DE1932981C3 - Verfahren zur biotechnischen Herstel lung eines Enzyms Lipase - Google Patents

Description

Die 1 rtindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Fn/\ms Lipase durch aerobes /lichten eines Mikroorganismus in einem Nährmedium. das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Quelle enthält, bei Ivrfür üblichen /üchlungsbedingungen und durch Isolierung des Enzyms aus dem Nährmedium.

Es lsi bekannt, daß es ein·: große Anzahl '.on Lipase produzierenden Mikroorganismen gibt, wie beispielsweise solche der Gattung Aspergillus, der Gattung Pcnicilhnum. der Gattung Rhizopus, der Gattung Mucor. der Gattung Absidia, der Gattung Candida, der Gattung Torulopsis, der Gattung Brettanomyces. der Gattung Bacillus, der Gattung Streptococcus, der Gattung Pseudomonus, der Gattung Clostridium. Solerotinia, Trichosporon, jedoch haben die bisher bekannten Lipase produzierenden Mikroorganismen den Nachteil, daß sie, wenn überhaupt, pflanzliche und insbesondere tierische Fette, speziell Emulsionen von Schweinefett, als Substrat nur ungenügend verbrauchen können. Dies gilt insbesondere, wenn solche Fette zusammen mit Detergentien als Substrat vorliegen. Nachteilig ist dies deshalb, weil seit einiger Zeit Remigungs- und Waschmittel mit Zusätzen von En-/vmen, die zur Beseitigung der Fettstoffe dienen sollen, vielfach Verwendung finden. Dazu werden in Detergentien und Fette enthaltenden Substraten aktive Stoffe benötigt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein solches beständiges und hochwirksames Enzym Lipase zu schaffen, das mittels eines in industriellem Maßstab vorteilhaft durchführbaren Verfahrens unter Anwendung eines bisher dafür nicht bekannten Mikroorganismns als Lipase-Produzent hergestellt werden kann.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren der eingangs genannten Art zur Herstellungeines Enzyms Lipase durch aerobes Züchten c,nes Mikroorganismus in einem Nährmcdium, das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Quelle enthält, bei hierfür üblichen Züchtungsbedingungen und durch Isolierung des Enzyms aus dem Nährmedium. das erfindiingsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daü man als Mikroorganismus Chromobacierium viscosum var. paralipolyticum KO HATSU KEN KIN Kl Nr. ".37 (Hinterlegungsbezeichnungdes Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology. Ministry of International Trade & Industry. Japan) oder Chromobacierium viscosum ATCC MIS oder Chromobacierium violaceum ATCC 12472 einsetzt.

Bisher i>t es nicht bekannt gewesen, daß man mittel* Mikroo.-eanismen der Gattung Chromobactenum Lipase~produzieren kann. ^Die Anmelderin hat Lipase produzierende Mikroorganismen, die als Substrat tierische oder pflanzliche Fette, speziell Emulsionen von Schweinefett, verbrauchen können, untersucht und geprüft, und dabei hat sie gefunden, daß sich ein stark wirksames und beständiges Enzym Lipase produzieren laßt mit Einsatz eines Mikroorganismus, der aus einer Schlammbodcnprobe de, an der Sardinenbank bei Numazu-shi, Shizuoka-Ken. Japan, vorbeifl· enden Flusses erhalten worden war.

Dieser Mikroorganismus hat folgende taxo.iomische Eigenschaften:

a) Wachstumsbedingungen:

(1) Mikroskopische Beobachtung
Maß: 0,6 bis 1.2 μ,

Form: kurze Stäbchen.
Beweglichkeit: schwach,
Sporen: keine Sporulation:

(2) Charakteristiken der Kolonie

Oberfläche: rund, konvex, glänzend und

, glänzend
viskos.

Färbung: fahl gelblichbraun,
Pisment: nicht gebildet,
Prüfmedium: a> Mannit-Hefcextrakt-Agar-Medium,

b) Glucose-Pepton-Mediuni.

c) Nähragar-Mcdium,

d) Kartoffelextrakt-Agar-Medium.

(3) Wachstumsbedingungen in verschiedenen
Medien

Bouillon: Wachstum,
Bouillon-Agar-Medium: Wachstum,
Glucose-Bouillon-Agar-Medium: gutes
Wachstum.

Gelatine-Medium: Wachstum,
Aqua-Pepton-Medium: Wachstum.
Kartoffel-Medium: Wachsten,
Lakmusmilch: Wachstum, Säurebildung;

b) Physiologische Eigenschaften

(1) Optimale Wachstumsbedingung.
pH: 6,5,

Temperatur: 26 C,

aerob oder anaerob: aerob;

(2) Wachstumsbedingung
pH; 5,5 bis 9,0,
Temperatur: 5 bis 37^UC.
aerob oder anaerob: aerob;

(3) Gramfärbiing: negativ

(4) Säure-Beschleunigung:

(5) Mcthylrot-Prüfung:

(6) Voges-Proskauer-Reaktion: —■

(7) lndol-Bildung:

(8) Schwefelsäurebildung:

(9) Ammoniakbildung: t
(10) Nitratreduktion: i

(12) ι e^!:'.;i:ie-.enliissigung:

(IS '. ν,auch vor. Cit: a:
(JfV '. igulierung vor, M;l;ii: (I": 1 :-.miwrediiktioii:
I i> ■ ν :i hy !en blau-Rod u ^t,-η
(!Οι V j: brauch von \irr,i, niu;::- ,' iind Harnstoff:

	■ lM.il \Γ	c	in Kohlen-li.i;-( ·,:
Λ:1.	1 ■/.
ν..	-öse	Sorb.t
c>	■. >se	in )>i;
\;	.; jse	Cilvcer:
! ■		Sähe :·
	■ ><e	Im: ι ir
I.	;-,ari>sc	Fiextrn
ν	Stärke
ν.	Celluio

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iie-jativc

W. man den Mikroorganisir...-ιν,.ι ..', Hiiscl'- ■ ige'ischaften unter Bezucp.ihy--. for t! :.:Ciiti!ication of Medical Baii.r Co¹ ■ '■! und K. J. S t e e 1. Caiv.br- 'ee ]96~ ' '!--ichtHch seiner taxonomisj-.i.-:i priiii i.iiin kann man im Hinblick ., \ϊ Grar ...rbung die Stäbchenfonn. di-e Bewe-jhchkeit. das . i-'-be Wachstum, lic po :i·-- Reaktion auf Kai· -ο. die negative Reaktion au;' Ovvl.^e und zur οχιά..; '.en Zersetzung von Zucker iie-en. Stamm als zur ! -.,nuiig Chromobacerium gehorm einstufen.

