DE3022250A1 - Verfahren zur herstellung des antibiotikums cephamycin c - Google Patents

Verfahren zur herstellung des antibiotikums cephamycin c

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DE3022250A1
DE3022250A1 DE19803022250 DE3022250A DE3022250A1 DE 3022250 A1 DE3022250 A1 DE 3022250A1 DE 19803022250 DE19803022250 DE 19803022250 DE 3022250 A DE3022250 A DE 3022250A DE 3022250 A1 DE3022250 A1 DE 3022250A1
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cephamycin
streptomyces
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agar
ofr
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Tsutomu Nishida
Michiharu Sugawara
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    • C12P35/08Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin disubstituted in the 7 position
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Description

Otsuka Pharmaceutical Co.. Ltd., Tokyo / Japan
Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephamycin C
Die Erfindung betrifft ein'Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephamycin C.
Cephamycin C ist ein bekanntes Antibiotikum, nämlich 7-(5-Amino-5-carboxyvalerylamino)-3-carbamoyloxymethyl-7-methoxy-3-cephem-4-carbonsäure der folgenden planen Formel
OCH
H7N-CH(CH., "W -CHN
-: COOH 0
030082/0728
Eine Reihe von Verfahren ist bereits zur Herstellung von Cephamycin C unter Verwendung verschiedener Streptomyces-Stärame bekannt. Z.B. wird S. jumonjiensis, S. laetamgenes, S. sp. P 6621, S. clavuiigerus, S. lactamduians in den US-Patentschriften 3 770 590, 3 865 693 und 3 977 942, in der GB-PS 1 425 081, in den japanischen Patentschriften 69294/75 und 11Q97/76 und in der japanischen Offenlegungsschrift 49071/77 beschrieben.
Es besteht ein Bedürfnis, Cephamycin C unter Verwendung von Mikroorganismen in wesentlich besseren Ausbeuten und nach einfacheren Verfahren herzustellen.
Nach gründlichen Untersuchungen wurde nun ein neuer Stamm Streptomyces sp. OFR 1022 aus dem Boden in Kenia isoliert, der grosse Mengen Cephamycin C in einem Kulturmedium bildet und vorteilhaft die technische Herstellung von Cephamycin C ermöglicht. Auf dieser Forschung beruht die neue Erfindung.
Die Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung von Cephamycin C und ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm Streptomyces sp. OFR 1022 in einem Kulturmedium kultiviert und darin Cephamycin C ansammelt und daraus Cephamycin C gewinnt.
Fig. 1 ist ein Ultraviolett-Adsoprtionsspektrum von Cephamycin C, das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhalten wurde.
Fig. 2 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum des erwähnten Cephaymcin C, und
Fig. 3 ist ein protonen-kernmagnetisches Resonanzspektrum (NMR) von Cephamycin C.
G3QG62/0728
Der erfindungsgemäss verwendete neue Stamm Streptomyces sp. OFR 1022 hat eine aussergewöhnliche Produktivität für Cephamycin C im Vergleich zu den bekannten Cephaymcin C produzierendem Stämmen und hat eine hohe optimale KuI-tivierungsteinperatur im Vergleich zu den bekannten Stämmen. Infolge dessen ist es mit dem erfindungsgemässen Verfahren möglich, Cephamycin C herzustellen, ohne dass man irgendwelche Kühlverfahren anwenden muss, unter Anwendung von einfachen Verfahrensweisen und Vorrichtungen, wobei man das Produkt in grossen Mengen zu niedrigen Kosten und in guten Ausbeuten erhält«
Die Erfindung stellt somit einen ganz erheblichen Fortschritt bei der Herstellung von Cephamycin' C dar.
Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes Streptomyces sp. OFR 1022,der erfindungsgemäss verwendet wird/ sind die folgenden:
(T) Morphologische Eigenschaften
"Die Beobachtungen wurden gemacht nachdem man den Stamm bei 28°€ während 3 Wochen wie folgt kultiviert hat.
