DE1800508C3 - Verfahren zur Herstellung von proteolytischen Enzymaufbereitungen und ihre Verwendung - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von proteolytischen Enzymaufbereitungen und ihre Verwendung

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DE1800508C3
DE1800508C3 DE1800508A DE1800508A DE1800508C3 DE 1800508 C3 DE1800508 C3 DE 1800508C3 DE 1800508 A DE1800508 A DE 1800508A DE 1800508 A DE1800508 A DE 1800508A DE 1800508 C3 DE1800508 C3 DE 1800508C3
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Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung neuer Enzymaufbereitungen, die eine besonders deutliche und wertvolle proteolytische Aktivität bei hohen Alkalitätsgraden zeigen.
In vielen Fällen besteht das Bedürfnis nach einem proteolytischen Enzym, das noch bei pH-Werten oberhalb 9 eine optimale proteolytische Aktivität entwickelt Solche Enzyme sollen auch noch andere günstige Eigenschaften besitzen, so beispielsweise eine gute Stabilität bei höheren Temperaturen und/oder eine gute Stabilität in Gegenwart von nichtenzymatischen Substanzen, die in den enzymhaltigen Aufbereitungen ebenfalls enthalten sind
Es ist bekannt, daß proteolytische Enzyme durch Kultivierung von gewissen Bakterien unter aeroben Bedingungen erhalten werden, daß jedoch die Proteasen, die nach den bekannten Kultivierungsverfahren erhalten werden, eine optimale proteolytische Aktivität gegenüber Hämoglobin bei einem pH-Wert neigen, der in den günstigsten Fällen bis an 9 heranreicht.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Feststellung zugrunde, daß in der Natur eine große Zahl von bisher unbekannten Bakterien existieren, welche im Zuge ihres Stoffwechsels unter gewissen Bedingungen proteolytische Enzyme zu bilden vermögen, die eine optimale proteolytische Aktivität gegenüber Hämoglobin bei pH-Werten oberhalb 9, vielfach sogar im pH-Bereich zwischen 10 und 12 entwickeln und die auch noch andere wertvolle Eigenschaften für eine gewerbliche Verwendung aufweisen.
Aus Bodenproben und Proben von tierischem Dung und einer Reihe von anderen natürlichen Quellen wurden über hundert Bakterienstämme isoliert und taxonomischen Untersuchungen unterworfen. Dabei wurde gefunden, daß sämtliche der bisher unbekannten Bakterien der Gattung Bacillus zuzurechnen sind, daß jedoch keiner dieser Mikroorganismen zu irgendeiner bekannten Spezies gehörte und sie auch nicht zu derselben Spezies gerechnet werden körnten. Es ergab sich ferner, daß innerhalb derselben Spezies in den meisten Fällen verschiedene Stämme und verschiedene Abarten (Subspezies) vorlagen.
Um die vorerwähnten unbekannten Bakterien isolieren zu können, kam eine neue Arbeitsweise zur Anwendung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Isolierung aus einer natürlichen Quelle auf einem Nährmedium durchgeführt wurde, das einen pH-Wert innerhalb des Bereichs von 8—12, vorzugsweise 9—11 aufweist und für den Nachweis der Erzeugung von proteolytischen Enzymen bestimmt ist. Die Bodenproben und die Proben von tierischem Dung oder aus anderen natürlichen Quellen wurden also auf dem Nährmedium mit einem in dem vorerwähnten Bereich liegenden hohen pH-Wert verteilt, wonach die Bakterien, die unter alkalischen Bedingungen Wachstum zeigten, isoliert und auf die Spezies und Rnzymerzeugung hin untersucht wurden.
In den meisten Fäll;n wurde dabei von einer Reihe verschiedener Anreichungsniethoden Gebrauch gemacht. Derartige Mithoden sind bekannt (vgl. /. B.
18 OO
H a y a i s h i, Methods in Enzymology, VoL 1, 126—131). Nach einer Regel wird hierbei so vorgegangen, daß eine Probe, die in der Natur gewachsen ist auf einem Nährmedium belassen wird, das eine spezifische und ausgewählte Zusammensetzung besitzt, welche das Wachstum eines Mikroorganismus begünstigt und Stoffwechselprodukte ergibt, welche die gewünschten Eigenschaften besitzen. Nach einer anderen Regel wird die aus einer natürlichen Quelle stammende Proue zusammen mit einer Verbindung gelagert beispielsweise einem anorganischen Salz, weiche die Entwicklung des gewünschten Mikroorganismus fördert (vgl. M. A. EI-Nakeeb and H.A. I.eche valier, Appl. Microbio!, Vol. 11, 75 [1963]), wonach die Probe auf einem zweckentsprechenden Nährmedium verteilt wird. das auf einen pH-Wert im Bereich von 8—12 eingestellt ist.
Einige der bisher unbekannten Angehörigen der Gattung Bacillus, die isoliert und hinsichtlich ihrer Taxonomie sowie der Erzeugung von proteolytischen Enzymen untersucht wurden, sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt Dort ist in der ersten Spalte die interne Referenznummer, in der zweiten Spalte die Nummer, unter welcher der Mikroorganismus bei der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Schottland hinterlegt worden ist in der dritten Spalte die bei der Isolierung benutzte Quelle und in der vierten Spalte die zur Anwendung gebrachte Anreicherungsmethode angegeben.
Tabelle 1
Nummer Quelle für die Isolierung
NCIB
Anreicherungsmethode
C 300 10 144 Erde von einem Kopenhagener Friedhof
Erde von einem Kopenhagener Friedhof Erd ■ von einem Kopenhagener Flußufer Erdaufwurf und Laub von einem kopenhagencr Friedhof
Waldsand von Blokhus, Jutland
Walderde von Ascheberg, Holstein Felderde von einer dänischen Stadt Seeufererde aus Ascheberg, Holstein Infektion auf einer Platte mit Perborat-Löchern Infektion auf einer Platte mit Perborat-Löchern
Flußufererde aus einer dänischen Stadt
Gartenerde aus einer dänischen Stadt
Pferde- und Elefantendung
Lehm von einem Grasfeld aus Ascheberg, Holstein
Erde von einem Kopenhagener Friedhof
Flußufererde von einer dänischen Stadt
Flußufererde von einer dänischen Stadt
Felderde von einer dänischen Stadt
Gartenerde von einem dänischen Dorf
Gartenerde von einer dänischen Stadt
Erde von einem Hühnerhof einer dänischen Stadt
C 347 10 297 Hirschdung von einem Wildpark in der Nähe von
Kopenhagen
C 348 10 298 Erde von einem Hühnerausleuf
C 349 10 299 Hirschdung von einem Wildpark in der Nähe von
Kopenhagen
C 350 10 300 Wasser von einem Kopcnhagener See
C 351 10 301 Hühnerdung
C 352 10 302 Straußdung aus dem Zoo
C 353 10 JO3 Elefantendung
C 354 10 304 Erde vom Hühnerhof
C 301 10145
C 302 10 146
C 303 10 147
C 304 10 148
C 311 10 281
C 323 10 282
C 324 10 283
C 325 10 284
C 326 10 285
C 334 10 286
C 335 10 287
C 336 10 288
C 337 10 289
C 338 10 290
C 339 10 291
C 340 10 292
C 341 10 293
C 342 10 294
C 343 10 295
C 346 10 296
Stärke-Kase'n-Medium (pH stufenweise erhöht von 10 bis 12)
Ausbreiten von Erdproben auf Agar mit Sesquikarbonat (pH =9,6-9,8) Testen von Hydrolyse-Zonen auf neutralem Agar mit Magermilch
Perborat-Agar
Perborat-Agar
Perborat-Agar
Alkalische Magermilch
Agarplatten mit mit Perborat
ausgefüllten Löchern
Perborat-Agar
Perborat-Agar
Perborat-Agar
Perborat-Lagerung
Perborat-Lagerung
Perborat-Agar
Perborat-Agar
Perborat-Agar
Sodalagerung
Perborat-Agar
Mehrfachanreicherung mit alkalischer
Stärke
Mehrfachanreicherung mit alkalischer
Stärke
Mehrfachanreicherung mit alkalischer
Stärke
Mehrfachanreicherung mit alkalischer
Stärke
Alkalisches Stärke-Kasein-Medium mit
Tripolyphosphat
Thermofile Sesquikarbonat-
Anreicherung (500C, pH 8,8 bis 9,7)
N atrium sesquikarbonat-Anreicherung
(pH 9.2-9,6)
Natriurnsesqu ι karhon at- Anreicherung
(pH 9.2-9.6)
Anreicherung auf der Basis von
Nummer 18 00 508
5 		6
Ref. NCIB Quelle für die Isolierung Anreicherungsmethode
Nr. 10 305
C 355 Erde vom Hühnerhof Anreicherung auf der Basis von
10 306 Glukosenitrat bei 40°C
C 356 Gartenborke Anreicherung auf der Basis von
10 307 Glukosenitrat bei 500C
C 357 Erde vom Hühnerhof Anreicherung auf der Basis von
10 308 Glukosenitrat bei 500C
C 358 Erde vom Hühnerhof Anreicherung auf der Basis von
10 309 Glukosenitrat bei 50°C
C 360 10310 Gartenerde vun einer dänischen Sihüi Perborat-Agar
C 364 Abschabung von einer Sickergrube Thermofile Sesquikarbonat-
10311 Anreicherung (50°C, pH 8,8-9,7)
C 365 10312 Flüssigkeit von einer kalkhaltigen Gerblohe Kleie-Soda-Anreicherung
C 366 Babykot Stärkeanreicherung (pH 11) mn
10313 anorganischem Stickstoff
C 367 Elefantendung Thermofile Sesquikarbonat-
10314 Anreicherung (50°C, pH 8,8-9,7)
C 369 10315 Straußdung aus dem Zoo Proteose Pepton (Schüttelflasche) pH 9,7
C 370 Abschabung von Behältern mit einer Alkalische Mannit-KNO3-Anreicherung
10316 kalkhaltigen Lohe
C 371 10317 Elefantendung Proteose Pepton (Schüttelflasche) pH 9,7
C 372 10318 Lehm von einem Grasfeld aus Ascheberg. Holstein deterg. Stärke-Kasein-Anreicherung
C 373 10319 Gartenerde aus einer dänischen Stadt Perborat-Agar
C 374 10 320 Lehm von einem Grasfeld aus Ascheberg, Holstein Äthylen-diamin-Natrium-tetraacetal
C 375 Straußdung aus dem Zoo Natriumsesquikarbonat-
10321 Anreicherung (pH 9,2—9,6)
C 376 Elefantendung Natriumsesquikarbonat-
10 322 Anreicherung (pH 9,2—9,6)
C 377 Wasser aus einem Nilpferdbassin Thermofile Kasein-Stärke-Anreicherung
10 323 mit NaOH
C 378 Abschabung von Behältern mit einer Mannit-K NO3-Anreicherung
10 324 kalkartigen Lohe
C410 10 325 Tigerdung \ Thermofile Sesquikarbonat-
C411 10 326 Taubendung I Anreicherung 500C (pH 8,8-9,7)
C412 Erde von einem Hühnerhof einer dänischen Stadt Kartoffelmehl und Natrium-Sesaui-
C 413 10 327 Lehm von einem Grasfeld aus Ascheberg, Holstein
karbonat- Aufhäufung Stärkeanreicherung (pH 11) mit anorganischem Stickstoff
Bei dem für die Anreicherung verwendeten Glukosenitrat handelt es sich um ein Agarsubstrat, das Glukose und Natriumnitrat als wesentliche Bestandteile enthält (Glukose 1%, NaNO, 0,1%, K7HPO4 0,1%, Agar 2%, Rest = Wasser).