Vv. -n man die taxonomischen 1 igcnsehaften dieses Chr.·:"' bacteriums und die Kulturen, die zu der von der \:r,encan Type Culture Collet ion erhältlichen Ga. .ng Chromobacterium gehoien. vergleicht, dann erhält man die Bestätigung, daß dieser Lipase produzierende Stamm ein Bakterium Chiomobaeterium visco-um ist.

In der nachfolgenden Tabelle sind die 1 igenschaften dos. -Ale zuvor erwähnt, aus einer Schlamnibodenprohe des genannten Flusses in Japan erhaltenen Mikroorganismus und des Mikroorganismus ChroniobacteriMm vjscosum ATCC 691S gegenübergestellt.

	Stamm	C :m omo-
	C tirnnii'-	bac'ermn
	\ ISCOslir,:	viscosum ATCC
	aus der Schlamni
	bodenprohe
	aus Japan
Verflüssigung von Kasein ....
Verbrauch von
Citrat
Arabinose
I actose
Raffmose ..
Sorbit ...		-1.
Dextrin	_

Diese beiden Stämme haben unabhängig von den aus der vorstehenden Tabelle erkennbaren Untersohieden beträchtliche Ähnlichkeit hinsichtlich vieler andrer laxonoinischer Higenschaften. wie buspiels-¹Aeise die Charakteristiken auf zahlreichen Medien ..!u! die physiologischen Higensc+iaften. und daher 'Aei^cn diese Stämme weniuer deutliche Unterschiede a-;: -Ale sonstige \ersehiedcne Arten von Chronv-- ^acierium. Ansprechend wird der aus der Schlamm- ^. cienpr-.>be ü Jap.'.n abgeschiedene Lipa^e produz;e^rende Stamm in der \or!iegenden Beschreibung als '■-l'.'omoKictenum '.iscosimi >ar paralipoKticum bezeichnet. Vt wurde beim t'ermeniation Research InstU'.ite. Agency, of Industrial Science <fc Technology. ~->\:■.-,: _\r\ of international Ti ade λ: Industry, Japan. hinterlegt und deren ständiger Kultur-Kollektion

■ '.rter der Hinterlegungsiiummer KO HATSl Kl N ■" Ki\ Kl Nr. 1?7 zugeordnet.

I s wurde gefunden, dali ebenso wie dieser Mikro-

■ ■■•rüaaiNmi,-, au-h die Mikroorganismen Chromobacterium \isco-i;m ATCC (¹OlS und Chromobaclenum \iolaceum ATCC 12472 zur Vcrv.enJung heim

- e;-!::vjiingsgemäl5en Verfahren brauchbar sind und das gewünschte \ nz\m Lipase /u produzieren \erm ti ge n

i)ie Diirchfuhrung des ertindungsgemälkn Verfahrens erfolgt in der Weise, daß man das Nährmedium •'5 mi: einem der genannten Lipase produzierenden Chromobacter'en-S'ämme beimpft und dann die Kultur einige Tage lang züchtet.

Nährmedien, die beim erfindungsgemäßen Verfahren für die Produktion von Lipase verwendet werden konnen. müssen eine I leferquelle für Kohlenstoff, beispielweise Glucose. Saccharose, Lactose, Maltose, lösliche Stärke. Stärke. Dextrin. Melassen od. dgl enthalten, es muß darin auch eine Lieferquelle für assimilierbaren Stickstoff vorhanden sein, wie bei-.15 spielsweise Sojabohnenmehl, entfettetes Soiabohnenmehl. Baumwollsaatmehl. Pepton, Fleischextrakt. Hefeextrakt, pulverisierte Trockenhefe. Kornquellwasser. Maisquellwasser. Kaseirr-ydroKsat, Harnstoff oder Ammoniumsalz. In dem Medium ist weiterhin 4« vorteilhaft ein Salz, wie beispielsweise Magnesium-. Calcium-. Kalium-Phosphat od. dgl. enthalten, l'nd es können ferner gewisse organische oder anorganische S'-hstanzen, die für das Wachstum des Mikroorganismus und-'oder die F.nzym-Produktion von Wert sind. dem Medium zugesetzt werden.

Fs wurde ferner gefunden, daß sich die l.ipase-Produktion erhöhen läßt, wenn die erfindungsgemäß einzusetzenden Mikroorganismen in einem Medium gezüchtet werden, das zusätzlich Öle und Fette enthält. Fine bevorzugte Ausführung des erlindungsge-iäßen Verfahrens ist demzufolge eine Arbeitsweise. ^l ei der man den die Lipase produzierenden Mikroorganismus in einem solchen Medium züchtet, das Öle und iette enthält, und dann das Fnzvm LipabC daraus iso-5.S liert.

Beispiele für Öle und Fette, die man beim erfindungsgemäßen Verfahren dem Nährmedium zusetzen kann, sind tierische und pflanzliche Fette und Öle, wie beispielsweise Schweineschmalz, Rindcrfett, Butter, Walfischöl, Fischöl oder Olivenöl, Sojabohnenöl. Baumwollsaatöl. Sesamöl. Rapssaatöl. Erdnußöl. Kokosnußöl, u. dgl. Diese Fette und Öle kann man in der geeigneten Menge, vorzugsweise in etwa 0,5 bis 5 ¹Vu, dem Medium zusetzen. Feste Fette, wie beispielsweise Schweineschmalz, Rinderfett oder Butter, lassen sich durch Dampfsterilisation in dem Medium suspendieren, und daher können sie von den Lipase produzierenden Mikroorgarnismen verbraucht werden

Die Züchtung der beim enindungsgemaüen \ erfahren verwendeter. Mikroorganismen kann in verschiedener Weise, beispielsweise als ! Iu->igkultur oder als Fesikultur durchgeführt werden, l'ur die im industriellen Maßstab durch/ufunrenJe Produktion :. ist die wirtschaftlichste Art der aerobe Sunrner?- kulturpro/eß.

