulturmediums liegt im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 8,0 und vorzugsweise bei etwa 6,0, und die Kultivierungstemperatur liegt bei etwa 15°C bis etwa 46°C und vorzugsweise etwa 37⁰C. Die maximale Prdouktionsmenge an dem gewünschten Cephamycin C wird gewöhnlich in einem Zeitraum von 72 bis 96 h erhalten. Z.B. kann man bei einer Kultivierung in einem 5-1-Fermentator eine Menge von etwa 2 mg/ml Cephamycin C ansammeln. Das Cephamycin C liegt hauptsächlich in dem flüssigen Teil der Kulturlösung vor, weil es gut in Wasser löslich ist.

Nach Beendigung der Kultivierung werden die Mycele und andere Feststoffe durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt, und das in dem Filtrat vorhandene Cephamycin C wird in einfacher und üblicher Weise isoliert unter Anwendung üblicher physikalischer und chemischer Trennmethoden. Zur Reinigung kann man eine Reihe von Adsorbentien, wie Ionenaustauschharze, Kieselgel und Aktivkohle, verwenden. Beispiele für Ionenaustauschharze sind saure Kationenaustauschharze und basische

Anionenaustauschharze. Stark basische Anionenaustauschhärze werden vorzugsweise verwendet. Typische Beispiele sind ' Diaion PA 406 (hergestellt von der Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), Dowex 50Wx4 (hergestellt von der Dow Chemical Corp.), Dowex 1x2 (hergestellt von der Dow Chemical Corp.).

Das auf dem Adsorptionsmittel adsorbierte Cephamycin C wird mit Wasser, Kochsalzlösung oder einer Methanol-Wasser- ^v Mischung, einer n-Butanlo-Wasser-Mischung,· einer Aceton-Wasser-Mischung oder dergleichen eluiert.

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- 19 - "5 Π-*> *> O E .

Zur Reinigung νη Cephamycin C kann man Chromatografie unter Verwendung von Kieselgel oder Avicel (hergestellt von der Asahi Kasei Kogyo, K.K.) anwenden.

Durch eine geeignete Kombination der vorerwähnten Reinigungsverfahren und durch Wiederholung derselben kann man reines Cephamycin C erhalten.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäss hergestellten Cephamycins C sind die folgenden:

(1) Aussehen: weisses Pulver .(2)- Spezifische Drehung:

on
[a]£^U = 221° (C=O,4, H₂O)

(3) Löslichkeit: löslich in Wasser, kaum löslich in

Äthanol und wenig löslich in Dimethylsulfoxid.

(4) Farbreaktion: positiv gegenüber Ninhydrin-Reaktion und

Jod-Reaktion und negativ gegenüber Ferridchlorid-Reaktion. j

(5) Dünnschichtchromatografie (TLC):

Die Entwicklung wurde unter Verwendung einer Lösung von n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 2:1:1 (V/V) auf einer dünnschichtchromatografischen Kieselgelplatte GF 254 (hergestellt von Merk & Co.) vorgenommen. Rf = 0,2

(6) Ultraviolett-Absorptiönsspektrum (UV):

In Fig. 1 wird das Spektrum in Kurve (a) (Lösungsmittel H₀O) und Kurve (b) (Lösungsmittel 0,1 N HCl) gezeigt.

1 % Die Maximalabsorption und der E₁ -Wert in jedem

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lösungsmittel wird in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

1 ^

Lösungsmittel Maximalabsorp- E₁ - Wert

tion (πιμπι) ^ICm

H	2°	240
		265
0	, 1 N HCl	245
		266

127 105

(7) Infrarotabsorptionsspektrum (IR):

Das IR-Spektrum (KBr-Tablette) wird in Fig. 2 gezeigt.

(8) Kernmagentisches Resonanzspektrum (NMR):

Das NMR-Spektrum wird in Fig. 3 gezeigt, wobei D2O als Lösungsmittel und- DSS als interner Reagensstandard verwendet wurde und die Frequenz 60 MHz betrug.

(9) Aminosäureanalyse:

Die'Analyse nach einer Hydrolyse mit 4 N HCl bei 110⁰C nach 4 h bestätigte, dass sich a-Aminoadipinsäure und Glycin gebildet hatten.

Das antimikrobielle Spektrum gegenüber verschiedenen Mikroorganismen von erfindungsgemäss hergestelltem Cephamycin C wird nachfolgend in Tabelle 4 anhand der minimalen Inhibierungskonzentrationen (MIC) gezeigt.

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MIC	(ug/ml)	5,6 ■
1	5,6	3,9
250	7,8
250	,8
1	5,6
7
1

Tabelle 4

Versuch Testorganismus

Nr.

1 Bacillus subtilis Pci 219

2 Staphylococcus aureus FDA 209P

3 Staphylococcus aureus Newman

4 Sarcina lutea PCI 1001

5 Salmonella typhi O-901 NCT 8393

6 Proteus vulgaris HD OX-19

7 Proteus mirabilis 1287

8 Esherichia coli NIHJ

Diese physikalischen und chemischen Eigenschaften unter Antimikroben-Spektrum sind in guter Übereinstimmung mit dem bekannten Cephamycin C, z.B. mit dem, das in der JA-OS 3286/1971 beschrieben wird.

Nachfolgend wird die Erfindung ausführlich aber nicht limitierend beschrieben. Alle Prozente sind auf das Gewicht bezogen.

Beispiel 1

Streptomyces sp. OFR 1022, das auf einem Hafermehl-Agar-Medium inkubiert worden war, wurde auf einem flüssigen Kulturmedium, enthaltend 3 % Stärke, 0,5 % Saccharose, 1 % Sojabohnenmehl und 0,3 % Trockenhefe, mit einem pH von 7 inokuliert und 48 h bei 37⁰C geschüttelt unter Erhalt einer Saatkulturlösung.

