DE2154031C3

DE2154031C3 - Neues proteolytisches Enzym und seine Herstellung

Info

Publication number: DE2154031C3
Application number: DE2154031A
Authority: DE
Inventors: Andre Vanves Hauts-De-Seine Belloc; Jean Paris Florent; Denise Charenton Val De Marne Mancy Geb. Courtillet; Jean Boulogne Hauts-De-Seine Verrier
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1970-10-30
Filing date: 1971-10-29
Publication date: 1980-04-24
Also published as: DE2154031A1; SE382996B; JPS5432069B1; NL7114575A; FR2110786A5; SE7412420L; DE2154031B2; GB1330390A

Description

Tabelle I

Hydrolyse von Casein bei 37⁰C durch das 25048 RP Einfluß des pH-Werts

40

45

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues proteolytisches Enzym, das im folgenden mit der Nummer 048 RP bezeichnet wird, sein Herstellungsverfahren und die Zusammensetzungen mit cnzymatischer Aktivität, die dieses enthalten.

Dieses neue Enzym kann durch Züchtung eines Mikroorganismus, der dem Genus Streptomyces angehört und mit »Streptomyces ncbulosusDS 14 579« (NRRL 3864) bezeichnet wird, in künstlichen Medien erhalten werden.

Das Enzym 25 048 RP ist eine Proteinsubstanz, die in Form eines grauen amorphen Pulvers vorliegt. Dieses Produkt ist in Wasser sehr löslich, in wäßrigen konzentrierten Lösungen von Neutralsalzen (beispielsweise Ammoniumsulfat) und in wäßrig-alkoholischen oder Wasscr-Aceton-Gemischen wenig löslich und in wasserfreien Alkoholen und in Ketonen unlöslich.

Durch Chromatographie an Dextrangel Sephadex konnte sein angenähertes Molekulargewicht bestimmt werden. Es beträgt etwa 45 000. ^

Die proteolytische Aktivität des Enzyms 25048 RP tritt bei einer Vielzahl von .Substraten protcinischer Natur, wie beispielsweise Casein, Hämoglobin, Fibrin (Lyse von Blutgerinnsel) und Milch (Koagulation) in Erscheinung. _hn

Die Aktivität bei Casein wird nach einer Technik bestimmt, die von derjenigen abgeleitet ist, die Kimii/ furche Hcstimiming von Trypsin entwickelte (M Kunii/, ). (ien. l'hysiol. 30, 291 [1447]). Die im Verlaufe der Hydrolyse freigesetzten, in Trichloressigsäurc löslichen hi Peptide werden durch Spektrofotometrie (optische Dichte bei 280 urn) bestiinml 11111I in Tyrosin-Äqiiivalenten ausgedrückt. Die cn/yniatisi-he Aklivitiil kann in pH des Reaktionsmediums

Art des Puffiers

In 20 Minuten freigesetzte Peptide (mg-Äquivalente Tyrosin)

5,5	Phosphat-O,lm
6,5	Phosphat-0,1 m
7,0	Phosphat-0,1 m
7,5	Borat-0,2 m
8,0	Borat-0,2 m
8,5	Borat-0,2 m
9,0	Borat-0,2 m
9,6	Borat-0,2 m
Tabelle II

0,098 0,231 0,400 0,837 0,899 0,882 0,768 0,579

Hydrolyse von Casein durch das 25048 RP bei pH = 8,0 Einfluß der Temperatur

Temperatur

25°C
37°C
50⁰C
6O⁰C
65⁰C
70⁰C
75°C
Tabelle III

Hydrolyse von Casein durch das 25048 RO bei 5O⁰C Einfluß des Reaktionsmediums

Freigesetzte Peptide (mg-Aquiva-	20 Minuten
lente Tyrosin) in	0,414
10 Minuten	0,840
0,207	1,105
0,503	1,318
0,651	1,195
0,711	0,821
0,814	0,333
0,675
0,311

pH des Reaktionsmediums

In 10 Minuten freigesetzte Peptide (mg-Äquivalente Tyrosin) in

0.2 m BoralpulTer Tripolyphosphat-

lösuiig*)

0,621
0,503
0,455

0,574 0.550 0.533

*) Lösung von Nalriumtripolyphosphat mit einem Gchall von 1.5 g/l.

Das Enzym 25048 RP ist somit in einem breiten pH-Bereich wirksam.

Der optimale pH-Wert beträgt 8,0, doch behält das Enzym in dem Bereich von 7,5—9,0 eine Aktivität über 85% seiner maximalen Aktivität.

Bei pH 8,0 beträgt die optimale Temperatur 65°C. Bei 70⁰C besitzt das Enzym noch mehr als 80% seiner maximalen Aktivität in den ersten 10 Minuten. Bei 75°C tritt die Inaktivierung des Enzyms nach 6 Minuten auf.

Bei 50⁰C ist das Enzym 25048 Rp in wäßrigen Natriunuripolyphosphatlösungen mit einem Gehalt von 1,5 g/l sehr aktiv.

In der nachfolgenden Tabelle IV sind schließlich die Kinetiken der Freisetzung von Peptiden aus Casein durch das Enzym 25048 RP und durch Trypsin verglichen.