Zur Durchführung der Züchtung der für die Lip.■.reproduktion gemäß der Erfindung benutzten Organismen-Stümmc kann man die Züciitungstcmperaiur n. ganz allgemein über den Bereich andern, in dem die Lipase produzierenden Mikroorganismen a. ..ach~C!"' vermögen und die Lipase produzieren können, vorzugsweise über den Bereich von 24 bis Is (". Die Zeitdauer für die Züchtung lief im allgemeinen bei 2 bis Λ Tagen, wenngleich die>e eitspanne je nach dem iin Spezialfall benutzten Bedingungen variieren kann, ι::κ) zu dem Zeitpunkt, an dem die Kulturbrühe die höchste Polen/ an Lipase-Produktion zeigt, sollte das Zuchten naturlich beendet werden.

I s ist unnötig, den pH-\\ett des Medium- m kon-Irolheren. Dieser pH-W crt ist in Λ.·π meisten Fällen konstant. Jedoch ist es vorteilhaft, ihn bei der Zubereitung des Mediums auf pH 6 bis 7 einzustellen.

Man kann die Isolierung der l.ipasc aus dem Nährmedium in einer üblichen für die -Abtrennung und Reinigung des Enzvms l.ipase bekannten Weise vornehmen. Wenn es sich um eine feste Kuitui handelt, dann kann man eine Extraktion nrt Wasser od. dgl. durchführen, entsprechend den bekannten \ erfahren. 3c mit denen sich eine f:\traktfiussigkeit gewinnen läßt. In den Fällen, in denen es sich um eine flüssige Kultur handelt, kann man sich einer besonders vorteilhaften Arbeitsweise, wie beispielsweise Vakuumtiuration. Zentrifugieren od. dgl. bekannter Methoden bedienen, ivohei die gesamte Flüssigkeit filtriert wird, um die Mycelien abzutrennen und ein Filtrat zu erhalten.

Zu diesem Extrakt oder F-iltrat. das man konzentrieren oder in nicht konzentrierter F orm einsetzen lann, werden lösliche Salze, wie beispielsweise Kochsalz. Ammoniumsulfat od. dgl., oder mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Äthanol, Aceton od. dgl , hinzugegeben, um die Lipase auszufällen. Alternativ kann man das Hhrat auch sprühtrocknen und dazu sekundäre Stabilisatoren, wie beispielsweise Malzdextrin, Lactose, Carhoxymethylce'lulose. Polyäthylenglykol. Magermilch. Kasein, Sorbit od. dgl. zusetzen. Ferner gibt es noch die weiteren Methoden der Lyophilisation, Absorption an Kationen- oder Ar.ionenaustauscherliar/en, Gelfiltration oder ähnliche Arbeitsweisen, die Irin ebenfalls benutzen kann.

Diese Isolations- und Reinigungsschritte können entweder einzeln oder kombinativ eingesetzt werden, lind dabei erhält man das Fnzympulver, das Lipase-Aktivität aufweist.

Die erfindungsgemäß gewonnene Lipase ist stabil lind aktiv In dieser Beziehung weist das rohe Lipaseptilvcr, das man uie nachstehend im Beispiel 1 beschrieben gewinnt, die folgenden Eigenschaften auf:

Stabilität gegen verschiedene pH-Werte bei 20 C über 24 Stunden:

im Bereich von pH 4,0 bis 9,0 machte die verbleibende Aktivität mehr als 80"'_n aus;

im Bereich von pll } bis 10 betrug sie mehr als

Optimaler pH-Wert:

Die Aktivität liegt in einem weiten pll-ßercich vim 4.0 bis 4.11:

die maximale Aktivität liegt hei pH <> Hs 7

Die Vkliv iiäisrate betrug:

bei p\\ (■> 100.

bei pH 4 - SO,

bei pl! 9 SO.

bei ^i \ ί0 70.

hei pH ? 40.

W ärmesiabilitäi nach IO Minuten !anger Behandlung bei Temperaturen von 5" N-. ^)? C:

vi> ' ,-, an Aktivität verblieb bei einer Temporary von '.'.eiliger a's Su C:

ö0"₍, blieb bei einer Temperatur von unterhalb

40 C".
Ontimak- Temperatur: bei etwa 50 C

Die so erhaltene Lipase. die nach dem effmdungsgemäßen \ erfahren hert^.-telk worden war. ist extrem stabil und aktiv, wie beispielsweise die rohen Proben von durch Alkohol-Ausfällung gewonnenem Enzym. Daher kann man das Enzym Lipase für eine Vielzahl von Verwendungszwecken benutzen, beispielsweise als Digestiv um. Reinigungsmittel, Mitlel zur Abvvasscrklärung u. dgl.

Die Zusammenstellung der Zerset/tingsraten von rohem Lipasepulver. wie rs bei dem zuvor beschriebenen Alkohol-Aiisfällungs-Verfahren gewonnen wird, ist in Tabelle 1 veranschaulicht (wobei die Zerset/ungsratc von Olivenöl als 1,0 gesetzt ist).

Tabelle 1

Substrat

Olivenöl

Baumvvolisaatöl .
Sesamsaatö! ...
Sojabohr.enöl . . .

Erdnußöl

Rapssaatö!

Schweineschmalz

Rinderfett

Butter

Γ ween 60

i.O

0.90

0.8(1

2.20

0.90

0.''¹O

2,0

1.2

1.2

0.50

Versuchsmethode:
Zubereitung: 24 Volumteiie Wasser 1 Volumteil Substrat 37,5 mg Lipasepulver je 1 g Substrat Bebrütet wurde 10 Stunden lang bei 30 C und pH 7,0.

