DE2154031B2

DE2154031B2 - Neues proteolytisches Enzym und seine Herstellung

Info

Publication number: DE2154031B2
Application number: DE2154031A
Authority: DE
Inventors: Andre Vanves Hauts-De-Seine Belloc; Jean Paris Florent; Denise Charenton Val De Marne Mancy Geb. Courtillet; Jean Boulogne Hauts-De-Seine Verrier
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1970-10-30
Filing date: 1971-10-29
Publication date: 1979-08-02
Also published as: DE2154031A1; SE382996B; JPS5432069B1; NL7114575A; DE2154031C3; FR2110786A5; SE7412420L; GB1330390A

Description

Tabelle I

Hydrolyse von Casein bei 37°C durch das 25048 RP Einfluß des pH-Werts

20

2ϊ

30

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues proteolytisches Enzym, das im folgenden mit der Nummer 25 048 RP bezeichnet wird, sein Herstellungsverfahren und die Zusammensetzungen mit enzymatischer Aktivität, die dieses enthalten.

Dieses neue Enzym kann durch Züchtung eines Mikroorganismus, der dem Genus Streptomyces angehört und mit »Streptomyces nebulosus DS 14 579« (NRRL 3864) bezeichnet wird, in künstlichen Medien erhalten werden. 4-,

Das Enzym 25 048 RP ist eine Proteinsubstanz, die in Form eines grauen amorphen Pulvers vorliegt. Dieses Produkt ist in Wasser sehr löslich, in wäßrigen konzentrierten Lösungen von Neutralsalzen (beispielsweise Ammoniumsulfat) und in wäßrig-alkoholischen oder Wasser-Aceton-Gemischen wenig löslich und in wasserfreien Alkoholen und in Ketonen unlöslich.

Durch Chromatographie an Dextrangel Sephadex konnte sein angenähertes Molekulargewicht bestimmt werden. Es beträgt etwa 45 000. «

Die proteolytische Aktivität des Enzyms 25048 RP tritt bei einer Vielzahl von Substraten proteinischer Natur, wie beispielsweise Casein, Hämoglobin, Fibrin (Lyse von Blutgerinnsel) und Milch (Koagulation) in Erscheinung. bo

Die Aktivität bei Casein wird nach einer Technik bestimmt, die von derjenigen abgeleitet ist, die Kunitz für die Bestimmung von Trypsin entwickelte (M Kunitz, ). Gen. Physiol. 30, 291 [1947]). Die im Verlaufe der Hydrolyse freigesetzten, in Trichloressigsäure löslichen bs Peptide werden durch Spektrophotometrie (optische Dichte bei 280 nm) bestimmt und in Tyrosin-Äquivalenten ausgedrückt. Die enzymatische Aktivität kann in

pH des	Art des Puffers	In 20 Minuten
Reaktions		freigesetzte
mediums		Peptide (mg-
		Äquivalente
		Tyrosin)
5,5	Phosphat-0,lm	0,098
6,5	Phosphat-0,1 m	0,231
7,0	Phosphat-0,lm	0,400
7,5	/Borat-0,2 m	0,837
8,0	Borat-0,2 m	0,899
8,5	Borat-0,2 m	0,882
9,0	Borat-0,2 m	0,768
9,6	Borat-0,2 m	0,579

Tabelle II

Hydrolyse von Casein durch das 25048 RP bei pH = 8,0 Einfluß der Temperatur

Temperatur	Freigesetzte Peptide (mg-Äquiva- lente Tyrosin) in	20 Minuten	Tripolyphosphat- lösung*)
	10 Minuten	0,414
25⁰C	0,207	0,840
37°C	0,503	1,105
50⁰C	0,651	1,318
6O⁰C	0,711	1,195
65 ⁰C	0,814	0,821
70⁰C	0,675	0,333
75°C	0,311
Tabelle III		ä 25048 RO bei 50⁰C
Hydrolyse von Casein durch da! Einfluß des Reaktionsmediums	In 10 Minuten freigesetzte Peptide (mg-Äquivalente Tyrosin) in
pH des Reaktions	0,2 m BoratpufTei
mediums

0,621
0,503
0,455

0,574
0,550
0,533

*) Lösung von Natriumtripolyphosphat mit einem Gehalt von 1.5 r/1.

Das Enzym 25048 RP ist somit in einem breiten pH-Bereich wirksam.

Der optimale pH-Wert beträgt 8,0, doch behält das Enzym in dem Bereich von 7,5—9,0 eine Aktivität über 85% seiner maximalen Aktivität

3ei pH 8,0 beträgt die optimale Temperatur 65°C. Bei 70⁰C besitzt das Enzym noch mehr als 80% seiner maximalen Aktivität in den ersten 10 Minuten. Bei 75°C tritt die Inaktivierung des Enzyms nach 6 Minuten auf.

Bei 50⁰C ist das Enzym 25048 Rp in wäßrigen

Tabelle IV

Natriumtripolyphosphutlösungen mit einem Gehalt von 1,5 g/l sehr aktiv.

In der nachfolgenden Tabelle IV sind schließlich die Kinetiken der Freisetzung von Peptiden aus Casein durch -das Enzym 25048 RP und durch Trypsin verglichen.