Man stellt feat, daU das Enzym 25048 RP mehr Peptidbindungen spaltet als Trypsin bei diesem Substrat.

Tabelle IV	Hydrolyse von Casein	bei pH 8,0 und	Trypsin**)
Vergleich der	37°C durch das Enzym 25048 RP und <	lurch Trypsin
	Reaktionszeit	Freigesetzte Peptide (mg-Äquivalente	0,158
(Minuten)	Tyrosin)durch
	das Enzym	0,540
	25048 RP*)
3	0,164
6	0,317
9	0,454	0,795
12	0,605
15	0,705	0,920
18	0,828	1,015
20	0,901
30	1,203
60	1.650
120	1,915

*) 32 ,ixg Enzym 25048 RP mit einem Gehalt von 3700 K.E./g. **) 32 jxg kristallisiertes Trypsin mit einem Gehalt von 4500 K.E./g.

Das Enzym 25048 RP besitzi nur eine geringe cstcrolytischc Wirksamkeit auf den Äthylesler von Benzoylarginin. wie in der nachfolgenden Tabelle V gezeigt wird, in der die Aktivitäten des Enzyms 25048 RP und des Trypsins auf Casein und auf den Äthylester von Benzoylarginin verglichen sind. Andererseits ist das Enzym 25048 RP praktisch frei von einer Wirkung auf den Alhylcstcr von Acctyltyrosin.

Tabelle V

Vergleich der Aktivitäten von Enzym 25048 RP und Trypsin

Enzym	Aktivität auf	Aktivität auf den
	Casein K.E./g	Athylester von
		Benzoylarginin
		I.E./g
25048 RP	37ClO	6 900
Trypsin	45(10	58 500

50

Das neue Enzym k;inn mit Vorteil in Delcrgenliongemischcn verwendet werden, da es bei alkalischen (,-, pll-Werten und bei Temperaturen in der Nähe von bO C aktiv ist und da e>. mil Polyphosphates verträglich

Das neue Enzym kann auch in den Nahrungsmittelindustrien, insbesondere als Hilfsmittel bei der Brothersicllung verwendet werden: Zu Mehl in einer Menge von 5 bis 10 mg/kg zugesetzt, erleichtert das Enzym die Teigbcarbcitung. setzt die zur Gärung erforderliche Zeit erheblich herab und verbessert die Qualitäten des erhaltenen Brots (insbesondere regelmäßigere Krumenporenbildung). Es kann in der Bäckerei, bei der Biskuitherstcllung und bei der Zwiebackhcrstcllung verwendet werden.

Für diese Verwendungen wird das Enzym vorteilhafterweise in Form von Zusammensetzungen eingesetzt, in denen es zusammen mit verträglichen Verdünnungsmitteln vorliegt, die seine Dosierung und sein Einbringen leichter machen. Beispielsweise kann das Enzym 25048 RP in den Nahrungsmittelindustrien in pulvcrförmigcn Produkten, insbesondere solchen auf der Basis von Kohlehydraten oder Mineralsalzen, wie beispielsweise Getreidemehl, Stärke. Saccharose, Glucose. Lactose und Calciumcarbonal, entweder allem oder zusammen mil anderen in geringen Mengen verwendeten Bestandteilen (wie Aromastoffen. Farbstoffen u.dgl.) verdünn) werden. In diesen Zusammensetzungen, wie in den für die Dclcrgcnticnindustrie brauchbaren Zusammensetzungen, kann das Enzym 0,005 bis 99 (iew.-% und vorzugsweise I bis IOCiew.% ausmachen.

Gewünschienfalls können die Enzymteilchen durch eine unter den Gebrauchsbedingungen labile und

beispielsweise wasserlösliche Umhüllung isoliert weiden.