Die erfindungsgcmäß gewonnene Lipa-e wird von Mctallionen inhibiert, wie dies in der nachfolgenden Tabelle II angezeigt ist:

Tabelle II

Metallen (10 'g lon.'l)

Fe", Fe ", K , Na\ Pb",
Co", Mn", Sn-, Sn"', Ba^:

Zn¹ ', Al" , Ni- \ Mg- '
Cu', Cu' ', Hg

lnhibiemni:

unter 10

K) bis 20 mehr als 20

7 8

In den nachfolgenden Beispielen ist die angegebene 2O⁰C in einer rotierenden Schütteleinrichtung mit Lipase-Aktivität nach folgender Prüfmethode geprüft 300 UpM gezüchtet. Es wurden 75 ml an Kulturworden: filtrat gewonnen, die 11,5 Einheiten/ml an Lipase,

η r .ι. j ι λι· -. ι ο u . . bestimmt mit der Prüfmethode II, entbielten.

Prufmethode I. Olivenöl als Substrat _{5 Zu def filtriertcn Brühe wurde Ätha|lo| bis Zll cincr}

a) Reaktionsgemisch Aikoholkonzentration von 75°/₀ zugegeben, und es Enzym-Lösung 1 ml wurden 3,43 g an rohem Lipasepulvcr gewonnen.

pH 7,0, 0,1 m Phosphatpuffer · 5 ml °ie Potenz dieses Enzympulvers betrug 198 Ein-

Olivenölemulsion 10 ml heiten/g, bestimmt mit der Prüf methode II.

„.. _, ,„,..., , · jju ^l0 Das so gewonnene rohe Lipasepulver zeigte Spuren

Die zuvor erwähnte Olivenolemubion wurde durch _{an Protea} ⁶ _se._Aktj_{vität ncben}' _ei^_er starken Lipasc-

Homogen.sierung eines Gemisches aus 80 ml einer _Aktivität. ,.Amylase-, /J-Amylase- und Lipoprotcin-

²°/o'Sen wäßrigen Losung von Polyvinylalkohol ,ip_ase._Aktivität * _dgl. Udw _nicht festgestellt.

und 20 ml eines Olivenöls (einer fur pharma-

kologische Zwecke in Japan benutzten Qualität) . .

bei 5 bis 10⁰C 10 Minuten lang mit einer Ge- ⁵ B c ι s ρ ι e 1 2

schwindigkeit von 11000 UpM zubereitet. _{Es wurde die jm Bcjspie}, , ,^^^ _Arbeits.

b) Arbeitsweise weise, jedoch ohne Zusatz von Schweineschmalz, Die Reaktion wurde 50 Minuten lang bei 37⁰C wiederholt, und man erhielt 26 g an rohem Lipasedurchgeführt. Danach wurde die Emulsion durch ^ao P^{ulver mit 15 E}'ⁿheiten/g.

plötzliche Zugabe von 30 ml eines Gemisches aus

Äthanol und Aceton (1:1) zerstört. Dann wurde Beispiel 3

mit 0,05 nNaOH in Anwesenheit von Phenol- _ , .._..,

phthalein als Ind.kaior titriert. . .^Es .^wurde.^W1C '^m Beispiel 1 beschrieben gearbeitet.

Es wurde auch eine Kontrollprobe an denaturier- ³⁵ J^{edoch wurd}*^an Stelle von Schweineschmalz Olivenöl

tem Enzym 10 Minuten lang bei 100⁰C erhitzt. verwendet. Dabei wurden 3,01_g an rohem Lipase-

Die Potenz wird gezeigt an Hand der Anzahl von P^ulver gewonnen Die Aktivität des Enzympulvers,

ml, um die sich die Kontrollprobe und die oben- bestimmt nach der Prufmethode I, betrug 109 Em-

erwähnicfi Proben bei der Titration unterscheiden heiten/g.

(wobei 1 ml 1 Einheit anzeigt). ³° B c i s ρ i ε ! 4

Prüfmethode II. Schweineschmalz als Substrat Es wurde wie im Beispiel 1 beschrieben gearbeitet,

jedoch wurde an Stelle von Schweineschmalz Soja-

a) Reaktionsgemisch bohnenöl benutzt. Dabei wurden 3,32 g an rohem

Enzym-Lösung 1 ml ₃₅ Lipasepulver gewonnen. Die Potenz dieses Enzym-

0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) 5 ml pulvere, bestimmt nach der Prüfmethode I, betrug

Schweineschmalzemulsion 10 ml joo Einheiten/g.

Die zuvor erwähnte Schweineschmalzemulsion Beispiel S

wurde durch Homogenisieren eines Gemisches

aus 20 g geschmolzenem Schweineschmalz, 10 ml ₄₀ 20 Liter eines wäßrigen Mediums (pH 6,5), das aus

an Tween 60 und 70 ml Wasser 10 Minuten lang ₂°/₀ Schweineschmalz, 2°/₀ Stärke, 2% entfettetem

mit 11000 UpM zubereitet. Sojabohnenpulver, 0,3°/₀ Ammoniumsulfat. 0,2°/₀

b) Arbeitsweise KH₂PO₄,0,5·/. CaCO₃, 0,1 ·/„ MgSO₄ · 7 H₁O bestand Das in ein L-Rohr eingefüllte Reaktionsgemisch ^{und 5},^ml> ^eines Antischaummittel enthielt wurden in wurde in einem Monod-Schüttler 60 Minuten « ^emc ^*™'* ι Ferrnentierbehalter eingelang bei 40⁰C geschüttelt, danach wurde die ^" ^und. 30 Minuten lang bei 120 C sterilisiert. Der Emulsion durch plötzliche Zugabe von 30 ml Fermentierbehalter hatte ein Fassungsvermögen von eines Äthanol-Aceton-Genusches (1:1) zerstört. 30 Litern. ... „, Danach wurde mit 0,05 η NaOH in Anwesenheit _u ^{1 Lller an} ^"unnedium des genannten Chromovon Phenolphthalein als Indikator titriert. Als 5° bactenum v«cosum var. paralipolyticum, das in dem KontroUprobe wurde 10 Minuten bei 100⁰C ß>^cl(*^en Medium 2 Tage lang bei 26°C gezüchtet erhitztes denaturiertes Enzym verwendet. ^worden war wurde zum Beimpfen dazugegeben, und Die Potenz wird an Hand der Anzahl von ml, J™J™^rde \ TfBe lang bei 26"C unter Belüften mit die als Unterschied zwischen der Kontrollprobe ²⁰¹^"- ^und ^^h^ ^mit ™^U bebrütet. Die und der bei der Titration der Prüf probe verbrauch- 55 gewonnene Kulturbruhe hatte eme Lipase-Akt.yitai ten ml erscheinen, angegeben (wobei 1 ml 1 Ein- von W Emhato/ml. Die: Brühe wurde .η 400 I ar h t nzeiet) stenlisiertem waßngen Medium, das aus dem gleichet