Man stellt fest, daß das Enzym 25048 RP mehr Peptidbindungen spaltet als Trypsin bei diesem Substrat

Vergleich der Hydrolyse von Casein bei pH 8,0 und 37°C durch das Enzym 25048 RP und durch Trypsin

Reaktionszeit (Minuten)	Freigesetzte Peptide (mg-Äquivalente Tyrosin)(lurch	Trypsin**)
	das Enzym 25048 RP*)	0,158
3	0,164
6	0,317	0,540
9	0,454
12	0,605
15	0,705
18	0,828	0,795
20	0,901
30	1,203	0,920
60	1,650	1,015
120	1,915

*) 32 μg Enzym 25048 RP mit einem Gehalt von 3700 K.E./g. **) 32 μg kristallisiertes Trypsin mit einem Gehalt von 4500

K-EVg.

Das Enzym 25048 RP besitzt nur eine geringe esterolytische Wirksamkeit auf den Äthylester von Benzoylarginin, wie in der nachfolgenden Tabelle V gezeigt wird, in der die Aktivitäten des Enzyms 25048 RP und des Trypsins auf Casein und auf den Äthylester von Benzoylarginin verglichen sind. Andererseits ist das Enzym 25048 RP praktisch frei von einer Wirkung auf den Äthylester von Acetyltyrosin.

Tabelle V

Vergleich der Aktivitäten von Enzym 25048 RP und Trypsin

Enzym	Aktivität auf	Aktivität auf den
	Casein KE./g	Athylester von
		Benzoylarginin
		I.E./g

25048 RP
Trypsin

3700
4500

6 900
58 500

Das neue Enzym kann mit Vorteil in Detergeniiengemischen verwendet werden, da es bei alkalischen pH-Werten und bei Temperaturen in der Nähe von 6O⁰C aktiv ist und da es mit Polyphosphaten verträglich ist.

Das neue Enzym kann auch in den Nahrungsmittelindustrien, insbesondere als Hilfsmittel bei der Brotherstellung verwendet werden: Zu Mehl in einer Menge von 5 bis 10 mg/kg zugesetzt, erleichtert das Enzym die Teigbearbeitung, setzt die zur Gärung erforderliche Zeit erheblich herab und verbessert die Qualitäten des erhaltenen Brots (insbesondere regelmäßigere Krumenporenbildung). Es kann in der Bäckerei, bei der Biskuitherstellung und bei der Zwiebackherstellung verwendet werden.

Für diese Verwendungen wird das Enzym vorteilhafterweise in Form von Zusammensetzungen eingesetzt, in denen es zusammen mit verträglichen Verdünnungsmitteln vorliegt, die seine Dosierung und sein Einbringen leichter machen. Beispielsweise kann das Enzym 25048 RP in den Nahrungsmittelindustrien in pulverförmigen Produkten, insbesondere solchen auf der Basis von Kohlehydraten oder Mineralsalzen, wie beispielsweise Getreidemehl, Stärke, Saccharose, Glucose, Lactose und Calciumcarbonat, entweder allein oder zusammen mit anderen in geringen Mengen verwendeten Bestandteilen (wie Aromastoffen, Farbstoffen u.dgl.) verdünnt werden. In diesen Zusammensetzungen, wie in den für die Detergentienindustrie brauchbaren Zusammensetzungen, kann das Enzym 0,005 bis 99 Gew.-% und vorzugsweise 1 bis 10Gew.-% ausmachen.

Gewünschtenfalls können die Enzymteilchen durch eine unter den Gebrauchsbedingungen labile und

beispielsweise wasserlösliche Umhüllung isoliert werden.