Aus cL-r DE-OS 14 42 163 bzw. aus dem französischen Patent 13 73 657 ist zwar bereits eine Protease bekannt, die sich jedoch von der erfindungsgemäßen sowohl 5 hinsichtlich ihrer Eigenschaften, als auch hinsichtlich der Anwendung unterscheidet. Bei der bekannten Protease handelt es sich um eine saure Protease, die in saurem Milieu wirksam ist, wohingegen die erfindungsgemäße Protease eine »alkalische« Protease ist, deren maximale in Aktivität im neutralen bzw. alkalischen Bereich liegt. Demzufolge sind auch die Anwendungsbereiche dieser beiden Proteasen verschieden, die Protease gemäß der DE-OS 14 42 163 wird in erster Linie auf veterinär-medizinischem oder medizinischem Gebiet verwendet, was 1 i sich aus der Aktivität des bekannten Enzyms beim pH-Wert 3 bei 37°C ergibt. Das erfindungsgemäße Enzym wird in der Waschmittelindustrie und in der Koch- bzw. Backindustrie auf Getreidebasis angev/andt. Die erfindungsgemäße Protease weist einen optimalen >o pH-Wert von 8,0 auf und besitzt beim pH-Wert 9.6 65% der maximalen Aktivität. Darüber hinaus bleibt sie in Anwesenheit von Tripolyphosphat aktiv, welches einen üblichen Zusatz zu den gegenwärtigen Waschmitteln darstellt. Außerdem liegt die maximale Aktivitätslemperatur der erfindungsgemäßen Protease bei 6O⁰C, woraus sich ergibt, daß die erfindungsgemäße Protease optimal bei Waschvorgängen eingesetzt werden kann.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen Protease in der Nahrungsmittelindustrie, insbesondere als Hilfsmit- jo tel bei der Brotherstellung, ergibt sich daraus, daß der Teig einen pH-Wert aufweist, der etwa im neutralen Bereich liegt. Es hat sich als besonders günstig erwiesen, die erfindungsgemäße Protease dem Brotteig zuzufügen, da hierdurch eine beträchtliche Verringerung der notwendigen Knetzeit, eine Verringerung der Fermentationszeit, eine bessere Steuerbarkeit der Luftblasen des erhaltenen Brots und eine Akiivitätssteuermng des Enzyms ermöglicht werden. Ihre Aktivität hört nämlich auf, wenn der pH-Wert sauer wird, was gegen Ende der Fermentation eintritt. Im Vergleich d.izu weist das bekannte Enzym hingegen während des Knetvorgangs Anm. A: keine Wirkung auf und wirkt allenfalls im Verlauf der Fermentation, was jedoch nur die Fermentationszeit verringert und keine Steuerung der Aktivität ermög- 4» Anm. B: licht, was das Risiko einer Aktivitätssteigerung während des Brotbackens ergibt, da die Wirksamkeil des Anm. C: bekannten Enzyms mit der Temperatur ansteigt',. Das Anm. D: erfindungsgemäße Enzym weist im Gegensat/, dazu eine günstige · Aktivitätszone für die Steuerung meiner >o Wirksamkeil auf. Anm. E:

Der das Enzym 25048 RP erzeugende Organismus gehört dem Genus Streptomyccs an und wird mit »Streptomyces nebulosus DS 14579« (NRRL 3864) Anm. F: bezeichnet.

Dieser Organismus wurde aus einer in Indien entnommenen Erdprobe isoliert.

Der Stamm Streptomyces nebulosus DS 14 579 bildet Anm. G: zylindrische Sporen mit abgerundeten Enden mit Abmessungen von O.b bis 0.8 /1,0 bis 1.2 μ. Die w Anm. II: Sporenketten sind gerade oder schwach gebogen und einzeln oder in Trauben auf den Luft-ausgcscl/tcn lüden, die sie tragen, angeordnet. Sie weisen zumeist 10 Anm. I: bis 20 Sporen auf. doch sind sie manchmal elwas länglicher und können einige Zehn an Sporen aufweisen, hi Anm. |: Durch seine Sporolü.'ionsart fällt dieser Stamm in die Sektion Rectus-flexibilis der Klassifikation nach l'rid- Anm. K: harn.

Eingehende Beschreibung von
Streptoinyces nebulosus DS 14579

Sireptomyces nebulosus DS 14579 entwickelt sich gin bei 26° C, etwas weniger gut bei 37°C und nicht bei 50 C. Er erzeugt kein Melaninpigment auf den organischen Medien, produziert kein H2S, bildet Nitrite aus Nitraten auf synthetischen Medien, jedoch nicht auf nitrathahiger Nährbouillon, hydrolysiert Stärke, verflüssigt Gelatine, peptonisiert Milch ohne vorhergehende Koagulation und verwertet Cellulose. Sein vegetatives Mycel weist im allgemeinen eine gelbbraune, je nach den Züchtungsmedien, auf denen er sich entwickelt, mehr oder weniger tiefe Färbung auf. Die löslichen Pigmente, die er erzeuat. haben einen je nach den Züchtungsmedien und ihrem Entwicklungsgrad mehr oder weniger dunklen gelbbraunen Ton. Sein Luft-ausgesetztes Myccl färbt sich grau, wenn die Sporulation eintritt.

Die Züchtungscharakterislik,·.- und die biochemischen Eigenschaften von Streptomj :es nebulosus DS 14579 sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. Es sind dies diejenigen von Kulturen, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben, d. h. Kulturen von etv.;; 2 bis 3 Wochen bei 26°C, falls es nicht anders angegeben ist. Diese Eigenschaften wurden auf Nähragar und Bouillons beobachtet, die üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Stämmen von Streptomyces verwendet werden, wobei die Kulturen auf Agarmedien auf Schrägagar durchgeführt wurden. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Züchtungsmedien wurde nach den Rezepturen hergestellt, die in »The Actinomyccies«. S. A. Waksman. Chronica Botanica Company. Waltham. Mass., USA. 1950. Seite 193—197. angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W. dem die Nummer folgt, die ihnen in »The Aclinomyeeies« gegeben wurde, bezeichnet.

Die Litcraturstcllen für die anderen Züchiungsmedien oder die Zusammensetzungen derselben sind die folgenden:

»Hickcy and Tresncr's Agar«. T. G. Pridham u. Mitarb.. Antibiotics Annual. I956—I957. Seite 950.

