DE2702417A1 - Neuer glyko-hydrolasen-inhibitor und dessen herstellung durch kultur eines streptomyces - Google Patents

Neuer glyko-hydrolasen-inhibitor und dessen herstellung durch kultur eines streptomyces

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DE2702417A1
DE2702417A1 DE19772702417 DE2702417A DE2702417A1 DE 2702417 A1 DE2702417 A1 DE 2702417A1 DE 19772702417 DE19772702417 DE 19772702417 DE 2702417 A DE2702417 A DE 2702417A DE 2702417 A1 DE2702417 A1 DE 2702417A1
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culture
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Description

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann - Dr. R. Koenigsberger Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipl.-Ing. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun.
PATENTANWÄLTE
8 MÜNCHEN 2,
PA Dr. Zumstein et al, Brauhausstraße 4, SOOO München 2
■ —-— :— BRAUHAUSSTRASSE 4
TELEFON: SAMMEL NR. 22 53 TELEGRAMME: ZUMPAT TELEX 529979
Case SC. 4-579
RHONE-POULENC INDUSTRIES, Paris / Frankreich
Neuer Glyko-Hydrolasen-Inhibitor und dessen Herstellung durch
Kultur eines Streptomyces
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Glykopeptid, bezeichnet mit der Nummer 31 177 RP, und dessen Verfahren zur Herstellung.
Dieses neue Produkt ist insbesondere interessant als Inhibitor von Glyko-Hydrolasen, wie den Amylasen, den Maltasen oder den Saccharasen und insbesondere von denjenigen des Verdauungstrakts,
709830/ 1031
27Ü2417
Das Glykopeptid 31 177 RP kann durch Kultur eines Mikroorganismus, der der Gattung Streptomyces angehört, und mit Streptomyces calidus DS 26 $20 bezeichnet wird, unter geeigneten Bedingungen erhalten werden. Eine Probe dieses Stamms wurde in dem United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois hinterlegt, wo er unter der Nummer NRRL 814-1 registriert ist. Dieser Stamm ist ab Veröffentlichung der DOS allgemein zugänglich.
Das erfindungsgemäße Glykopeptid 31 177 RP besitzt die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
- es ist in einer Menge von mehr als 1000 g/l in Wasser löslich, wobei sich dessen Löslichkeit rasch in wässrig-alkoholischen und wässrig-acetonischen Lösungen vermindert und auf weniger als 0,1 g/l in wasserfreien Alkoholen, Aceton, Hexan, Äthylacetat, Äther und chlorierten Lösungsmitteln sinkt;
- es ergibt bestimmte Farbreaktionen der Zucker /entweder direkt (Reaktion mit 3,5-Dinitrosalicylsäure) oder nach saurer Hydrolyse (Reaktion mit 3,5-Dinitrosalicylsäure mit Anisaldehyd, mit Naphthoresorcin>mit Anilinphthalat und mit dem Somogyi-Nelson-Reagens)/. Demgegenüber erweist sich die Peptidbestimmung mit dem Folin-Ciocalten-Reagens beim 31 177 RP als negativ, jedoch zeigt die Analyse nach der sauren Hydrolyse hauptsächlich die Anwesenheit von Lysin;
- es enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel.
Seine Elementarzusammensetzung beträgt etwa:
C = 46,2 %, H = 6,05 %, 0 = 46,11 %, N = 1,44 %, S = 0,20 %.
Es wird an porösen Gelen von vernetztem Acrylamid und vernetztem Dextran stark zurückgehalten bzw. gehemmt, wodurch jegliche Bestimmung des Molekulargewichts nach diesen Methoden versagt ist.
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Entsprechend seinem Verhalten bei der Ultrafiltration an Membranen mit kontrollierter Porosität beträgt dessen Molekulargewicht zwischen 10 000 und 20 000.
Die Hydrolyse mit n-Schwefelsäure bei 95°C während 2 Stunden 30 Minuten ergibt in den Hydrolysaten lediglich Lysin, identifiziert durch den Autoanalysator Technicon, und nach Silylierung und Gasphasenchromatographie lediglich Monosaccharide, die im wesentlichen aus Glucose bestehen.
Das Glykopeptid 31 177 RP ist durch die folgenden physikalischen Eigenschaften gekennzeichnet:
- Aussehen: lyophilisiertes weißes Pulver
- Ultraviolettspektrum: Abwesenheit von charakteristischen
Maxima bei 220 bis 400 nm
- InfrarotSpektrum: (Bestimmung an Presslingen im Ge
misch mit KBr).
Dieses Spektrum wird durch die Figur I wiedergegeben, in der an den Abszissen einerseits die Wellenlängen ausgedrückt in Mikron (oberer Maßstab) und andererseits die Wellenzahlen in cm" (unterer Maßstab) und an den Ordinaten die optischen Dichten angegeben sind.