¹ ®~'' Medium wie zuvor angegeben bestand, in einert

B e · s ρ i e 1 1 Fermentations-Behälter aus Edelstahl eingebrach

6o (100 ml an Antischaummittel wurden zugegeben). E:

ml eines wäßrigen Mediums (pH 6,5), das aus wurde 4 Tage lang bei 26 C unter Belüftung mi

2% Schweineschmalz, 2% Stärke, 2% entfettetem 400 l/Min, und Rühren mit 300 UpM gezüchtet, un<

Sojabohnenpulver, 0,3% Ammoniumsulfat, 0,2 ⁰I₀ dabei wurden 2651 an Kulturbrühe erhalten, nnchden

KH₁PO₄, 0,5^e/o CaCO, und 0,1 °/o MgSO₄-7 H₁O zweimal mittels einer Sharples-Zentrifuge zenirifugier

bestand, wurden in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben 65 worden war.

eingebracht, 20 Minuten lang bei 120⁰C sterilisiert, Die Potenz der Brühe betrug, bestimmt nach de

dann mit dem genannten Chromobacterium viscosum Prüfmethode II, 13,0 Einheiten/ml,

var. paralipolyticum beimpft und 4 Tage lang bei Weiterhin wurde dieses Filtrat durch Spruhkonzen

trierung (Verdampfung 25 I/Std., Temperatur 30⁰C) auf 125 I konzentriert. Das so erhaltene Konzentrat wurde bei einer Einlaßtemperatur von 120⁰C und einer Auslaßtemperatur von 70°C sprühgetrocknet, und es wurden 8,1 kg an rohem Lipasepulver erhalten. Dieses zeigte eine Aktivität von 251 Einheiten/g, bestimmt nach der Prüfmethode 11.

Beispiel ό

20 I an flüssigem Medium (pH 6,5), bestehend Aus 2% Schweineschmalz, 2% Stärke, 2% entfettetem Sojabohnenmehl, 0,3% Ammoniumsulfat, 0,2% KH₁PO₄, 0,5% CaCO₃, 0,1% MgSO₄-7H₂O und 5 ml Antischaummittel, wurden in eine 30 Liter fassende Leidener-Flasche als Fermentier-Behälter eingefüllt. Nach 30minutigem Sterilisieren bei 120⁰C wurde zum Beimpfen 1 Liter an wäßriger Kultur des genannten Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum, die 2 Tage lang bei 26°C in dem gleichen Medium fermentiert worden war, beigegeben, und dann wurde 4 Tage lang bei 26"C unter Belüftungsbedingungen von 20 l/Min, und Umrühren mit 300 UpM kultiviert. Die Mycelien wurden abfiltriert, und es wurden 14,8 1 an Filtrat gewonnen, das eine Lipase-Aktivität von 11,4 Einheiten/ml, bestimmt gemäß der Prüfmethode II, hatte.

490 g an Malzdextrin wurden dem Filtrat zugegeben. Danach wurde bei einer Einlaßtemperatur von 120⁰C und einer Auslaßtemperatur von 70"C sprühgetrocknet, und es wurden 927 g an rohem Lipasepulver erhalten. Die Aktivität dieses Enzympulvers betrug 126 Einheiten/g, bestimmt nach der zuvor beschriebenen Prüfmethode.

Beispiel 7

Es wurde wie im Beispiel 6 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde an Stelle von Schweineschmalz Olivenöl verwendet, und dabei wurden 15,61 an Kulturbrühe mit einer Lipase-Potenz von 5,9 Einheiten/ml, bestimmt gemäß der Prüfmethode I, erhalten.

Diese Kulturbrühe wurde unter Verwendung einer schnell konzentrierenden Vorrichtung bei 30⁰C mit einer Verdampfungsgeschwindigkeit von 25 1/Std. konzentriert, und es wurden 7,5 1 an Konzentrat (Lipase-Aktivität 11,0 Einheiten/ml) gewonnen. Dazu wurde Äthanol bis zu 75%iger Konzentration zugegeben, und es wurden 495 g an rohem Lipasepulver daraus erhalten. Die Aktivität dieses Enzympulvers betrug 107 Einheiten/ml, bestimmt nach der gleichen zuvor beschriebenen Prüfmethode.

Beispiel 8

Aceton wurde tropfenweise zu 80 ml des Kulturnitrats, das wie im Beispiel 1 beschrieben gewonnen worden war, (Lipase-Aktivität 11,0 Einheiten/ml, bestimmt nach der zuvor beschriebenen Prüfmethode II) bei 5°C zugegeben, bis die Aceton-Konzentration 30% betrug. Dann wurde durch Zentrifugieren mit 9000 UpM die Ausfällung abgetrennt Die verbliebene überstehende Flüssigkeit wurde in der gleichen Weise wie zuvor beschrieben behandelt, und dabei wurden bei jeweils 60%iger und 80%iger Konzentration an Aceton die Ausfällungen abgetrennt

Diese ausgefällten Produkte, die bei 30-, 60- und 80%iger Aceton-Konzentration isoliert worden waren, wurden mit jeweils entsprechend 30-, 60- und 80%ig konzentriertem Aceton gewaschen, und die Waschlösungen wurden getrennt aufbewahrt.

Die gleiche Arbeitsweise wurde nochmals wiederholt, und dann wurden die Ausfällungen im Vakuum getrocknet.