Die taxonomischen Untersuchungen all dieser Angehörigen der Gattung Bacillus sind unter Anwendung der bei Smith, Gordon & Clark in »Aerobic Spore-forming Bacteria«, U.S. Department of Agr, Monograph No. 16 (1952) beschriebenen Verfahren durchgeführt worden. Diese Verfahren, die bis heute als die besten angesehen werden können, mußten jedoch im Hinblick darauf, daß sämtliche Nährmedien auf einen sehr viel höheren pH-Wert einzustellen waren als bei Smith, Gordon & Clark angegeben ist, modifiziert werden, nachdem sämtliche in der Tabelle I aufgeführten Bacillus-Stämme bei höheren pH-Werten wachsen.
Die untersuchten Mikroorganismen können in morpholigische Gruppen eingeordnet werden, die sich voneinander in einem solchen Ausmaß unterscheiden.
daß sie tatsächlich jeweils als eine gesonderte Spezie: angesehen werden können.
Innerhalb der morphologischen Gruppen wurden be biochemischen Reaktionen Varianten festgestellt. Au' der Grundlage dieser Varianten wurden die Gruppen ir Arten (Abarten) unterteilt, die durch einen odei mehrere Stämme verkörpert werden.
Spezies No. I
to (gehört gemäß B e r g e y zu der
morphologischen Gruppe I)
Morphologie
Vegetativer Stamm: f,5 03-0.7 μ · 13-4 μ
Sporen:
0,5—0,8 μ · 03—1 μ zentral bis subterminal, oval bis zylindrisch, dünnwandig.
18 OO
Sporangien:
Sehr wenig, wenn überhaupt, dann aufgequollene Sporen.
Abart a s
C 300, C 301, C 360, C 372, C 374. Grampositiv.
Das Wachstum auf Nähragar ist bei pH 7,3 so gut oder noch besser als auf Nähragar mit einem pH 9,7. Maximale Temperatur für das Wachstum: 50—55°C. Auf Glukose- oder Mannit-Agar pH 9,7 mit einem Nitrat als einzige Stickstoffquelle ist das Wachstum kärglich.
Hydrolyse der Stärke: Positiv, eng begrenzte Hydrolysezonen nach 7 Tagen. ι s
Abart b
C 302, C 334.
Grampositiv.
Das Wachstum auf Nähragar pH 7,3 ist während der ersten beiden Tage verhältnismäßig langsam, hiernach jedoch annähernd vergleichbar mit dem Wachstum auf Nähragar pH 9,7.
Maximale Temperatur für das Wachstum: 40—500C. Auf Glukose- oder Mannitagar mit pH 9,7 und mit 2s einem Nitrat als einzige Stickstoffquelle ist das Wachstum kärglich.
Hydrolyse der Stärke: Positiv, weite Hydrolysezonen.
Abart c
C 323, C 339, C 352, C269.
Grampositiv oJer gramveränderlich. Auf Nähragar pH 7,3 ein mäßiges bis kärgliches Wachstum.
Maximale Temperatur für das Wachstum: 37—50°C. Auf Glukose- oder Mannitagar mit einem Nitrat als einziger Stickstoffquelle kärgliches Wachstum. Hydrolyse der Stärke: Positiv, weite Hydrolysezonen.
Abart d
C 304, C 311, C 336.
Grampositive Stämme.
Mäßiges bis kärgliches Wachstum auf einem Nähragar bei pH 7,3.
Maximale Temperatur für das Wachstum: 37°C. 4s
Auf Glukose- oder Mannit-Agar bei pH 9,7 mit Nitrat als einziger Stickstoffqelle kärgliches Wachstum. Hydrolyse der Stärke: negativ.
Spezies No. II so
(gehört gemäß Bergey zu der morphologischen Gruppe I)
C335.C341.
Morphologie
Vegetative Stämme:
03-0,4 μ- 1,5-^5 μ. Sporen:
03—0,5 μ · 0,8—1 μ, zentral bis parazentral, oval bis zylindrisch dünnwandig.
Sporangien: Sehr wenig, oder Oberhaupt keine, aufgequollene
Sporen.
Grampositiv
Auf einem Nähragar bei pH 73 fast kein Wachstum. r>s
Maximale Temperatur für das Wachstum: 37°C. Auf Glukose- oder Mannit-Agar mit einem Nitrat als
einziger Stickstoffquelle kein oder nur ein kärgliches Wachstum.
Hydrolyse der Stärke: Negativ.
Spezies No. Ill
Morphologie
Vegetative Stämme:
0,6—0,7 μ · 1,5—3,5 μ abgerundete Enden.
Sporen:
0,7—0,9 μ · 1,0-1,2 μ elliptisch,
parazentral bis subterminal, dickwandig.
Sporangien:
Einige zeigen eine ausgeprägte Quellung, andere nicht. Die Stämme in sporenbildenden Kulturen quellen und wachsen sehr dick, behalten jedoch ihre ursprüngliche Form. Sporenbiidende kurze Stämme können in diesem Zustand Kugelform besitzen. Es gibt deshalb kein örtliches Aufquellen dort, wo sich die Sporen befinden, obgleich einige Sporangien spindelförmig ausgebildet sind.
Abart a
C 326, C 342.
Grampositiv.
Auf Nähragar bei pH 7,3 kein oder nur ein kärgliches Wachstum.
Maximale Temperatur für das Wachstum 500C.
Auf Glukose- oder Mannit-Agar bei pH 9,7 mit einem Nitrat als einziger Stickstoffquelle kein oder nur ein kärgliches Wachstum.
Hydrolyse der Stärke: positiv, weite Hydrolysezonen.
Abart b
C 347, C 350.
Grampositiv.
Auf Nähragar pH 7,3 mäßiges Wachstum.
Maximale Temperatur für das Wachstum: 500C.
Auf Glukose- oder Mannit-Agar bei pH 9,7 mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle kärgliches Wachstum.
Hydrolyse der Stärke: positiv, weite Hydrolysezonen.
Abart c
C 337, C 340.
Gramnegativ oder gramveränderlich.
Mäßiges Wachstum auf Nähragar bei pH 7,3.
Maximale Temperatur für das Wachstum: 37 bzw. 50° C. Aui Glukose- oder Mannit-Agar bei pH 9,7 mit einem Nitrat als einziger Stickstoffqueüe kärgliches Wachstum.
Hydrolyse der Stärke: positiv, weite Hydrolysezonen.
Abart d
C 338, C 343, C 346, C 348, C 349.
Gramveränderlich oder gramnegativ.
Auf Nähragar bei pH 73 kein oder nur ein kärgliches Wachstum.
Maximale Temperatur für das Wachstum: 45—50° C. Auf Glukose- oder Mannit-Agar bei pH 9,7 mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle kein oder ein nur sehr kärgliches Wachstum. Hydrolyse der Stärke: positiv, weite Hydrolysezonen.
Abarte
C324.C355. Grampositiv.
Auf Nähragar bei pH 7,3 kein oder nur ein sehr kärgliches Wachstum. Maximale Temperatur für das Wachstum: 45—500C
18 OO 508
ίο
Mäßiges Wachstum auf Glukose- oder Mannit-Agar bei pH 9,7 mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle. Hydrolyse der Stärke: positiv, weite Hydrolysezonen.
Abart f
C 353.
Gramnegativ.
Auf Nähragar bei pH 7,3 mäßiges Wachstum. Maximale Temperatur für das Wachstum: 50°C. Auf Glukose- oder Mannit-Agar mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle mäßiges Wachstum Hydrolyse der Stärke: positiv, weite Hydrolysezonen.
Spezies No. IV
(gehört gemäß B e r g e y zu der morphologischen Gruppe II)
Morphologie
Vegetative Stämme.
0,4-0,5 μ · 2-3 μ, oft in langen Ketter.. Sporen:
0,6—0,8 μ · 0,7— 0,9 μ, oval, subterminal,
dickwandig, leicht gefleckt.
Sporangien:
Ausgeprägte Quellung, keulenförmig.
\bart a
C 303, C 354, C 357, C 366, C 367, C 371, C 375, C 378. Gramnegativ.
Auf Nähragar bei pH 7,3 mäßiges oder gutes Wachstum. Maximale Temperatur für das Wachstum: 57°C. Auf Glukose- oder Mannit-Agar bei pH 9,7 mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle mäßiges oder gutes Wachstum.
Hydrolyse der Stärke: positiv, Hydrolysezonen in bescheidenem Umfang.
Abart b
C351,C356,C364,C376,C377,C411. Gramveränderlich.
Sonst wie Abart a.
Abart c
C 358, C 410.
Grampositiv.
Sonst wie Abart a.
Spezies No. V
(gehört gemäß B e r g e y zur morphologischen Gruppe II)
C 365, C 412.