In der Tabelle.I sind die Hauptbanden der Infrarotabsorption von 31 177 RP, ausgedrückt in Wellenzahlen (cm~ )r angegeben.
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27Q24I7
ept 2540 Tabelle I ept 760 m
3470 ept 2350 ept 1335 ept 720 ept
3400 tF 2100 tf (GO2) 1305 f 700 m
3350 ept 1985 tf 1240 F 640 ept
3270 ept 1945 tf 1160 ept 610 ept
3100 ept 1900 tf 1100 ept 580 m
3050 ept 1850 tf 1075 tF 525 f
3000 ept 1760 tf 1030 ept 440 ept
2980 F 1630 tf 935 m 410 ept
2930 ept 1450 m 920 m 370 ept
2900 ept 1410 ept 850 ept
2830 ept 1370 F 785 ept
2780 f 770
tF = sehr"stark
F = stark
m = mittel
f = schwach
tf = sehr schwach
ept = Schulter
Drehwert (Bestimmung an einer 0,4 %-igen Lösung in Wasser)
~° = +149,5 + 2,5°
= +295
= +448
+ 4,0( + 5,5(
Das 31 177 KP, ein sehr wirksamer Inhibitor der Pancreas-oC-Amylase, der die Hyperglykämie und Hyperinsulinämie, die der Einnahme von Stärke folgen, herabsetzt und verzögert, besitzt auch eine bemerkenswerte Antisaccharase- und Antimaltase-Aktivität. Es ist überdies sehr wenig toxisch.
Antienzymatische Aktivität
Die inhibierenden Aktivitäten gegenüber der Pancreas-oC^Amylase^
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der Maltase und der Saccharase wurden in vitro bestimmt:
Inhibierende Aktivität gegenüber Amylase
Die Amylaseaktivität wird gemäß der Methode von Noelting G. und Bernfeld P. /HeIv. Chim. Acta 31, 286 (19481/ in Gegenwart und in Abwesenheit des zu bestimmenden inhibierenden Produkts ermittelt. Sie wird in internationalen Einheiten ausgedrückt. Eine Amylaseeinheit ist die Enzymmenge, die ein Mikroäquivalent der reduzierenden Funktion, bezogen auf Maltose je Minute während der Hydrolyse der OC-1,4-Glucosidbindungen der Stärke freisetzt. Die reduzierenden Funktionen reagieren beim Sieden mit 3,5-Dinitrosalicylsäure unter Ausbildung einer Färbung, die bei 540 m/U gemessen wird. Bei sehr schwachen Enzymmengen erhält man einen linearen Verlauf,der während mehrerer Minuten anhält und durch den Nullpunkt geht. Die Vergleichskurve wird mit Hilfe von Maltose erhalten.
Die inhibierende Aktivität wird in Inhibitoreinheiten (I.E.) ausgedrückt. Die Amylaseinhibitoreinheit entspricht der Produktmenge, die 50 % der zwei Amyleseeinheiten entsprechenden Aktivität inhibiert. Man stellt Mischungen her, die aus 0,5 ml einer Enzymlösung mit vier Amylaseeinheiten je ml und 0,5 ml einer wässrigen Inhibitorlösung bestehen, die 0; 0,100; 0,200; 0,300 und 0,400 /Ug/ml 31 177 KP enthält. Die Mischungen werden bei 35°C hergestellt und während 15 Minuten bei dieser Temperatur gehalten. Die enzymatische Aktivität einer jeden der Mischungen wird darauf gemäß der vorstehenden Technik bestimmt. Aus der Kurve, die man erhält, indem man an den Abszissen die Einheiten der Amylaseaktivität und an den Ordinaten die Inhibitormenge in /Ug/ml aufträgt, leitet man die zu 50 % inhibierende Konzentration ab (CI50 = 0,106 /Ug/ml 31 177 KP). Man überträgt dann die CI50 in inhibierende Einheiten je mg Inhibitor (9430 I.E./mg 31 177 KP).
Anders ausgedrückt, beträgt die Konzentration, die eine 50 %-ige Verminderung der Aktivität der Pancreas-OC-Amylase gegenüber lös-
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licher Stärke zuläßt, gemäß der von der Federation Internationale Pharmnceutique, J. Mond. Phcrm. 3_, 337 (1968) empfohlenen Methode 0,015 mg/1·
Inhibierende Aktivität gegenüber Sacchnrase
Eine Snccharaseinhibitoreinheit (IES) wird definiert durch die Inhibitormenge, die erforderlich ist, um zu 50 % zwei Saccharaseeinheiten zu inhibieren. Eine Snccharaseeinheit (ES) entspricht der Enzymmenge, die während 1 Minute unter den nachstehenden Versuchsbedingungen ein Mikromol Saccharose in 00-Glucose und ß-Fructose spaltet. Die Οζ,-Glucose wird nach der Mutarotation zu ß-Glucose mit dem System Glucoseoxydase und o-Dianisidinperoxydase gemäß der von A. Dahlquist beschriebenen Methode /Methods in Enzymology 8, S.P. Colov/ick, N.O. Kaplan, S. 584, Acad. Press (1963) und Anal. Biochem. 7, 18 (1964)/ bestimmt.