Das Oberflächenmycel besteht aus einer Hauptachse und einfachen Verzweigungen entlang der Hauptachse. Diese Verzweigungen bilden häufig Agglomerate. Auf dem Kulturmedium, auf dem die Sporenbildung stattfindet, liegt die Verzweigung nur etwas in Kreisform vor, und im allgemeinen bildet sie eine vollständige Spirale, in welcher sie mehrere Male aufgewunden ist. Die Sporen haben eine spinal« oberfläche und sand kreisförmig oder elliptisch in Form und haben eine Grosse von 0,7 bis 1,0 μΐη χ 1,1 1,3 {im. It): oder mehr Sporen bilden eine Kette.
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(II) Kultureigenschaften auf verschiedenen Agarmedien
Die Beobachtungen wurden mit Stämmen gemacht, nachdem diese drei Wochen bei 2ß°C auf den in Tabelle 3 gezeigten Medien kultiviert worden waren. Die Farbtönung wird im Vergleich zu dem Color Harmony Manual^ Container Corporation of America, Chicago, bestimmt*
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Tabelle
O If» G
Kultur Wachstum Oberfläche- Substrat-
medium mycel mycel
Saccharose massig massig, pulve hell elfen
Nitrat-Agar rig, natürlich bein 2ca
2dc
Glucose- massig reichlich, perlrosa
Asparagin- samtähnlich, 3ca
Agar gelb-braun
gefärbt, 2ge
beige, 3ge
Glycerin- gut, etwas reichlich, samt senffarben
Asparagin- spärlich ähnlich, silber 21 g
Agar (kreisförmig) grau, 3fe, beige-
baun, 3ig
Stärke- gut reichlich, senffarben
anorgani samtähnlich, 21 g
sche Salze- silbergrau,
Agar 3fe
Rückseite lösliches
Pigment
bambus, 2gc kein
perlrosa, 3ca kein
ziegelbraun, Spur gelb 31g
ziegelbraun, kein 31 g
Fortsetzung Tabelle
Kulturmedium
Tyorin-Agar
Nähr-Agar
Hefe-Malz-Agar
Hafermehl-Agar '
Wachstum massig
schlecht
CfUt
Oberflächenmycel
reichlich, samtähnlich, natürlich, 2dc
kein
Substratmycel
ziegelbraun 31g
bambus, 2gc
reichlich, samt- camel, 3ie ähnlich, weiss
cjut, spar- samtähnlich, Elfenbeinlich (kreis- pulverig, beige- tönung, 2cb förmig) braun 3ig Rückseite
nelkenbraun, 3ni
zimt, 31e
lösliches Pigment
ziegelbraun, 31g
Elfenbein- kein tönung, 2cb
kein
silberbrau, kein 3fe
Pepton-Hefe-Eisen- Agar
massig schlecht
kein
beige-braun 3 ig gelb-braun tiefbraun 2ge 3pl
(III) Physiologische Eigenschaften
(1) Wachstumstemperaturbereich 15°C bis 46°C (optimale Wachstumstemperatur etwa 37°C)
(2) Wachstums-pH-Bereich pH 4,5 bis 8,5 (optimaler WachstumspH etwa 6,5)
(3) Verflüssigung von Gelatine (in einem Glucose-Pepton-Gelatine-Medium, 200C) negativ
(4) Hydrolyse von Stärke (in einem Stärke-anorganische Salze -Agar-Medium) positiv
(5) Koagulierung und Peptonisierung von entrahmter Milch
Peptonisierung
(6) Produktion von Melanoidin-Pigment
positiv (in Tyrosin-Agar, einem Pepton-Hefe-Eisen-Agar und einer Trypton-Hefeextraktbrühe)
(7) Reduktion von Nitraten negativ
(8) Zersetzung von Cellulose negativ
(9) NaCl-Toleranz
wächst bei 3 % und wächst nicht bei 5
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(IV) Verwendung von Kohlenstoffquellen (in einem Pridham-Gottlieb-Agar-Medium)
L-ÄrabinoDG +_
D-Xylose +
D-Glucose ++
D-Fructose +
Saccharose ++
Inosit ++
L-Rhamnose -
Raffinose j+
D-Mannit ++
Anmerkung: ++: gute Verwertung; +: Verwertung;
_+: etwas Verwertung; -: keine Verwertung.
