Sposób wytwarzania lipazy i Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia lipazy.Dotychczas lipaze otrzymywano dzieki mikro¬ organizmom nalezacym do rodzaju Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Mucor, AbsMia, Candida, 5 Torulopis, Berttanomyces, Bacillus, Streptocoecus, Pseudomonus, Clostridium jak równiez dzieki1 in¬ nym, nalezacym do rodzaju Selerotinia.W wyniku wyczerpujacych badan prowadzonych przy uzyciu róznych mikroorganizmów hodowa- 10 nych na podlozach z emulsji oleju roslinnego lub tluszczu zwierzecego, a zwlaszcza smalcu stwier¬ dzono nieoczekiwanie, ze Gramoujemne bakterie wydzielone z wód rzeki przeplywajacej przez miasto Numazu City, kolo Mt. Fuji, Shizuoka-ken, 15 Japonia zmieszany z wrzacym lugiem odpadkowym z fabryk przerabiajacych sardynki wytwarzaja mocna i trwala lipaze.Ponizej podano wlasnosci wyzej wspomnianych bakterii wykorzystywane do celów diagnostycz- 2o nych.Wzrost. Na podstawie mikroskopowych obser¬ wacji stwierdzono, ze dlugosc bakterii wynosi 0,6—1,2 mikronów, przy czym maja one postac malo ruchliwych, niewielkich paleczek nie posia- 25 dajacych zarodników. Powierzchnia kolonii jest okragla, wypukla, szklistawa i lepka. Kolonia miala barwe jasno zóltawo-brazowa i nie wy¬ twarza pigmentu. Jako pozywke do badan stoso^ wano wyciag mannitowo-drozdzowy, wyciag dróz- 30 dzowy z agarem, glukozopepton, pozywke agarowa oraz ekstrakt ziemniaczany z agarem. Stwierdzono, ze kolonia wzrasta na bulionie, na bulionie zmie¬ szanym z agarem, na zelatynie, na cieklym pep¬ tonie i na pozywce ziemniaczanej, ze wzrasta dobrze na bulionie cukrowym z agarem, nato¬ miast na mleku z lakmusem kolonia wzrasta z wytworzeniem kwasu.Wlasnosci fizjologiczne. Stwierdzono, ze opty¬ malny rozwój kolonii osiaga sie przy pH=6,5, w temperaturze 26°C i w srodowisku tlenowym. Ko¬ lonia wzrasta jednak przy pH od 5,5 do 9,0 w temperaturze od 5 do 37 °C i w srodowisku tle¬ nowym. W tescie Grama, w tescie odpornosci na kwasy, w tescie z czerwienia metylowa, w reakcji yoges-Proskane^a uzyskano wynik ujemny.Stwierdzono, ze kolonia nie powoduje tworzenia sie indolu i wodorosiarczku, nie hydrolifcuje skro- ibii, nie koaguluje mleka, nie redukuje blekitu metylenowego i nie zuzywa soli amonowych oraz mocznika, natomiast powoduje tworzenie sie amo¬ niaku i katalozy, redukuje azotan, uplynnia ze¬ latyne, czasami uplynnia kazeine, zuzywa kwas cytrynowy i redukuje lakmus.Wykorzystanie zródel wegla. Badajac zuzycie zródel wegla uzyskano wynik dodatni w przypad¬ ku arabinozy, glukozy, fruktozy, mannozy, galak- tozy, sacharozy, treharozy zas wynik ujemny otrzy¬ mano w przypadku ksylozy, laktozy, maltozy, ra- 80 08480 084 3 finozy, sorbitolu, inozytu, gliceryny, salicyny, inuliny, dekstryny, skrobii i celulozy.W oparciu o znajomosc wlasnosci wykorzysty¬ wanych do celów diagnostycznych zidentyfikowa¬ no i zakwalifikowano bakterie znaleziona do