DE2154031A1

DE2154031A1 - Neues proteolytisches Enzym und seine Herstellung

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Publication number: DE2154031A1
Application number: DE19712154031
Authority: DE
Inventors: Andre Vanves Hauts de Seme Florent Jean Paris Mancy geb Courtillet Denise Charenton VaI de Marne Verner Jean Boulogne Hauts de Seine Belloc, (Frankreich)
Original assignee: Rhone Poulenc SA
Current assignee: Rhone Poulenc SA
Priority date: 1970-10-30
Filing date: 1971-10-29
Publication date: 1972-05-04
Also published as: DE2154031C3; FR2110786A5; SE7412420L; DE2154031B2; GB1330390A; SE382996B; JPS5432069B1; NL7114575A

Description

Neues proteolytisches Enzym und seine Herstellung

; Die vorliegende Erfindung "betrifft ein neues proteolytisches ι Enzym, das im folgenden mit der Nummer 25C48 RP bezeichnet wird, ! sein Herstellungsverfahren und die Zusammenseti angen mit enzy-

! matischer Aktivität, die dieses enthalten.

! ■ ■ f

ι Dieses neue Enzym kann durch Züchtung eines Mikroorganismus, ' der dem Genus Streptomyces angehört und mit "Streptomyces i nebulosus DS 14579" (NRRL 3864) bezeichnet wird, in künstlichen ; Medien erhalten werden.

,Das Enzym 25048 RP ist eine Proteinsubstanz, die-in Form eines j grauen amorphen Pulvers, vorliegt. Dieses Produkt ist in Y/asser j sehr löslich, in wässrigen konzentrierten Lösungen von Neutral- \ salzen (beispielsweise Ammoniumsulfat) und in wässrig-alkoholischen oder Yfasser-Aceton-Gemischen wenig löslich und in wasserfreien Alkoholen und in Ketonen unlöslich.

Durch Chromatographie an Dextrangel Sephadex konnte sein angenähertes Molekulargewicht bestimmt v/erden. Es beträgt etwa 45 000. _ _ '

"" " 20981977003 "' ^BAD °^R1GINAL

Die proteolytische Aktivität des Enzyms 25048 RP tritt bei einer Vielzahl von Substraten proteinischer Natur, wie beispielsweise Casein, Hämoglobin, Fibrin (Lyse von Blutgerinnsel ) und Milch (Koagulation) in Erscheinung.

Die Aktivität bei Casein wird nach einer Technik bestimmt, die von derjenigen abgeleitet ist, die Kunitz für die Bestimmung von Trypsin entwickelte /M. Kunitz, J. Gen. Physiol. 3,0, 291 (1947)_7· Die im Verlaufe der Hydrolyse freigesetzten, in Trichloressigsäure löslichen Peptide werden durch Spektrophotometrie (optische Dichte bei 280 nm) bestimmt und in Tyrosin-Äquivalenten ausgedrückt. Die enzymatische Aktivität kann in Kunitz-Einheiten (K.E.) ausgedrückt werden: Nach der Definition von Kunitz ist eine Einheit die Enzymmenge, die ausreichend lösliche Peptide in Freiheit setzt, nm eine Erhöhung der optischen Dichte des Trichloressigsäurefiltrafcs bei 280 nm in 1 Minute um 1_p000 zu erhalten.

In den nachfolgenden Tabellen I, II und III sind die für die Hydrolyse von Casein mit dem Enzym 25048 RP bei verschiedenen pH-Werten, bei verschiedenen Temperaturen und in verschiedenen Medien erhaltenen Ergebnisse zusammengestellt. Für jeden Versuch wurden 32 ,ug Enzym mit einem Gehalt von 3700 K.E./g verwendet.

BAD ORIGINAL

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- 3 -Tabelle I

Hydrolyse von Casein bei 37⁰C durch das	Art des Puffers	25048 HP -
Einfluss des pH-Werts	Phosphat - 0,1m
pH des Reaktions mediums	It	in 20 Minuten freigesetzte Peptide (mg-Äquiva- lente Tyrosin)
5,5	Il	0,098
6,5	Borat - 0,2m	0,231
7,0	Il	0,400
7,f	Il	0,837
b,0	Il	0,899
8,5	" ! !	0,882
9,0	0,768
9,6	0,579

Tabelle II

Hydrolyse von Casein durch das 25048 RP bei pH = 8,0 - Einfluss der Temperatur	freigesetzte Peptide (mg-Äquivalente ! Tyrosin) in	0,414 0,840 1,105 1,318 • 1,195 0,821 0,333
Temperatur	10 Minuten 20 Minuten
25⁰C 37⁰C 50⁰C 60⁰C 65⁰C 70⁰C 75°C	0,207 0,503 0,651 0,711 0,814 0,675 0,311

2 09819/100 3

Tabelle III

Hydrolyse \ron Casein durch das 25048 RP bei 50⁰C - Einfluss deη Reaktionsmediums	in 10 Minuten freigesetzte Peptide (mg--Äquivalente Tyrosin) in	(* ) Tripolyphosphatlö'sung ^v '
pH des Reaktions mediums	0,2m Boratpuffer	0,574 0,550 0,533 I
8,5 9,0 9,5	0,621 0,503 0,455 t

J (*) Lösung von Natriumtripolyphosphat mit ejnem Gehalt ! von 1,5 g/l.