(V) Diaminopimelinsäure in der Zellwand LL-Diaminopimelinsäure
Der erfindungsgemässe Stamm OFR 1022 gehört zum Genus Streptomyces; aufgrund der internationalen Streptomyces Project-Methode (ISP), der Morpholgy der .sporenbildenden Mycele gehört er zu der Sektion Spiralis; die Oberflächen der Sporen ist spinal und die Farbe des ausgewachsenen Oberflächenmycels entspricht der Graufarbreihe und es wird ein Melanoidpigment, aber sonst praktisch kein anderes Pigment gebildet. Berücksichtigt man fernerhin die Tatsache, dass das Substratmycel und die Rückseite schwach gelb-gelbbraun oder hellbraun sind and die verschiedenen vorher beschriebenen Daten, wie die physiologischen Eigenschaften und die Verwendung von Kohlenstoffquellen, so ist die Einteilung des vorliegenden Stammes derart, dass dieser Stamm am ähnlichsten Streptomyces filipinensis
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und Streptomyces gannmycicus ist, entsprechend Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1974), S.A. Waksman, The Actinomycetes, Band 2 (1961) und E.B. Shirling and D. Gottlieb, International Lournal of Systematic Bacteriology, Band 18, S-. 69 bis 189 (1968), Band 18, S. 279 bis 392 (1968, Band 19, S. 391-512 (1969) und Band 22, S. 265 bis 394 (1972).
Deshalb wurde der vorliegende Stamm und die Art der Stämme, die diesem Stamm am meisten entsprechen, unter gleichen Bedingungen kultiviert und dann verglichen.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.
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Tabelle 2
Streptomvces sp. OFR 1022
Streptomyces filiplnensis ISP 5112
Streptomyces gannmycicus
ISP 5572
O
U
O
O
Form des Oberfla-'.·
chenmycels
Wachstum auf
Saccharose-Nitrat-
Agar
Oberflächenmycel
Rückseite
lösliches Pigment
einfache Verzweigungen werden entlang d. Hauptachse gebildet, Oberflächenmycele, bilden oft Kreise und geschlossene Spirale, die sich mehrere Male in der Spitze ' winden,und die selten in geschlossener Form vorliegen
büschelig, enge Spiralkreise oder hakenähnlich am oberen Ende
einfache Verzweigung. Das obere Ende ist hauptsächlich RF, liegt selten in einer offenen Spirale oder einer engen Spirale vor
massig, hell-elfen-
bein 2ca
2gc gut, pastellgelb,
1db
pulverig, schlech
massig, pulverig,
natürlich, 2dc
massig,
weiss
2 ge nicht
bambus, bambus, farblos
nicht nicht nicht
Fortsetzung Tabelle
Glucose-Asparagin-Agar-Wachstum
Oberflächenmycel
Rückseite
lösliches Pigment Nähr-Agar-Wachstum
Oberflächenmycel Rückseite
lösliches Pigment
massig, perlrosa, 3ca
reichlich, samtähnlich, gelbbraun, 2ge bis beige, 3ge
perlsosa, 3ca nicht
schlecht bambus, 2gc
nicht
elfenbein, 2cb nicht
gut,
senfbraun
gut
senf, 21e
reichlich, pulve- massig, pulverig rig, natürlich, 2dc oberflächengrau,2fe bis oberflächengrau,2fe
beige-braun, 3ig
Spur gelb
massig, schlecht
stroh, 2fb
nicht
elfenbein,2db
nicht
O
O
<5>
Pepton-Hefe-Eiisen-
Agar-Wachstum
massig bis
beige-braun
schlecht
, 3ig
massig, hei
farbig, 2ie
lsen
**^ Oberflächenmycel nicht nicht
•U Rückseite gelbbraun, 2 ge gelbbraun, 2 ge
09 lösliches Pigment dunkelbraun , 3pl gelb-ahorn, 3ng
gelb-ahorn, 3ng Spur gelb
massig, bambus, 2gc
schlecht, weiss
creme, 1^- ca
nicht
gut, bambus, 2gc
schlecht, weiss hell-aprikot, 2ea Spur braun
Fortsetzung Tabelle
Physiologische Eienschaften
Obere Grenze der Wachstumstemperatur
Wachstums-pH-Bereich
Verflüssigung von Gelatine
Hydrolyse von Stärke
wächst bei 260C und wächst nicht bei 600C
4,5 - 8,5 negativ
positiv
Peptonisierurig von entrahmter Milch positiv
Melanoidpigment. Bildungsfähigkeit
Trypton-Hefe-Extraktbrühe +
Peton-Hefe-Eisen-Agar
Tyrosin-Agar
Reduktion von Nitraten
Wächst bei 460C und wächst nicht bei 6O0C
4,5 - 10,5 negativ
positiv positiv
wächst bei 420C und wächst nicht bei 46°C
4,5 - 11,0 positiv
positiv (stark) positiv (stark)
negativ positiv
positiv (schwach)
in
Fortsetzung Tabelle 2
Verwendung von Kohlenstoffquellen
L-Arabinose
P-Xylose
D-Glucose
D-Fructose
Saccharose
Inosit
L-Rhamnose
Raffinose
D-Mannit
Anmerkung: ++: gut ausgenutzt; +: ausgenutzt; _+ wenig ausgenutzt; -: nicht ausgenutzt.