Aus der DE-OS 14 42 163 bzw. aus dem französischen Patent 13 73 657 ist zwar bereits eine P/otease bekannt, die sich jedoch von der erfindu^gsgemäßen sowohl hinsichtlich ihrer Eigenschaften, als auch hinsichtlich der Anwendung unterscheidet Bei der bekannten Protease handelt es sich um eine saure Protease, die in saurem Milieu wirksam ist, wohingegen die erfindungsgemäße Protease eine »alkalische« Protease ist, deren maximale Aktivität im neutralen bzw. alkalischen Bereich liegt. Demzufolge sind auch die Anwendungsbereiche dieser beiden Proteasen verschieden, die Protease gemäß der DE-OS 14 42 163 wird in erster Linie auf veterinär-medizinischem oder medizinischem Gebiet verwendet, was sich aus der Aktivität des bekannten Enzyms beim pH-Wert 3 bei 37° C ergibt Das erfindungsgemäße Enzym wird in der Waschmittelindustrie und in der Koch- bzw. Backindustrie auf Getreidebasis angewandt Die erfindungsgemäße Protease weist einen optimalen pH-Wert von 8,0 auf und besitzt beim pH-Wert 9,6 65% der maximalen Aktivität. Darüber hinaus bleibt sie in Anwesenheit von Tripolyphosphat aktiv, welches einen üblichen Zusatz zu den gegenwärtigen Waschmitteln darstellt Außerdem liegt die maximale Aktivitätstemperatur der erfindungsgemäßen Protease bei 60⁰C, woraus sich ergibt, daß die erfindungsgemäße Protease optimal bei Waschvorgängen eingesetzt werden kann.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen Protease in der Nahrungsmittelindustrie, insbesondere als Hilfsmittel bei der Brotherstellung, ergibt sich daraus, daß der Teig einen pH-Wert aufweist, der etwa im neutralen Bereich liegt. Es hat sich als besonders günstig erwiesen, die erfindungsgemäße Protease dem Brotteig zuzufügen, da hierdurch eine beträchtliche Verringerung der notwendigen Knetzeit, eine Verringerung der Fermentationszeit, eine bessere Steuerbarkeit der Luftblasen des erhaltenen Brots und eine Aktivitätssteuerung des Enzyms ermöglicht werden. Ihre Aktivität hört nämlich auf, wenn der pH-Wert sauer wird, was gegen Ende der Fermentation eintritt Im Vergleich dazu weist das bekannte Enzym hingegen während des Knetvorgangs keine Wirkung auf und wirkt allenfalls im Verlauf der Fermentation, was jedoch nur die Fermentationszeit verringert und keine Steuerung der Aktivität ermöglicht, was das Risiko einer Aktivitätssteigerung während des Brotbackens ergibt, da die Wirksamkeit des bekannten Enzyms mit der Temperatur ansteigt. Das erfindungsgemäße Enzym weist im Gegensatz dazu eine günstige · Aktivitätszone für die Steuerung seiner Wirksamkeit auf.

Der das Enzym 25048 RP erzeugende Organismus gehört dem Genus Streptomyces an und wird mit »Streptomyces nebulosus DS 14579« (NRRL 3864) bezeichnet.

Dieser Organismus wurde aus einer in Indien entnommenen Erdprobe isoliert

Der Stamm Streptomyces nebulosus DS 14 579 bildet zylindrische Sporen mit abgerundeten Enden mit Abmessungen von 0,6 bis 0,8 /1,0 bis 1,2 μ. Die Sporenketten sind gerade oder schwach gebogen und einzeln oder in Trauben auf den Luft-ausgesetzten Fäden, die sie tragen, angeordnet Sie weisen zumeist 10 bis 20 Sporen auf, doch sind sie manchmal etwas länglicher und können einige Zehn an Sporen aufweisen. Durch seine Sporolationsart fällt dieser Stamm in die Sektion Rectus-Flexibilis der Klassifikation nach Prid-Eingehende Beschreibung von
Streptomyces nebulosus DS 14579

Streptomyces nebulosus DS 14579 entwickelt sich gut bei 26°C, etwas weniger gut bei 37°C und nicht bei 50°C. Er erzeugt kein Melaninpigment auf den organischen Medien, produziert kein H2S. bildet Nitrite aus Nitraten auf synthetischen Medien Jedoch nicht auf nitrathaltiger Nährbouillon, hydrolysiert Stärke, verflüssigt Gelatine, peptonisiert Milch ohne vorhergehende Koagulation und verwertet Cellulose. Sein vegetatives Mycel weist im allgemeinen eine gelbbraune, je nach den Züchtungsmedien, auf denen er sich entwickelt, mehr oder weniger tiefe Färbung auf. Die löslichen Pigmente, die er erzeugt.

haben einen je nach den Züchtungsmedien und ihrem Entwicklungsgrad mehr oder weniger dunklen gelbbraunen Ton. Sein Luft-ausgesetztes Mycel färbt sich grau, wenn die Sporulation eintritt

Die Züchtungscharakteristiken und die biochemisehen Eigenschaften von Streptomyces nebulosus DS 14579 sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt Es sind dies diejenigen von Kulturen, die ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben, d. h. Kulturen von etwa 2 bis 3 Wochen bei 26°C, falls es nicht anders angegeben ist. Diese Eigenschaften wurden auf Nähragar und Bouillons beobachtet, die üblicherv.eise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Stämmen von Streptomyces verwendet werden, wobei die Kulturen auf Agarmedien auf Schrägagar durchgeführt wurden. Eine gewisse Anzahl der verwendeten Züchtungsmedien wurde nach den Rezepturen hergestellt, die in »The Actinomycetes«, S. A. Waksman. Chronica Botanica Company, Waltham, Mass.. USA, 1950, Seite 193—197, angegeben sind. In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem die Nummer folgt, die ihnen in »The Actinomycetes« gegeben wurde, bezeichnet

Die Literaturstellen für die anderen Züchiiungsmedien oder die Zusammensetzungen derselben sind die folgenden:

Anm. A:

45	Anm. B:
	Anm. C: Anm. D:
50	Anm. E:
55	Anm. F:
	Anm. G:
60	Anm. H:
	Anm. I:
b5	Anm. J:
	Anm. K:

»Hickey and Tresner's Agar«, T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956—1957, Seite 950.

K. L. Jones, Journal of Bacteriology. 57, 142. 1949.

Rezeptur W-23, versetzt mit 2% Agar.
»Yeast Extract Agar«, T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956—1957, Seite 950.

»Tomato Paste Oatmeal Agar«, T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956 — 1957, Seite 950.