Morphologie
Vegetative Stämme:
0,3—0,4 μ - 2—4 μ, einige leicht gebogen.
Sporen:
0,6—0,7 μ - 0,9—1,2 μ, oval bis elliptisch, parazentral bis terminal, dickwandig, leicht gefleckt, Überbleibsel der Sporangien oft festhaftend.
Sporangien:
Ausgeprägte Quellung, keulenförmig bis racketförmig.
Grampositiv.
Auf Nähragar bei pH 73 mäßiges bis gutes Wachstum.
Maximale Temperatur für das Wachstum:57°G Auf Glukose- oder Mannit-Agar bei pH 9,7 mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle gutes Wachstum.
Hydrolyse der Stärke: positiv, mäßige bis weite Hydrolysezonen.
Spezies No. VI
(gehörtgemäß Bergey zur
morphologischen Gruppe II)
Morphologie
Vegetative Stämme:
0,25-0,35 μ · 2,5-5 μ.
Leicht bogenförmig, Enden spitz.
Sporen.
0,8-1 μ · 1,1-1,3 μ.
Oval bis elliptisch, subterminal bis terminal.
is Sporangien:
Ausgeprägte Queliung, keulenförmig bis schlägclförmig.
Abaita
C 373.
Gramnegativ.
Auf Nähragar bei 7,3 pH kein oder nur kärgliches Wachstum.
Maximale Temperatur für das Wachstum: 500C.
2s Auf Glukose- oder Mannit-Agar bei pH 9,7 mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle kein oder nur ein sehr kärgliches Wachstum.
Hydrolyse der Stärke: Positiv, weite Hydrolysezonen.
Abart b
C325.C413.
Grampositiv.
Mäßiges Wachstum auf Nähragar bei pH 7,3.
Maximale Temperatur für das Wachstum: 500C.
Auf Glukose- oder Mannit-Agar bei pH 9,7 mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle kein oder nur ein sehr kärgliches Wachstum.
Hydrolyse der Stärke: Positiv, weite Hydrolysezonen.
Spezies No. VII
C 370.
Bildet keine oder nur wenig Sporen und kann deshalb nicht in eine morphologische Gruppe eingeordnet werden.
Steht den alkalischen Bakterien sehr nahe, welche zur morphologischen Gruppe II der Gattung Bacillus (gemäß B e r g e y) gehören.
Vegetative Stämme:
0,3—0,5 μ · 2—5 μ, oft in langen Ketten, fadenförmig, enden leicht spitz und abgerundet.
Gramnegativ.
Auf Nähragar bei pH 7,3 mäßiges bis gutes Wachstum.
Maximale Temperatur für das Wachstum: 57°C.
Auf Glukose- oder Mannit-Agar bei pH 9,7 mit Nitrat als einziger Stickstoffquelle gutes Wachstum.
Hydrolyse der Stärke: Positive, mäßige Hydrolysezonen.
Die nachfolgenden Charakteristika sind einer Anzahl von Stämmen gemein, welche zu verschiedenen Abarten in der Sp'ezies I—IV gehören:
Hydrolyse von Gelatine: Positiv
Hydrolyse von Kasein: Positiv.
Glukose-Nähragar-Scheiben(slants). Wachstum wie auf Nähragar oder schwerer.
Sojabohnen-Agar-Scheiben. Wachstum reichlicher und leichter als auf Nähragar.
Tyrosin-Agar-Scheibe-i. — Wachstum wie auf Nähragar. Nährbrühe — mittlere Trübe mit reichlicher
18 OO
Sedimentation, keine Häutchen oder dünne und leicht zerreibbare Häutchen. Spezies
NaCI-Konzentration; Wachstum bei 7 Prozent. Erzeugung von Acetyläthylakohol. — Negativ. Reduktion von Nitrat zu Nitrit. — Positiv. ^1
Anaerobes Wachstum in Glukosebrühe. — Wenn überhaupt, dann sehr wenig; pH 7,8 oder höher bei 14 Tagen (vor Beimpfung wurde der pH des Mediums auf 9 eingestellt). IV
Auf der Grundlage der vorstehend beschriebenen taxonomischen Untersuchungen sollen die in der Tabelle I aufgeführten Glieder der Gattung Bacillus so klassifiziert werden, wie sich aus der nachfolgenden Tabelle II ergibt. is
Tabelle II
A ban
Spezies
Abart
Stämme ■
I a III C
C		 Gram
färbung		 300, C
372, C		 301,
374		 C 360,
b Abart C 302, C 334
C C
C		 323, C
369		 339, C 352,
d C 304, C 311, C 336
II C 335, C 341
Hl a C 326, C 342
b C 347, C 350
C C 337, C 340
Tabelle
Spezies Wachstum
Nähragar
pH 7.3		 auf Max.
Tempo für
Wachstum
V VI
12 338, C 343, C 346
Stämme 348, C 349
C 324, C 355
C 353
C 303, C 354, C 357
C 366, C 367, C 371
C 375, C 378
C 351, C 356, C 364
C 376, C 377, C 411
C 358, C 410
C 365, C Λ 1 "Ί
T I ί.
C 373
C 325, C 413
C
C
C 370
Sämtliche der vorerwähnten Stämme wurden auch auf Nähragar und Sojabohnenagar und einige von ihnen auch auf Glukose-Nitrat-Agar und Mannit-Nitrat-Agar gezüchtet, um die Form, das Aussehen und die Farbe der Kolonien zu beobachten.
In der nachfolgenden Tabelle III sind die Eigenschaf-,o ten angegeben, deren Veränderung die Grundlage für die Einordnung der Abarten in die verschiedenen morphologischen Gruppen bildet.
Wachstum
auf Nitrat
(NCh) als
einziger
N-Quelle
Hydrolyse Weite der
von Hydrolyse-
Stärke zone auf
Stärkeagar
pH für maximale Wachstumsgeschwindigkeit
II
ill
—, var.
—, var.
var.
wenig wenig
wenig wenig
wenig
50-55 40-50 37-40 37
37
50
50
37,50
45-50
45-50
50
57 57 57
57
50 50
57
wenig wenig wenig wenig
wenig
wenig wenig wenig wenig
■+■ + +
wenig wenig 8,0-9,5
8,0-8,5
8,3-8.6
8,0-8.6
8.0-9.0
8,3-9,0
8,5-9.0
8.0-9.0
8.0-9.0
8,5-9,2
8,0-8,5
Sämtliche in den Tabellen I und II angegebenen Spezies und Stämme sind für eine proteolytische Enzymerzeugung kultiviert worden. Diese Kultivierung fts ist sowohl in Schüttelflaschen als auch in Tanks einer Versuchsanlage mit künstlicher Belüftung ausgeführt worden. Die erhaltenen Ausbeuten wurden unter Anwendung der hinlänglich bekannten Anson-Hämoglobinmethode (Journal of General Physiology, 22, 79—89 [1939] ) bestimmt. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Beschreibung bedeutet eine Anson-Einheit die Menge an proteolytischem Enzym, welche Hämoglobin bei einem pH-Wert von 10,1 und einer
18 OO 508
Temperatur von 25° C während einer Reaktionsdauer von 10 Minuten mit einer solchen Anfangsgeschwindigkeit aufschließt, daß pro Minute eine solche Menge an Spaltprodukten gebildet ;«ird, die mit Trichloressigsäure nicht ausgefällt werden kann und wobei diese Spaltprodukte mit Phenolreagenz dieselbe Farbwirkung zeigen wie ein Milliäquivalent an Tyrosin.
Es ist hinlänglich bekannt, proteolytisch Enzyme dadurch zu erzeugen, daß Bakterien unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert werden, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält. In den bekannten Fällen zeigten die Proteasen jedoch keine optimale protelytische Aktivität in stark alkalischen Medien (oberhalb pH 9).
Mit der vorliegenden Erfindung wird nun ein Verfahren zur Verfügung gestellt, das es ermöglicht, Enzymaufbereitungen mit einem Aktivitätsoptimum und einer ausgeprägten proteolytischen Wirkung bei pH-Werten oberhalb 9 zu erhalten. Solche Enzymaufbereitungen sind vor allem zur Verwendung bei der Herstellung von Mitteln zur Hydrolyse von Proteinen und hier insbesondere für Wasch- und Geschirrspülmittel bestimmt.
Die Erfindung beruht auf der nachfolgend noch im einzelnen beschriebenen Feststellung, daß Enzyme von solchen Bacillus-Stämmen, die innerhalb eines pH-Bereichs von 7 bis 12 Wachstum zeigen und ein Enzym des Serin-Typs erzeugen überraschenderweise oberhalb pH 9 eine optimale proteolytische Aktivität gegenüber Hämoglobin aufweisen. Hiernach besteht das Hauptmerkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens darin, daß man Bacillus-Stämme mit den vorgenannten Stoffwechseleigenschaften aerob in einem Nährmedium mit assimilierbaren C- und N-Quellen bei einem pH-Wert innerhalb des Bereiches von 7,5 bis 10,5 züchtet und daß man anschließend die Enzymaufbereitung abtrennt.
Dabei hat sich gezeigt, daß sich die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Enzyme aufgrund der bei pH 12 nach der Anson-Methode bestimmten proteolytischen Aktivität in drei Gruppen einteilen lassen. Bei dieser Messung zeigt die erste Gruppe eine proteolytische Aktivität zwischen 80 und 100%, die zweite Gruppe zwischen 50 und 80% und die dritte Gruppe zwischen 0 und 50% der maximalen proteolytischen Aktivität.
Die Zusammensetzung des bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Nährmediums richtet sich nach bekannten Grundsätzen. Geeignete Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff sind Kohlenhydrate wie Saccharose, Glukose, Stärke, aus Getreidekörnerr hergestelltes Mehl, Malz, Reis, Zuckerhirse usw. Die Kohlehydratkonzentration kann innerhalb weiter Grenzen variieren, z. B. nach oben bis 25% und nach unten bis 1—5%; im allgemeinen sind 8—10% zweckmäßig. Die Prozentangaben beziehen sich auf Dextrose. Es wurde festgestellt, daß die Anwesentheit von Kohlehydraten in dem Nährmedium zur Bildung von sauren Verbindungen Anlaß gibt, was iu einer Abnahme des pH-Wertes während der Kultivierung führt. Da der für die Kultivierung optimale pH-Bereich zwischen 7,5 und 10,5 liegt, sollte Vorsorge dagegen getroffen werden, daß der pH-Wert über eine längere Zeitdauer unter 7 abfällt. Um den pH-Wert innerhalb des gewünschten Bereichs zu halten, kann eine begrenzte Menge an Kohlehydraten zusammen mit einem Puffer verwendet werden, vermittels dessen der gewünschte pH-Wert aufrechterhalten werden kann. Es wurde gefunden, daß Karbonate und hier insbesondere Sesquikarbonatc in einer
Konzentration bis zu 0,2 M in dem Medium einen pH-Wert von etwa 10,5 bzw. 93 einstellen können.