Tabelle 2 sagt folgendes aus:
(1) Der vorliegende Stamm OFR 1022 unterschiedet sich von Streptomyces filipinensis ISP 5112 darin, dass itreptomyces filipinensis ISP 5112 ein büscheliges Oberflächenmycel hat, und dass deren Enden enge Spiralen bilden oder kreis- oder hakenförmig sind, und dass die Farbe des Substratmycels auf dem Glucose-Asparagin-Agar-Medium senfbraun 2pl und die Rückseite beige-braun 3ig ist, dass es die Fähigkeit hat, Nitrat zu reduzieren, und dass es L-Arabinose und Raffinose gut verbraucht.
(2) Der vorliegende Stamm OFR 1022 unterscheidet sich von Streptomyces gannmycicus ISP 5572 darin, dass der Hauptteil des Oberflächenmycels von Streptomyces gannmycicus ISP 5572 in Form der Sektion RF (Rectiflexibiles) vorliegt und kaum in der etwas offenen Spiral- oder in der engen Spiralform, dass das Wachstum"auf einem Saccharose-Nitrat-Agar-Medium schlecht ist, und dass man keine Ausbildung von Oberflächenmycelen feststellt, und dass man andererseits Entwicklung von Oberflächenmycelen auf Nähr-Agar-Medium und auf Pepton-Hefe-Eisen-Agar-Medium feststellt und dass er ausserdem nicht bei 460C wachsen kann, dass er Gelatine verflüssigt, und dass er die Fähigkeit hat, als Kohlenstoffquelle besonders gut L-Arabinose, L-Rhamnose und Raffinose zu verwenden, während er Saccharose nicht verbrauchen kann.
Somit wird ersichtlich, dass der vorliegende Stamm OFR 1022 ein neuer Stamm ist, der sich von Streptomvces filipinensis und Streptomyces crannmycicus, denen er am ähnlichsten ist, unterscheidet.
Der vorliegende Stamm OFR 1022 wurde als Streptomyces
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— i *7 — ι
NACHGEREiOHT!
sp.OFR 10 22 bezeichnet und beim Fermentation Research
Institute, the Agency of Industrial Science and Technology, Ibaragi,.Japan, unter der Mikroorganismus-Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 4985 und bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, USA,unter der Hinterlegungsnummer ATCC
31 666 hinterlegt.
Für die vorliegende Erfindung ist es wesentlich, Streptomyces sp. OFR 1022 oder einen natürlichen oder künstlichen Mutanten davon zu verwenden. Die Kultivierung des vorliegenden Stammes oder eines Mutanten davon kann nach üblichen Kultivierungsverfahren erfolgen, und zwar vorzugsweise in einem flüssigen Kulturmedium mittels einer Schüttelkultur oder einer belüfteten gerührten Kultur.
Eine Reihe bekannter Nährmittel für Actinomycetes kann zur Kultivierung des vorliegenden Stammes verwendet werden. Nährmittel, die als Kohlenstoffquelle verwendet werden können, schliessen Glucose, Saccharose, Glycerin, Maltose, Dextrin,. Stärke, Sojabohnenöl, Bauirwollsamenöl und dergleichen ein. Nährmittel, die als Stickstoffquelle verwendet werden können, schliessen Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Baumwohlsamenmehl, Hefe, Fischmehl, Maismaische, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Hafermehl, Kaseinhydrolysat, Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat und dergleichen ein. Anorganische Salze schliessen Magnesiumsulfat, Phosphor säuresalze, Kaliumcarbonat und dergleichen ein.