Die Aktivität und Ausbeute an trockenem Lipasepulver, die dabei erhalten wurden, waren folgende:

Aceton- Konzentration (".'.)	Lipase-Aktivität (Einheit/g)	Ausbeute (g)
30 60 80	15 60 1530	1,03 0,70 0,31

15

Beispiel 9

Es wurde wie im Beispiel 1 beschrieben gearbeitet, jedoch wurde das genannte Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum durch Chromobacteriiim viscosum ATCC 6918 bzw. Chromobacterium viola- *5 ceum ATCC 12472 ausgetauscht, und dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

	Chromobacterium	viscosum	Rohes Lipasepulver I	Einhcitcn/g
3O	ATCC 6918		Ausbeute	3X
	Chromobacterium	violaceum	1.3 g
	ATCC 12472			35
		1,5 g

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Lipase ist verschieden von bekannten Lipasen

und weist eine diesen gegenüber vorteilhaft unterschiedliche Wirkungsweise auf. Gegenüber einer aus der USA.-Patentschrift 3 262 863 bekannten Lipse, produziert unter Verwendung des Mikroorganismus Rhizopus delemar, besteht der Vorteil der erfindungs-

gemäß hergestellten Lipase darin, daß die Anfälligkeit gegen Inhibierung durch Eisen-Ionen wesentlich geringer ist. Die Aktivität der bekannten Lipase wird bereits bei einem Gehalt an Fe++-Ionen von 5,0 ppm vollständig inhibiert, wohingegen die erfindungsgemäß

gewonnene Lipase durch 56 ppm Fe⁺⁺-Ionen nur zu weniger als 10% inhibiert wird. Dies ist ein erheblichei Fortschritt für die Praxis, denn die Einwirkung von Eisen-Ionen fällt infolge der Lagerung und dei Benutzung der Lipase in üblicherweise eisenhaltiger

Gefäßen ins Gewicht.

Gegenüber der aus der schweizerischen Patentschrift 433 162 bekannten Lipase, die mit den Mikroorga nismen Mucor Hiemalis, Mucor Racemosus, Mucoi Mucedor, Rhizopus delemar, Rhizopus arrhizus unt

Mortierella Alpina gewonnen werden kann, weist di< erfindungsgemäß gewonnene Lipase den Vorteil eine wesentlich höheren Wärmebeständigkeit auf.

Der Vorteil der erfindungsgemäß erhaltenen Lipas· gegenüber aus Rhizopus arrhizus var. deicm.tr erhal

tener bekannter Lipase, beschrieben in »Bulletin de L Societe de Chimic Bblogique« Tome XLVIII, Nr. ί S. 747 bis 770, 1966, liegt für die erfindungsgemäi gewonnene Lipase in der «eringeren Anfä!li"kö

gegen Inhibierung durch Metall-Kationen, insbesondere Eisen-Ionen.

Der Vorteil der erfindungsgemäß hergestellten Lipase gegenüber der aus der französischen Patentschrift 1 490 099 bekannten, mittels eines Mikroorganismus der Gattung Pseudomocea gewonnenen Lipase liegt in einer höheren Wärmestabilität und außerdem darin, daß die erfindungsgemälJe Lipase ihren optimalen Wirkungsbereich bei neutralem pH hat, während die bekannte Lipase ihr Wirkungsoptimum im hoch-alkalischen Bereich hat. Dies macht die erfindungsgemäß gewonnene Lipase insbesondere für die Verwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln im neutralen Gebiet vorteilhaft.

Auch gegenüber der aus »Applied Microbiology« 16, S. 617 bis 619, 1968, bekannten Lipase, produziert mittels des Mikroorganismus Mucor pusillus, zeichnet sich die erfindungsgemäß hergestellte Lipase durch bessere Wärmebeständigkeit aus. Beim Erhitzen in Acetat-Puffer (pH 5,5) bei 55"C über eine Zeitspanne bis zu 60 Minuten betrug der Aktivitätsverlust bei der bekannten Lipase rund 38°/₀, während die erfindungs-

gemäß hergestellte Lipase nur 10¹Y_n ihrer Aktivität einbüiJte.

Darüber hinaus ist die erundungsgemäß hergestellte Lipase wegen ihrer Fähigkeit, auch sehmalzhaltigc Substrate verbrauchen zu können, sonstigen bekannten Lipasen technisch überlegen. Dies wird in den nachfolgend beschriebenen Vergleichsuntersuchimgen illustriert.

Es wurden folgende Mikroorganismen für die Durchführung der Versuche verwendet:

1. Candida cylindracea ATCC 14830 (vgl. mit USA.-Patentschrift 3 189 529).

2. Trichosporon heteromorphum ATCC 20001 (vgl mit französischer Patentschrift 1 489 553).

3. Aspergillus luchuensis AHU 7089 (vgl. mit USA.· Patentschrift 2 480 090).

4. a) Aspergillus niger AHU 7015 (vgl. mit USA. _ao Patentschrift 2 888 385, Beispiel ?.).

b) Aspergillus oryzae AHU 7155 (vgl. USA. Patentschrift 2 888 385, Beispiel I und 3).

Für die Versuche wurden folgende Medien eingesetzt:

Medium (A)	Stärke Sojabohnenmehl Ammoniumsulfat MgSO4- 7 Η,Ο K3HPO.	l°/o 2°/„ 0,1 °/o o'.i °/o 0,5 °/o	100 ml. pH 7,0 in 500 ml Schüttelkolben
Medium (B)	Dextrin Maisweichwasser Ammoniumsulfat CaCO3	4°/, so; 3 IO	100 ml, pH 7,0 in 500 ml Schüttelkolben
Medium (C)	(Beispiel 1 der USA.-Patentschrift	3 189 529)

Stärke 2°/₀

Sojabohnenmehl 2°/₀

Ammoniumsulfat 0,1 °/₀

	Kaliumdiphosphat	0.5 °;0	2°/„	l°/o	l°/o	50 ml, pH 7.2 in 500 ml
	Magnesiumsulfat	0,1 °/o	2°/o	2°/o	3 0O	Schüttelkolben
Medium (D)	(Beispiel 2 der USA.-Patentschrift 3 189 529)	o,i °,'o	1%	0,01 °(0
	Xylose	0,1 °o	(Der pH-Wert wurde nicht justiert)	0,2 °/„
	Sojabohnenmehl	0,5 e/o	Schmalz
	Ammoniumsulfat	(Beispiel 1 der französischen Patentschrift 1 489 553)	Baumwollsaat-Rückstand
	Magnesiumsulfat	Sojabohnenöl	MgSO4	50 ml, pH 7,2 in 500 ml
	Kaliumdiphosphat	Sojabohnenrückstand	K2HPO4	Schüttelkolben
Medium (E)	Maisweichwasser
	50 ml, in 500 ml
	Schüttelkolben
Medium (F)
	100 ml in 500 ml
	Schüttelkolben

Die Prüfung der Lipase wurde wie folgt vorgenommen:

Als Prüfungsmethoden für die Lipase-Aktivität wurden die in der Beschreibung angegebenen Arbeitsweisen verwendet, wobei geringfügige Abänderungen erfolgten. Es wurde wie folgt gearbeitet:

Prüfmethode I. Olivenöl als Substrat

a) Reaktionsgemisch

Enzymlösung 1 ml

0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) 2 m!