»Melanin formation medium«. The Actinomycetes, Band 2, Seite 333, Nr. 42, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961.

W. E. Grundy u. Mitarb, Antibiotics and Chem.2,401,1952.

»Inorganic Salts — Starch Agar«, T. G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual. 1956-1957,Seite951.

Entspricht der Rezeptur W-I, wobei 3% Saccharose durch 1,5% Glucose ersetzt sind. Entspricht der Rezeptur W-I, wobei 3% Saccharose durch 1,5% Glycerin ersetzt sind. »Synthetic medium of Dimmick« (ohne

Study of Bacteria« der Society of American Anm. P:

Bacteriologists, Geneva, N. Y., II₅o-19. Anm. L: Entspricht der Rezeptur W-18, wobei 3%

Saccharose durch 1,5% Glucose ersetzt sind. Anm. M: Entspricht der Rezeptur W-18, wobei die 5 Anm. Q:

Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapierstreifen ersetzt ist, die teilweise Anm. R:

in die Flüssigkeit eintauchen. Anm. N: »Manual of Methods for Pure Culture Stucy of Bacteria« der Society of American Bacteriologists, Geneva, N. Y., II50-18.

»Plain gelatin«, hergestellt nach den Angaben im »Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria« der Society of American Bacteriologists, Geneva, N. Y., 1150-18. Handelsübliches Magermilchpulver, nach den Angaben des Herstellers zubereitet. Für die Untersuchung der Produktion von H2S von H. D. Tresner und F. Danga, Journal of Bacteriology, 76, 239-244, 1958, angegebenes Medium.

Kulturmedium	Entwicklungs	Vegetatives Mycel	Luftausgesetzter	Lösliches	Beobachtungen und
	grad	(v. M) oder	Teil (umfaßt Ge	Pigment	biochemische
		Unterseite der	samtheit von luft		Eigenschaften
		Kultur	ausgesetztem Mycel
			und Sporulation)
(1)	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)

Agar nach
Hickey und
Tresner (Anm.A)

gut

dickes und gefaltetes v.M., gelbbraun

dunkelgrau

gelbbraun

zylindrische Sporen mit abgerundeten Enden und Abmessungen von 0,6 bis 0,8 μ/1,0 bis 1,2 μ; gerade und schwach gebogene, isolierte oder traubenförmige Sporenfaden

Agar nach Bennett (Anm. B)	gut	dickes und ge faltetes v. M., gelbbraun	weißlich bis grau; sehr mäßig entwickelt	gelbbraun	Produktion von Melanin negativ (nach den Angaben des Autors durch geführte Ablesun gen)
Agar nach Emerson (Anm. C)	gut	dickes und ge faltetes v. M., gelbbraun	gräulich-weiß bis grau; sehr mäßig entwickelt	gelbbraun	gute Löslichma- chung von Calciummalat
Agar mit Hefe extrakt nach Pridham (Anm. D)	sehr gut	sehr dickes und stark gefaltetes v. M. gelbbraun	hellgrau bis dunkelgrau	gelbbraun
Agar mit Hafer mehl und mit Tomatenextrakt nach Pridham (Anm. E)	gut	dickes und ge faltetes v. M., gelbbraun bis dunkel kastanien braun	hellgrau bis dunkelgrau	dunkelbraun
Glucose-Pepton- Agar (W bis 6) Agar (W-6)	ziemlich gut	gelbbraune vis dunkelbraune Unterseite	sehr hell gelblichgrau	gelbbraun
Nähragar (W-5)	mittel	gelbbraunes v. M.	gräulich-weiß, in Form von Spuren	gelbbraun
Tyrosin-Hefe- extrakt-Agar zur Bildung von Melanin (Anm. F)	mäßig	gelbbraune Unterseite	hellgrau	gräulich gelbbraun
Agar mit Calcium- malat nach Krainsky (Anm. G)	mittel	hellgelbe Unterseite	sehr hellgräulich	schwach gelblichgrau
Agar mit Oval- bumin (W-12)	ziemlich schlecht	ungefärbtes bis gräulich-weißes v.M.; hellgelbliche Unterseite	hellgräulich in Form von Spuren	keines

ίο

Fortsetzung

Kulturmedium	Entwicklungs	Vegetatives Mycel	Luftausgesetzter	Lösliches	Beobachtungen und
	grad	(v. M) oder	Teil (umfaßt Ge	Pigment	biochemische
		Unterseite der	samtheit von luft		Eigenschaften
		Kultur	ausgesetztem Mycel
			und Sfiorulation)
(D	(2)	(3)	(4)	(5)	(6)

Glucose-Asparagin-Agar (W-2)

Glycerin-Asparagin-Agar (W-3)

Stärke-Mi neralsalz-Agar nach Pridham (Anm.H)

mittel

gut

ziemlich gut

Stärke-Nitrat- gut Agar (W-IO)

Synthetischer Agar gut nach Czapek mit Saccharose (W-I)

Synthetischer Agar gut nach Czapek mit Glucose (Anm. I)

Synthetischer Agar gut nach Czapek mit Glycerin (Anm. J)

Stärke-Nitrat-Bouillon (W-19)