Für die Durchführung der Bestimmung der Antisaccharaseaktivität fügt man zu 0,06 ml Saccharasesuspension (0,165 ES/ml Saccharaseextrakt vom Dünndarm der Ratte, hergestellt nach der von A. Dahlquist beschriebenen Methode /Methods in Enzymology 8, S.P. Colowick, N.O. Kaplan, S. 584, Acad. Press (1963)/, 0,14 ml Inhibitorlösung in einem 0,1 m Natriummaleatpuffer mit einem pH = 6,0 (0-400 mg/1) und beläßt während 30 Minuten bei Raumtemperatur in Kontakt.
Man fügt darauf 0,2 ml einer Lösung von reiner D(+)-Saccharose (Analysenqualität), 0,056 m in 0,1 m-Natriummaleatpuffer mit einem pH = 6,0 und läßt während 1 Stunde in einem Wasserbad von 37°C inkubieren. Man bricht die Inkubation ab, indem man 1,6 ml destilliertes Wasser zufügt und darauf das Milieu während 2 Minuten in ein siedendes Wasserbad bringt. Die Bestimmung der freigesetzten Glucose wird durchgeführt, indem man einen aliquoten Teil von 0,5 ml Milieu entnimmt und 3 ml Glucoseoxydase-Peroxydase-o-Dinnisidin-Reagens einsetzt. Die Färbung entwickelt sich nach einer Stunde bei 37°C und man bestimmt die optische Dichte
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bei 420 nm unter Bezug <?uf eine Blindprobe, die an 0,5 ml 0,1 in Maleatpuffer mit einem pH = 6,0 durchgeführt wurde.
Man bringt die Werte für die optische Dichte, erhalten durch die Färbung, hervorgerufen einerseits durch den Inhibitor und andererseits durch die Saccharase>in Abzug.
Man zeichnet die Kurve auf, die die optische Dichte in Abhängigkeit von der Inhibitorkonzentration im Reaktionsmilieu ergibt.
Die Inhibitorkonzentration, die einer optischen Dichte entsprechend 50 % derjenigen, die man in Abwesenheit des Inhibitors erhält, entspricht, wird als zu 50 % inhibierende Konzentration bezeichnet: CIn0 (mg/1). Für das 31 177 EP findet man eine CI™ = 16 mg/1.
Die Umwandlung dieser Konzentration in Saccharaseinhibitoreinheiten (IES) erfolgt nach der Formel:
1000 IES/mg
CI1-Q x 0,4 χ 200 Die Aktivität von 31 177 RP beträgt somit 0,8 IES/mg.
Inhibierende Aktivität gegenüber Maltese
Eine Maltaseinhibitoreinheit (IEM) ist durch die Inhibitormenge definiert, die erforderlich ist, um zwei Maltaseeinheiten zu 50 % zu inhibieren. Eine Maltaseeinheit (EM) entspricht der Enzymmenge, die während einer Minute unter den nachstehenden Versuchsbedingungen ein Mikromol Maltose in 2 Mikromol OO-Glucose spaltet. Die OO-Glucose wird nach der Mutarotation zu ß-Glucose mit dem System Glucoseoxydase und o-Dianisidinperoxydase gemäß der von A. Dahlquist ^/Methods in Enzymology 8, S.P. Colowick, N.O. Kaplan, S. 584, Acad. Press (1963)7 beschriebenen Methode bestimmt.
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iO
Für die Durchführung der Messung der Antimaltaseriktivität fügt man zu 0,06 ml Maltaser.uspension (0,07 EM/ml Maltaseextrakt vom Dünndarm der Ratte, hergestellt gemäß der von A. Dahlquist beschriebenen Methode /Methods in Enzymology 8, S.P. Colowick, N.O. Kaplan, S. 584, Aced. Press (1%3)yj, 0,14 ml Inhibitorlösung in 0,1 m Natriummnleatpuffer mit einem pH = 6,0 (0-40 mg/l) und beläßt während 30 Minuten bei Raumtemperatur in Kontakt. Man fügt darauf 0,2 ml einer Lösung von reiner D(+)-Maltose, 0,0^6 m in 0,1 m Natriummaleatpnffer mit einem pH = 6,0 und läßt während einer Stunde in einem l/naserbad von 37 CJ inkubieren. Man bricht die Inkubation ab, indem man 1,6 ml destilliertes Wasser zufügt und darauf das Milieu während 2 Minuten in ein siedendes Wasserbad bringt. Die Bestimmung der freigesetzten Glucose wird durchgeführt, indem man einen aliquoten Teil von 0,5 ml des Milieus entnimmt und 3 ml des Glucoseoxydase-Peroxydase-o-Dianisidin-Reagens einsetzt. Nech 1 Stunde bei 37°C entwickelt sich die Färbung und man bestimmt die optische Dichte bei 420 um in Bezug auf eine an 0,5 ml 0,1 m Maleatpuffer mit einem pH = 6,0 durchgeführten Blind probe.