ro¬ dzaju Chromobacterium, poslugujac sie przy tym opracowaniem T. Cowana i K. J. Steela pt. „Ma¬ nual for the Identification of Medical Bacteria", Cambridge Univ. Press, 1965. Porównujac wymie¬ nione wlasnosci z wlasnosciami kultury naleza¬ cej do rodzaju Chromobacterium uzyskanej z A.T.C.C. (American Type Culture Collection) zidentyfikowano bakterie jako bardzo podobna do Chromobacterium viscosum. Stwierdzono, ze za¬ chowanie bakterii rózni sie od zachowania Chro¬ mobacterium viscosum ATCC 6918 w przypadkach podanych w tablicy 1.Tablica 1 Uplynnianie kazeiny Wykorzystanie kwasu cytrynowego Wykorzystanie arabinozy „ laktozy „ rafinozy „ sarbitolu „ dekstryny Bakteria znaleziona + i- + + Chromobacterium viscosum ATCC 6918 + 1 1 ++++ Znaleziona bakteria rózni sie wiec od Chromo¬ bacterium viscosum, jednak z drugiej strony stwierdzono, ze jej zasadnicze wlasnosci wykorzy¬ stywane do celów diagnostycznych, a zwlaszcza charakterystyka kolonii na pewnych pozywkach, wlasnosci fizjologiczne itp. sa zasadniczo podobne do tych wlasnosci Chromobacterium viscosum.Zdecydowano wiec, ze otrzymana bakteria jest odmiana Chromobacterium viscosum i oznaczono ja jako chromobacterium viscosum var. parali- polyticum. Oznaczajac bakterie symbolem „Ko- -Hatsu-Ken-Kin-Ki Nr 137" zlozono ja do depo¬ zytu w Hakko Kenkyusho (Formentation Insti- tute), Kogyo Gijutsuin (Board of Industrial Tech¬ nology), Thusho-Sangyosho (Ministry of Industry and Commerce), Chiba, of Japanese Government.Dalsze badania wykazaly, ze nie tylko wymie¬ niona bakteria lecz równiez bakterie nalezace do Chromobacterium Viscosum ATCC 6918 i chromo¬ bacterium violaceium ATCC 12472 moga wytwa¬ rzac lipaze.Sposób wedlug wynalazku charakteryzuje sie zatem otrzymywaniem lipazy z produktów hodowli wytwarzajacych lipaze bakterii nalezacych do ro¬ dzaju Chromobacterium. Bakterie, które mozna stosowac wykorzystujac sposób wedlug wynalazku, naleza do chromobacterium viscosum var. para- lipolyticum; chromobacterium viscosum ATCC 6918 oraz Chromobacterium violaceum ATCC 12472. Z poprzednich badan wynika, ze kazda inna bakteria nalezaca do rodzaju chromobacterium i zdolna do wytwarzania lipazy moze byc rów¬ niez stosowana wedlug wynalazku. W praktyce, bakteria nalezaca do rodzaju chromobacterium i posiadajaca zdolnosc wytwarzania lipazy jest hodowana wedlug wynalazku na pozywce hodow¬ lanej, jak to juz wyzej wspomniano.Jako zródla pozywki mozna stosowac pozywki zwykle uzywane do tego celu. Jako zródlo wegla mozna stosowac bez zadnych ograniczen kazdy przyswajalny zwiazek wegla, taki jak na przy¬ klad glukoza, sacharoza, laktoza, maltoza, skrobia rozpuszczalna, skrobia zwykla, dekstryna, melasy 30 35 40 50 60 65 i/lub tym podobny. Zródlem azotu moze byc kazdy dostepny zwiazek azotu uzywany zwykle do tych celów, jak na przyklad sproszkowane ziarna sojowe, odtluszczona maczke z ziarna so¬ jowego, maczke z ziarn