Das Enzym 25048 RP ißt somit in einem breiten pH-Bereich wirk- ; sam.

Der optimale pH-Wert beträgt 8,0, doch behält r<as Enzym in dem Bereich von 7,5 - 9,0 eine Aktivität über C5 $> seiner maximalen Aktivität.

Bei pH 8,0 beträgt die optimale Temperatur 65°C. Bei 70⁰C besitzt das Enzym noch mehr als 80 ^c/o seiner maximalen Aktivität in den ersten 10 Minuten. Bei 75⁰C tritt die Inaktivierung des Enzyms nach 6 Minuten auf.

Bei 50 C ist das Enzym 25048 RP in. wässrigen Natriumtripolyphosphatlösungen mit einem Gehalt von 1,5 g/l sehr aktiv.

In der nachfolgenden Tabelle IV sind schliesslich die Kinetiken der Freisetzung von Pepiiden aus Casein durch das Enzym ?5048 RP und durch Trypsin verglichen.

Man stellt fest, dass das Enzym 25048 RP mehr Pepta(lbindungen spaltet als Trypsin bei diesem Substrat.

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^ßAD

— 5 — Tabelle IV

Vergleich der Hydrolyse von Casein "bei pH 8,0 und 37°C diirch das Enzym 25048 RP und durch Trypsin	freigesetzte Peptide (rag -Äquivalente Tyrosin) durch	Trypsin ^v '
Reaktions zeit (Minuten)	das Enzym 25048 Rp(*)	0,158 0,540 0,795 0,920 1,015
3 6 9 12 15 13 20 30 60 120	0,164 0,317 0,454 0,605 0,705 0,828 0,901 1,203 1,650 1,915

: (*) 32 jig Enzym 25048 ·RP mit einem Gehalt von 3700 K.E./g (**) 32 ug kristallisiertes Trypsin mit einem Gehalt von

j 4500 K.E./g

ι Das Enzym 25048 RP besitzt nur eine geringe esterolytische Y/irksamkeit auf den Äthylester von Benzoylarginin, wie in der nachfolgenden Tabelle V gezeigt wird, in der die Aktivitäten

'■' des Enzyms 25048 RP und des Trypsins auf Casein und auf den ' Äthylester von Benzoylarginin verglichen sind. Andererseits ' ist das Enzym 25048 RP praktisch frei von einer Wirkung auf den Äthylester von Acetyltyrosin.

BAD ORIGINAL

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Tabe3De V

Vergleich dei*	Aktivitäten	von Enzym 25040	Aktivität ester von I.E./g	RP und Trypsin
Enzym	Aktivität Casein K.E	auf ./g	auf den Athyl- Benzoylarginin
25040 HP Trypsin	3700 4500		■ 6900 50500

Das neue Enzym kann mit "Vorteil in Detergentiengemischen verwendet werde"-, da es bei alkalischen pH-Werten und bei Temperaturen in (i3r Nähe von 60⁰C aktiv ist und da es mit Polyphosphaten vorträglich r'.st.

Dan neue Enzym kann auch in den Nahrungsmittelindustrien, insbesondere als Hilfsmittel bei der Brotherstellung verwendet • werden: Zu Mehl in einer Menge von 5 bis 10 mg/kg zugesetzt, ' erleichtert das E1zy.11 die Teigbearbeitung, setzt die zur Gärung

erforderliche Zeit erheblich herab und verbessert die Quali-' täten des erhaltenen Brot", (insbesondere regelmässigere Kru-

menporenbildung). Es kann in der Bäckerei, bei der Biskuitherfe stellung und bei der Zwiebackherstellung verwendet werden.

^: Für diese Verwendungen wird das Enzym vorteilhafterweise in _: Form von Zusammensetzungen eingesetzt, in denen es zusammen mit verträglichen Verdünnungsmitteln vorliegt, die seine Dosierung und sein Einbringen leichter machen. Beispielsweise kann dos Enzym 25048 RP in den Nahrungsmittelindustrien in pulverförmigen Produkten, insbesondere solchen auf der Basis von Kohlehydraten oder Mineralsalzen, wie beispielsweise Getreide- 'λ mehl, Stärke, Saccharose, Glucose, Lactose und Calciumcarbonat, entweder allein oder zusammen mit anderen in geringen Mengen verwendeten Bestandteilen (wie Aromastoffen, Farbstoffen und dergl) verdünnt v/erden. In diesen Zusammensetzungen, ivie in den für die Detergentienindustrie brauchbaren Zusammensetzungen, kann das Enzym 0,005 bis 99 Gew.-^ und vorzugsweise 1 bis 10 Gew.-% ausmachen. \ BAD

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Gevmnschtenfalls können die Enzymteilchen durch eine unter den Gebrauchsbedingungen labile und beispielsweise wasserlösliche Umhüllung isoliert werden.

Der das Enzym 25048 RP erzeugende Organismus gehört dem Genus Streptomyces an und wird mit "Streptomyces nebulosus DS 14579" (KRRL 3864) bezeichnet.

Dieser Organismus wurde aus einer in Indien entnommenen Erdprobe isoliert.