Es können natürlich auch andere Puffersysteme, wie z. B. Phosphatpuffer, eingesetzt werden.
Es ist auch möglich, die Kultivierung mit einem niedrigen Kohlehydratgehalt einzuleiten und während der Kultivierung sukzessive kleine Mengen von Kohlehydraten zuzugeben.
Eine dritte Möglichkeit besteht darin, eine automatische pH-Kontrolle anzuwenden, indem verschiedene basisch reagierende Substanzen zugegeben werden, was an sich bekannt ist.
Die Anwendung von Karbonaten und Sesquikarbonaten als den pH-Wert kontrollierende Substanzen ist sehr zweckmäßig, und es ist überraschend, daß es während der Kultivierung möglich ist, diese Verbindungen in den vorerwähnten Konzentrationen einzusetzen.
Die Stickstoffquelle des Nährmediums kann anorganischen und/oder organischen Charakter haben. Als geeignete anorganische Stickstoffquellen werden vielfach Hydrate und Ammoniumsalze eingesetzt, von den organischen Stickstofi'quellen gibt es eine ganze Anzahl für die Verwendung bei Fermentationsprozessen und bei der KuitivieruP7 von Bakterien. Als Beispiele seien genannt: Sojamehl, Baumwollsamenmehl, Erdnußmehl, gequollener Mais, Hefeextrakte, Harnstoff, Albumin usw.
Außerdem soll natürlich das Nährmedium auch die üblichen Spurenverbindungen enthalten.
Die Temperatur für die Kultivierung liegt normalerweise innerhalb desselben Bereichs wie bei der Kultivierung von bekannten Spezies der Gattung Bacillus. Temperaturen zwischen 25 und 55°C sind zweckentsprechend, wobei die Temperatur vorzugsweise zwischen 30 und 400C liegt.
Da die Kultivierung unter aeroben Bedingungen ausgeführt werden muß, ist es bei der Anwendung von Fermentationstanks notwendig, eine künstliche Belüftung anzuwenden. Die benötigte Luftmenge entspricht derjenigen bei Anwendung der bekannten Kultivierungsprozesse.
Im allgemeinen werden maximale Ausbeuten der proteolytischen Enzyme nach einer Kultivierungszeit von 1 bis 5 Tagen erhalten.
Obgleich die meisten der in Zusammenhang mit der Erzeugung von proteolytischen Enzymen mit den in der Tabelle 11 wiedergegebenen Spezies und Stämme in Schüttelflaschen oder in Tanks von Versuchsanlagen durchgeführt wurden, kam auch eine Oberflächenzüchtigung zur Anwendung. In diesem Falle bestand das Nährmedium aus 10 g Weizenkleie, 2 g Na3PO4- 12H2O und etwa 10 ml Wasser. Vor der Beimpfung wurde der pH mit 2 ml 1 N-NaOH auf etwa 10 eingestellt. Auf diesem Medium wurden die Stämme C 300 und C 303 durch Oberflächenzüchtung kultiviert. Bei beiden Stämmen betrug die Ausbeute an proteolytischen Enzymen etwa 20 Ansoneinheiten pro kg Weizenkleie bei pH 10.
Für die Kultivierung der in Tabelle Il wiedergegebenen Spezies und Stämme wurden die zwei nachfolgenden Medien eingesetzt:
1) Medium BPFA mit folgender Zusammensetzung:
Kartoffelmehl 50 g pro Liter
Leitungswasser
Saccharose 50 g pro Liter
Leitungswasser
15 50g 18 00 pro Liter pro Liter Il V Markt bringt. 300 Anson- 508 16 oder Soda unter sterilen Zugabe von I in Schüttelflaschen wurden in 500-ml- f der Flaschen I. auf 9,3—10,5 eingestellt mit Natrium entnommen. mit 240 Umdrehungen pro Minute BSX Einheiten 6,5 Einheiten dieser Zeit
Leitungswasser Leitungswasser 15 301 Bedingungen. I ausgeführt, wobei jede 100 ml des Nährmediums BPFA bzw. BSX enthielt, die wurde. Für Die Flaschen wurden während der Kultivierung auf I Mediums Anson- pro kg 6,5 pro kg
Gerstenmehl pro Liter pro Liter IV a VIl Stämme BPFA 360 Die in den Medien enthaltene Stärke wurde vor der | zuvor in Autoklaven während 90 Minuten bei 1200C wurden vier Flaschen verwendet Um einen Drehtisch In der nachfolgenden Tabelle IV sind die maximalen 19 6,3 19
20 g Leitungswasser Leitungswasser 372 Die beiden vorerwähnten Medien wurden auf den Sterilisation mit alpha-Amylase verflüssigt sterilisiert wurden, wonach der pH-Wert den in Anson- Einheiten ausgedrückten Enzymgehalt zu ' abgestellt Enzymgehalte 1 10 6,4 24
Sojamehl pro Liter 5 pro Liter "74 gewünschten μΗ-Wert eingestellt durch Die Versuche sesquikarbonat bestimmen, wurden nach der Kultivierung während 3,4, : and die pH-Werte zu 20 6,3 30 pH des
Leitungswasser Leitungswasser 302 Sesquikarbonat Schüttelflaschen jedes Bakterium 5 und 6 Tagen I zusammengestellt 20 9,2 15 Mediums
N atriumkaseinat !Og pro Liter *) Pluronic ist eine warenzeichenrechtliche Bezeichnung, unter 20 C 334 3roben der Kulturmedien 11 8,6 18
Leitungswasser der die Firma Wyandotte Chemicals, Michigan, Polyäthylen- C 323 36 7,6 16
Na2HPO4 · 12 H2O pro Liter Polypropylen-Blockcopolymere auf den C 339 pH des 38 9,3 10 9,5
9g Leitungswasser ,0 Tabelle IV C 352 22 9,1 9 9,5
Pluronic*) Spezies Abart b C 369 38 9,3 19 9,5
der folgenden Zusammenset- C 304 32 8,1 33 9,3
0,1g C 311 115 9,4 16 9,3
2) Medium BSX mit C 336 48 8,0 7 9,3
zung: 100g I a C 335 67 9,5 11 9,5
Gerstenmehl C 341 2 9,2 1 10,0
C C 303 38 7,2 3 9,2
Sojamehl 30 g C 354 42 9,0 3 3,5
C 357 3 8,2 30 9,3
Pluronic*) b C 366 17 8,7 11 6,5
0,1g C 367 4 8,8 25 9,7
C C 371 5 8,5 30 9,1
C 375 4 7,6 35 10,0
C 378 2 8,5 40 9,9
C 351 1 8,3 30 9,7
d C 356 2 7,7 25 9,1
C 364 2 8,3 30 9,4
C 376 3 9,3 20 9,5
C 377 3 7,8 40 9,4
C 411 10 20 9,4
C 358 1 7.1 9 9,6
C 410 0 15 9,3
C 365 2 8,2 25 9,7
C 412 J - 17 9,7
C 370 60 9.0 55 9,3
C 4 80 9,7
C 115 45 9,7
C
C 9,6
C
C 9,5
-
9.3
Fortsetzung
18
Spezies
Abart
Stämme
BPFA Anson-Einheiten pro kg pH des Mediums
BSX Anson-Einheiten pro kg
pH des Mediums
a C 326 47
C 342 67
b C 347 44
C 350 44
C C 337 78
C 340 22
d C 338 72
C 343 14
C 346 26
C 348 17
C 349 21
e C 324 97
C 355 60
f C 353 %
a C 373 12
b C 325 1
C 413 0
8,9
93 8,8
8,0 9,4 8,2 9,0 8,5 9,6 9,0
8,9 7,3 9,5
10
13 13 7 7 2 5 7
11 8 6 8 1 1 18
9,8 9,4
9,1 8,9 9,6 9,8 7,7 8,9 9,4 9,1 9,2
93 9,2 9,6
6,4 6,5
Die beiden Kulturmedien BPFA und BSX wurden ebenso für die Kultivierung in Tanks unter submersen Bedingungen und künstlicher Belüftung verwendet, wobei 550-Liter-Tanks aus rostfreiem Stahl eingesetzt wurden. Um diese Kultivierungen in den Versuchsanlagen zu veranschaulichen, wird auf die nachfolgende Tabelle V Bezug genommen, welche die eingesetzten Stämme, die Kultivierungsbedingungen und die erhaltenen Ergebnisse angibt.
Tabelle V
Stamm C 335 C 339 C 347 C 351
C 324
Medium BPFA BPFA BPFA BSX
BPFA
9,3 10,2 10,5 10,2 10,2
34
34
34
34
0,3 0,25 0,25 0,25 0,3
pH-Wert vor
der Beimpfung
Kultivierungstemperatur
in Celsius
Luft, m3 pro
Minute
Kultivierungszeit in Stunden
Schluß-pH
Abschließende
proteolytische
Aktivität in
Anson-Einheiten
pro kg des Substrats
In einer anderen Versuchsanlage wurden für die Kultivierung andere Stämme mit verschiedenen Zusammensetzungen des Kultivierungsmediums verwendet. In den vorerwähnten Stahltanks wurde der Stamm C 303 in vier Ansätzen unter verschiedenen Bedingungen kultiviert. Die Zusammensetzungen des Kultivierungs-
53
8,3
44
9,2
40
97
9,1 29
59
8,9 48
83
9,35 33 mediums, die Kultivierungsbedingungen und die er haitenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle VI angegeben.
Tabelle VI
Kultivierungs-Nr.