Man bringt von den erhaltenen Werten für die optischen Dichten die einesteils durch den Inhibitor und anderenteils durch die Maltase hervorgerufene Färbung in Abrechnung.
Man zeichnet die Kurve auf, die die optische Dichte in Abhängigkeit der Inhibitorkonzentration in dem Reaktionsmilieu angibt.
Die Inhibitorkonzentration, die einer optischen Dichte entsprechend 50 % derjenigen entspricht, die man in Abwesenheit des Inhibitors erhält, wird als zu 50 % inhibierende Konzentration bezeichnet: CIj-Q (mg/1). Für das 31 177 RP findet man CI^q = 2,5 mg/1.
Die Überführung dieser Konzentration in Inhibitoreinheiten der Maltase (ILM) erfolgt nach der Formel:
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- 9 M
1000 . 0,004 ΤΓΜ/
ΙΕΜ/π16
Die Aktivität von 31 177 RP betrügt somit 2 IEM/mg.
Diese Aktivitäten wurden in vivo bei der Ratte im Hinblick auf die Hyperglykämie bestätigt, die durch Verabreichung entweder von Getreidestärke (2,5 g/kg p.o.) oder von Saccharose (2,5 g/kg p.o.) hervorgerufen wurde. Des 51 177 RP wird auf oralem Weg im Gemisch entweder mit Stärke oder mit Saccharose verabreicht und eine Stunde danach wird von der abdominalen Aorta für die Bestimmung der Glykätnie Blut entnommen.
Die auf die Zufuhr von Stärke erfolgende Hyperglykämie wird^bezogen auf ihren Wert bei Vergleichsratten,bei einor Dosis von 6 mg/kg p.o. zu 50 % herabgesetzt.
Die auf die Zufuhr von Saccharose erfolgende Hyperglykämie wird^ bezogen auf ihren Wert bei Vergleichsratten,zu 50 % bei einer Dosis von 25 mg/kg p.o. herabgesetzt. Die akute Toxizität von 31 177 RP wurde hauptsächlich an Mäusen untersucht, wobei es bei einer Dosis von 1 g/kg i.v. atoxisch ist.
Der Erzeugerorganismus des Amylaseinhibitors 31 177 RP ist ein Streptomycesstamm, der ausgehend von einer Erdprobe isoliert wurde und dem man die Bezeichnung DS 26 320 (NRRL 8141) gegeben hat.
Dieser Organismus, der Eigenschaften besitzt, die es nicht zuließen, daß er als eine bereits beschriebene Species identifiziert wurde, muß als eine neue Species angesehen werden und wurde mit der Bezeichnung Streptomyces calidus DS 26 320 versehen.
Die Isolierung erfolgte, indem man die allgemeine Methode befolgte, die darin besteht, daß man eine geringe Menge Erde in
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sterilem destillierten Wasser in Suspension bringt, die Suspension auf verschiedene Konzentrationen verdünnt und ein geringes Volumen jeder Verdünnung auf der Oberfläche von Petri-Schalen, die ein Gelose-Nährmilieu enthalten, ausbreitet. Nach einer Inkubation von einigen Tagen bei 26 C, die eine Entwicklung der Organismen zuläßt, werden die Kolonien, die man für die Durchführung einer Untersuchung isolieren möchte, entnommen und auf Gelose-Nährmilieus versetzt, um schließlich hieraus üppigere Kulturen zu erhalten.
Streptomyces calidus DS 26 320 bildet ovale Sporen in Form von Zylindern mit abgerundeten Enden und mit den Abmessungen 1,0 bis 1,2 /U /0,5 bis 0,8/U. Er besitzt Sporophoren in Form von Knäueln bzw. Klumpen. Die Sporenketten, die bis zu einem Mehrfachen von "1O Sporen enthalten können, sind locker und gewunden bzw. mehrfach gebogen und sind in der Lage, eine sinusartige bzw. kurvenreiche Form anzunehmen oder sich um ihren endständigen Abschnitt zu krümmen, um einen Schnörkel oder eine sehr weite bzw. breite Windung zu beschreiben. Aufgrund seiner Art der Sporenbildung befindet sich Streptomyces calidus DS 26 320 in dem Abschnitt Retinaculum Apertum der Klassifikation von Pridham.