Die Isolipr^.-smethode ist die folgende: Die Erdprobe wird in sterilem üestilliertem V/asser suspendiert, die Suspension wird dann auf verschiedene Konzertrationen verdünnt, und ein kleines Volumen jeder Verdünnung wird auf die Oberfläche von Pe.risehalen verteilt, die ein Agarrmhrmedium enthalten. Nacli einer Inkubation von einigen Tagen bei 26°C werden die Kolonien von Mikroorganismen, die man isolieren will, auf Schrägagar versetzt, um reichlichere Kulturen zu erhalten.

Der Stamm Streptomyces nobulosus l'.-B 14579 bildet zylindrische Sporen mit abgerundeten Enden mit Abmessungen von 0,6 bis 0,8/u/1,0 bis 1,2,«, Die Sporenketten sind gerade oder schwach gebogen und einzeln oder in Trauben auf den Luft-ausgesetzten Fäden, die sie tragen, angeordnet. Sie weisen zumeist 10 bis 20 Sporen auf, doch sind sie manchmal etwas länglicher und können einige Zehn an Sporen aufweisen. Durch seine Sporolationsart fällt dieser Stamm in die Sektion Rectus-Plexibilis der Klassifikation nach Pridham.

Eingehende Beschreibung von Streptomyces nebulosus DH 14 57.9

Strsptoriyces nebulosus DS 14579 entwickelt sich gut bei 26 G, etwas weniger gut bei 37°O und nicht bej 5O⁰C. Er erzeugt kein Lleliuninpigment auf den organischen Medien, produziert kenn H₀S, bildet IJitrite aus !Nitraten auf synthetischen Kedien, jedoch nicht auf na tratholtiger Hährlu-ui Π lon, hydrolysiert Stärke, verflüssigt Gelatine, peptonini ort LIi3 ch ohne vorhergehende

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Koagulation und verwertet Cellulose. Sein vegetatives Myeel weist im allgemeinen eine gelbbraune, je nach den Zücbtungsmedien, auf denen er sich entwickelt, mehr oder weniger tiefe Färbung auf. Die löslichen Pigmente, die er erzeugt, haben einen je nach den Züchtungsmedien und ihrem Entwicklungsgrad mehr oder weniger dunklen gelbbraunen Ton. Sein Luft-ausgesetztes My-Cel färbt sich grau, wenn die Sporulation eintritt.

Die Züchtungscharakteristiken und die biochemischen Eigenschaften von Streptomyces nebulosus DS 14579 sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt. Es sind dies diejenigen von Kulturen, die ein gutes Entwicklungsgradium erreicht haben, d.h. Kulturen von etwa 2 bis 3 Wochen bei 26 C, falls es nicht anders angegeben ist. Diese Eigenschaften w irden auf Nähragar und Bouillons beobachtet, die üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Stämmen von Streptomyces verwendet werden, wobei die Kulturen auf Agarmedien auf Schrägagar durchgeführt wurden. Eine gev/isse Anzahl der verwendeten Züchtungsmedien wurde nach den Rezepturen hergestellt, die in ■ "The Actinomycetes", S.A. Waksman, Chronica Bctauica Company, j Waltham, Mass., USA, 1950, Seite 193 - 197, angegaben sind. . In diesem Falle sind die Medien durch den Buchstaben W, dem

·; die Nummer folgt, die ihnen in "The Actinomycetes" gegeben wur-I

: de, bezeichnet.

Die Literaturstellen für die anderen Züchtungsmedien oder die Zusammensetzungen derselben sind die folgenden:

. Anm. A: "Hickey and Tresner's Agar", T.G. Pridham u. Mitarb., j Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950

Anm. B: K.L. Jones, Journal of Bacteriology,52, 142, 1949 '■ Anm. C: Rezeptur W-23, versetzt mit 2 ^v/o Agar

Anm. D: "Yeast Extract Agar", T.G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual,1956-1957, Seite 950

Anm. E: "Tomato Paste Oatmeal Agar", T.G. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 950

209819/1003 ^ßAD °R'G/nal

; Arm. F: "Melanin formation medium", The Actinomycetes, '. Band 2, Seite 333, Nr. 42, S.A. Waksman, The Williams-

^! and Wilkins Company, Baltimore, 1961

Anm. ft: ¥.E. G-rundy u. Mitarb., Antibiotics and Chem. 2,, 401, 1952

Anm. H: "Inorganic Salts - Starch Agar", T.G-. Pridham u. Mitarb., Antibiotics Annual, 1956-1957, Seite 951

Anm. I: Entspricht der Rezeptur Y/-1 , wobei 3 °/° Saccharose durch 1,5 $ Glucose ersetzt sind.

Anm. J: Entspricht der Rezeptur W-1, wobei 3 i> Saccharose durch 1,5 $ Glycerin ersetz+ Bind.

Anm. K: "Synthetic medium of Dimmick" (ohne Agar), "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of Americar Bacteriologists, Geneva, IT.Y.,

H₅₀-19 :

Anm. .L: Entspricht der Rezeptur W-18, wobei 3 i° Saccharose durch 1,5 ^c/° Glucose ersetzt sind

Anm. M: Entspricht der Rezeptur ¥-18, wobei die Saccharose weggelassen und durch kleine Filterpapierstreifen ersetzt ist, die teilweise in die Flüssigkeit eintauchen.

Anm. N: "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y.,

¹¹So-¹⁸

Anm. Pi "Plain gelatin", hergestellt nach den Angaben im "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Geneva, Ν.Ύ.,

H₅₀-I β

Anm. Q: Handelsübliches Magermilchpulver, nach den Angaben des Herstellers zubereitet.