bawelny, pepton, wyciag z miesa, wyciag drozdzowy, sproszkowane suche drozdze, „cone steep liauor", hydrolizat kazeiny, mocznik, sole amonowe i/lub tym podobne. Jako sole nieorganiczne dodawane do pozywki hodow¬ lanej mozna stosowac sole kwasu fosforowego, takie jak sole magnezowe, wapniowe i potasowe.Oczywiscie do pozywki hodowlanej mozna rów^ niez dodawac rózne substancje organiczne i nie¬ organiczne konieczne do hodowli bakterii, jak równiez do wytwarzania pozadanego enzymu.Stwierdzono, ze dodanie tluszczu i/lub oleju zwierzecego lub roslinnego do pozywki hodowla¬ nej poprawia znacznie wydajnosc otrzymywania lipazy.W tym celu mozna stosowac tluszcze lub oleje zwierzece, takie jak na przyklad smalec, lój, maslo, tran wielorybi olej rybny oraz olej ros¬ linny, taki jak na przyklad olej oliwkowy, olej sojowy, olej z ziarn bawelny, olej sezamowy, olej rzepakowy, olej arachidowy, olej kokoso¬ wy i/lub tym podobny. Ogólnie biorac mozna stosowac te tluszcze i/lub oleje w ilosci od 0,5 do 5% wagowych pozywki hodowlanej. Tluszcze stale, takie jak smalec, lój, maslo itp. topia sie na skutek ogrzewania podczas sterylizacji wstep¬ nej pozywki hodowlanej, w wyniku czego mozna ie rozprowadzic na pozywce hodowlanej, co poz¬ wala na ich efektywne wykorzystanie przez grzyby.Wytwarzanie lipazy sposobem wedlug wynalaz¬ ku mozna realizowac zarówno przy uzyciu po¬ zywek stalych jak i plynnych. Do celów prze¬ myslowych przydatna jest zwlaszcza hodowla na pozywkach plynnych z dobrym napowietrzeniem.Stwierdzono, ze korzystnie mozna prowadzic hodowle w temperaturze 24—28°C, a czas hodow¬ li powinien wynosic od 2 do 6 dni. Niezbedne jest zakonczenie hodowania w czasie, w którym wydajnosc otrzymywanej lipazy osiaga wartosc80 084 maksymalna. Nie stwierdzono zasadniczo zalez¬ nosci od wartosci pH, wiec nie jest rzecza nie¬ zbedna dokladne jego ustalenie. W poczatkowym okresie hodowli bardzo korzystne jest jednak ustalenie wartosci pH = 6—7 lub w poblizu.Wydzielanie i oczyszczanie lipazy mozna pro¬ wadzic znanymi sposobami. Jezeli zastosowano pozywke hodowlana w postaci stalej, wówczas produkty mozna ekstrahowac za pomoca srodków zwykle stosowanych do ekstrakcji, jak na przy¬ klad, woda, w taki sposób, aby otrzymac poza¬ dany ekstrakt. Jezeli natomiast stosuje sie pozywke hodowlana w postaci cieklej, oddziela sie ja zna¬ nymi sposobami, jak na przyklad saczenie pod zmniejszonym cisnieniem lub tez wirowanie.Otrzymany w ten sposób przesacz lub ekstrakt mozna zatezyc lub tez produkty mozna wytracic przez dodanie rozpuszczalnych soli, tak jak sól kuchenna, siarczan amonowy badz mieszajacych sie z woda rozpuszczalników organicznych takich jak etanol, aceton itp., stosowanych zwykle w praktyce. Przesacz lub roztwór zatezony mozna równiez poddac suszeniu rozpylowemu po uprzed¬ nim dodaniu srodka stabilizujacego, takiego jak malto-dekstryna, laktoza, karboksymetyloceluloza, glikol