Glucose-Nitrat-Bouillon nach Dimmick (Anm. K)

Synthetische Bouillon nach Czapek mit Saccharose (W-18)
Synthetische Bouillon nach Czapek mit Glucose
(Anm. L)

Synthetische Bouillon nach Czapek mit Cellulose (Anm. M)

ziemlich gut

mäßig

sehr mäßig

ziemlich gut

hellgräulichgelbes	weißlich bis	schwach	1	zylindrische Sporen	Produktion von
v.M.	gräulich	bräunlichgelb		mit abgerundeten	Nitriten:
dickes und ge	weißlich bis	schwach		Enden und mit Ab	schwach positiv
faltetes v. M.,	grau	gelbbraun		messungen von 0,6	zu Beginn der
heiigelbiichgrau				bis 0,8 μ/1,0 bis	Züchtung
hellbraungelbe bis	hellgräulich bis	keines	1,2 μ; gerade oder	Produktion von
dunkelbraune	grau		schwach gebogene,	Nitriten: positiv;
Unterseite			isolierte oder trau-	Verwertung von
			benförmige Sporen	Cellulose: positiv
			fäden; Hydrolyse
			von Stärke: positiv
			Hydrolyse von
			Stärke: positiv



dunkelbraune	grau	gelbbraun
Unterseite
dickes und ge	hellgräulich;	gelbbraun
faltetes v. M.,	sehr schlecht
dunkelgelbbraun	entwickelt
dickes und ge	hellgrau;	gelbbraun
faltetes v. M.,	sehr schlecht		Produktion von §
dunkelgelbbraun	entwickelt		Nitriten: positiv 1
ziemlich dickes	weißlich;	gelbbraun	I
und gefaltetes	in Form von		Ϊ
v. M., gelbbraun	Spuren		I
weißlicher	weißlich;	keines oder	Produktion von i
Schleier, gut	in Form von	sehr schwach	Nitriten: positiv \|
entwickelt	Spuren	bräunlich und	1
		in sehr geringer	1
		Menge
weißlicher	keiner	keines
Schleier, mäßig
entwickelt
weißliche	keiner	keines
flockige Kultur
an der Oberfläche
und sedimentiert
weißliche	keiner	keines
flockige Kultur
an der Oberfläche
und sedimentiert

gut entwickelter	grau auf dem	bräunlich
weißlicher	Schleier und auf
Schleier	dem aus der
	Bouillon heraus
	ragenden Papier

Fortsetzung

Kulturmedium	Entwicklungs	Vegetatives Mycel	Luftausgesetzter	Lösliches	Beobachtungen und
	grad	(v. M) oder	Teillünifaßt Ge	Pigment	biochemische
		Unterseite der	samtheit von luft		Eigenschaften
		Kultur	ausgesetztem Mycel
			und Sporulätion)
(D	(2)	(3)	(4)	(S)	(6)

Nitrat-Nährbouillon (Anm. N)

ziemlich gut

Reine Gelatine
mit 12%
(Anm. P)

Kultur auf
Kartoffeln
(W-27)

Magermilch
(Anm. Q)

Agar nach
Tresner und
Danga (Anm.R)

mäßig

gut

gut entwickelter	weißlich;	keines Produktion von	keines oder	rasche Peptonisation
Ring, sehr hell	in Form von	Nitriten: negativ im	zögernd schwach	ohne Koagulation,
bräunlich	Spuren	Verlaufe von nach	bräunlich	pH von 6,2 auf 8,0
		24 Stunden, 48 Stun	in 1 Monat gehend
		den, 7 Tagen, 14 Ta	hellgelbbraun Produktion von
		gen und 28 Tagen	H₂S: negativ
		Züchtung vorge	(nach den Angaben
		nommenen Able	der Autoren durch
		sungen	geführte Ablesun
dunkelbraungraue	keiner	braungelb gute Verflüssigung	gen)
zentrale Kolonie		von Gelatine
an der Oberfläche
um die Stelle der
Beimpfung
hellbräunliches	keiner oder
bis dunkelbraunes	hellgräulich, in
v.M.	Form von Spuren
bräunlichgelber	keiner
Ring


gelbbraunes	keiner
v.M.

Streptomyces nebulosus DS 14579 weist eine Gesamtheit von Eigenschaften auf, die mit keiner derjenigen der bereits beschriebenen Stämme genau übereinstimmt.