Streptomyces calidus DS 26 320 entwickelt sich gut bei 26 bis 37°C>etwas gemäßigter, obgleich eindeutig bei 500C^ weniger gut bei 52°C und überhaupt nicht bei 550C. Er besitzt ein versportes Luftmycel von grau-gelblicher oder gelb-gräulicher bis grauer Farbe. Auf sämtlichen seiner Kulturmilieus bildet er ein vegetatives Mycel, das mehr oder weniger dunkelbraun bis braunschwarz ist und meistens durch das Luftmycel verdeckt ist. Er besitzt die Eigenschaft, auf seinen organischen Milieus, insbesondere auf der speziellen Tyrosin-Hefeextrakt-Gelose von Waksman (Melaninbildungsmedium) Melaninpigmente zu bilden und auch Pigmente zu bilden, die in der überwiegenden Anzahl der synthetischen Milieus mit dunkelbrauner bis braun-schwarzer Farbe löslich sind.
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In diesen Kulturen, die bei 26 C durchgeführt werden, besitzt er die folgenden biochemischen Eigenschaften:
Bildung von Melanin: Bildung von H2S: Tyrosinese:
Verflüssigung von Gelatine: Verwertung von Cellulose:
Bildung von Nitriten ausgehend von Nitraten:
Stärkehydrolyse:
Kultur über entrahmter Milch:
positiv positiv positiv positiv positiv
keine bei einer Nitratnährbrühe, positiv bei synthetischen Milieus
positiv
rasche Peptonisierung ohne Koagulation, mäßige Alkalinisierung des pH, der während eines Monats von 6,3 auf 7,3 steigt
Die Kultureigenschaften von Streptomyces calidus DS 26 320 sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Es handelt sich hierbei um Kulturen, die bereits ein gutes Entwicklungsstadium erreicht haben, d.h. von ca. 2 bis 3 Wochen bei 26°C,es sei denn, es ist anders angegeben. Diese Eigenschaften wurden über Gelose-Nähnnilieus und Brühen beobachtet, die üblicherweise zur Bestimmung der morphologischen Eigenschaften von Streptomycesstämmen verwendet werden, wobei die Kulturen über den Gelosemilieus über geneigten Gelosen durchgeführt wurden. Eine bestimmte Anzahl der verwendeten Kulturmilieus wurde nach den Formulierungen hergestellt, die in "The Actinomycetes", S.A. Waksman, Seite 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., USA, 1950 angegeben sind. In diesen Fällen sind sie durch den Buchstaben V/, gefolgt von der Zahl, die ihnen in "The Actinomycetes" zugeteilt ist, gekennzeichnet. Die Bezugnahmen oder Zusammensetzungen der anderen Kulturmilieus sind die folgenden:
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Ref. A - "Hickey and Tresner's Agar" - T.G. Pridham et al., Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 950.
Ref. B - "Bennett's Agar" S.A. V/nksman - The Actinomycetes
Bd. 2, S. 331 Nr. 30, The William and Wilkins Comp., Baltimore 1961.
Ref. C - Formulierung W-23, versetzt mit 2 % Gelose. ·
Ref. D - "Yeast Extract Agar" - T.G. Pridham et al., Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 950.
Ref. E - "Tomato Paste Ontmeal Agar" - T.G. Pridham et al., Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 950.
Ref. F - "Melanin formation medium" - The Actinomycetes, Bd. 2, S. 333, Nr. 4-2, S.A. Waksman - The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961.
Ref. G - W.E. Grundy et al. - Antibiotics and Chem. 2_, 401, 1952.
Ref. H - "Inorganic Salts - Starch Agar" - T.G. Pridham et al., Antibiotics Annual, 1956-1957, S. 951.
Ref. I - Entspricht der Formulierung W-1, in der 3 % Saccharose durch 1,5 % Glucose ersetzt sind.
Ref. J - Entspricht der Formulierung W-1, in der 3 % Saccharose durch 1,5 % Glycerin ersetzt sind.
Ref. K - Entspricht der Formulierung W-18, in der 3 % Saccharose durch 1,5 % Glucose ersetzt sind.
Ref. L - Entspricht der Formulierung W-18, in der Saccharose weggelassen ist und durch teilweise in Flüssigkeit eingetauchte kleine Filterpapierstreifen ersetzt ist.
Ref. M - "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Genf, N.Y., H50 - 18.
Ref. N - "Plain Gelatin" - hergestellt gemäß den Angaben von "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" der Society of American Bacteriologists, Genf, N.Y.,
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- Vr-
Ref. P - Entrahmte Milch in Form von im Handel erhältlichen
Pulver, wieder eingesetzt gemäß den Angaben des Fabrikanten.
Ref. Q - Für die Untersuchung der I^S-Bildung angegebenes Milieu von: H.D. Tresner und F. Danga - Journal of Bacteriology, 76, 239-244, 1958.