polietylenowy, mleko zbierane, kazeina, sorbitol i/lub tym podobne. Ponadto mozna sto¬ sowac kofilizacje, adsorpcje na wymieniaczach jonowych lub saczenie przez zel. Sposoby te mozna stosowac niezaleznie od siebie lub tez ich kombi¬ nacje. Jako produkt surowy mozna zatem otrzy¬ mac enzym w proszku zawierajacy lipaze.Lipaza otrzymana sposobem wedlug wynalazku jest mocna i trwala. Ponizej opisano wynikii ba¬ dan nad trwaloscia i moca dzialania surowej li- 30 6 pazy w proszku, otrzymanej w sposób opisany w przykladzie I.Stwierdzono, ze aktywnosc lipazy w proszku spada do wartosci nie mniejszej niz 80°/o aktyw¬ nosci poczatkowej w wyniku przebywania lipazy w srodowisku o pH od 4,0 do 9,0 w ciagu 24 go¬ dzin w temperaturze 20°C. Aktywnosc ta wyno¬ sila ponad 70% nawet w granicach pH od 3 do 10.Optimum mocy uzyskano przy pH = 6 do 7 lub niedaleko tej wartosci. Jezeli zalozyc, ze moc surowego produktu przy pH = 7 wynosila 100, to moc ta wynosila 80 przy pH= 41ub9, 70 przy pH = = 10 i 40 przy pH = 3. Trwalosc termiczna bada¬ no oznaczajac aktywnosc po ogrzaniu w tempera¬ turze 37—95°C. W temperaturze nizszej niz 80°C aktywnosc lipazy wyniosla powyzej 90°/o aktyw¬ nosci poczatkowej, zas w temperaturze 90°C wy¬ niosla ona 600/o. Wyniki te oznaczaja duza sta¬ bilnosc termiczna lipazy. Maksimum mocy uzy¬ skano w poblizu temperatury 50°C.Poniewaz lipaza otrzymana sposobem wedlug wynalazku jest bardzo stabilna i mocna nawet w stanie surowym, co stwierdzono badajac pro¬ dukt po wytraceniu alkoholem, przeto lipaze moz¬ na wykorzystac nie tylko jako srodek ulatwiajacy trawienie, lecz równiez jako detergent lub sro¬ dek do sterylizacji, sama lub jako aktywny do¬ datek, co znacznie rozszerza zakres jej stosowal¬ nosci1.W tablicy 2 podano porównawcze zestawienie wyników rozkladajacego dzialania lipazy suro¬ wej w proszku otrzymanej po wytraceniu alko¬ holem, w odniesieniu do róznych olejów i tlu¬ szczów.Podloze Olej oliwkowy Olej z ziarn bawelny Olej z ziarn drzew kauczukodajnych Olej z ziarn sojowych Olej arachidowy Tablica 2 Stopien rozkladu 1.0 0.90 0.86 2.20 0.90 Podloze Olej rzepakowy Smalec Lój Maslo Tween 60 Stopien rozkladu j 0.90 2.0 1.2 1.2 0.50 Uwagi do tablicy: 24 czesci objetosciowe wody zmieszano dokladnie z 1 czescia objetosciowa pod¬ loza, dodano 37,5 mg surowej lipazy w proszku na 1 g podloza i pozostawiono na 10 godzin w temperaturze 30° i przy pH=7.Tablica 3 Jony metali (10--3 gjon/1) Fe++, Fe+ ++, K+, Na+, Pb++, Co++, Mn++, Sn + + , Sn+ + + , Ba++, Ca+ + Zn++, A1+ + + , Ni + +, Mg+ + Cu+, Cu++, Hg+ + Stopien dzia- 1 lania hamu¬ jacego ponizej 10% | 10—20% powyzej 20% Z tablicy 3, w której zebrano wyniki badan wplywu jonów metali na dzialanie lipazy, widac wyraznie, ze rózne jony metali dzialaja hamujaco 65 na aktywnosc lipazy otrzymanej sposobem wedlug wynalazku.Ponizej podano kilka przykladów ulatwiajacych80 084 7 zrozumienie istoty