K. L. |oncs. lournal of Bacteriology. 57. 142. 1949.

Rezeptur W-23. versetzt mit 2% Agar.
»Yeast Extract Agar«. T. G. Pridham 11. Mitarb.. Antibiotics Annual. 1956-1957. Seite 950.

»Tomato Paste Oatmeal Agar«. T. G. I'ridham u. Mitarb.. Antibiotics Annual. 1956 — 1957. Seite 950.

»Melanin formation medium«. The Aclinomycctcs. Band 2. Seite 333. Nr. 42. S. A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore. 1961.

W. Z. Grundy u. Mitarb.. Antibiotics and Chem.2,401,1952.

»Inorganic Salts — Slarch Ai'ar«. T. (j. Pridham u. Mitarb.. Antibiotics Annual. l956-l957.Seite95l.

Entspricht der Rezeptur W-I. wobei 3% Saccharose durch 1.5% Glucose ersetzt ίιικΙ. Entspricht der Rezeptur W-I, wobei i"A> Saccharose durch 1.5% Glycerin crsei/i sind. »Synthetic medium of Dimmick« (ohne AearV »Manual of Methods for Pure Culture

Study of Bacteria« der Society of Americnn Amr. P:

Bacteriologists.Geneva, N. Y., Ihn 19. Ληηι. L: Entspricht der Ke/cptur W-IH. wobei Wn

Saccharose durch 1.3% Glucose «rsiM/t sind. Ληηι. M: !Entspricht der Re/cptur W 18. Anbei die *, Ainu. Q:

Saccharose weggelassen und durch kleine l'ilterpapiersireifen ersetzt ist. die teilweise Ληηι. Κ:

in die Flüssigkeit eintauchen Ληηι. N: »Manual of Methods for Pure Culture Slue) of Bacteria« tier Society of American ίο Bacteriologists. Geneva. N Y., lly, IH.

»Plain gelatin«, hergestellt nach den Angaben im »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« der Society of American Bacteriologists. Geneva, N. Y.. IIv,-18.
I landelsiiblichcs Magermilchpulver. nach den Angaben des Herstellers zubereitet.
I ür die Untersuchung der Produktion von WiS von II. D. Tresner und F". Danga. |ournal of Haclenology, 76. 239 — 244, 1958. angege benes Medium.

Kulturmedium	Entwicklung*-	A)	Vegetatives Mycel	I unausgesetzter	Lösliches	Beobachtungen und
	grad		(v M) oder	Teil (umfaßt Ge	Pigment	biochemische
			Unterseile der	samtheit von IuR-		Eigenschaften
				und Sporuiation)
(I)	(2)		(3)	(4)	(5)	(6)
Agar nach	gut		dickes und	dunkelgrau	gelbbraun	zylindrische Sporen
H icke ν und			gefaltetes v. M..			mit abgerundeten
Tresner (Anm.	gelbbraun			Enden und Abmes
				sungen von 0,6 bis
				0,8 μ/1,0 bis 1.2 μ;
				gerade und schwach
				gebogene, iso
				lierte oder trauben-
				fönnige Sporenfäden

Agar nach	gut	dickes und ge	weißlich bis grau:	gelbbraun	Produktion von
B e η η e 11		faltetes v. M..	sehr mäßig		Melanin negativ
(Anm. B)		gelbbraun	entwickelt		(nach den Angaben
Agar nach	gut	dickes und ge	gräulich-weiß	gelbbraun	des Autors durch
Ii m c r s ο η		faltetes v. M..	bis grau; sehr		geführte Ablesun
(Anm. C)		gelbbraun	maßig entwickelt		gen)
Agar mit Wch-	sehr gut	sehr dickes und	hellgrau bis	gelbbraun	gute Löslichma-
extrakt nach		stark gefaltetes	dunkelgrau		chung von
Prid harn		v. M. gelbbraun			Oalciummaiat
t .' \ 111! 1. I 1 I
Agar mit Haler-	gut	dickes und ge	hellgrau bis	dunkelbraun
mehl und mit		faltetes v. M..	dunkelgrau
Tomatenextrakt		gelbbraun bis
nach Pridha πι		dunkel kastanien
(Anm f^;)		braun
Glucose-Pepton-	ziemlich gut	gelbbraune vis	sehr hell	gelbbraun
Agar (W bis 6)		dunkelbraune	gclblichgrau
Agar (W-6)		Unterseite
Nähragar fW-5)	mittel	gelbbraunes \. Sl.	gräulich-weiß.	gelbbraun
			in Form von
			Spuren
Tyrosin-Hefe-	mäßig	gelbbraune	hellgrau	gräulich
extrakt-Agar zur		Unterseite		gelbbraun
Bildung von
Melanin
(Anm.F)

Agar mit Calcium-	mittel	hellgelbe	sehr heligräulich	schwach
malat nach		Unterseite		gelblichgrau
Krainsky
(Anm. G)
Agar mit Oval-	ziemlich	ungefärbtes bis	hellgräulich	keines
bumin (W-12)	schlecht	gräulich-weißes	in Form von
		v.M.; hellgelbliche	Spuren
		Unterseite