Olivenölemulsion 5 ml

Die Olivenölemulsion wurde in der Weise hergestellt, daß zunächst ein Polyvinylalkohol-Gcmiscli (18.5 g eines Polyvinylalkohol mit einem mittleren Vernetzungsgrad und 1,5 g eines Polyvinylalcohols mit höherem Vernetzungsgrad) in 1 1 Wasser mechanisch verrührt und 1 Stunde lang auf 75 bis 85"C erhitzt wurde, bis vollständige Lösung erfolgt war. Nach dem Abkühlen wurden 75 ml dieser Polyvinylalkohol-Lösung und 23 g Olivenöl bei 0 bis 5^CC durch 10 Minuten langes Rühren mit UOOOUpM miteinander cmulgiert. Hierzu wurde ein Homogenisator aus Fdelstahl benutzt. Die Emulsion wurde nach lstündicem Stehenlassen an einem kalten Ort benutzt. Die Emulsion kann 1 Tag lang an einem solchen Ort stehen bleiben, ohne daß sie instabil wird.

Der Phosphatpuffer wurde aus 39 ml einer 0,1 m Kaliumdihydrogenphosphal-Lösung und 61 ml einer 0,1 m Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung durch Vermische ; hergestellt, und der pH-Wert wurde unter Verwendung eines Glaselektroden-pH-Meters auf 7,0 eingestellt.

b) Arbeitsweise

Die 2 ml des Phosphatpuffers und die 5 ml der Olivenölemulsion wurden in einem Prüfrohr mit

einem Durchmesser von 24 mm gut miteinander vei mischt und 10 Minuten lan; hei 37⁰C präinkubiert. Die Reaktion wurde 20 Minuten lang bei 37¹C durchgeführt, durch Zugabe des 1 ml der Enzymlösung initiiert und durch Hinzufügen von 15 ml eines Äthanol-Aceton-Gemisches (1:1) beendet.

Die resultierende Lösung wurde mit 0,05 η NaOH in Anwesenheit von Phenolphthalein als Indikator titriert.

Als Kontrolle wurde nach der Zugabe der 15 ml des Äthanol-Aceton-Gemisches (1:1) eine ml Enzyrnlösung beigegeben, und das resultierende Lösuriesgcmisch wurde wie zuvor beschrieben behandelt

Die Differenz der Titrationswerte (Probe-Kontrolle) ist proportional der Enzymmenge in der Größenordnung 1,0 bis 2,0 ml; die Werte sind gut reproduzierbar.

c) Umrechnung der Enzym-Einheit

Entsprechend dem Vorschlag des Internationalen Enzym Komittees definiert man die Enzym-Einheit als diejenige Menge, die 1 |imol an Fettsäuren je Minute freizusetzen vermag.

_N (Titrationswert der Probe) - (Titrationswert der Kontrolle) . ,

Lipase-Aktivitat (Einheit) -■■ -- - - ■■ · 2,5

Menge (g) an Probe in 1 ml

Prüfmethode II. Schweineschmalz als Substrat

a) Reaktionsgemisch

Enzymlösung 1 ml

0,1 ml Phosphatpuffer (pH 7,0) 2 ml

Schweineschmalzemulsion 5 ml

Die Schweineschmalzemulsion wurde in einem Homogenisator aus Edelstahl durch Homogenisieren eines Gemisches aus 20 g durch Γ -wärmen verflüssigter Schmalzschmelze, 20 ml eines nichtionischen Detergenzes (Äthoxylat von sekunderem Alkohol) und 60 ml entsalztem Wasser unter 5 Minuten langem Rühren mit 11000 UpM bei Zimmertemperatur zubereitet.

Diese Emulsion ist 2 Tage lang bei Zimmertemperatur stabil.

b) Arbeitsweise

Es wurde wie zuvor im Zusammenhang mit der Olivenöl-Prüfmethode 1 beschrieben gearbeitet.

Der Tilrationswert ist proportional der Enzymmenge im Bereich von 0,5 bis 3,5 ml und ist gut reproduzierbar.

Es wurden folgende Versuchs-Ergebnisse erhalten: Die zuvor aufgeführten Medien wurden mit den eingangs angegebenen Mikroorganismen beimpft, und es wurde 112 Stunden lang bei 26°C bebrütet.

Nach 40, 64 und 112 Stunden wurde die Lipase-Aktivilät untersucht. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 (ermittelt mit der Prüfmethode 1) aufgeführt.

Bei Untersuchung mit der Prüf methode II (unter Zusatz eines nichtionischen Detergens) zeigten die von Candida cylindracea ATCC 14830, Trichosporon heteromorphum ATCC 20001, Aspergillus Luchuensis AHU 7089, Aspergillus niger AHU 7015 und Aspergillus orycae AHU 7155 gar keine oder nahezu keine Lipase-Aktivitäten. Im Gegensat/dazu war die Lipase-Aktivität des erfindungsgemäß gewonnenen Enzyms stark erhöht.