wynalazku. Wartosc miana uzyskanej iipazy oznaczono w sposób opisany ponizej.I sposób oznaczenia miana lipazy, w przypadku, gdy podlozem jest olej oliwkowy.Mieszanina reakcyjna Sklada sie z 1 ml roztwo¬ ru enzymu, 5 ml 0,1 mm buforu fosforanowego, o pH=7 i 10 ml emulsji oleju oliwkowego. Emul¬ sje oleju oliwkowego przyrzadzono mieszajac 80 ml 2°/o wodnego roztworu polialkoholu winy¬ lowego z 20 ml oleju oliwkowego o czystosci far- makopealnej i mieszajac na drodze wirowania z szybkoscia 11000 obr./min. w temperaturze 5—10°C w ci^gu 10 minut w celu zhomogenizo- wania.Reakcje prowadzono w temperaturze okolo 37°C w ciagu 50 minut. Do calkowicie przereagowanej cieczy dodawano 39 ml mieszaniny etanolu z ace¬ tonem w stosunku 1:1, w celu rozbicia emulsji.Nastepnie ciecz miareczkowano 0,05 m roztwo¬ rem NaOH wobec 1% roztworu fenoloftaleiny jako wskaznika. Podobne miareczkowanie przeprowa¬ dzono w przypadku zdenaturowanego enzymu obra¬ bianego wstepnie w temperaturze 100°C w ciagu 10 minut.Od liczby onililitrów NaOH uzyskanych w pierw¬ szym miareczkowaniu odejmowano liczbe milili- trów uzyskanych przy miareczkowaniu enzymu zdenaturowanego. Róznica wyrazona w milili- trach reprezentuje miano lipazy (tak wiec 1 ml oznacza jednostke).II sposób oznaczania miana lipazy, w przy¬ padku gdy podlozem jest smalec.Mieszanina reakcyjna sklada sie z 1 ml roz¬ tworu enzymu, 5 ml 0,1 m roztworu buforu fo¬ sforanowego o pH=7 i 10 ml emulsji smalcu.Emulsje smalcu przyrzadzono dodajac 20 g sto¬ pionego smalcu do 10 ml Tweenu 60 i 70 ml wo¬ dy i mieszajac na drodze wirowania z szybkos¬ cia 10.000 obr./min. w celu zhomogenizowania.Ciekla mieszanine reakcyjna wlewano do pro¬ bówki w ksztalcie litery L, która poddano wibra¬ cji przy uzyciu wytrzasarki Monoda w tempera¬ turze 40QC w ciagu 60 min. Po zakonczeniu reak¬ cji do mieszaniny reakcyjnej dodano 30 ml mie¬ szaniny etanolu z acetonem (1:1) w celu rozbicia emulsji. Nastepnie ciecz miareczkowano 0,05 m roztworem NaOH wobec l°/o roztworu fenolofta¬ leiny jako wskaznika. Podobnie miareczkowano zdenaturowany enzym ogrzany do temperatury 100°C w ciagu 10 minut. Dalej postepowano w sposób opisany powyzej.Przyklad I. W kolbie stozkowej o pojem¬ nosci 500 ml umieszczono 100 ml cieklej pozywki o pH=6,5 zawierajacej 2 2% sproszkowanych i odtluszczonych ziarn so¬ jowych, 0,3°/o siarczanu amonowego, 0,2% KH2P04, 0,5% CaC03, 0,l°/o MgS04-7H20 oraz 192,9°/o wody i sterylizowano para w temperaturze 120°C w ciagu 20 minut. Ciekla pozywke zaszczepiono chromobacterium viscosum var. paralipolyticum i hodowano kolonie w temperaturze 26°C w ciagu 4 dni stale wstrzasajac za pomoca obro¬ towej wytrzasarki o szybkosci 300 obr./min. Grzy- 8 bnie oddzielono od cieklej pozywki i otrzymano 75 ml przesaczu. Aktywnosc lipazy zawartej w przesaczu wyniosla 11,5 jednostki/ml, przy zasto¬ sowaniu poprzednio opisanego drugiego sposobu 5 oznaczania. Do