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Tabelle II
CD CO 00 CO O
Kultur Grad der vegetatives Mycel an der Luft befind lösliches biochemische Be I
milieu Entwick oder Unterseite liche Organe (enthal Pigment obachtungen und
lung der Kultur tend das gesamte Luft- Eigenschaften
mycel und die Sporulntion)
Gelose gut Unterseite dunkel weiß-gräulich bis grau, braun ovale Sporen in
von braun bis braun durchschnittlich ent schwarz zylindrischer An
Hickey schwarz wickelt ordnung mit abge
und rundeten Enden und
Tresner den Abmessungen
(Ref.A) 1,0 bis 1,2/0,5
bis 0,8/U. Sporo-
phoren In Form von
Knäueln, gewundene
Sporenketten, die
eine kurvenreiche
Form annehmen kön
nen oder an ihrem
äußeren Ende ge
krümmt sein können,
um eine sehr brei
te Biegung oder
Windung zu bilden
Gelose gut sehr dunkelbrsun- weiß-gräulich bis grau, braun
von
\j ^\ w% *0% f^ ■·» 4» ■		 orange Unterseite gut entwickelt schwarz
uennecυ
(Ref.B) ί
Gelose gut sehr dunkelbraun- hell-gelb-gräulich bis dunkel
von orange Unterseite grau, durchschnittlich braun-
I Emerson entwickelt orange K)
(Ref.C) : O
Hefeex- gut schwarze Unterseite hell-grau-gelblich bis schwarz,
trakt-
Gelose ] 		grau, ziemlich gut ent
wickelt		 üppig
von PrioV
ham I
(Ref.D) ;
Tabelle II (Fortsetzung)
CD OO <*> CD
Kultur j Grad der - mäßig vegetatives Mycel an der Luft befind lösliches biochemische Be Auflösung von K>
milieu j Entwick- oder Unterseite liche Organe (enthal Pigment obachtungen und Malat: positiv,
I lung der Kultur tend das gesamte Luft- Eigenschaften ziemlich gut O
mäßig mycel und die Süorulation) NJ
mm*
Hafermehl- J gut schwarze Unterseite hellgräulich bis grau, schwarz,
und Toma- J durch zahlreiche Ausschwitzungs- üppig
tenextraki schnitt tröpfchen, gelb-braun, gut
Gelose voi lich entwickelt
Pridham
(Ref.E)
Glucose- braun-schwarze hell-grau-gelblich bis braun
Pepton-
f*X.^ Π f\ ο a 		Unterseite grau, mäßig entwickelt schwarz
uc-Lose
(W-7)		 mäßig
Nährgelo- braun-gelbe Unter weißlich, spärlich ent braun-
se (W-5) seite wickelt gelb
Tyrosin braun-schwarze sehr hellgräulich, mäßig schwarz k
Bildung von Mela- ;
Hefe ex- Unterseite entwickelt nin: positiv j
trakt-Ge- - mäßig (durchgeführte Ab
Iose für lesungen gemäß den
die MeIa- Empfehlungen des
ninbildg. Autors) j
(Ref.F) I
*
Calcium- helle braun-gelb weiß-gräulich bis grau, grau-
malat-Ge- liche Unterseite mäßig entwickelt bräunlich
lose von
Krainsky J
(Ref.G) j
Osralbumin dunkelbraune Unter hellgräulich, mäßig ent braun-
Gelose seite wickelt schwärz
(W-12) lich
Tabelle II (FortsetzunfO
Kultur Grad der vegetatives Mycel an der Luft befind lösliches biochemische Be
milieu Entwick oder Unterseite liche Organe (enthal Pigment obachtungen und
lung der Kultur tend das gesamte Luft- Eigenschaften
mycel und die Snorulation)
Glucose- ziemlich braun-orange Unter hell-grau-gelblich bis dunkel
Aspara- gut seite grau, ziemlich gut ent braun-
gin-Gelo- wickelt orange
se (W-2)
Glycerin- gut sehr dunkle braun weiß-gräulich bis grau, braun
Aspara- orange Unterseite, ziemlich gut entwickelt schwarz
gin-Gelo- die auf braun
se (W 3) schwarz zuläuft
Stärke- gut braun-gelbe Unter weiß-gräulich bis grau, ziemlich Stärkehydrolyse:
Mineral- seite gut entwickelt dunkles positiv, gut.
salze-Ge- grau-braun C-rale Sporen in
lose von zylindrischer An
Pridham ordnung mit abge
(Ref.H) rundeten Enden und
den Abmessungen
1,0 bis 1,2/0,5
bis 0,8/U.