Notwendigerweise oder gewünschtenfalls kann man zu dem Kulturmedium eine geringe Menge eines Metallsalzes und geeignete Mengen an Aminosäure, wie a-Aminoadipinsäure, Natriumthiosulfat, Natriumdithionit, Glycin, L-Phenylalnin, Arginin und Ornithin und Diamine, wie 1,3-Diaminopropan,
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1 , S-Diamino^-hydroxypropan. Polyamine, wie Spermidin und dergleichen zugeben. Im Falle einer Flüssigkultivierung kann man als Entschäumungsmittel Silikon, Pflanzenöl, oberflächenaktive Stoffe und dergleichen zugeben.
Der pH des Kulturmediums liegt im Bereich von etwa 4,0 bis etwa 8,0 und vorzugsweise bei etwa 6,0, und die Kultivierungstemperatur liegt bei etwa 15°C bis etwa 46°C und vorzugsweise etwa 370C. Die maximale Prdouktionsmenge an dem gewünschten Cephamycin C wird gewöhnlich in einem Zeitraum von 72 bis 96 h erhalten. Z.B. kann man bei einer Kultivierung in einem 5-1-Fermentator eine Menge von etwa 2 mg/ml Cephamycin C ansammeln. Das Cephamycin C liegt hauptsächlich in dem flüssigen Teil der Kulturlösung vor, weil es gut in Wasser löslich ist.
Nach Beendigung der Kultivierung werden die Mycele und andere Feststoffe durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt, und das in dem Filtrat vorhandene Cephamycin C wird in einfacher und üblicher Weise isoliert unter Anwendung üblicher physikalischer und chemischer Trennmethoden. Zur Reinigung kann man eine Reihe von Adsorbentien, wie Ionenaustauschharze, Kieselgel und Aktivkohle, verwenden. Beispiele für Ionenaustauschharze sind saure Kationenaustauschharze und basische
Anionenaustauschharze. Stark basische Anionenaustauschhärze werden vorzugsweise verwendet. Typische Beispiele sind ' Diaion PA 406 (hergestellt von der Mitsubishi Chemical Co., Ltd.), Dowex 50Wx4 (hergestellt von der Dow Chemical Corp.), Dowex 1x2 (hergestellt von der Dow Chemical Corp.).
Das auf dem Adsorptionsmittel adsorbierte Cephamycin C wird mit Wasser, Kochsalzlösung oder einer Methanol-Wasser- v Mischung, einer n-Butanlo-Wasser-Mischung,· einer Aceton-Wasser-Mischung oder dergleichen eluiert.
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- 19 - "5 Π-*> *> O E .
Zur Reinigung νη Cephamycin C kann man Chromatografie unter Verwendung von Kieselgel oder Avicel (hergestellt von der Asahi Kasei Kogyo, K.K.) anwenden.
Durch eine geeignete Kombination der vorerwähnten Reinigungsverfahren und durch Wiederholung derselben kann man reines Cephamycin C erhalten.
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäss hergestellten Cephamycins C sind die folgenden:
(1) Aussehen: weisses Pulver .(2)- Spezifische Drehung:
on
[a]£U = 221° (C=O,4, H2O)
(3) Löslichkeit: löslich in Wasser, kaum löslich in
Äthanol und wenig löslich in Dimethylsulfoxid.
(4) Farbreaktion: positiv gegenüber Ninhydrin-Reaktion und
Jod-Reaktion und negativ gegenüber Ferridchlorid-Reaktion. j
(5) Dünnschichtchromatografie (TLC):
Die Entwicklung wurde unter Verwendung einer Lösung von n-Butanol : Essigsäure : Wasser = 2:1:1 (V/V) auf einer dünnschichtchromatografischen Kieselgelplatte GF 254 (hergestellt von Merk & Co.) vorgenommen. Rf = 0,2
(6) Ultraviolett-Absorptiönsspektrum (UV):
In Fig. 1 wird das Spektrum in Kurve (a) (Lösungsmittel H0O) und Kurve (b) (Lösungsmittel 0,1 N HCl) gezeigt.