12 3
Gerstenmehl, 100 100 150
g/Liter
Sojamehl, g/Liter 30 30 45
Pluronic®, ml/Liter 0,03 0,03 0,03 0,03 Na2CO3 (sterile 0,2 M 0,2 M 0,2 M 0,4 M Zugabe vor der Beimpfung)
pH vor der 10,0 10,0 10,35 10,1
Beimpfung
Kultivierungs- 34 34 34
temperatur, °C
Luft, mVMin. 0,3 0,3 0,3 0,3
Kultivierungszeit 125 104 113
in Stunden
pH beim Maximum 9,3 9,3 9,6 9,3
Maximale Anson- 67 80 77
Einheiten pro kg
Die proteolytischen Enzyme können aus der Kultivierungsbrühe gewonnen werden indem die Brühe einer Zentrifugation unterworfen, das Enzym aus der so erhaltenen Flüssigkeit durch Zugabe von Na2SO4 oder Äthanol gefällt, der Niederschlag durch Filtration über Kieselgur abgetrennt und hiernach der Niederschlag getrocknet wird, wobei eine pulverförmige Substanz mit aktiven proteolytischen Enzymen gewonnen wird. Derartige lediglich als Beispiele zu betrachtende Aufbereitungsprozesse werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die Tabelle VH veranschaulicht.
Tabelle VII 18 00 508 Stamm C 347 20
19 C 339 250 kg Kühl
250 kg Kultur flüssigkeit mit
Ausgangsmaterial flüssigkeit mit 45 Anson-Einheiten C 351
25 Anson-Einheiten pro kg 600 ml Kühl
pro kg 11250 flüssigkeit mit
6250 32 Anson-Einheiten
Gesamtmenge an 3000 Umdrehungen/ pro Liter
Anson-Einheiten 3000 Umdrehungen/ min · 30 min 19,2
Zentrifugation min ■ 30 min 35° C
35° C 85 kg NazSO4 4000 Umdrehungen/
Niederschlag 85 kg Na2SO4 stehenlassen min - 30 min
stehenlassen während 1 Std. 0°C
während 1 Std. 2,25 kg Kieselgur 1200 ml
2,25 kg Kieselgur, Filterpresse OHsOH
Filtration Filterpresse
keine
(Zentrifugation während
30 min bei 4000 Um
drehungen/min,
Auswaschen mit 600 ml
C2H5OH bei 0°C,
Trocknungskammer Zentrifugation während
Trocknungskammer 4O0C 10 min bei 4000 Um
Trocknen 4O0C 1300 g mit drehungen/min)
4000 g mit 0,8 Anson-Einheiten Vakuum P2O5
Enzympulver 0,4 Anson-Einheiten prog
prog 1020 Anson-Einheiten 9,7 g mit
1600 Anson-Einheiten =9O/o 1,3 Anson-Einheiten
Ausbeute = 25% prog
12,6 Anson-Einheiten
= 65%
Die in der Tabelle VII erwähnten Ausgangsmaterialien sind durch Kultivierung in 550-Liter-Tanks aus rostfreiem Stahl unter künstlicher Belüftung hergestellt worden. Die Nährmedien wurden auf den Anfangs-pH-Wert durch Zugabe einer 2-M-Na2CO3-Lösung unter sterilen Bedingungen vor der Beimpfung eingestellt.
Eine Untersuchung der von den in der Tabelle II angegebenen Stämmen erzeugten proteolytischen Enzyme zeigte, daß hinsichtlich einer Reihe von Eigenschaften Unterschiede bestehen.
Im Hinblick auf die proteolytische Aktivität können die Enzyme in drei Gruppen oder Typen eingeordnet werden, falls die proteolytische Aktivität bei pH 12 gemessen und im Prozentsatz der maximalen Aktivität ausgedrückt wird, nämlich:
Typl
Typ 2
Typ 3
100 bis 80%
80 bis 50%
50 bis 0%
Es ist bekannt, daß Calciumionen die Aktivität der meisten proteolytischen Enzyme stabilisieren. Die
Tabelle VIII
erfindungsgemäßen Enzyme, welche durch die Mikroorganismen erzeugt werden, die in der Tabelle 1 angegeben sind und in die Spezies und Abarten gemäß Tabelle II eingeteilt werden können, wurden in bezug des Stabilisierungseffekts von Calciumionen bei einer Konzentration von 0,01 M bei pH 10,5 oder 11 untersucht. Die Stabilisierung wurde in dem Prozentsatz der Restaktivität nach dem Stehenlassen von 30 Minuten bei 500C angegeben. Die Ergebnisse der Untersuchung der Enzymtypen und dür mit Calciumionen erzielbare Stabilisierungseffekt sind in der Tabelle VIII zusammengestellt, in der das Pluszeichen bedeutet, daß die proteolytische Restaktivität in Abwesenheit von Calciumionen weniger als 80% der entsprechenden Aktivität bei der Untersuchung in Gegenwart von Calciumionen beträgt; das Minuszeichen bedeutet, daß die proteolytische Restaktivität in Abwesentheit von Calciumionen über 80% der entsprechenden Aktivität bei der Untersuchung in Gegenwart von Calciumionen beträgt.
Spezies
Abart Stämme
Enzym- CA+ +
Typ Stabilisierung
a C 300, C 301, C 360, C 372, C 374 1 + + + + +
b C 302, C 334 I+ +
c C 323, C 339, C 352, C 369 2 ?+ + +
d C 304, C 311, C 336 1 + + +
C 335, C 341 2 + +
Fortsct/uiiü Abart Stämme 1 8 00 508 22
21 Spezies a
b
C
d
e
f		 C 326, C
C 347, C
C 337, C
C 338, C
C 324, C
C 353
111
C 		a
b
C 		C 303, C
C 371, C
C 351, C
C411
C 358, C		 Iji/yin (Λ ' '
Typ StiihilisieruriL1
IV C 365, C 342
350
340
343, C
355		 346, C 348, C 349 3 ? +
3 +?
3 + +
3 +????
3 +?
3 +
V a
b		 C 373
C 325, C		 354, C
375, C
356, C
410		 357, C 366, C 367,
378
364. C 376, C 377,		 1
1 _? η
1 - +
Vl 412 1 -?
413 1
VII
C 370
Die proteolytische Aktivität der von den in der Tabelle VIII aufgeführten Stämmen erzeugten Enzyme ist nicht nur bei dem pH 12, sondern auch bei niederen pH-Werten untersucht worden, um nähere Anhaltspunkte für die proteolytische Aktivität bei verschiedenen pH-Werten und nähere Informationen über die Aktivität der drei Enzynuypen zu erhalten. Zur Veranschaulichung wird auf die Zeichnung verwiesen, in der zeigt
F i g. 1 die proteolytische Aktivität des von dem Stamm C 311 erzeugten Enzyms, wobei dieses zu dem Typ 1 gehört,
F i g. 2 in gleicher Weise die Aktivität des von dem Stamm C 335 erzeugten Enzyms, wobei dieses zu dem Typ 2 gehört und
F i g. 3 in entsprechender Weise die Aktivität des von dem Stamm C 324 erzeugten Enzyms, das zum Typ 3 gehört.
Es versteht sich, daß die Aktivitätskurven nur den grundsätzlichen Unterschied in der Aktivität der drei Typen von proteolytischen Enzymen bei unterschiedlichem pH-Wert darstellen sollen und das die Aktivitätskurve für jeden einzelnen Typ variieren kann, ohne daß das charakteristische Bild verlorengeht.
Die neuen Enzyme gemäß der Erfindung sind weiterhin folgenden Untersuchungen unterworfen worden
a) Stabilität gegenüber Na-Tripolyphosphat (TPP)
Es wurde die Stabilität der Enzyme in einer Lösung bestimmt, welche einen Gehalt an Tripoiyphosphat von 0,2% besitzt Die Stabilität wurde in dem Prozentsatz der Restaktivität nach 30 Minuten bei 500C und bei pH 10 ausgedrückt Die Enzymkonzentration betrug 0,1 Anson-Einheiten pro Liter. Bei der Analyse wurde nach der Anson-Methode vorgegangen.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IX zusammengestellt
Die entsprechenden Lösungen mit 0,01 M CaCb zeigten in allen Fällen eine Restaktivität von 80 -100%.
b) Stabilität gegenüber Perborat
Es wurde die Aktivität einer Lösung bestimmt, welche das Enzym und Natriumperborat in einer Menge von 0.1% enthielt Die Stabilität wurde in dem Prozentsatz der Restaktivitäi nach 30 Minuten bei 500C und pH IC ausgedrückt. Die Enzymkonzentration und die Analysenmethode stimmten mit der oben unter a) erwähnter Untersuchung überein.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IX zusammengestellt.
c) Stabilität gegenüber oberflächenaktiven Mitteln
Es wurde die Stabilität von Lösungen untersucht welche das Enzym und verschiedene oberflächenaktive Verbindungen enthalten, wobei drei typische oberflächenaktive Mittel in Konzentrationen eingesetzt wur den, die auch in der Waschlösung Anwendung finden:
I.Seife 0,25 g/l
2. Dodecyl-Benzol-Sulfonat (DBS) 50% 2,5 g/l
3. Talg-Fettalkohol-Sulfat (TAS) 50% 5,0 g/l
Die Enzymkonzentration betrug 0,1 Anson-Einheii pro Liter. Die Untersuchungen wurden während 3( Minuten bei 50°C und bei pH 10 durchgeführt. Bei dei Analyse wurde die Nitro-Kasein-Methode (E. v. P e c h mann, Biochemische Zeitschrift, Bd. 321, 248—26( [1950]) angewandt.
Zum Verständnis der Tabelle IX sei auf folgende; verwiesen: Die Zahl vor dem Schrägstrich gibt der Prozentsatz an Restaktivität an wenn die Analyse unmittelbar nach der Zugabe des oberflächenaktiver Mittels durchgeführt wird; diese Zahl macht also ein« Angabe über die Anfangsgeschwindigkeit der Inaktivie rung.