Sporophoren in Fore
von Knäueln, gewun
dene Sporenketten,
die eine kurven
reiche Form anneh
men können oder ?.n
ihrem äußeren Ende
gekrümmt sein kön
nen, um eine sehr
weite Biegung oder
Windung zu bilden
Stärke- ziemlich braun-gelbe Unter weiß-gräulich bis grau, braun- Stärkehydrolyse:
Nitrat- :
Gelose |		 gut seite durchschnittlich entwickelt gelb positiv, mäßig
(W-IO)
Tabelle II (Fortsetzung)
Kultur Grad der k gut vegetatives Hycel
milieu Entwick (v.M.) oder Unter
lung seite der Kultur
syntheti sehr helle gelb-bräun
sche spärlich mäßig liche Unterseite
Saccharo
se-Gelose
von Czape
(W-1 ) sehr gut
syntheti gut braun-schwarz e
sche GIu- Unterseite
cose-Ge-
lose von
Czapek
(Ref.I)
syntheti gut braun-schwarze
sche GIy- Unterseite
cerin-
Gelose
von Czap<
(Ref.J)
Stärke- dichter Schleier,
Nitrat- dunkelbraune Unter
Brühe seite
(w-19)
Glucose- dunkelbrauner
Brühe voi Schleier
Czapek
(Ref.K)
Cellulo- dunkelbraunes v.M.
se-Brühe
von
Czapek
(Ref.L)
an der Luft befindliche Organe (enthaltend das gesamte Luftnycel und die Suorulation)
lösliches Pigment
biochemische Beobachtungen und Eigenschaften
CD CD OO CjJ
hell-gräulich, sehr spärlich entwickelt, beinahe in Form von Spuren
hellgräulich bis hell-grau gelblich, mäßig entwickelt
keines
braunschwarz
hellgräulich bis hell-grau gelblich, mäßig entwickelt
braunschwarz
weiß-gräulich, gut entwickelt
hellgräulich, üppig auf Papier, das aus der Brühe herausragt
braun
braun
dunkelbraun
Bildung von Nitriten: positiv
Bildung von Nitriten: positiv
Verwertung von Cellulose: positiv Bildung von Nitriten: positiv
Tabelle II (Fortsetzung)
CD CjD OD UJ O
Kultur Grad der vegetatives Mycel an der Luft befind lösliches biochemische Be t
milieu Entwick (v.M.) oder Unter liche Organe (enthal Pigment obachtungen und
lung seite der Kultur tend das gesamte Luft- Cl-P.) Eigenschaften
mycel und die Sporulation)
Nitrat ziemlich sehr dichter weiß-gräulich, ziemlich dunkel Bildung von Nitri
nährbrühe gut Schleier, dunkel gut entwickelt braun ten: negativ
(Ref. M) braune Unterseite
Kultur gut dichtes und gefalte weiß-gräulich bis hell schwarz schwarzes l.P.,
über Kar tes, dunkles braun- gelb-gräulich, gut ent das sich in der
toffeln graues v.M. wickelt Kartoffel nach 24
(W-27) Stunden Inkubation
ausbreitet C
4
um
12 % rein« gut auf der Oberfläche weiß-gräulich, .mäßig sehr dun Gelatineverflüssi
Gelatine gut entwickelte Kul entwickelt kelbraun gung: positiv, gut
(Ref. N) tur, sehr dunkel
braune Unterseite
entrahmte gut braun-gelber Ring keine dunkel keine Koagulation,
Milch braun rasche Peptonisie-
(Ref. P) rung. Der pH ver
ändert sich inner
halb eines Monats
von 6,3 zu 7,3
Gelose
von Tres-		 mäßig braun-schwärzlich keine schwarz H^S-Bildung: posi
tiv (durchge
ner und führte Ablesungen
Danga entsprechend den
(Ref. Q) Empfehlungen des
Autors)
Zusätzlich von seiner Besonderheit, sich bei 5O0C zu entwickeln, besitzt Streptomyces calidus DS 26 520 eine Kombination von Eigenschaften, die in keiner V/eise mit irgendeiner derjenigen von bereits beschriebenen Stämmen zusammenfällt und aus diesem Grunde muß man ihn als eine neue Species ansehen.