ίο

Fortsetzung

Kulturmedium	Entwicklungs	Vegetatives Mycel	LufUusgesetzter	Lösliches	Beobachtungen und
	grad	(v. M) oder	Teil (umfaßt Ge	Pigment	biochemische
		Unterseite der	samtheit von luft		Eigenschaften
		Kultur	ausgesetztem Mycel
			und Sporulation)
(I)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)

Glucose-Aspara- mittel gin-Agar (W-2)

Glycerin-Aspara- gut gin-Agar (W-3)

hcllgräulichgelbcs

v.M.

dickes und gefaltetes v. M., hellgelblichgrau

weißlich bis graulich

weißlich bis grau

Pridham (Anm. H)

Stärke-Nitrat-Agf: (W-IO)

gut

Synthetischer Agar gut nach Czapek mit Saccharose (W-I)

Synthetischer Agar gut nach Czapek mit Glucose (Anm. I)

Synthetischer Agar gut nach Czapek mit Glycerin (Anm. J)

Stärke-Nitrat-Bouillon (W-19)

Glucose-Nitrat-Bouillon nach Dimmick (Anm. K)

Synthetische Bouillon nach Czapek mit Saccharose (W-] 8)

Synthetische Bouillon nach Czapek mit Glucose (Anm. L)

Synthetische Bouillon nach Czapek mit Cellulose (Anm. M)

ziemlich gut

mäßig

sehr mäßig

ziemlich gut

Unterseite

giau

dunkelbraune Unterseite

dickes und gefaltetes v. M., dunkelgelbbraun

dickes und gefaltetes v.M., dunkelgelbbraun

ziemlich dickes und gefaltetes v.M., gelbbraun

weißlicher Schleier, gut entwickelt

weißlicher Schleier, mäßig entwickelt

weißliche flockige Kultur an der Oberfläche und segmentiert

weißliche flockige Kultur an der Oberfläche und sedimentiert

gut entwickelter

weißlicher

Schleier

grau

hellgräulich; sehr schlecht entwickelt

hellgrau; sehr schlecht entwickelt

weißlich; in Form von Spuren

keiner

grau auf dem Schleier und auf dem aus der Bouillon herausragenden Papier

schwach hniunlichgclb

schwach gelbbraun

Stärke-Mineral- ziemlich gut hellbraungelbe bis hellgräulich bis keines

zylindrische Sporen imi augeruiideieii Enden und mit Abmessungen von 0,6 bis 0,8 μ/1,0 bis 1,2 μ; gerade oder schwach gebogene, isolierte oder traubenförmige Sporenfäden; Hydrolyse von Stärke: positiv

Hydrolyse von Stärke: positiv

gelbbraun gelbbraun

keines oder Produktion von sehr schwach Nitriten: positiv bräunlich und in sehr geringer Menge

keines

bräunlich

Produktion von Nitriten: positiv

Produktion von Nitriten: schwach positiv zu Beginn der Züchtung

Produktion von

j ■*! II ILIsII. puälU * <,

Verwertung von Cellulose: positiv

If

Fortsetzung

Kulturmedium	Entwicklungs	Vegetatives Mycel	Luftausgcsetzter	Lösliches	Beobachtungen und
	grad	(v. M) oder	Teil (umfaßt Ge	Pigment	biochemische
		Unterseite der	samtheit von luft		Eigenschaften
		Kultur	ausgesetztem Mycel
			und Sporulation)
(I)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)

Nitrat-Nähr- ziemlich gut

bouillon (Anm. N)

Reine Gelatine mällig
mit 12%
(Anm. P)

Kultur auf mällig

Kartoffeln

(W-27)

Magermilch madig

(Anm. Q)

Agar nach gut

Tresncr und
Danga(Anm.R)

gut entwickelter Ring, sehr hcll- hräunlich	weißlich; in Form von Spuren	keines Produktion von Nitriten: negativ im Verlaufe von nach 24 Stunden,48 Stun den, 7 Tagen, 14 Ta gen und 28 Tagen Züchtung VOrge- nf^mmonon AK!»-
		sungen
dunkelbraungraue zentrale Kolonie an der Oberfläche um die Stelle der Beimpfung	keiner	braungelb gute Verflüssigung von Gelatine
hellbräunliches bis dunkelbraunes v.M.	keiner oder hellgräulich, in Form von Spuren	keines oder zögernd schwach bräunlich
bräunlichgelber Ring	keiner	rasche Peptonisation ohne Koagulation, pH von 6,2 auf 8,0 in 1 Monat gehend
gelbbraunes v.M.	keiner	hellgelbbraun Produktion von H₂S: negativ (nach den Angaben der Autoren durch geführte Ablesun gen)

Streptomyces nebulosus DS 14579 weist eine Vjcsamineii von tigeniichalten aul, die mit keiner derjenigen der bereits l>eschriebenen Stämme genau übereinstimmt