Die Zahl hinter dem Schrägstrich gibt den Unter schied zwischen dieser anfänglichen Restaktivität um dem Prozentsatz der Restaktivität nach 30 Minuten an.
d) Temperaturoptimum
In der Tabelle IX ist die Temperatur in Celsiusgrai angegeben, bei der die maximale Aktivität bei pH K festgestellt wurde. Bei der Analyse wurde die Anson Methode angewendet
e) Enzymtyp
Es wurde festgestellt daß alle Enzymaufbereitungei durch Phenylmethylsulfonylfluorid eine sofortige um vollständige Inhibierung erleiden. Dies bedeutet, dal
18 OO 508
sämtliche Enzyme Serin im aktiven Zentrum haben. Aufgrund dieses Parameters lassen sich die für das erfindungsgemäße Verfahren in Betracht kommenden Bacillus-Stämme auf einfache Weise, d. h. ohne erfinderischen Aufwand, bestimmen.
f) pH-Stabilität
Im Zusammenhang mit fünf Enzymaufbereitungen wurde die Stabilität der verschiedenen pH-Werte unter folgenden Bedingungen untersucht:
Enzymkonzentration
0,2 Anson-Einheiten
pro Liter
Verweilzeit
pH-Werte
24 Stunden bei 250C 5 7-8-10-12
In der Tabelle IX ist der pH-Bereich angegeben, innerhalb dessen eine Restaktivität von 80—100% festgestellt wurde.
Eine Untersuchung der Enzymaufbereitungen von den Stämmen C 303 und C 347 in Gegenwart von Natriumsulfit zeigte, daß die Enzyme gegenüber diesem Reduktionsmittel nicht empfindlich sind, was darauf schließen läßt, daß S-S-Brücken für die tertiäre Struktur der Enzyme nicht von Bedeutung sind.
Tabelle IX
Stamm
Enzymaufbe
reitung
in Pulverform
Aktivität
Anson-Einheiten
pro Gramm
bei pH
Enzym typ
Stabilität TPP
Perborat oberflächenaktives Mittel
Seife DBS TAS
Tempera- Serin pH-tur- Stabili-
optimum tat
C 300
C 301
C 302
C 303
C 304
C 334
C 351
C 354
C 360
C 364
C 365
C 366
C 367
C 370
C 371
C 372
C 376
C 377
C 335
C 339
C 369
C 347
600
2,5
1500
42
117
456
2000
26
500
3000
50
430
17
2!3
1500
217
7,2
573
0,5 (10)
0,7 (10)
0,7 (10)
3,0 (7,5)
0,3 (7,5)
0,5 (7,5)
1.3 (7,5)
0,6 (7,5)
0,4 (7,5)
0,9 (7,5)
0,4 (7,5)
0.8 (7,5)
2,2 (7,5)
0,6 (7,5)
1,0(7,5)
2.7 (7,5)
7.8 (7,5)
1,9(7,5)
0,3 (7,5)
1.4 (7,5)
1,4 (7,5)
2,0
2 4 1
91
95
78
94
90
94
100
94
89
95
88 93 60 16 81 0
89 47 48 95 4 39 66 82 83 80 86 96 100 91 93 60 78 86 29 76 2 36
82/71 56/48 7/6 50
50/47 35/31 4/2 50
59/56 60/- 3/1 50
85/50 40/30 23/18 60
57/56 34/31 3/0 50
100/83 90/27 93/73 40
93/67 67/50 53/45 60
77/33 60/38 60/53 60
97/94 76/70 75/75 50
81/31 27/11 16/8 60
100/0 72/30 92/48 60
92/42 67/14 68/61 60
88/2 58/34 71/52 60
94/4 33/15 67/30 60
97/60 70/44 93/57 60
98/95 75/68 87/85 50
66/42 25/10 15/12 60
100/10 59/27 74/59 βο
95/51 40/32 78/71 55
89/10 75/57 83/62 45
28/28 6/6 0/0 50
81/78 94/71 67/63 40
6,0-10,5
Aus Tabelle IX geht hervor, daß eine Anzahl von Enzymaufbereitungen eine erstaunliche Stabilität besitzen.
Die Enzymaufbereitungen gemäß der Erfindung bestehen im allgemeinen aus einer festen oder flüssigen Mischung der gemäß der Erfindung hergestellten proteolytischen Enzyme und anderen Komponenten, deren Menge und Zusammensetzung von dem Zweck und dem technischen oder wissenschaftlichen Gebiet abhängen, auf welchem die Enzymaufbereitung eingesetzt werden solL Wenn die Enzymaufbereitungen in fester Form vorliegen, so können sie aus Körnern bestehen, in welche die Enzyme eingeschlossen sind Dabei können beispielsweise auch andere Enzyme oder Substanzen anwesend sein, welche eine andere als eine enzymatische Aktivität besitzen, die für die Brauchbarkeit der Enzymaufbereitungen nützlich ist Liegen die Enzyme nicht in kristalliner Form vor, dann können Verunreinigungen organischer Natur, wie z. B. Proteine und Kohlehydrate aus dem Kulturmedium vorhanden sein.
Die flüssigen Enzymaufbereitungen können durch Lösungen oder Suspensionen gebildet sein, welche, falls
5,0-11,0 6,0-10,5
6,3-10,3 6,3-11,0
es sich als erforderlich erweist, Stabilisatoren enthalten.
Im allgemeinen werden die neuen Enzyme nach der Erfindung in geringen Mengen eingesetzt Im Hinblick hierauf besitzen die Enzymaufbereitungen für industrielle Zwecke normalerweise einen Enzymgehalt von nicht mehr als etwa 10 Gew.-%.
Die erfindungsgemäßen Enzyme können ganz allgemein in Mitteln für die Hydrolyse von Proteinen, z. B. in Wasch- und Geschirrspülmitteln, Enthaarungsmitteln, und als Additive zu Faulbehältern und in Installationen für die Abwasserreinigung verwendet werden. Nach der Erfindung besteht das vorzugsweise Einsatzgebiet der neuen Enzymaufbereitungen auf dem Gebiet der Wasch- und Geschirrspülmittel.
Im Zusammenhang mit der Brauchbarkeit der erfindungsgemäßen Enzymaufbereitungen in Waschmitteln wurden eine Reihe von Versuchen durchgeführt
Bei den Waschversuchen wurden EMPA- (Abk. Eidgenössische Materialprüfungs- und Versuchsanstalt, St Gallen, Schweiz) Teststreifen der Typen Nr. 116 und Nr. 112 verwendet Bei den Waschexperimenten wurden also mit Blut, Milch und Ruß (Nr. 116) oder mit Kakao, Milch und Zucker (Nr. 112) verschmutzte Teststreifen
18 OO
eingesetzt. Die Untersuchungen wurden mit zwei Typen von Teststreifen gesondert durchgeführt, wobei jede Untersuchung dreimal bei 5O0C und 600C wiederholt wurde. Die Enzymkonzentrationen in der Waschlösung betrugen 0,048 Anson-Einheiten pro Liter.
Ein Detergens mit hoher Wirksamkeit hatte folgende Zusammensetzung:
Nansa*) S (40% Natriumalkylarylsulfonat, 60% Natriumsulfat)
Nonylphenol, 10 Äthylenoxyd-Einheiten (EO) Seife (80%)
Natriumtripolyphosphat
Carboxymethylzellulose 60% (CMC) Natriumkarbonat, anhydr.
Natriumsulfat, anhydr.
Natriumperborat (NaBO3,4 H2O)
Insgesamt
250 g 30 g 30 g
300 g 16g 80 g 74 g
220 g
1000 g
Die übrigen Bedingungen waren wie folgt:
Wasserhärte in deutschen
Einheiten
Stoff/Wasser- Verhältnis
Versuchsdauer
pH-Wert
Konzentration des Detergens
10°
1 :40
30 Minuten
etwa 10
4,0 g pro Liter
der Waschlösung
*) Nansa ist die warenzeichenrechtliche Bezeichnung für ein von der Firma Marchon Products Ltd., Whitehaven, England auf den Markt gebrachtes Na-Alkylbenzolsulfonat.
Der Waschprozeß wurde bei 500C wie folgt ausgeführt:
Mit einer Pipette wurden 20 ml einer Enzymlösung mit einer Aktivität von 0,288 Anson-Einheiten pro Liter in einen 150-ml-Becher gegeben. Zuvor wurde der pH-Wert auf 10,0 und die Temperatur auf 200C eingestellt. Bei Nullzeit wurden 100 ml der auf pH 10,3 und 560C eingestellten Lösung des Detergens zugegeben. Die Konzentration des Detergens betrug 4,8 g pro Liter. Der Becher wurde sofort in einen Wasserthermostaten mit 50° C gestellt. 6 kreisförmige EM PA-Teststreifen mit einem Gesamtgewicht von 3,0 g wurden zugesetzt. Es wurde mit einem Glasspatel während 10 Sekunden gerührt. Der Becher wurde insgesamt während 30 Minuten in dem Thermostaten belassen. Das Rühren wurde jeweils nach 4 Minuten während 10 Sekunden fortgesetzt. Die Waschlösung wurde hiernach abgetrennt, und der pH-Wert wurde nach dem Abkühlen gemessen. Die Teststücke wurden unter laufendem Leitungswasser während ίΰ Minuten gespült und dann zwischen zwei Handtüchern getrocknet und geplättet. Jedes Teststück wurde Remissionsmessungen in einem Beckman Spektrofotometer bei 460 ιτιμ ausgesetzt. Außer diesen Untersuchungen wurden Kontrollexperimente ausgeführt, bei denen die Enzymlösung durch Wasser ersetzt worden war.
Bei den bei 600C durchgeführten Untersuchungen wurde die Temperatur der Detergenslösung auf 68° eingestellt.
Die bei diesen Untersuchungen gewonnenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle X wiedergegeben.
Tabelle X
Stamm des
Enzyms
Remission des EM PA-Teststreifens 116
nicht behandelt nach Einweichen u. Spülen 50°C 60°C
nicht behandelt
nach Einweichen u. Spülen
50°C 60°C
keines
C 303
C 339
C 351
C 367
C 377
C 364
C 372
C 376
C 366
11,9
14,6 32,6 27,0 30,0 34,0 34,0 33,6 38,1 32,7 35,8
17,8 33,4 23,0 27,7 33,0 33,2 31,0 29,7 32,7 33,5
Die Remissionswerte stellen Durchschnittszahlen der Messungen von jedem der 6 Teststücke bei jedem der Experimente dar.