In einer 30-1-Fermentator wurden 20 1 eines Kulturmediums vorgelegt, das 3 % Stärke, 1 % Saccharose, 2 % Baumwollsamenmehl, 1 % Trockenhefe, 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,02 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 % Dinatriummonohydrogenphosphat

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und 0,05 % Silikon (hergestellt von der Shinetsu Chemical Co., Ltd.) als Entschäumungsmittel enthielt. Vorher war, bei einem pH von 6,0 sterilisiert worden. Dazu wurde die oben erwähnte Saatkulturlösung in einer Menge von 1 % gegeben und das Ganze wurde unter Belüftung bei 37°C inkubiert. Die Menge der zugeführten Luft betrug 20 l/Min, und die Anzahl der Drehungen des Propellerrührers 300 UpM.

Nach 90-stündiger Kultivierung erreichte die Menge an gebildetem Cephamycin C 2 mg/ml. Dies wurde durch Hochgeschwindigkeit s-Chr oma tograf ie unter den folgenden Messbedingungen festgestellt:

Pumpe: (Japan Waters Co., Ltd., 6000 A-Typ) Injektor: (Japan Waters Co., Ltd., U6K-Typ) Detektor: (Shimazu Seisakusho Ltd., SPD 1) Säule: (Japan Waters: Mikro-Bandapack C-18, 4 mmidx30 cm) Mobile Phase: 0,01 M- Essigsäure

Fliessgeschwindigkeit 2 ml/Min.

Nachweis: UV 254 nm 0,16 AUFS

Aufzeichnungsgeschwindigkeit: 0,5 cm/Min.

Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Kulturlösung zentrifugiert und die Mycelen vom Filtrat getrennt, wobei man 18 1 Filtrat erhielt, das auf pH 7 bis 8 eingestellt und auf 3 1 Diaion PA 406 adsorbiert wurde. Dann wurde es mit einer wässrigen 0,6M Natriumchloridlösung eluiert, wobei man 2 1 einer antimikrobiellen aktiven Fraktion erhielt. Diese Fraktion wurde unter vermindertem Druck bei etwa 30⁰C konzentriert. 200 ml der konzentrierten Lösung wurden über 400 ml Kieselgel ODS (Hergestellt von Waters Co.) geleitet und dann wieder konzentriert. Die so konzentrierte Lösung wurde einer Ümkehrphasenchromatografie mit 0,01 M Essigsäure über einer 5,35 cm Durchmesser χ 120 cm langen Kieselgel-ODS-Säule unterworfen.

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Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei man 18 g eines weissen, pulvrigen Cephamycin C erhielt. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindung wurden untersucht und stimmten mit den vorher bestimmten überein.

Beispiel 2

Streptomyces sp. OFR 1022 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 kultiviert und die Kulturbrühe wurde filtriert/ wobei man 20 1 Filtrat erhielt. Das Filtrat wurde über 1,5 1 Diaion PA 406 C₁-TyP (hergestellt von Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) adsorbiert. Dann wurde die Säule mit dem vierfachen Säulenvolumen an entionisiertem Wasser gewaschen und mit 1M wässriger NaCl-Lösung eluiert, wobei man 2,5 1 einer antimikrobiellen aktiven Fraktion erhielt. Diese Fraktion wurde mit 4N Chlorwasserstoffsäure auf pH 1 eingestellt und dann wurde NaCl bis zu einer Endkonzentration von 4M (Mol/l) zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Säule (21) Diaion HP 20 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) absorbiert und mit Wasser eluiert. Das gefundene Cephamycin C wurde dann eluiert, nachdem der pH des Eluats etwa 4 erreichte. Anschliessend wurde das Eluat gesammelt bis zu einer Gesamtmente von 1,5 1 und gefriergetrocknet, wobei man 24 g eines weissen Pulvers von Cephamycin C erhielt.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindung wurden untersucht und stimmten gut mit der in Beispiel 1 gefundenen überein.

Die Produktivität des neuen Stammes OFR 1022 an Cephamycin C wurde mit den bekannten Stämmen, die in verschiedenen Berichten beschrieben werden, verglichen und in Tabelle 5 wird der Vergleich gezeigt.

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Tabelle 5

Stamm

Ausbeute an Cephamycin C in der Brühe Literatur

Streptomyces jumonjiensis

Streptomyces lactamgenes

Streptomyces sp.
P 6621

Streptomyces clavuligerus

Streptomyces lactamgenes

Streptomyces lactamgenes

Streptomyces sp.
OFR 1022

40 mg/1 200 mg/1 350 mg/. 494 mg/1

1291 mg/1 530 mg/1

2000 mg/1 US-PS 3 865 693

Japanische Patentanmeldung 69294/75

Japanische Patentanmeldung 110097/76

US-PS 3 977 942

US-PS 3 770 590

Japanische Patentanmeldung 49071/77

erf indungsgemäs s

Aus Tabelle 5 wird ersichtlich, dass Streptomyces sp. OFR 1022 im Vergleich zu den bekannten Stämmen Streptomyces eine sehr hohe Ausbeute an Cephamycin C liefert.

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L e e r s e

Claims (3)

33 591 o/fg Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo / Japan Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephamycin C Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Cephamycin C, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomvces sp. OFR 1022 in einem Kulturmedium kultiviert und darin Cephamycin C ansammelt und daraus Cephamycin C gewinnt.

2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man den genannten Mikroorganismus bei einer Temperatur von 15°C bis 46⁰C kultiviert.

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·— ο -·

3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet/ dass man den Mikroorganismus bei einer Temperatur von 37⁰C kultiviert.

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