przesaczu dodano etanol w takiej ilosci, aby uzyskac stezenie alkoholu równe 75°/«.W ten sposób otrzymano 3,43 g surowej lipazy w proszku wykazujacej slaba aktywnosc proteazy i nie wykazujacej aktywnosci a-amylazo-, P-amy- io lazo i lipoprotein.Przyklad II. Postepujac zasadniczo w spo¬ sób opisany w przykladzie I, lecz stosujac pozyw¬ ke nie zawierajaca smalcu otrzymano 26 g suro¬ wej lipazy w proszku o mianie równym 15 jed- 15 nostek/g.Przyklad III. Postepujac zasadniczo w spo¬ sób opisany w przykladzie I, lecz zastepujac sma¬ lec olejem oliwkowym otrzymano 3,01 g surowej lipazy w proszku. Miano lipazy oznaczone spo- 20 sobem I wynosilo 109 jednostek/g.Przyklad IV. Postepujac zasadniczo w spo¬ sób opisany w przykladzie I, lecz zastepujac sma¬ lec olejem z ziarn sojowych otrzymano 3,32 g surowej lipazy w proszku. Miano produktu ozna- 5 czone sposobem I wynosilo 100 jednostek/g.Przyklad V. We wstrzasanej kadzi fermen¬ tacyjnej o pojemnosci 30 litrów umieszczono 20 litrów cieklej pozywki o pH=6,5 zawierajacej 2°/t 30 smalcu, 2°/o skrobii, 2°/o sproszkowanych i odtlu¬ szczonych ziarn sojowych, 0,3°/o siarczanu amo¬ nowego, 0,2% KH2P04, 0,5°/o CaC03, 0,l°/o MgS04'7H20 i srodek przeciwpieniacy („Disform CA 220" produkcji Nippon Yushi Co., Ltd.) i ste- 35 rylizowano para w temperaturze 120°C w ciagu 30 minut. Chromobacterium viscosum var. para¬ lipolyticum hodowano oddzielnie na podobnej po¬ zywce w temperaturze 26°C w ciagu 2 dni, a nastepnie 1 litr cieklej kultury przeniesiono w 40 sposób jalowy do kadzi fermentacyjnej ze stery¬ lizowana pozywka, napowietrzanej z szybkoscia 20 litrów/minute ciagle wstrzasanej z szybkoscia 300 obr./min. Hodowle kontynuowano w tempe¬ raturze 26°C w ciagu 2 dni. Otrzymany produkt 45 wykazywal aktywnosc lipazy równa 8,3 jedno¬ stki/ml oznaczona sposobem II.Plynna hodowle, lacznie z 400 litrami plynnej pozywki hodowlanej o tym samym skladzie i ze 100 ml znanego srodka przeciwpieniacego wpro- 50 wadzono w sposób jalowy do wstrzasanej stalo¬ wej kadzi fermentacyjnej sterylizujac para po¬ zywke hodowlana w temperaturze 120°C w ciagu 30 min., napowietrzano z szybkoscia 400 1 powie¬ trza na minute wstrzasajac równoczesnie z szyb- 55 koscia 400 obr./min. w temperaturze 26°C w ciagu 4 dni. Otrzymany produkt saczono dwukrotnie przy uzyciu wirówki typu Stharpless. Otrzymano 265 litrów przesaczu. Aktywnosc lipazy w prze¬ saczu wynosila 13,0 jednostek/ml. Przesacz za- 60 tezano na drodze kondensacji strumieniowej (szyb¬ kosc odparowania wynosila 25 litrów/godz., otrzy¬ mywano produkt o temperaturze 30°C). W ten sposób otrzymano 125 litrów stezonego cieklego produktu o mianie lipazy równym 24,0 jedno- B5 stkom/ml. Produkt nastepnie suszono metoda roz-80 084 9 pylowa. Uzyskano 8,1 kg surowej lipazy w pro¬ szku. Miano proszku, oznaczone sposobem opisa¬ nym powyzej wynosilo 251 jednostek/g.Przyklad VI. We wstrzasanej kadzi fermen¬ tacyjnej