Betrachtet man die Species, deren Beschreibung in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« (7. Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961) oder in »The Actinomycetes« (Band 2, S.A. Waksman, The William and Wilkins Company, Baltimore, 1961) gegeben ist, so isl die Species, der er sich am meisten nähert Sltreptomyces aburaviensis, der, wie er, kein Melanin auf organischen Medien produziert, ein weißes bis graues Lu f!-ausgesetztes Mycel aufweist und gerade Sporophoren. bildet und dessen vegetatives Mycel auf »Saccharose-Nilrat-Agar« gelbbraun ist Er ist mit diesem jedoch nicht identisch, da man, wenn man sich auf die Beschreibung von S. aburaviensis in »The Actinomycetes« (Seite 166) bezieht, sieht, daß zwar eine gewisse Anzahl der Eigenschaften, die diese beiden Stämme aufweisen, identisch ist, jedoch eine Anzahl anderer Eigenschaften nicht Obereinstimmt

S. aburaviensis ergibt insbesondere ein oliv-gräuliches Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar und ein gelbes bis blassolives Wachstum auf Kartoffeln, während S. nebuiosus DS Ϊ4573 auf Giucose-Asparagin-Agar ein hellgräulichgelbes Wachstum und auf Kartoffeln tin Wachstum ergibt, dessen Färbung von hellbräunlich bis dunkelbraun geht Es sei bemerkt, daß niemals eine grünliche oder olive Färbung des vegetativen Mycels von S. nebulosus DS 14579 auf irgendeinem Medium im Verlaufe seiner Prüfung beobachtet wurde: Das vegetative Mycel weist in allen Fällen Färbungen auf, die von gelblich bis braungelb oder gelbbraun gehen, je nach den Medien und dem Entwicklungsgrad. Außerdem produziert S. aburaviensis kein lösliches Pigment auf Nähragar oder Gelatine und bildet ovale Sporen, während S. nebulosus DS 14579 ein gelbbraunes

so lösliches Pigment auf Nähragar und ein lösliches braungclbes Pigment auf Gelatine produziert und zylindrische Sporen bildet. Außerdem verwertet S. aburaviensis die folgenden Kohlenstoffquellen nicht, die S. nebulosus DS 14579 verwertet: Mannit, Arabinose, Raffinose, lnsosit Xylose und Saccharose.

Die Fähigkeit von S. nebulosus DS 14579, verschiedene Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen zur Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode nach Pridham und Gottlieb (J. of Bact 56, 307—114. 1948) bestimmt Der Entwicklungsgrad wurde auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium beobachtet wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlenstoffquellen oder das (NHt)₂SO₄ durch die verschiedenen jeweils untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

	21	13	54 031	14	Verwertung
	Verwertung	Geprüfte StickstolTqucllcn	Γ nsitiv
Geprüfte Kohlenstoffquellen	positiv	NaNO,	positiv
D-Ri böse	positiv	NaNO₂	positiv
D-Xylose	positiv	(NH₄J₂SO₄	positiv
L-Arabinose	neigativ	(NH₄I₂HPO₄	negativ
L-Rhamnose	positiv	Adenin	positiv
D-Glucose	positiv	Adenosin	negativ
D-Galactose	positiv	Uracil	positiv
D-Fructose	positiv	Harnstoff	positiv
D-Mannose	negativ	L-Asparagin	positiv
L-Sorbose	schwach und zögernd	Glykokol!	negativ
Lactose	positiv	Sarcosin	pöäiti V
Maltose	ncüitiv	DL Alanin	positiv
Sarrharnsp	positiv	DL-Valin	positiv
Trehalose	positiv	DL-Asparaginsäurc	positiv
Cellobiose	positiv	L-Gluiaminsa'ure	positiv
Raffinose	positiv	L-Arginin	positiv
Dextrin	positiv	L-Lysin	positiv
Inulin	positiv	DL-Serin	positiv
Stärke	positiv	DL-Th reonin	positiv, langsam
Glykogen	positiv	DL-Methionin	negativ
Glycerin	negativ	Taurin	positiv
Erythrit	negativ	DL-Phenylalanin	positiv
Adonit	negativ	L-Tyrosin	positiv
Dulcit	positiv	DL-Prolin	positiv
D-Mannit	negativ	L-Hydroxypyrolin	positiv
D-Sorbit	positiv	L-Histidin	positiv
Inosit	negativ	L-Tryptophan	negativ
Salicin		Betain

Die Herstellung von 25048 RP besteht im wescntli- Stickstoffquelle. Mineralstoffe und gegebenenfalls

seine Mutanten in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Produkt abzutrennen.

Die Züchtung von Streptomyces nebulosus DS 14579 kann nach jeder beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder Submerszüchtungsmethode erfolgen, doch ist diese letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die versciedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden.

Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

Streptomyces nebulosus DS 14579 — Stammansatz

Kultur auf Agar

Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermenter

Produktionskultur im Fermenter

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare »τucri3iiMii.-jiaMwicn CMIiIdIiCIi, wuuci anc uiese bestandteile in Form von gut definierten Prod.'.ten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen

.15 Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, /ugefühn werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Mallose. Dextrine Stärke, oder andere Kohlehydratsubstanzen.

wie beispielsweise Zuckeralkohole, ζ. Β. Glycerin oder Mannit, oder wie gewisse organische Säuren. /.. B. Mischsäure, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlehydratquellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumsulfat, oder gewisse Aminosäuren, sein. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Glu'.en und deren HydrolySaten, Sojamehl. Arachismehi, Fischmehl. Pepton, Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distillers' Solubles und Maisquellwasser.