Diese Ergebnisse verdeutlichen den unterschiedlichen Charakter zwischen dem erfindungsgemäß gewonnenen Enzym und den aus den Entgegenhaltungen bekannten Lipase-Enzymen. Die Bebrütung erfolgte dabei wie nachstehend angegeben:

a) Ein Stamm von Candida cylindracea ATCC 14830 wurde in 1 Liter des Mediums (C) 112 Fanden lang gezüchtet.

b) Ein Stamm von Trichosporon heteromorphum ATCC 20001 wurde in 1 Liter des Mediums (B) (1 °/₀ Dextrin wurde durch 1 % Olivenöl ersetzt) 64 Stunden lang gezüchtet.

c) Ein Stamm Aspergillus luchuensis AHU 7089 wurde in 1 Liter des Mediums (Q 64 Stunden lang gezüchtet.

d) Ein Stamm Aspergillus niger AHU 7015 wurde in 1 Lieter des Mediums (D) 64 Stunden lang gezüchtet.

e) Ein Stamm Aspergillus orycae AHU 7155 wurde in 1 Liter des Mediums (Q 64 Stunden lang gezüchtet.

f) Ein Stamm des genannten Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum wurde in 15Ö Liter des Mediums (F) in dem 250-1-Fernientationsbehälter gezüchtet.

i 932 16

Tabelle

Mikroorganismus Vicdiuni

Lipase-Aktivität (Emlicit'ml) nach Stunden 1 M Stunden I IU Stunden

Candida cylindracea ATCC 14S30

Candida cylindracea ATCC 14830

Candida cylindracea ATCC 14830

Candida c>lindracea ATCC 14830

Candida eylindraeea ATCC 14830

Trichosporon heteromürphum ATCC 20(K)I Trichosporon heteromorphum ATCC 2CKX)I

rrichosporon heteromorphum ATCC 2(XX)I Trichosporon heteromorphum ATCC 20001

TrivJiosporon heteromorphum ATCC 20Ü01 Trichosporon heteromorphum ATCC 20001 Tnchosporon heteromorphum ATCC 20001 Trichosporon heteromorphum ATCC 20001

A- 1° „Schmalz
C
D
F

Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus
Aspergillus

!uchuensis
luchuensis
luchuensis
luchuensis
luchuensis
luchuensis
luchuensis
luchuensis
luchuensis

AHU A HL: AHU AHU AHU AHU AHU AHl: AHU

70S') 7089 7089 70X9 7089 70.S9 70X9 7089 7089

Aspergillus niger AHU 7015

Aspergillus niger AHU 7015

Aspergillus niger AHU 7015

Aspergillus niger AHU 7015

Aspergiüus niger AHU 7015

Aspergillus Oryzae AHU 7155

Aspergillus Oryzae AHU 7155

Aspergillus Oryzae AHU 7155

Aspergillus Oryzae AHU 7155

Aspergillus Oryzae AHU 7155

Chromobaclerium \iseosum var. paralipolyticuir. Chromobacterium viscosum \ar. paralipolyticum

Tabelle

0
0
U
0

	A j	0 Olivenöl) j	„Olivenöl)	0
A	11 ° „ Stärke j	B j	1° „Schmalz	0
ersetzt durch j	11 ° „ Stärke j	F
1°	ersetzt durch !	■ I ° ., Schmalz
	1 c	1LU	0
B	A -	A	0
	1 ° „Schmalz
E -.	B
	- 1° „Schmalz	0
	C	3.5
A	1° „Schmalz	0
	D	0
B '	1 °'o Schmalz	0
	F	0
C	A	0
	B	0
D	C	0
	D	0
	F	0
	A	0
	B	0
	C	0
	D	0
	F	0
	A	0
	F	0
	0
	0
	0
	0
0
0
30

8.5	O
0	O
3.5	20.5
6.5	18
0	O
0	O
5.5
^ -	9.5
Ko	!0.5
O	O
8.0	5.0
O	O
O	O
6.5	O
O	(I
11,5	8.n
O	«
13.0	10.0
O	(I
10.0	3.5
O	O
O	I)
10	itl
7	IO
10.5	10.5
O	O
O	(I
8	10
16	10
14	14
18	Kl
O	O
18.5	10.:
130	220

Fn/yni extrahiert	Ausbeute an	Aktivität (F.inhcit/g).	untersucht nach
aus	Inzym-PuUcr		Prüfmelhode 1
Bebrutungsansalz	in g	Prüf methode 11	(Olivenöl)
a)	2.5	0	430
b)	2.7	0	355
C)	1.8	0	205
d)	1.5	0	187
e)	2.2	0	263
f)	101	59000	12700

Die Extraktion des Enzyms aus den Bebrütungs- und dann wurde CaCI, bis zu einer Konzcntratioi ansätzen erfolgte wie nachstehend angegeben. 6₅ von 3°/₀ zugegeben. Danach wurde Aceton hinzu

Zur Entfernung der Kullurmasse wurde die Kulturbrühe zentrifugiert. Das Filtrat wurde unter vermin-

brühe zentrifugiert. Das Filtrat wurde uer dertem Druck auf '/, des Volumens konzentriert, gefügt, bis eine Acetonkonzentration von 5Ü^Ü'„ er reicht war. Die gebildete Ausfällung wurde dann ab zentrifugiert. Zu der überstehenden Flüssigkeit wurd>

309 637 6

weiter Aceton bis zu einer Konzentration von S0% zugegeben.

Die so gebildete Ausfällung wurde durch Abzentrifugieren gesammelt, in Wasser gelöst, und dann wurde Ammoniumsulfat bis zur 40° _öigen Absättigung zugege-

ben Die Ausfällung wurde gesammelt und mit Äthanol entwässert, und man erhielt das Lipase-Enzym in Form eines weißen bis bräunlichweißen Pulvers.

Die Lipase-Aktivität der so gewonnenen Enzyme ist in der vorstehenden Tabelle 2 illustriert.

Claims (1)

1. Pa;entan»pruch:

   Verfahren 7 ir Herstellung eines En/;, ms Lipase durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in einem Nährmedium. das eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoff-Quelle enthält, bei hierfür üblichen Züchtungsbedingungen und durch Isolierung des Enzyms aus dem Nährmedium. dadurch gekenn zeich π el. daß man ίο als Mikroorganimus Chromobacierium \iscosum var. pa rali pol Vt ic um KO H'\TSl^: K. E N KlN KI Nr. 137 (Hinterlegungsbezciehnung des Fermentation Research Institute. Agency of Industrial Science & Technology. Ministry of International Trade A: Industry. Japan) oder Chromobacierium viscosuin ATCC 691S oder Chromobacierium violaceiim ATCC 12472 einset/t