Betrachtet man die Species, deren Beschreibung in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology« (7. Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961) oder in »The Actinomycetes« (Band 2, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961) gegeben ist, so ist die Species, der er sich am meisten nähert, Streptomyces aburaviensis, der, wie er, kein Melanin auf organischen Medien produziert, ein weißes bis graues Luft-ausgesetztes Mycel aufweist , und gerade Sporophoren bildet und dessen vegetatives Mycel auf »Saccharose-Nitrat-Agar« gelbbraun ist Er ist mit diesem jedoch nicht identisch, da man, wenn man sich auf die Beschreibung von S. aburaviensis in »The Actinomycetes« (Seite 166) bezieht, sieht, daß zwar eine gewisse Anzahl der Eigenschaften, die diese beiden Stämme aufweisen, identisch ist, jedoch eine Anzahl anderer Eigenschaften nicht übereinstimmt

S. aburaviensis ergibt insbesondere ein oliv-gräuliches Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar und ein gelbes bis blassolives Wachstum auf Kartoffeln, während S. nebulosus DS 14579 auf Glucose-Asparagin-Agar ein hellgräulichgelbes Wachstum und auf Kartoffeln ein Wachstum ergibt, dessen Färbung von hellbräunlich bis dunkelbraun geht Es sei bemerkt, daß niemals eine grünliche oder olive Färbung des vegetativen Mycels von S. nebulosus DS 14579 auf irgendeinem Medium im Verlaufe seiner Prüfung beobachtet wurde: Das vegetative Mycel weist in allen Fällen Färbungen auf, die von gelblich bis braungelb oder gelbbraun gehen, je nach den Medien und dem Entwicklungsgrad. Außerdem produziert S. aburaviensis kein lösliches Pigment auf Nähragar oder Gelatine und bildet ovale Sporen, während S. nebulosus DS 14579 ein gelbbraunes lösliches Pigment auf Nähragar und ein lösliches braungelbes Pigment auf Gelatine produziert und zylindrische Sporen bildet Außerdem verwertet S. aburaviensis die folgenden Kohlenstoffquellen nicht, die S. nebulosus DS 14579 verwertet: Mannit, Arabinose, Raffinose, Insosit, Xylose und Saccharose.

Die Fähigkeit von S. nebulosus DS 14579, verschiedene Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen zur Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode nach Pridham und Gottlieb (J. of Bact 56, 107—114,1948) bestimmt Der Entwicklungsgrad würde auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium beobachtet, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlenstoffquellen oder das (NH₄J₂SO₄ durch die

verschiedenen jeweils untersuchten Stickstoffquellen ersetzt würde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

■-; :ϊ :i	21	13	54 031	14	Verwertung
■'■·	Verwertung	Geprüfte Stickstoffquelien	positiv
, Geprüfte Kohlenstoffquellen	positiv	NaNO₃	positiv
D-Ribose	positiv	NaNO₂	positiv
D-Xylose	positiv	(NH₄J₂SO₄	positiv
L-Arabinose	negativ	(NH₄J₂HPO₄	negativ
L-Rhamnose	positiv	Adenin	positiv
D-Glucose	positiv	Adenosin	negativ
D-Galactose	positiv	Uracil	positiv
D-Fructose	positiv	Harnstoff	positiv
D-Mannose	negativ	L-Asparagin	positiv
L-Sorbose	schwach und zögernd	Glykokoll	negativ
Lactose	positiv	Sarcosin	positiv
Maltose	positiv	DL-Alanin	positiv
Saccharose	positiv	DL-Valin	positiv
Trehalose	positiv	DL-Asparaginsäure	positiv
Cellobiose	positiv	L-Glutaminsäure	positiv
RafTinose	positiv	L-Arginin	positiv
Dextrin	positiv	L-Lysin	positiv
Inulin	positiv	DL-Serin	positiv
Stärke	positiv	DL-Threonin	positiv, langsam
Glykogen	positiv	DL-Methionin	negativ
Glycerin	negativ	Taurin	positiv
Erythrit	negativ	DL-Phenylalanin	positiv
Adonit	negativ	L-Tyrosin	positiv
Dulcit	positiv	DL-Prolin	positiv
D-Mannit	negativ	L-Hydroxypyrolin	positiv
D-Sorbit	positiv	L-Histidin	positiv
Inosit	negativ	L-Tryptophan	negativ
Salicin		Betain

Die Herstellung von 25048 RP besteht im wesentlichen darin, Streptomyces nebulosus DS 14579 oder seine Mutanten in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Produkt abzutrennen.

Die Züchtung von Streptomyces nebulosus DS 14579 kann nach jeder beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder Submerszüchtungsmethode erfolgen, doch ist diese letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verwendet zu diesem Zweck die versciedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden.

Man kann insbesondere den folgenden Weg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

Streptomyces nebulosus DS 14579 — Stammansatz

Kultur auf Agar

i
Kultur im Kolben unter Bewegung

Impfkultur im Fermenter

i
Produktionskultur im Fermenter

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoff quelle und eine assimilierbare Stickstoffqueile, Mineralstoffe und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Bestandteile in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohienstoffquelle kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose. Dextrine Stärke, oder andere Kohlehydratsubstanzen.

so wie beispielsweise Zuckeralkohole, z. B. Glycerin oder Mannit oder wie gewisse organische Säuren, z. B. Mischsäure, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche öle, wie beispielsweise Schmalzö! oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlehydratquellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt werden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise anorganische oder organische Ammoniumsalze, wie beispielsweise Ammoniumsulfat oder gewisse Aminosäuren, sein. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten, zugeführt werden, wie beispielsweise in Form von Casein, Lactalbumin, Gluten und deren HydrolySaten, Sojamehl, Arachismehl, Fischmehl, Pepton, Fleischextrakten, Hefeextrakten, Distillers' Solubles und Maisquellwasser.
Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können

gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Wirkung besitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder CaJcium- oder MagnesiumcarbonaL

Andere führen zu dem zur Entwicklung von ί Streptomyces nebulosus DS 14579 und zur Erzeugung von 25048 RP erforderlichen lonengleichgewicht, wie beispielsweise Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken gewisse in spezieller Weise als Aktivatoren der Stoffwechselreaktionen von Strepto- in myces nebulosus DS 14579. Es sind dies insbesondere die Kobaltsalze.