Unter den 711Ppfii£TiPn minpralicrhon Ql^ffan ls«n«i.

gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium- oder Magnesiumcarbonat

Andere führen zu dem zur Entwicklung von Streptomyces nebulosus DS 14579 und zur Erzeugung von 25048 RP erforderlichen Ionengleichgewicht, wie beispielsweise Alkali- und Erdalkalich'oride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in spezieller Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen von Streptomyces nebulosus DS 14579. Es sind dies insbesondere die Kobaltsalze.

Der pH-Wert des Fermentatinsmediums sollte zu Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5, liegen. Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 bis 30° C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und 33⁰C eine zufriedenstellende Produktion erhalten. Die Belüftung der Züchtung kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 03 bis 3 I Luft je 1 Bouillon und je Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an 25048 RP wird nach 3- bis 7tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hautpsächlich von dem verwendeten Medium abhängt

Das 25048 RP kann aus den Fermentationsmaischen ir. verschiedener Weise isoliert werden:

Man kann die Fermentationsmaische bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 7.5 und vorzugsweise bei pH 7 filtrieren und dann das so erhaltene Filtrat auf ein Volumen zwischen ¹A und '/s des anfänglichen Volumens einengen und dann in der Kälte ein schlechtes Lösungsmittel für 25048 RP, wie beispielsweise Aceton, zugeben, um die Ausfällung des Rohprodukts zu bewirken.

Das Rohprodukt kann nach einer der folgenden Methoden gereinigt werden:

Fraktionierte Ausfällung mittels konzentrierten wäßrigen Lösungen von Mineralsalzen, wie beispielsweise Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, und/oder schlechten Lösungsmitteln für 25048 RP, wie beispielsweise Methanol oder Aceton:

Dialyse durch eine Membran, vorzugsweise eine Membran aus regenerierter Cellulose, gegen Wasser, um die Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen;

Chromatographie einer wäßrigen Lösung von 25048 RP an verschiedenen Adsorbentien: Man verwendet vorzugsweise Gele von Kieselsäure, Dextran oder Polyacrylamid.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. Die Aktivität der Produkte ist in Kurilz-Einheitcn (K. E.), wie oben definiert, ausgedrückt. Diese Aktivität ist in K. E./cm³ ausgedrückt, wenn es sich um ein in Lösung befindliches Produkt handelt, und in K. E./g, wenn es sich um ein festes Produkt handelt.

Beispiel I

Die Produktionskultur wird in einem 30-Liter-Fermenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

Distillers' Solubles gekörnte Bohnen Sojaöl

Natriumchlorid
Kobaltchlorid ■ ö I
Leitungswasser

100 ρ
800 g
200 cm¹ 100 g 0.4 ρ 20 1

Der pH-Wert wird mit 17 cm³ I0n-Natronlauge auf 8,20 eingestellt Man sterilisiert das Medium bei 122°C während 40 Minuten. Nach Abkühlen setzt man eine sterile Lösung von 100 g Glucose-Monohydrat und Leitungswasser ad 1 Liter zu.

Das Volumen der Bouillon beträgt 201 und der pH-Wert 6,70. Man beimpft dann mi·. 200 cm³ einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur von Streptomyces nebulosus DS 14579. Die Züchtung wird bei 25⁰C während 6 Tagen unter Rühren mittels eines Turbinenrührers, der mit 440 U/min betrieben wird, und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 1 mVStunde durchgeführt Der pH-Wert beträgt dann 6,90 und die Aktivität der Maische erreicht 53 K. E7cm³.

Beispiel 2

181 der unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen hergestellten Kullurmaische werden bei pH 63 auf einem Faltenfilter filtriert Man erhält so 101 klares Filtrat mit einem Gehalt von 7 K. E7cm³.

Dieses Filtrat wird bei 25° C unter vermindertem

Druck (2 mm Hg) auf '/3 seines Volumens eingeengt Das Konzentrat wird durch eine Cellophanmembran über Nacht bei +4⁰C gegen 10 Volumina destilliertes Wasser dialysiert.

Zu dem erhaltenen, bei 4°C gehaltenen Dialysat (3,2 Liter) setzt man unter Bewegen 1,6 1 zuvor auf — 10⁰C abgekühltes Aceton zu.

Der erhaltene inaktive Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Zu der überstehenden Lösung setzt man unter den gleichen Bedingungen wie oben 4,8 1 auf — 10° C abgekühltes Aceton zu.
J5 Nach iOminütigern Zentrifugieren mit 12 000 g wird der aktive Niederschlag gesammelt und dann in 550 cm³ destilliertem Wasser gelöst.

Zu dieser auf +4⁰C abgekühlten Lösung setzt man unter Bewegen 272 g kristallisiertes Ammoniumsulfat (zur Erzielung einer Lösung mit 80%iger Sättigung an Salz berechnete Menge) zu.

Nach I '/jslündigem Stehenlassen bei +4^C C zentrifugiert man 10 Minuten mit 12 000 g. Der erhaltene Niederschlag wird in 200 cm³ Wasser suspendiert.
4', Diese Lösung wird über Nacht bei +4°C dialysiert, um restliches Salz zu entfernen.