1 % Die Maximalabsorption und der E1 -Wert in jedem
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lösungsmittel wird in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
1 ^
Lösungsmittel Maximalabsorp- E1 - Wert
tion (πιμπι) ICm
H 240
265
0 , 1 N HCl 245
266
127 105
(7) Infrarotabsorptionsspektrum (IR):
Das IR-Spektrum (KBr-Tablette) wird in Fig. 2 gezeigt.
(8) Kernmagentisches Resonanzspektrum (NMR):
Das NMR-Spektrum wird in Fig. 3 gezeigt, wobei D2O als Lösungsmittel und- DSS als interner Reagensstandard verwendet wurde und die Frequenz 60 MHz betrug.
(9) Aminosäureanalyse:
Die'Analyse nach einer Hydrolyse mit 4 N HCl bei 1100C nach 4 h bestätigte, dass sich a-Aminoadipinsäure und Glycin gebildet hatten.
Das antimikrobielle Spektrum gegenüber verschiedenen Mikroorganismen von erfindungsgemäss hergestelltem Cephamycin C wird nachfolgend in Tabelle 4 anhand der minimalen Inhibierungskonzentrationen (MIC) gezeigt.
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MIC (ug/ml) 5,6 ■
1 5,6 3,9
250 7,8
250 ,8
1 5,6
7
1
Tabelle 4
Versuch Testorganismus
Nr.
1 Bacillus subtilis Pci 219
2 Staphylococcus aureus FDA 209P
3 Staphylococcus aureus Newman
4 Sarcina lutea PCI 1001
5 Salmonella typhi O-901 NCT 8393
6 Proteus vulgaris HD OX-19
7 Proteus mirabilis 1287
8 Esherichia coli NIHJ
Diese physikalischen und chemischen Eigenschaften unter Antimikroben-Spektrum sind in guter Übereinstimmung mit dem bekannten Cephamycin C, z.B. mit dem, das in der JA-OS 3286/1971 beschrieben wird.
Nachfolgend wird die Erfindung ausführlich aber nicht limitierend beschrieben. Alle Prozente sind auf das Gewicht bezogen.
Beispiel 1
Streptomyces sp. OFR 1022, das auf einem Hafermehl-Agar-Medium inkubiert worden war, wurde auf einem flüssigen Kulturmedium, enthaltend 3 % Stärke, 0,5 % Saccharose, 1 % Sojabohnenmehl und 0,3 % Trockenhefe, mit einem pH von 7 inokuliert und 48 h bei 370C geschüttelt unter Erhalt einer Saatkulturlösung.
In einer 30-1-Fermentator wurden 20 1 eines Kulturmediums vorgelegt, das 3 % Stärke, 1 % Saccharose, 2 % Baumwollsamenmehl, 1 % Trockenhefe, 0,05 % Magnesiumsulfat, 0,02 % Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 % Dinatriummonohydrogenphosphat
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und 0,05 % Silikon (hergestellt von der Shinetsu Chemical Co., Ltd.) als Entschäumungsmittel enthielt. Vorher war, bei einem pH von 6,0 sterilisiert worden. Dazu wurde die oben erwähnte Saatkulturlösung in einer Menge von 1 % gegeben und das Ganze wurde unter Belüftung bei 37°C inkubiert. Die Menge der zugeführten Luft betrug 20 l/Min, und die Anzahl der Drehungen des Propellerrührers 300 UpM.
Nach 90-stündiger Kultivierung erreichte die Menge an gebildetem Cephamycin C 2 mg/ml. Dies wurde durch Hochgeschwindigkeit s-Chr oma tograf ie unter den folgenden Messbedingungen festgestellt:
Pumpe: (Japan Waters Co., Ltd., 6000 A-Typ) Injektor: (Japan Waters Co., Ltd., U6K-Typ) Detektor: (Shimazu Seisakusho Ltd., SPD 1) Säule: (Japan Waters: Mikro-Bandapack C-18, 4 mmidx30 cm) Mobile Phase: 0,01 M- Essigsäure
Fliessgeschwindigkeit 2 ml/Min.
Nachweis: UV 254 nm 0,16 AUFS
Aufzeichnungsgeschwindigkeit: 0,5 cm/Min.