o pojemnosci 30 litrów umieszczono 20 5 litrów cieklej pozywki hodowlanej o pH=6,5 za¬ wierajacej 2% smalcu, 2% skrolbii, 2% sproszko¬ wanych i odtluszczonych ziarn sojowych, 0,3°/o siarczanu amonowego, 0,2% KHaFO^ 0,5% CaC03, 0,1% MgS04-7H20 i 5 ml znanego srodka prze- io ciwpieniacego i sterylizowano para w tempera¬ turze 120°C w ci^gu 30 minut 1 litr hodowli plynnej chramobacterium viscosum var. parali- polyticum, hodowanej wstepnie w temperaturze 26°C w ciagu 2 dni na pozywce o podobnym 15 skladzie przeniesiono do wstrzasanej kadzi fer¬ mentacyjnej w atmosferze pozbawionej zarazków i hodowle kontynuowano w temperaturze 26°C w ciagu 4 dni, napowietrzajac z szybkosci^ 20 litrów/minute przy szybkosci wstrzasania 300 20 obr./min. Nastepnie odsaczono grzybnie. Otrzy¬ mano 14,8 litrów przesaczu o aktywnosci lipazy równej 11,4 jednostki/ml oznaczonej sposobem II.Przesacz zmieszano z 490 g maltodekstryny i su¬ szono goracym powietrzem (temperatura powie- 25 trza na wlocie wynosila 120°C, zas na wylocie 70°C). Otrzymano 927 g surowej lipazy w proszku, posiadajacej miano równe 126 jednostkom/g, oznaczone sposobem II.Przyklad VII. Postepujac zasadniczo w spo- 30 sób opisany w przykladzie VI, lecz zastepujac olej oliwkowy smalcem otrzymano 15,6 litrów przesaczu, wykazujacego aktywnosc lipazy, ozna¬ czona sposobem I, równa 5,9 jednostek/ml.Tak otrzymany przesacz zatezano szybko w tern- 85 peraturze 30°C metoda kondensacji strumieniowej przy szybkosci parowania równej 25 litrów/godz.Otrzymano 7,5 litra stezonego roztworu posiada¬ jacego miano równe 11,0 jednostkom/iml. Zatezony roztwór zmieszano z taka iloscia etanolu by uzy- 40 skac stezenie 75% alkoholu. Otrzymano 495 g surowej lipazy w proszku. Miano proszku ozna¬ czone sposobem I wynosilo 107 jednostek/g. 10 Przyklad VIII. 80 ml przesaczu hodowli otrzymanego w przykladzie I (o aktywnosci li¬ pazy równej 11,0 jednostkom/ml oznaczonej spo¬ sobem II) mieszano stopniowo w temperaturze 5°C z taka iloscia acetonu, by jego stezenie wy¬ nioslo 30%. Wytracony osad oddzielono na wi¬ rówce (9000 obr./min.). Ciecz z nad osadu poddano podobnej obróbce i oddzielono wytracony osad przy stezeniu acetonu równym 60% i 80%. Osady otrzymane przy stezeniu acetonu 30%, 60% i 80% przemyto odpowiednio 30%, 60% i 80% roztwo¬ rami wodnymi acetonu i ciecz z przemycia usu¬ wano na wirówce. Operacje powtórzono jeszcze raz, a przemyte osady wysuszono pod zmniej¬ szonym cisnieniem. W tablicy 4 zebrano wyniki uzyskanych wydajnosci suchej lipazy i jej akty¬ wnosci.Przyklad IX. Postepujac zasadniczo w spo¬ sób opisany w przykladzie I, lecz zastepujac chro- mobacterium viscosum var. paralipolyticum chro- mobacterium viscosum ATCC 6018 i Chromobac- terium violaceum ATCC 12472 otrzymano wyniki zamieszczone w tablicy 4.Tablica 4 Stezenie acetonu 30 60 80 Aktywnosc lipazy (jednostki/g) 15 60 1530 Wydajnosc (g) 1.03 0.70 0.31 1 PL PL