Eine andere Serie von Waschexperimenten wurde mit EMPA-Teststücken Nr. 116 durchgeführt, die vorher bei einer Temperatur von 400C während 20 Minuten mit einem anionischen oberflächenaktiven Mittel und Natriumperborat behandelt worden waren. Nach dieser Behandlung wurden die Teststücke abgespült und getrocknet Die Behandlung mit Perborat ergab eine gute Fixierung des Schmutzes, der sich danach nur noch sehr schwierig entfernen ließ.
Das Detergens hatte folgende Zusammensetzung:
34,0 41,1 40,3 400 g 150 g
41,5 43,9 Carboxymethylzellulose 45% (CMC) 20 g 350g
39,3 39,7 Natriumkarbonat, anhydr. 1000 g
40,5 40,2 Natriumsulfat anhydr. Weitere Bedingungen:
39,7 41,3 Insgesamt 10° deutsche
41,7 43,8 Härte
41,9 43,5 Wasser 1 :40
43,6 42,5 30 Minuten
42,4 43,2 Stoff/Wasser-Verhältnis 45°C
41,2 41,5 Zeitdauer
Nonylphenol, 10 Äthylenoxyd-Einheiten (EO) ' 80 g Temperatur
Natriumtripolyphosphat
Konzentration des Detergens
etwa 10
4,0 g pro Liter
der Waschlösung
Das Verfahren war dasselbe wie bei den oben beschriebenen Waschexperimenten mit der Ausnahme, daß die Waschlösung eine Temperatur von 500C hatte bevor sie mit der Enzymlösung vermischt wurde.
Es wurde drei Experimente mit jedem der Enzyme durchgeführt. Die Ergebnisse gehen aus der nachfolgen- ι ο der Tabelle XI hervor.
Tabelle XI Remission de; » EMPA-Teststreifens und Spülen
Stamm des Enzyms Nr 116 18,7
nicht behandelt nach Einweichen 36,8
32,3
16,4 31,0
Keines 34,3
C 303 37,6
C 339 34,6
C 351 43,2
C 367 36,8
C 377 37,3
C 364
C 372
C 376
C 366
Detergens dasselbe war wie bei den oben zuerst erwähnten Waschversuchen, nämlich:
Nansa*) S (40% Natriumalkylarylsulfonat,
60% Natriumsulfat) 250 g
Nonylphenol, 10 Äthylenoxyd-Einheiten 30 g
Seife (80%) 30 g
Natriumtripolyphosphat 300 g
Carboxymethylzellulose (CMC) 60% 16 g
Natriumkarbonat, anhydr. 80 g
Natriumsulfat, anhydr. 74 g
Natriumperborat NaBO3,4 H2O 220 g
Insgesamt 1000 g
*) Nansa ist die warenzeichenrechtliche Bezeichnung für ein von der Firma Marchon Products Ltd., Whitehaven, England auf den Markt gebrachtes Na-Alkylbenzolsulfonat.
Die Testbedingungen waren wie folgt:
Wasser
Stoff/Wasser-Verhältnis
Zeitdauer
Temperatur
Konzentration des Detergens
3°
Die Remissionswerte stellen Durchschnittszahlen der Messungen von jedem der 6 Teststreifen bei jedem der Experimente dar, allerdings mit der Ausnahme, daß die im Zusammenhang mit den Untersuchungen mit den Enzymen vom Stamm C 339 und C 351 angegebenen ;,> Werte nur auf einer Messung basieren.
Es wurden auch Untersuchungen durchgeführt, bei denen verschiedene Enzymkonzentrationen in der Waschlösung angewendet wurden, nämlich in dem Bereich zwischen 0,02 und 0,16 Anson-Einheiten pro Liter der Waschlösung. Für die Untersuchungen wurden EM PA-Teststreifen Type Nr. 116 verwendet, wobei das
Tabelle XII
Remission der EM PA-Teststücke 116
10° deutsche
Härte
1 :40
30 Minuten
45°C und 6O0C
etwa 10
4,0 g pro Liter
der Waschlösung
Das Verfahren stimmte mit dem bei den vorstehend zuerst erwähnten Experimenten überein mit Ausnahme, daß die Konzentration der Enzymlösung so variiert wurde, daß die Aktivität in der Waschlösung die folgenden Werte erhält:
0,02-0,04-0,08-0,16 Anson-Einheiten pro Liter.
Bevor die Lösung des Detergens mit der Enzymlösung vermischt wurde, wurde sie auf 50° C bzw. 68° C eingestellt, entsprechend einer Temperatur in der für den Gebrauch fertigen Waschlösung von 450C bzw. 6O0C.
Jede Enzymaufbereitung wurde bei beiden Temperaturen untersucht. Die Ergebnisse der Remissionsmessungen sind in der nachfolgenden Tabelle XII zusammengestellt
Stamm des Tempe Anson-Einheiten pro 0,02 Liter der Waschlösung 0,08 0,16
Enzyms ratur 25,8 33,5 36,8
0C 0 25,8 0,04 32,5 36,0
C 303 45 15,0 26,0 28,8 34,2 37,3
C 339 45 16,02 25,2 29,7 31,7 36,3
C 351 45 15,7 29,2 30,8 36,8 41,7
C 367 45 14,0 27,2 28,3 33,7 36,7
C 377 45 16,5 33,0 32,2 42,0 46,1
C 364 45 15,3 30,0 293 36,3 39,8
C 372 45 16,2 31,8 36,6 383 46,7
C 376 45 17,5 29,8 33,7 34,1 36,1
C 366 45 16,7 20,9 34,0 25,4 28,8
C 303 60 19,2 27,0 32,0 32,4 34,4
C 339 60 io,9 28,8 21,7 32,6 34,1
C 351 60 17,4 27,0 28,8 32,4 34.4
C jc7 60 17,3 28,7 303 33,0 33,5
C 377 60 17,4 213 28,8 25,7 29,1
C 364 60 20,8 28,4 29,8 33,6 35^
C 372 60 17,0 3ZO 23,7 35.0
C 376 60 19,0 31,4
C 366 60 19.0 3Z5
18 OO 5Q8
Die Remissionswerte stellen Durchschnittszahlen aus den 6 Messungen dar.
Schließlich wurden noch Versuche durchgeführt zur
Lagerungsstabilität
Jede Enzymaufbereitung wurde in einem Turbolamischei· mit dem oben auf Seite 40 erwähnten Detergens vermischt Entsprechende Versuche wurden mit demselben Detergens ausgeführt mit der Maßgabe, daß das Perborat durch wasserfreies Natriumsulfat ersetzt wurde. Der Wassergehalt in dem kein Perborat enthaltenden Detergens war 2,7%. Der Wassergehalt in dem Detergens mit dem Perborat lag naturgemäß entsprechend höher weil das Perborat etwa 47% Kristallwasser besitzt
Alle Mischungen wurden unmittelbar nach ihrer Herstellung auf ihre proteolytische Aktivität hin untersucht und dann in verschlossene Glasbehälter bei 40°C gebracht Die Analyse der proteolytischen Aktivität wurde in bestimmten Zeitabständen wiederholt Hierbei wurden die Analysen wie folgt durchgeführt:
Von 12 verschiedenen Stellen in den Glasbehältern wurde eine Probe von 12,5 g genommen, die in eine 1 -Liter-Meßfiasche überführt wurde. Bei der Perborat enthaltenden Mischung wurden 4,4 g Natriumsulfit zum Zwecke der Neutralisation des Perborats zugegeben. Es wurde deionisiertes Wasser bis zur Meßmarke aufgefüllt und die Lösung dann unter mechanischem Umrühren während 30 Minuten bei 25° C gehalten. Hiernach wurde die proteolytische Aktivität in Anson-Einheiten bestimmt.
Die untersuchten Mischungen und die nach verschiedenen Lagerungszeiten gemessene proteolytische Restaktivität ist in de nachfolgenden Tabelle XIlI angegeben.
Tabelle XIII
Detergens Per- Lagerungszeiten
und der borat
Stamm Anson-Einheiten pro Gramm Enzym und Prozentsat/ der Aktivität nach einer Lagerung bei 40cC in
Enzyms 0 Tage 1 Tag 3 Tage 5 Tage 8 Tage 14 Tage 21 Tage 28 Tage
AU/g Act.- AU/g Act.- AU/g Act.- AU/g Act.- AU/g Act.· AU/g Act.- AU/g Act.- AU/g Act.-
C 303
C 367
C 377
C 364
C 372
C 376
C 366
2,90 100 2,94 101 2,85 100
2,90 100 2,78 96 2,90 100
4,20 100 4,00 95 3,60 86
4,20 100 4,20 100 4,30 80
2,65 100 2,50 94 2,38 90
2,65 100 2,65 100 2,30 86
0,70 100 0,70 100
0,70 100 0,70 100
2,97 100 2,97 100
2,84 100 2,57 90
8,60 100 7,70 90
(7,90) 8,20 96
0,90 100 0,86 95
0,90 100 0,70 /'8
3,00 103 2,95 101 2,80 97 3,00 103
2,50 86 2,50 86 1,86 67
3,72 88 3,80 90 3,95 94
2,30 55 2,00 47 1,90 45
2,40 90 2,50 94 2,41 90
1,62 61 0,37 52 1,44 54
0,72 103 0,72 103 0,66 94 0,70 100
0,72 103 0,57 81 0,46 66 0,43 61
3,00 100 3,00 100 2,94 100 3,00 100
2,10 74 2,10 74 1,40 49 1,03 36
8,60 100 8,60 100 8,00 93 8,10 94
7,70 90 7,70 90 7,00 81 5,50 64
0,94 104 0,94 104 0,87 97 0,85 95
0,70 78 0,70 78 0,71 79 0,68 76
AU/g = Anson-Einheiten pro Gramm.
Acl.-% = Prozentsatz der proteolytischen Restaktivität.
Die Stabilität von einigen der Enzyme in Gegenwart von Perborat ist beträchtlich.