Anm. R: Für die Untersuchung der Produktion von HpS von H.D. Tresner und F. Danga, Journal of Bacteriology, 76« 239-244, 1958, angegebenes Medium.

20981971003 bad original

Kulturmedium

Entwicklungsgrad

ro ο to α»

(O

(2)

Vegetatives Mycel (v.H) oder

Unterseite der Kultur

(3)

luft-ausgesetzter Teil (umfasst Gesamtheit von Luf-j-aas gesetztem Mycel und Sporulation)

(4)

lösliches
Pigment

(5)

Beobachtungen und "biochemische Eigenschaften

(6)

Agar nach Hickey und Tresner (Anm. A)

gut

Agar nach Bennett (Anm. B)

;ut

dickes und gefaltetes v.M., gelbbraun

dickes und gefaltetes v.M.. gelbbraiui

dunkelgrau

gelbbraun

weisslieh
bis grau;
sehr massig
entwickelt

braun

zylindrische Sporen mit abgerundeten Enden und Abmessungen von 0,6 bis 0,8 :U/ 1,0 bis 1,2 μ gerade oder schwach gebogene, isolier· te oder traubenfcrmige Sporenfäden

σ co α>

co

ο ο co

(D	(2) 1	(3)	U)	(5)	(6)	I ■
Agar nach Emerson (Anm. C)	gut	dickes und gefaltetes v.M., gelb braun	I I gräulich-weiss bis ^"au; sehr massig ent wickelt	gelb braun
Agar mit Hefe extrakt nach Pridham (Anm. D)	sehr gut	sehr dickes und stark gefaltetes ν.Η., gelb braun	hellgrau bis dunkelgrau	gelb braun
Agar mit Hafermehl und mit Tomaten extrakt nach Pridham (Anm. E)	gut	dickes und gefaltetes v.M., gelb braun bis dunkel ka stanien braun	hellgrau bis dunkelgrau	dunkel braun
Glucöse- Pepton- Ag ar (V/-6)	ziemlich gut	gelbbraune bis dunkel braune Unterseite	sehr hell gelblichgrau	gelb braun

ro cn

CD CO

; ι	(D	(2)	(3)	.(4) .	j	(5)	(6)
	Mhragar	mittel	gelbbraunes	gräulich-weiss,	gelb
	(\",^r— 5)		v.M.	in Form von	braun
				Spuren
	Tyrosin-	massig	gelbbraune	hellgrau	gräulich	Produktion von
	Kefeextrakt-		Unterseite		gelb	Melanin negativ
	Agar zur				braun	(nach den Angaben
	Bildung von					des Autors durch
	Melanin					geführte Able
	(Anin. F)					sungen)
	Agar mit	mittel	hellgelbe	sehr hell	schwach	gute Löslichma-
	Calciumirv-		Unterseite	gräulich	gelblich	chung von
	lat nach				grau	Calciumrnalat
	Krainsky (Ann. G)
	Agar mit
	Cvalbumin	ziemlich	ungefärbtes	hellgräulich.	imines
	(W-12)	schlecht	bis gräu-	in Form von
			lich-weis-	Spuren
			ses v.II. ;
			hellgelb
			liche Un
	Glucose-		terseite
	Asparagin-	mittel	hellgräulich-	weisslich	schwach
	Ag ar		' gelbes v.M.	bis	bräunlich
ITI	(W-2)			gräulich	gelb
!AD Of

(D	(2)	(3)	L^ ⁽⁴⁾	(5)	(6)
Glycerin- Asparagin- Ag ar (W-3)	gut	dickes und gefaltetes v.M., hell- gelblich grau	weisslich bis grau	schwach gelbbraun
Stärke- Mineral- salz-Agar nach Pridham (Anm. H)	ziem lich gut	hellbraun gelbe bis dunkelbraune Unterseite	hellgräulich bis grau	keines	zylindrische Sporen mit abgerundeten Enden und mit Abmes sungen von 0,6 bis 0,8 u/1 ,0 bis 1,2 /α; gerade oder schwach gebogene, isolierte oder traubenförmige Sporenfäden; Hydro lyse von Stärke: positiv
Stärke- Mtrat- Ag ar (W-10)	gut	dunkelbraune Unterseite	grau	gelbbraun	Hydrolyse von Stärke: positiv
Syntheti scher Agar nach Czapek mit Saccharose	gut	dickes und gefaltetes v.M., dunkel gelbbraun	hellgräulich; sehr schlecht entwickelt	gelbbraun
Syntheti scher Agar. nach Czapek mit Glucose (Anm. I)	gut	dickes und gefaltetes v.M., dunkel gelbbraun	hellgrau; sehr schlecht entwickelt	gelbbraun