Nach Beendigung der Kultivierung wurde die Kulturlösung zentrifugiert und die Mycelen vom Filtrat getrennt, wobei man 18 1 Filtrat erhielt, das auf pH 7 bis 8 eingestellt und auf 3 1 Diaion PA 406 adsorbiert wurde. Dann wurde es mit einer wässrigen 0,6M Natriumchloridlösung eluiert, wobei man 2 1 einer antimikrobiellen aktiven Fraktion erhielt. Diese Fraktion wurde unter vermindertem Druck bei etwa 300C konzentriert. 200 ml der konzentrierten Lösung wurden über 400 ml Kieselgel ODS (Hergestellt von Waters Co.) geleitet und dann wieder konzentriert. Die so konzentrierte Lösung wurde einer Ümkehrphasenchromatografie mit 0,01 M Essigsäure über einer 5,35 cm Durchmesser χ 120 cm langen Kieselgel-ODS-Säule unterworfen.
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Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wobei man 18 g eines weissen, pulvrigen Cephamycin C erhielt. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindung wurden untersucht und stimmten mit den vorher bestimmten überein.
Beispiel 2
Streptomyces sp. OFR 1022 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 kultiviert und die Kulturbrühe wurde filtriert/ wobei man 20 1 Filtrat erhielt. Das Filtrat wurde über 1,5 1 Diaion PA 406 C1-TyP (hergestellt von Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) adsorbiert. Dann wurde die Säule mit dem vierfachen Säulenvolumen an entionisiertem Wasser gewaschen und mit 1M wässriger NaCl-Lösung eluiert, wobei man 2,5 1 einer antimikrobiellen aktiven Fraktion erhielt. Diese Fraktion wurde mit 4N Chlorwasserstoffsäure auf pH 1 eingestellt und dann wurde NaCl bis zu einer Endkonzentration von 4M (Mol/l) zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Säule (21) Diaion HP 20 (hergestellt von Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) absorbiert und mit Wasser eluiert. Das gefundene Cephamycin C wurde dann eluiert, nachdem der pH des Eluats etwa 4 erreichte. Anschliessend wurde das Eluat gesammelt bis zu einer Gesamtmente von 1,5 1 und gefriergetrocknet, wobei man 24 g eines weissen Pulvers von Cephamycin C erhielt.
Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der erhaltenen Verbindung wurden untersucht und stimmten gut mit der in Beispiel 1 gefundenen überein.
Die Produktivität des neuen Stammes OFR 1022 an Cephamycin C wurde mit den bekannten Stämmen, die in verschiedenen Berichten beschrieben werden, verglichen und in Tabelle 5 wird der Vergleich gezeigt.
030062/0728
Tabelle 5
Stamm
Ausbeute an Cephamycin C in der Brühe Literatur
Streptomyces jumonjiensis
Streptomyces lactamgenes
Streptomyces sp.
P 6621
Streptomyces clavuligerus
Streptomyces lactamgenes
Streptomyces lactamgenes
Streptomyces sp.
OFR 1022
40 mg/1 200 mg/1 350 mg/. 494 mg/1
1291 mg/1 530 mg/1
2000 mg/1 US-PS 3 865 693
Japanische Patentanmeldung 69294/75
Japanische Patentanmeldung 110097/76
US-PS 3 977 942
US-PS 3 770 590
Japanische Patentanmeldung 49071/77
erf indungsgemäs s
Aus Tabelle 5 wird ersichtlich, dass Streptomyces sp. OFR 1022 im Vergleich zu den bekannten Stämmen Streptomyces eine sehr hohe Ausbeute an Cephamycin C liefert.
030082/072
L e e r s e

Claims (3)

33 591 o/fg Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo / Japan Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Cephamycin C Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Cephamycin C, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomvces sp. OFR 1022 in einem Kulturmedium kultiviert und darin Cephamycin C ansammelt und daraus Cephamycin C gewinnt.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass man den genannten Mikroorganismus bei einer Temperatur von 15°C bis 460C kultiviert.
030052/0728
·— ο
3. Verfahren gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet/ dass man den Mikroorganismus bei einer Temperatur von 370C kultiviert.
030062/0728
DE3022250A 1979-06-15 1980-06-13 Herstellung des Antibiotikums Cephamycin C Expired DE3022250C2 (de)

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