Der pH-Wert des Fermentatinsmediums sollte zu Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen GJj und 7,5, liegen. Die zur Fermentation r> optimale Temperatur beträgt 25 bis 30⁰C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und 33°C eine zufriedenstellende Produktion erhalten. Die Belüftung der Züchtung kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde jedoch gefunden, daß Belüftungen von 0,3 bis 3 I Luft je I Bouillon und je Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an 25048 RP wird nach 3- bis 7tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hautpsächlich von dem verwendeten Medium abhängt. 2^r>

Das 25048 RP kann aus den Fermentationsmaischen in verschiedener Weise isoliert werden:

Man kann die Fermentationsmaische bei einem pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5 und vorzugsweise bei pH 7 filtrieren und dann das so erhaltene Filtrat auf ein jo Volumen zwischen ¹A und '/β des anfänglichen Volumens einengen und dann in der Kälte ein schlechtes Lösungsmittel für 25048 RP, wie beispielsweise Aceton, zugeben, um die Ausfällung des Rohprodukts zu bewirken. r>

Das Rohprodukt kann nach einer der folgenden Methoden gereinigt werden:

Fraktionierte Ausfällung mittels konzentrierten wäßrigen Lösungen von Mineralsalzen, wie beispielsweise Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, und/oder schlechten Lösungsmitteln für 25048 RP, wie beispielsweise Methanol oder Aceton;

Dialyse durch eine Membran, vorzugsweise eine Membran aus regenerierter Cellulose, gegen Wasser, um die Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen;

Chromatographie einer wäßrigen Lösung von 25048 RP an verschiedenen Adsorbentien: Man verwendet vorzugsweise Gele von Kieselsäure, Dextran oder Polyacrylamid. ^r«>

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung. Die Aktivität der Produkte ist in Kuritz-Einheiten (K. E.), wie oben definiert, ausgedrückt. Diese Aktivität ist in K. E./cm³ ausgedrückt, wenn es sich um ein in Lösung befindliches Produkt handelt, und in K. E./g, wenn es sieb um ein festes Produkt handelt.

Beispiel 1

Die Produktionskultur wird in einem 30-Lilcr-Fcrmenter durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

Distillers' Solubles
gekörnte Bohnen
Sojaöl

Natriumchlorid
Kobaltchlorid · 6 H₂O
Leitungswasser

100 g
800 g
200 cm¹
100g
0,4 g
201

b¹) Der pH-Wert wird mit 17 cm³ 10n-Natronlauge auf 8,20 eingestellt. Man sterilisiert das Medium bei 122°C während 40 Minuten. Nach Abkühlen setzt man eine sterile Lösung von 100 g GIucose-Monohydrat und Leitungswasser ad 1 Liter zu.

Das Volumen der Bouillon beträgt 201 und der pH-Wert 6,70. Man beimpft dann mit 200 cm³ einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur von Streptomyces nebulosus DS 14579. Die Züchtung wird bei 25°C während 6 Tagen unter Rühren mittels eines Turbinenrührers, der mit 440 U/min betrieben wird, und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 1 mVStunde durchgeführt. Der pH-Wert beträgt dann 6,90 und die Aktivität der Maische erreicht 5,3 K. E./cm³.

Beispiel 2

181 der unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen hergestellten Kultunmaische werden bei pH 6,9 auf einem Faltenfilter filtriert. Man erhält so 101 klares Filtrat mit einem Gehalt von 7 K. EVcrn³.

Dieses Filtrat wird bei 25⁰C unter vermindertem Druck (2 mm Hg> auf '/3 seines Volumens eingeengt. Das Konzentrat wird durch eine Cellophanmembran über Nacht bei +4° C gegen 10 Volumina destilliertes Wasser dialysiert.

Zu dem erhaltenen, bei 4° C gehaltenen Dialysat (3,2 Liter) setzt man unter Beweger. 1,61 zuvor auf - 10⁰C abgekühltes Aceton zu.

Der erhaltene inaktive Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Zu der überstehenden Lösung setzt man unter den gleichen Bedingungen wie oben 4,8 I auf — 10⁰C abgekühltes Aceton zu.

Nach lOminütigem Zentrifugieren mit 12 000 g wird der aktive Niederschlag gesammelt und dann in 550 cm³ destilliertem Wasser gelöst.

Zu dieser auf +4⁰C abgekühlten Lösung setzt man unter Bewegen 272 g kristallisiertes Ammoniumsulfat (zur Erzielung einer Lösung mit 8O°/oiger Sättigung an Salz berechnete Menge) zu.

Nach i'/^stündigem Stehenlassen bei +4⁰C zentrifugiert man 10 Minuten mit 12 000 g. Der erhaltene Niederschlag wird in 200 cm³ Wasser suspendiert.