(O	(2)	ί	(3)	I	U)	(5)	(6)	I	Produktion von
Syntheti	gut	ziemlich	weisslich;	gelb			Hitriten:
scher Agar		dickes und	in Form von	braun			schwach positiv
nach		gefaltetes	Spuren				i su Ξβίτίηη der
Czapek mit		v.LI., gelb					Züchtung
Glycerin		braun
(Anm. J)
Stärke-	ziem	weisslicher	weisslich;	keines oder	Produktion von
Mtrat-	lich	Schleier,	in Form von	sehr schwach	Nitriten:
Bouillon	gut	gut ent	Spuren	bräunlich und	positiv
(W-19)		wickelt		in sehr gerin
				ger Menge
Glucose-	mas	weisslicher	keiner	keines	Produktion von
Mtrat-	sig	Schleier,			!■Titriten:
Bouiilon		massig			positiv
nach		entwickelt
Dimmick
(Anm. K)
Syntheti- C O Vt Ω	sehr	weissliche	keiner	keines
scne Bouillon	massig	flockige Kultur an der
nach Czapek mit Saccharose		Oberfläche und sedimestiert
(Y/-18)
Syntheti	sehr	weissliche	keiner	keines
sche	massig	flockige
Bouillon		Kultur an der
nach Czapek		Oberfläche und
mit Glucose		sedimentiert
(Anm. I·),

	(D	(2)	(3)	•(4)	(5)	(6)
	Syntheti	ziem	gut entwickelter	grau auf dem	bräunlich	Produktion von
	sche	lich	weis sucher	Schleier und		ITi tr it en:
	Bouillin	gut	Schleier	auf dem aus		positiv; Ver
	nach			der Bouillon		wertung von
	Czapek mit			herausragenden		Cellulose:
	Celluolse			Papier		positiv
	(Anm. LI)
	JTitrat-	ziem	gut entwickelter	weisslichj- in	keines	Produktion von
O	Kahr-	lich	Ring, sehr hell	Form von		Nitriten:
OO	bouillon	gut	bräunlich	Spuren		negativ im Ver
	(Anm. IT)					laufe von nach
CO						24· Stunden, 4-8
						Stunden, 7 Ta
-*						gen, 14- Tagen
O						und 28 Tagen
O						Züchtung vorge
						nommenen Able
						sungen
	reine Gelatine	massig	dunkelbraungraue zentrale Kolonie	keiner	braungelb	gute Verflüssi
	mit 12 fo		an der Oberfläche			gung von Gela tine
	(Anm. P)		um die Stelle der
			Beimpfung

O Q >

ro cn ο

CO

ro

co co- _j co

C? CJ co

(D	(2)	(3)	U)	(5)	(6)
Kultur	massig	hellbräunliches	keiner oder	keines oder
auf		bis dunkel	hellgräulich,	zögernd
Kartoffeln		braunes v.M. ·	in Form von	s ch'wach
0.7-27)			Spuren	bräunlich
Magermilch	massig	bräunlichgelber	keiner		rasche Peptonisa-
(Ann. Q)		Ring			tion ohne Koagu
					lation, pH von 6,2
					auf 8,0 in 1 Mo
					nat gehend
Agar nach	gut	gelbbraunes	keiner	hellgelb	Produktion von
Tresner		v.M.		braun	HpS: negativ
und					(nach den Anga
Danga					ben der Autoren
(Anm. R)					durchgeführte
					Ablesungen)

cn -Ο-O co

Streptomyces nebulosus DS 14579 v/eist eine Gesamtheit von Eigenschaften auf, die mit keiner derjenigen der "bereits beschriebenen Stämme genau übereinstimmt.

Betrachtet man die Species, deren Beschreibung in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (7« Auflage, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961) oder in "The Actinomycetes" (Band 2, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961) gegeben ist, so ist die Species, der er sich am meisten nähert, Streptomyces aburaviensis, der, wie er, | kein Melanin auf organischen Medien ^reduziert, ein weisses bis graues Luft-ausgesetztes MyceI aufweist und gerade Sporophoren bildet und dessen vegetatives Mycel r.uf "Saccharose-Nitrat-Agar" gelbbraun ist. Er ist mit diesem jedoch nicht identisch, da man, wenn man £-:±ch avf die Beschreibung von S. aburaviensis in "The Actinomycetes" (Seite 166) bezieht, sieht, dass zwar eine gewisse Anzahl der Eigenschaften, die diese beiden Stämme aufweisen, identisch Ist, jedoch eine Anzahl anderer Eigenschaften nicht übereinstimm-t. S. aburaviensis ergibt insbesondere ein oliv-g.^äuliches Wachstum auf Glucose-Asparagin-Agar und ein gelbes bis blassolivös Y/achstum auf Kartoffeln, während S. nebulosus DS H579 auf Glucose-Asparagin-Agar ein hellgräulichgelbes Wachstum und auf " Kartoffeln ein Wachstum ergibt, dessen Färbung von hellbräunlich bis dunkelbraun geht. Es sei bemerkt, dass niemals eine grünliche oder olive Färbung des vegetativen Mycels von S. nebulosus DS 14579 auf irgendeinem Medium im Verlaufe seiner Prüfung beobachtet wurde: Das vegetative Mycel weist in allen Fällen Färbungen auf, die von gelblich bis braungelb oder gelbbraun gehen, je nach den Medien und dem Entwicklungsgrad.. Ausserdem produziert S-aburavienais kein lösliches Pigment auf Nähr ag ar oder Gelatine ur-id bildet ovale Sporen, während S. nebulosus 'JS 14579 ein gelbbraunes lösliches Pigment auf Nähragar und ein lösliches braungelbes Pigment auf Gelatine produziert und zylindrische Sporen bildet. Ausserdem verwertet S. aburaviensis die folgenden Kohlenstoffquellen nicht, die fj. nebuloHus DS 14579 verwertet: Mannit, Arabinose, Raffinose,