Viele der erfindungsgemäßen Enzyme sind nicht nur für die bei den vorerwähnten Versuchen eingesetzten Detergentien brauchbar; sie eignen sich vielmehr tatsächlich für alle Arten von Detergentien. Diese können wasserlösliche Seifen, anionische synthetische Detergentien, beispielweise wasserlösliche Salze von Reaktionsprodukten zwischen organischen Verbindungen und Schwefelsäure, nichtionische synthetische Detergentien, beispielweise Verbindungen wie sie durch Kondensation von Alkylenoxydgruppen mit einer organischen hydrophoben Verbindung erhalten werden, amphoiytische synthetische Detergentien und andere synthetische Detergentien enthalten. Es können auch die Wirkung von Seife erhöhende Substanzen in den Detergentien vorhanden sein, und die Enzyme gemäß den Experimenten können mit derartigen Substanzen kombiniprt werden. Beispiele derartiger Substanzen so sind: Karbonate, Boi<ne, Phosphate, Polyphosphate, Silikate und Sulfate der Alkalimetalle, vorzugsweise des Natriums.
Falls es sich als zweckmäßig erweist, können auch organische, alkalisch reagierende Abkömmlinge der
ss vorerwähnten Substanzen Anwendung finden und mit den erfindungsgemäßen Enzymen kombiniert werden.
Die auf dem Gebiet der industriellen Detergentien eingesetzten Enzymaufbereitungen gemäß der Erfindung können auch noch andere Enzyme enthalten, die
(.ο eine für den Waschprozeß brauchbare Wirksamkeit zeigen. Eine Anzahl derartiger Enzyme sind bekannt.
Wenn die Enzymaufbereitungen gemäß der Erfindung als aktive Komponente der Detergentien eingesetzt werden sollen, dann werden die Enzymaufberei-
r«. tungen im allgemeinen als Pulver auf den Markt gebracht, in denen das aktive Enzym bzw. die Enzyme nur einen geringen Anteil bilden und der Rest des Pulvers aus anorganischen Salzen, beispielsweise
18 OO
Natriumsulfat, Kalziumphosphat und Natriumchlorid, besteht Daneben können auch noch andere Substanzen als Bestandteile des fertigen Detergens vorhanden sein.
Da proteolytische Enzyme bereits als Bestandteile von Detergentien verwendet wurden, ist es dem Fachmann geläufig, die erfindungsgemäßen Enzymaufbereitungen in der geeigneten Form zur Verwendung in den Detergentien herzustellen.
Es ist ein wesentlicher Fortschritt für die Verwendung in Detergentien, daß die erfindungsgerräß hergestellten ι ο Enzyme eine optimale proteolytische Aktivität bei pH-Werten oberhalb 9 und in Gegenwart von Perboraten eine verbesserte Stabilität besitzen. Die proteolytischen Enzyme gemäß der Erfindung können auch als aktive Bestandteile in Geschirrspülmitteln verwendet werden. Beim Geschirrspülen ist eine proteolytische Aktivität bei verhältnismäßig hohen pH-Werten wünschenswert
Wie bereits erwähnt, können die erfindungsgemäßen Enzymaufbereitungen ebenfalls für die Enthaarung von Häuten und Fellen eingesetzt werden. Bei dem herkömmlichen Enthaarungsverfahren werden die Häute in ein Bad gelegt das Kalziumhydroxyd und Natriumsulfid enthält und einen pH-Wert von etwa 12 besitzt. Ein solches Enthaarungsverfahren wirkt sich auf 2s die Haare, die noch weiter verwendet werden könnten, sehr nachteilig aus.
Während der letzten Jahre bediente man sich enzymatischer Enthaarungsverfahren, wobei proteolytische Enzyme zur Anwendung kamen. Die Enthaarung jo wurde bei einem niederen pH-Wert von 7 — 10 ausgeführt, wobei die Qualität der Haare nicht beeinträchtigt wurde. Andererseits findet keine Que!- lung der Häute oder Felle statt wie es bei den herkömmlichen Enthaarungsverfahren der Fall war, was zu Schwierigkeiten bei der weiteren Behandlung der Häute und FeUe führte.
Diese Schwierigkeiten sind bekannt, und es wurde vorgeschlagen proteolytische Enzyme zu verwenden, welche eine hinreichende Aktivität bei höheren pH-Werten als 10 besitzen. Da einige der erfindungsgemäßen Enzyme eine optimale proteolytische Aktivität bei pH-Werten bis zu 12 aufweisen, sind diese Enzyme zur Verwendung bei Enthaarungsprozessen sehr gut geeignet Die nachfolgenden Untersuchungen sollen die Brauchbarkeit von einigen der erfindungsgemäßen Enzyme für die Enthaarung verdeutlichen.
Eine eingesalzene Kuhhaut wird in Stücke von etwa 20 χ 4 cm geschnitten. Die Stücke werden während 24 Stunden eingeweicht wonach das Fett und Fleisch abgeschab: wird; die Hautstücke werden dann in 400 ml von verschiedenen Enzymlösungen gelegt die in Glasgefäßen mit einem Volumen von 500 ml enthalten waren. Die Glasgefäße werden bei 300C während 24 Stunden inkubiert. Die Stücke werden dann aus den Lösungen genommen und die Haare mit einem Stück Plexiglas abgeschabt. Der Enthaarungseffekt wird nach dem folgenden Maßstab bewertet.
1. Leichte und vollständige Entfernung der Haare.
2. Vollständige Entfernung der Haare unter Zurückbleiben von Haarflecken auf der Haut.
3. Keine oder nur schwierige Entfernung der Haare. Die verwendeten proteolytischen Enzymlösungen
enthielten 1 g Kalziumhydroxid pro 13Üg Wasser. Die Enzymmenge ist in der nachfolgenden Tabelle XlV angegeben, die auch die pH-Werte beim Beginn und am Ende des Enthaarungsprozesses zusammen mit den erhaltenen Ergebnissen angibt.
Tabelle XIV Nr.
1
Stamm
0-Ver-
such		 2
des Enzyms
C 303		 5
11,9
11,8
1		 3
C 367		 5
11,8
11,8
2		 4
C 372		 5
11,9
11,8
1
0
11,9
11,9
3		 0,5
11,9
11,8
1		 0,5
11,9
11,8
2		 0,5
12,0
11,9
3
Enzymmenge in Anson-
Einheiten
Anfänglicher pH-Wert
End-pH-Wert
Enthaarungsergebnis
Aufgrund des Standes der Technik konnte nicht erwartet werden, daß es möglich sein würde, von bestimmten Mikroorganismen Enzyme zu gewinnen, deren Aktivitätsoptimuir; oberhalb pH 9 liegt und die in stark alkalischen Medien eine ausgezeichnete proteolytische Wirkung entfalten. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Enzyme ist darin zu sehen, daß sie gegenüber nichtenzymatischen Substanzen, wie sie im allgemeinen in Detergentien vorkommen, eine im Vergleich zu bekannten Proteasen verbesserte Stabilität besitzen. Dies gilt insbesondere gegenüber Perboraten.
Die Erfindung trägt somit einem seit langem auf dem Gebiet der Herstellung von Mitteln zur Hydrolyse von Proteinen, insbesondere soweit es sich dabei um Wasch- und Geschirrspülmittel handelt, bestehenden Bedürfnis Rechnung.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (7)

18 OO 508 Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung einer Enzymaufbereitung mit mindestens einem proteolytischen Bacillus-Enzym des Serin-Typs, das bei einem pH-Wert oberhalb 9 eine optimale proteolytische Aktivität gegenüber Haemoglobin aufweist und dessen proteolytische Aktivität bei einer Messung bei pH 12 nach der Anson-Methode 80 bis 100% der maximalen Aktivität beträgt, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bacillus-Stamm, der das proteolytische Enzym erzeugt und der innerhalb des pH-Bereichs von 7 bis 12 Wachstum zeigt, aerob in einem Nährmedium mit assimilierbaren C- und N-Quellen bei einem pH-Wert innerhalb des Bereiches von 7,5 bis 10,5 züchtet und daß man anschließend die Enzymaufbereitung abtrennt
2. Verfahren zur Herstellung einer Enzymaufbereitung mit mindestens einem proteolytischen Bacillus-Enzym des Serin-Typs, das bei einem pH-Wert oberhalb 9 eine optimale proteolytische Aktivität gegenüber Haemoglobin aufweist und dessen proteolytische Aktivität bei einer Messung bei pH 12 nach der Anson-Methode 50 bis 80% der maximalen Aktivität beträgt, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bacillus-Stamm, der das proteolytische Enzym erzeugt und der innerhalb des pH-Bereichs von 7 bis 12 Wachstum zeigt, aerob in einem Nährmedium mit assimilierbaren C- und N-Quellen bei einem pH-Wert innerhalb des Bereiches von 7,5 bis 10,5 züchtet und daß man anschließend die Enzymaufbereitung abtrennt.
3. Verfahren zur Herstellung einer Enzymaufbereitung mit mindestens einem proteolytischen Bacillus-Enzym des Serin-Typs, das bei einem pH-Wert oberhalb 9 eine optimale proteolytische Aktivität gegenüber Haemoglobin aufweist und dessen proteolytische Aktivität bei einer Messung bei pH 12 nach der Anson-methode 0 bis 50% der maximalen Aktivität beträgt, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Bacillus-Stamm, der das proteolytische Enzym erzeugt und der innerhalb des pH-Bereichs von 7 bis 12 Wachstum zeigt, aerob in einem Nährmedium mit assimilierbaren C- und N-Quellen bei einem pH-Wert innerhalb des Bereichs von 7,5 bis 10,5 züchtet und daß man anschließend die Enzymaufbereitung abtrennt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bacillus-Stamm einen der in der National Öollection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen (Schottland) unter den Nummern 10144 bis 10148, 10281, 10284, 10286, 10288, 10301, 10304, 10306 bis 10313 und 10315 bis 10327 hinterlegten Stämme einsetzt.
5. Verfahren nach /Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bacillus-Stamm einen der in der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen (Schottland) unter den Nummern 10282, 10287, 10291, 10293, 10302 und 10314 hinterlegten Stämme einsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bacillus-Stamm einen der in der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen (Schottland) unter den Nummern 10283, 10285, 10289, 10290, 10292, 10294 bis 10300 und 10305 hinterlegten Stämme einsetzt.
7. Mittel zur Hydrolyse von Proteinen, insbeson
dere Wasch- und Geschirrspülmittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem der nach einem der vorhergehenden Ansprüche erhältlichen Enzymaul· bereitungen.
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