Zu dem bei +4°C gehaltenen Dialysat (280 cm³) setzt

man langsam unter Bewegen 600 cm³ zuvor auf - 1O⁰C abgekühltes Isopropanol zu und hält dann noch 10 bis 15

in Minuten nach beendeter Zugabe des Lösungsmittels in Bewegung.

Der aktive Niederschlag wird durch Zentrifugieren

während IO Minuten mit 12 000 g gewonnen. Das Produkt wird unter vermindertem Druck (2 mm Hg) in

γ-, Anwesenheil von P2O5 bei einer Temperatur von etwa 20" C getrocknet.

Man erhält so 6.8 g Produkt mit einem Gehalt vor 3800 K. E./g.

M' Versuch I

Man stellt einen Brotteig mit dem folgenden Gcmiscl

her:

Cictrcidcmchl

Hefe

SnI/

Wasser

I kg
20 g

22»

(150 cm'

030 717/104

Parallel stellt man einen Brotteig mit einem identischen Gemisch her, zu dem man 10 mg des Enzyms 25048 RP mit einem Gehalt von 380C K. E/g in Form eines Konzentrats mit 0,1 Gew.-% in Getreidemehl zugibt.

Nach intensivem Kneten und einer ersten Gärung von 75 Minuten formt man den Teig und stellt fest, daß in Anwesenheit des Enzyms die Bearbeitung des Teigs erheblich erleichtert ist: Der Teig ist viel streckbarer und viel weniger elastisch als der Vergleichsteig. ι ο

Die Aufgehzeit (2. Gärung) ist eindeutig in Anwesenheit des Enzyms vermindert (HO Minuten gegenüber 135 Minuten), und der erhaltene Teig weist eine Kohlendioxydretention auf, die mit der des Vergleichsteigs identisch ist (mit einem Chopin-Zymotachygraph durchgeführte Bestimmungen).

Nach dem Backen erhält man bei dem Versuch mit Enzym ein Brot, das das gleiche Volumen wie das Vergleichsbrot aufweist, jedoch eine viel gleichmäßigere Kmmenporenbildung besitzt.

Versuch 2

Man stellt durch Verkneten ein Konzentrat für industrielle Biskuitherstellung her, das 1000 g Stärke und 100 g Enzym 25048 RP enthält

Dieses Konzentrat kann zu trockenen Bestandteilen oder flüssigen Bestandteilen in einer Menge von 10 g je Charge von 100 kg Mehl zugegeben werden.

Versuch 3

Ein Konzentrat für die Detergensindustrie enthält:
Enzym 25048 RP 99 g

ausgefällte Kieselsäure

»Levilite«

Methylenblau

Ig
0.1g

Dieses Konzentrat ist für die Herstellu';» von Granulaten verwendbar, die 2% Enzym enthalten und Waschpulver nach den üblichen Techniken in einer Menge von 50 g Enzym je Tonne Waschpulver zugesetzt werden können.

Claims

Patentansprüche:

1. Proteolytisches Enzym, das mit der Nummer 25048 RP bezeichnet wird, dadurch gekenn- i zeichnet, daß es eine Proteinsubstanz ist, die in Wasser sehr löslich ist, in konzentrierten Lösungen von Neuiralsalzen und in wäßrig-alkoholischen oder wäDrig-acetonischen Gemischen wenig löslich ist und in wasserfreien Alkoholen und Ketonen m unlöslich ist, auf Casein bei pH 8 eine Maximalaktivität bei 37 bis 65°C aufweist und bei 75°C in 6 Minuten inaktiviert wird, bei Casein mehr Peptidbindungen als Trypsin hydrolysiert und nur eine geringe esterolytische Wirksamkeit auf die Äthylester von Benzoylarginin und Acetyltyrosin aufweist.

2. Verfahren zur Herstellung von 25 048 RP, dadurch gekennzeichnet, daß man aerob in einem assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Medium Streptomyccs ncbulcsus DS 14 579 (NRRL 3864) bis zur Bildung einer merklichen Menge an F.nzym züchtet und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Enzym abtrennt.

3. Proteolytische cnzymatische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 0,005 bis 99 Gew.-% Enzym 25 048 RP. zusammen mit verträglichen Verdünnungsmitteln.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie 1 bis 10 Gew.-% Enzym

25 048 RP zusammen mit zumindest einem Kohlehy- _OT drai oder Mineralsalz enthält.

Kunitz-Einheiten (K.E) ausgedrückt werden: Nach der Definition von Kunitz ist eine Einheil die Enzymmenge, die ausreichend lösliche Peptide in Freiheit setzt, um eine Erhöhung der optischen Dichte des Trichloressjgsäurefiltrats bei 280 nm in I Minute um 1000 zu erhalten. In den nachfolgenden Tabellen I, Il und III sind die für die Hydrolyse von Casein mit dem Enzym 25048 RP bei verschiedenen pH-Werten, bei verschiedenen Temperaturen und in verschiedenen Medien erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt. Für jeden Versuch wurden 32 μg Enzym mit einem Gehalt von 3700 K.EJg verwendet.