^209819/1003 BADOR₁Q₁NAL

! Insosit, Xylose und Saccharose,

Die Fähigkeit von S. nebulosus LS 14579, verschiedene Kohlenstoffquellen und Stickstofftiuellen zur Gewährleistung seiner Entwicklung zu verwerten, wurde nach dem Prinzip der Methode nach Pridham und Gottlieb (J. of Bact. 5j>, 107-114, 1948) "bestimmt. Der Entwicklungsgrad wurde auf dem von diesen Autoren angegebenen Grundmedium beobachtet, wobei die Glucose durch die verschiedenen jeweilig untersuchten Kohlenstoffquellen oder das (HEL)₂SO, durch die verschiedenen jeweils untersuchten Stickstoffquellen ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben:

Geprüfte Kohlenstoff quellen	Verwertung	Geprüfte Stickstoff quellen	Verwertung
D-Ribose	positiv	NaNO₃	positiv
D-Xylose	positiv	NaAO₂	positiv
L-Arabinose	positiv	(MH₄)₂S0₄	positiv
L-Ehamnose	negativ	(NH₄)₂HP0₄	posixiv
D-Glucose	positiv	Adenin	negativ
D-Galactose	positiv	Adenosin	positiv
D-Fructose	positiv	Uracil	negativ
D-Mannose	positiv	Harns toff	positiv
L-Sorbose	negativ	L-Asparagin	positiv
Lactose	schwach und. zögernd	Glykokoll	positiv
Haltöse	positiv	Sarcosin	negativ
Saccharose	positiv	DL-Alanin	positiv
Trehalose	positiv	DL-Valin	positiv
Cellobiose	positiv	DL-Asparagin- säure	positiv
Raffinose	positiv	L-Glutaminsäure	positiv
Dextrin	positiv	L-Arginin	positiv
Inulin	positiv	L-Lysin	positiv
Stärke	positiv	DL-Serin	positiv »

209819/1003

BAD

215A031

- -19 -

Geprüfte Kohlenstoff quellen	Verwertung	Geprüfte Stickstoff quellen	Verwertung
Glykogen	positiv	DL-Threonin	positiv
Glycerin	positiv	I)L-Me th i onin	positiv, langsam
Erythrit	negativ	Taurin	negativ
Adonit	negativ	I)L-Ph e η y 1 al anin	positiv
Dulcit	negativ	L-Tyrosin	positiv
D-Mannit	positiv	DL-Prolin	positiv
D-Sorbit	negativ	L-Hydroxyprolin	positiv
Inosit	positiv	L-Histidin	positiv
Salicin	negativ	L-Tryptophan	positiv
	-	Betain	negativ J

Die Herstellung \nn 25048 HP besteht im wesentlichen darin, Streptomyces nebulosuf. DS 14579 oder seine Hutanten in einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und das im Verlaufe der Züchtung gebildete Produkt abzutrennen,

Die Züchtung von Streptomyces nebulosus I)S 14579 kann nach jeder beliebigen aeroben Oberflächenzüchtungsmethode oder Submersßüchtungsmethode erfolgen, doch ist diese letztere aus Gründen der Bequemlichkeit zu bevorzugen. Man verv.^rendet zu diesem Zweck die verschiedenen Apparaturtypen, die jetzt üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden.

Man kann insbesondere den folgenden \7eg für die Durchführung der Arbeitsgänge einschlagen:

BAD ORIGINAL

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- 20 Streptomyces nebulosus DS 14579 - Stammansatz

Kultur auf Agar

■I

Kultur im Kolben unter Bewegimg

Impfkultur im Ferrnentcr

Produktionskultur im Fermenter

Das Fermentationsmedium soll im wesentlichen eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle, Mineralstoffe und gegebenenfalls V/achstumsfiiktoren enthalten, wobei alle dj öse Bestandteile in Form '^ron gut definierten Produkten odex* τοπ komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten Yorcschiodenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können.

Als assimilierbare Kohlenstoffquelle kann man Kohlehydrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose, Dextrine Stiirke, oder andere Kohlehydratsubstanzen, wie beispielsweise Zuckeralkohole, z.B. Glycerin oder Mannit, oder', wie gewisse organische Säuren, z.B. Milchsäure, verwenden. Gewisse tierische oder pflanzliche Öle, wie beispielsweise Schmalzöl oder Sojaöl, können diese verschiedenen Kohlehydratquellen mit Vorteil ersetzen oder ihnen beigefügt v/erden.

Die geeigneten assimilierbaren Stickstoffquellen sind außerordentlich verschiedenartig. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie beispielsweise anorganische? oder organische Ammoniumsalze, wie beispielsweise Aimnoniunn.nil fat ,oder gewisse Aminosäuren, sein. Sie können auch in Form von komplexen Substanzen, die den Stickstoff hauptsächlich in pro Iidischer Form enthalten, zugeführt werden, wie bo.inpioli-swei^e in Form von Casein, Lactalbumi η, Gluten und deren Hydrolyrsa» ten, Sojamehl, Arachir.mehl, Fischmehl, Pepton, Floir.chextrnk-

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- 21 ten, Hefeextrakten, Distillers' Solubles und Maisquellwasser.

■ Unter den zugefügten mineralischen Stoffen können gewisse eine Pufferwirkung oder eine neutralisierende Y/irkung be-. sitzen, wie beispielsweise die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder Calcium-·oder Magnesiumcarbonat.