Diese Lösung wird über Nacht bei +4⁰C dialysiert, um restliches Salz zu entfernen.

Zu dem bei +4⁰C gehaltenen Dialysat (280 cm³) setzt man langsam unter Bewegen 600 cm³ zuvor auf — 10⁰C abgekühltes Isopropanol zu und hält dann noch 10 bis 15 Minuten nach beendeter Zugabe des Lösungsmittels in Bewegung.

Der aktive Niederschlag wird durch Zentrifugieren während 10 Minuten mit 12 000 g gewonnen. Das Produkt wird unter vermindertem Druck (2 mm Hg) in Anwesenheit von P2O5 bei einer Temperatur von etwa 20°C getrocknet.

Man erhält so 6,8 g Produkt mit einem Gehalt von 3800 K. E./g.

Versuch 1

Man stellt einen Brotteig mit dem folgenden Gemisch her:

Getreidemehl
Hefe
Salz
Wasser

1kg
20 g
22 g
630 cm^J

9öää3i/i2s

Parallel stellt man einen Brotteig mit einem identischen Gemisch her, zu dem man 10 mg des Enzyms 25048 RP mit einem Gehalt von 3800 K. EJg in Form eines Konzentrats mit 0,1 Gew.-% in Getreidemehl zugibt

Nach intensivem Kneten und einer ersten Gärung von 75 Minuten formt man den Teig und stellt fest, daß in Anwesenheit des Enzyms die Bearbeitung des Teigs erheblich erleichtert ist: Der Teig ist viel streckbarer und viel weniger elastisch als der Vergleichsteig. ι ο

Die Aufgehzeit (2. Gärung) ist eindeutig in Anwesenheit des Enzyms vermindert (110 Minuten gegenüber 135 Minuten), und der erhaltene Teig weist eine Kohlendioxydretention auf, die mit der des Vergleichsteigs identisch ist (mit einem Chopin-Zymotachygraph r> durchgeführte Bestimmungen).

Nach dem Backen erhält man bei dem Versuch mit Enzym ein Brot, das das gleiche Volumen wie das Vergleichsbrot aufweist, jedoch eine viel gleichmäßigere Krumenporenbildung besitzt Versuch 2

Man stellt durch Verkneten ein Konzentrat für industrielle Biskuitherstellung her. das 1000 g Stärke und 100 g Enzym 25048 RP enthält

Dieses Konzentrat kann zu trockenen Bestandteilen oder flüssigen Bestandteilen in einer Menge von 10 g je Charge von 100 kg Mehl zugegeben werden.

Versuch 3 Ein Konzentrat für die Detergensindustrie enthält:

Enzym 25048 RP	99g
ausgefällte Kieselsäure
»Le viii te«	ig
Methylenblau	0,1g

Dieses Konzentrat ist für die Herstellung von Granulaten verwendbar, die 2% Enzym enthalten und Waschpulver nach den üblichen Techniken in einer Menge von 50 g Enzym je Tonne Waschpulver zugesetzt werden können.

Claims

Patentansprüche:

1. Proteolytisches Enzym, das mit der Nummer 25048 RP bezeichnet wird, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Proteinsubstanz ist, die in Wasser sehr löslich ist in konzentrierten Lösungen von Neutralsalzen und in wäßrig-alkoholischen oder wäßrig-acetonischen Gemischen wenig löslich ist und in wasserfreien Alkoholen und Ketonen unlöslich ist, auf Casein bei pH 8 eine Maximalaktivität bei 37 bis 65° C aufweist und bei 75°C in 6 Minuten inaktiviert wird, bei Casein mehr Peptidbindungen als Trypsin hydrolysiert und nur eine geringe esterolytische Wirksamkeit auf die Äthylester von Benzoylarginin und Acetyltyrosin aufweist.

2. Verfahren zur Herstellung von 25 048 RP, dadurch gekennzeichnet, daß man aerob in einem assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden Medium Streptomyces nebulosus DS 14 579 (NRRL 3864) bis zur Bildung einer merklichen Menge an Enzym züchtet und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Enzym abtrennt.

3. Proteolytische enzymatische Zusammensetzung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an 0,005 bis 99 Gew.-% Enzym 25 048 RP, zusammen mit verträglichen Verdünnungsmitteln.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie 1 bis 10 Gew.-°/o Enzym 25 048 RP zusammen mit zumindest einem Kohlehydrat oder Mineralsalz enthält.

Kunitz-Eiaheiten (K.E.) ausgedrückt werden: Nach der Definition von Kunitz ist eine Einheit die Enzymmenge, die ausreichend lösliche Peptide in Freiheit setzt, um eine Erhöhung der optischen Dichte des Trichloressigsäurefiltrats bei 280 nm in 1 Minute um 1000 zu erhalten. In den nachfolgenden Tabellen I, II und III sind die für die Hydrolyse von Carein mit dem Enzym 25048 RP bei verschiedenen pH-Werten, bei verschiedenen Temperaturen und in verschiedenen Medien erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt Für jeden Versuch wurden 32 μg Enzym mit einem Gehalt von 3700 K.EVg verwendet