' Andere führen zu dem zur Entwicklung von Streptomyces nebulosus

14579 und zur Erzeugung von 25048 RP erforderlichen Ionengleichgewicht, wie beispielsweise Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schliesslich wirken gewisse in spezieller V/eise als Ale fciv at ο ".·■"! der Stoffwechselreaktionen von Streptomyces ; nebulosus DS 14579. Es sind dies insbesondere die Kobaltsalze.

Der pH-V/ert des Fermentationsmediums sollte zu Beginn der Züchtung zwischen 6,0 und 7»8, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7»5, liegen. Die zur Fermentation optimale Temperatur beträgt 25 " bis 30 C, doch wird auch bei Temperaturen zwischen 23 und 33⁰C eine zufriedenstellende Produktion erhalten. Die Belüftung der Züchtung kann in ziemlich weiten Grenzen variieren. Es wurde jedoch gefunden, dass Belüftungen von 0,3 bis 3 1 Luft je ■ 1 Bouillon und je Minute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an 25048 RP wird nach 3- Ms 7-tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeitspanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.

Das 25048 RP kann aus den Fermentationsmaischen in verschie-

! denen Weise - isoliert werden:

Man kann die Fermentationsmaische bei einem pH-Wert zwischen

6,5 und 7»5 und vorzugsweise bei pH 7 filtrieren und dann das so erhaltene Filtrat auf ein Volumen zwischen 1/4 und 1/8 des anfänglichen Volumens einengen.und dann in der Kälte ein schlechtes Lösungsmittel für 25048 RP, wie beispielsweise Aceton, zugeben, um die Ausfällung des Rohprodukts zu bewirken.

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Das Rohprodukt kann nach einer der folgenden Methoden gerolnigt werden:

Fraktionierte Ausfällung mittels konzentrierten wässrigen Lösungen von Mineralsalzen, v/ie beispielsweise Aranoniumsulfnt oder Natriumchlorid, und/oder schlechten Lösungsmitteln für j 25048 RP, wie beispielsweise Methanol oder Aceton ;

Dialyse durch eine Membran, vorsugsweise eine Membran aus regenerierter Cellulose, gegen V/asoer, um die Substanzen mit j niedrigem Molekulargewicht zu entfernen j

Chromatographie einer wässrigen Lösung von P5048 RP an verschiedenen A&sorbrntien: Man verwendet vorzugsweise Gv7.e "von Kieselsäure, Dextiari oder Polyacrylamid.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der •J Erfindung. Die Aktivität der Produkte ist in Kunitz-Einheiten j (K.E.)» wie oben definiert, ausgedrückt. Diese Aktivität ist : in K.E./cm ausgedrückt, wenn es sich um ein :n Lö'sung be j findliches Produkt handelt, und in K.E./g_f wenn es sich um j ein festes Produkt handelt.
W ι

Beispiel 1

■ Die Produktionskultur wird in einem 30 Liter·—Permenter durch-ι geführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt ist:

\ Distillers' Solubles 100 g

j gekörnte Bohnen 800 g

Sojaöl ' 200 cm⁵

Natriumchlorid d 100 g

Kobaltchloria · δ H₂O 0,4 g

Leitungswasser ad 20 1

Der pH-Wert wird mit 17 cm 10n-Iiatronlauge auf 8,20 eingestellt. Man sterilisiert das Medium bei 122⁰C während 40 LLL-

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nuten. Nach Abkühlen setzt man eine sterile Lösung von 100 g Glucose-Monohydrat und Leitungswasser ad 1 Liter zu.

Das Volumen der Bouillon beträgt L¹O 1 und der pH-Wert 6,70. Man beimpft dann mit 200 cm einer gerührten bzw. geschüttelten Erlenmeyer-Kultur von Streptomyces nebulosus 'J)S 141379. Die Züchtimg wird bei 25°O während G Tagen unter Rühren mitte] s eines 'lurbiiienrülirors, dor mit 440 U/min betrieben wird, und unter Belüftung mit steriler Luft in einer Menge von 1 m /Stunde durchgeführt. Der pH-Wert beträgt dann 6,9OjUn(I die Aktivität der Maische erreicht 5,3 K.E./cm . ^

Beispiel 2

18 1 uar unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen hergestellten Ku'.l turmaische werden bei pH 6,9 auj 3χη<ν··π faltenfilter filtriert, !.lan erhält so 10 1 klares FiItrat, mit einem Gehalt von 7 K.K./cm^.

Dieses Piltrat wird bei 25 0 unter vermindertem Druck (2 mm Hg) ci..J 1/3 fc-oines Volumens eingeengt. Das Konzentrat wird durch eine Cellophanmembran über Facht bei +4⁰C gegen 10 Volumina destilliertes Wasser dialysiert.

Zu dem erhaltenen, bei 4⁰C gehaltenen Dialysat (3,2 Liter) setzt man '
Aceton zu.

setzt man unter Bewegen 1,6 1 zuvor auf -10⁰C abgekühltes

Der erlmltene inaktive Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Zu der überstehenden Lösung setzt man unter den gleichen Bedingungen wie oben 4,8 1 auf -10⁰G abgekühltes Aceton zu.

Nach lOminütigem Zentrifugieren mit 12000 g wird der aktive Niederschlag gesammelt und dann in 5^fjü cm⁵ destilliertem Wasser gelöst.

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Zu dieser auf +4-⁰C abgekühlten Lösung setzt man. unter Bewegen 272 g kristallisiertes Ammoniumsulfat (zur Erzielung einer Lösung mit 80$iger Sättigung an Salz "berechnete Menge) zu.

Nach 1 1/2stündigem Stehenlassen bei +4⁰G zentrifugiert man 10 Minuten mit 12000 g. Der erhaltene Niederschlag wird in

; 200 cm Wasser suspendiert.

Diese Lösung wird über Nacht bei +4 C dialysiert, um restli-' ches Salz zu entfernen.

i . ν

Zu dem bei +4⁰C gehaltenen Dialysefc {^80 cm ) setzt man langsam unter Bewegen 600 cm zuvor auf -10 C abgekühltes Isopro- ! panol zu und hält dann noch 10 bis 15 Minuten nach "beendeter ι Zugabe des Lösungsmittels in Bewegung.

j Der aktive Niederschlag wird durch Zentrifugieren während 10 Minuten mit 12000 g gewonnen. Das Produkt wird unter vermindertem Druck (2 mm Hg) in Anwesenheit ^on £0^5 ^be·*- ^e^^neT

! Temperatur von etwa 20 C getrocknet.

Man erhält so 6,8 g Produkt mit einem Gehalt von 3800 K.E./g. W i Beispiel 3

ΐ Man stellt einen Brotteig mit dem folgenden Gemisch her:

Getreidemehl 1 kg

; Hefe 20 g

: Salz 22 g

Wasser ' 630 cm^

j Parallel stellt man eJnen B.rotteig mit einem identischen Gemisch her, ;zu dem man 10 mg des Enzyms 25048 HE mit einem Gehalt von 3800 K.E./g in Form eines Konzentrats mit 0,1 Gew.f>

; ia Getreidemehl zugibt.

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Nach intensivem Kneten und einer ersten Gärung von 75 Minuten formt man den Teig und stellt fest, dass in Anwesenheit des Enzyms die Bearbeitung des Teigs erheblich erleichtert ist: Der Teig ist viel streckbarer und viel weniger elastisch als der Vergleichstejg.

Die Aufgehzeit (2. Gärung) ist eindeutig in Anwesenheit des Enzyms vermindert (110 Minuten gegenüber 135 Minuten), und der erhaltene Teig weist eine Kohlend!oxydretention auf, die mit der des Vergleiohsteigs identisch ist (mit einem Chopin-Zymotachygraph durchgeführte Bestimmungen). %

Nach dem Backen erhält man bei dem Versuch mit Enzym ein Brot, das das gleiche Volumen wie das Vergleichsb.-ot aufweist, jedoch eine viel gle"i chrriäesigere Krumenporenbildung besitzt.

Beispiel 4

Man stellt durch Verkneten ein Konzentrat für industrielle Biskuithersteilung her, das 1000 g Stärke und 100 g Enzym 25048 RP enthält.

Dieses Konzentrat kann zu trockenen Bestandteilen oder flüssigen Bestandteilen in einer Menge von 10 g je Charge von 100 kg f Mehl zugegeben werden.

Beispiel 5

Ein Konzentrat für die Detergensindustrie enthält:

Enzym 25048 RP 99 g ausgefällte Kieselsäure

"LeviIite» 1 g

Methylenblau 0,1 g

Dieses Konzentrat ist für die Herstellung von Granulaten ver-? wendbar, die 2 ^cß> Enzym enthalten und Waschpulver nach den üblichen Techniken in einer Menge von 50 g Enzym je Tonne Y/aschpulver zugesetzt werden können.

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Claims

Patentansprüche

1. Proteolytißches Enzym, das mit der Nummer 25048 RP bezeich- ; net wird, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Proteinsub-

j stanz ist, die in V/asser sehr löslich ist, in konzentrierten Lösungen von Neutralsalzen und in wässrig-alkoholischen oder wässrig-acetonischen Gemischen wenig löslich ist und i in wasserfreien Alkoholen und Ketonen unlöslich ist, auf > Casein bei pH 8 eine Maximalaktivität bei 57 bis 65⁰C auf- ! weist und bei 75⁰C in 6 Minuter i/\ü>ctiviert wird, bei j· Casein mehr Peptidbindungen als Trypsin hydrolysiert und

' nur eine geringe esterolytische Wirksamkeit auf di.e- Äthyl-

i ester von Benzoylarginin und Acetyltyrosin aufweist.

i

2. Verfahren zur Herstellung von 25048 RP, dadurch gekennzeichi ne.t, dass man aerob in einem assimilierbare Kohlenstoff- ! und Stickstoffquellen enthaltenden Hed^um Streptomyces ; nebulosus DS 14579 (NRRL 3864) bis zur Bild"mg einer merk-¹ liehen Menge an Enzym züchtet und das im' Verlaufe der

; Züchtung gebildete Enzym abtrennt.

!

3. Proteolytische enzymatische Zusammensetzung, gekennzeichnet ¹ durch einen Gehalt an 0,005 bis 99 Gew.$ Enzym 25048 RP, ί zusammen mit verträglichen Verdünnungsmitteln.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, . dass sie 1 bis 10 Gew.$ Enzym 25048 RP zusammen mit zumindest einem Kohlehydrat .oder Mineralsalz.enthält.

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