Berücksichtigt man die Species, deren Beschreibung in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7· Ausgabe, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957) sowie in "The Actinomycetes" (Band 2, S.A. Waksmsn, The William and V/ilkins Company, Baltimore, 1961) zu finden ist, so ist die Species Streptomyces phaeochromogenes diejenige, die am ehesten in Beziehung zu bringen ist mit Streptomyces calidus DS 26 320, der auf organischen Milieus Melaninpigmente bildet, ebenso wie er auf der überwiegenden Anz.ahl synthetischer Milieus lösliche Pigmente von brauner bis braun-schwarzer Farbe bildet, meistens auf seinen Kulturmilieus ein braunes bis braun-schwarzes vegetatives Mycel bildet, insbesondere auf der Kartoffel, gleichzeitig mit einer üppigen Bildung von schwarzem löslichen Pigment zu einem dunkelbraun-grauen vegetativen Mycel führt und ein grau-gelbliches oder gelb-gräuliches, das in älteren Kulturen zuweilen graugelb-bräunlich wird, bis graues Luftmycel bildet. Es muß indessen hierbei jedoch insofern unterschieden werden, als nämlich einesteils S. phaeochromogenes sphärische Sporen oder Sporen in Form von kurzen Stäbchen bildet und seine Sporenketten in der Lage sind, Spiralen zu beschreiben, während S. calidus DS 26 520 ovale Sporen in zylindrischer Anordnung mit abgerundeten Enden bildet, jedoch niemals sphärische Sporen und das Aussehen seiner Sporenketten demjenigen der Stämme der Reihe Retinaculum Apertum von Pridham entspricht. Anderenteils bildet S. phaeochromogenes auf Gelose-Nährmilieus ein dunkel-braun-rotes lösliches Pigment, bildet kein Luftmycel auf der Kartoffel und ergibt auf synthetischer Nitrat-Saccharose-Gelose eine gute Entwicklung, die sich in einem braunen bis nahezu schwarzen vegetativen Mycel .,einem üppigen weißen Luftmycel mit einer bräunlichen Nuance sowie in der Bildung eines braunen löslichen Pigments äußert, während
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S. calidus DS 26 320 auf Gelose-Nährmilieus o.i.n braun-gelbes lösliches Pigment bildet, auf der Kartoffel oin gut entwickeltes weiß-gräuliches bis hell-gelb-gräuliches l.uftmycel bildet und auf synthetischer Nitrat-Saccharose-Gelorw; von Czapek, auf der er sich nur sehr spärlich entwickelt, kein lösliches Pigment bildet.
Die Fähigkeit von Streptomyces calidus DS 267;.'Ό_, verschiedene Kohlenstoff- oder Stick stoffquellen zu verwerten, um dessen Entwicklung sicherzustellen, wurde nach dem Prinzip der Methode von Pridhara und Gottlieb bestimmt (J. of Bact. %, 107-114, 19^8). Der Entwicklungsgrad wurde auf dem von den Autoren angegebenen Grundmilieu beobachtet, wobei man entweder die Glucose durch die jeweils untersuchten verschiedenen Kohlenstoffquellen oder SO^CNH^^ durch die jeweils untersuchten verschiedenen Stickstoffquellen ersetzte. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle angegeben.
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Tabelle III
untersuchte
Kohlenstoff
quellen		 Verwertung untersuchte
Stickstoff
quellen		 Verwertung negativ positiv negativ positiv negativ positiv negativ
D-Ribose positiv NOxNa positiv positiv positiv negativ positiv
D-Xylose positiv NO2Na positiv positiv positiv positiv
L-Arabinose positiv SO4(NH^)2 positiv positiv positiv
L-Rhamnose positiv,
langsam		 PO4H(NH^)2 positiv positiv
D-Glucose positiv Adenin positiv positiv
D-Golactose positiv Adenosin positiv positiv
D-Fructose positiv Uracil
D-Mennose positiv Harnstoff
L-Sorbose negativ L-Asparagin
Lactose positiv,
langsam		 Glykokoll
Maltose positiv Sarkosin
Saccharose negativ DL-Alanin
Trehalose positiv DL-Valin
Cellobiose positiv DL-Asparaginsäure
Raffinose negativ L-Glutaminsäure
Dextrin positiv L-Arginin
Inulin negativ L-Lysin
Stärke positiv DL-Threonin
Cellulose positiv DL-Methionin
Glykogen positiv Taurin
Glycerin positiv L-Tyrosin
Erythrit negativ DL-Prolin
Adonit negativ L-Histidin
Dulcit negativ L-Tryptophan
D-Mannit positiv Betain
D-Sorbit negativ
Inosit negativ
Salicin negativ
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Das Verfahren zur Herstellung des Glykohydrolascninhibitors 51 177 RP besteht im wesentlichen darin, Streptomyces calidus DS 26 320 oder dessen Mutantenbildner über einem Milieu unter für die Kultur von Streptorayces geeigneten Bedingungen zu kultivieren und darauf den während der Kultur gebildeten Glykohydrolaseninhibitor abzutrennen.
Die Kultur von Streptomyces calidus DS 26 320 kann nach jeder Methode für die aerobe Kultur auf der Oberfläche oder in der Tiefe durchgeführt werden, jedoch ist die letztere aus Gründen der Einfachheit zu bevorzugen. Zu diesem Zweck verwendet man verschiedene Apparatur- bzw. Vorrichtungstypen, die derzeit üblicherweise in der Fermentationsindustrie verwendet werden.
Insbesondere kann man die folgende Abfolge für die Durchführung der Arbeitsgänge verwenden:
Streptomyces calidus DS 26 320 Kultur auf Gelose Kultur in einem bewegten Flaschen
ν Inoculum-Kultur in einem Fermentator
Produktionskultur in einem Fermentator
Das Fermentationsmilieu soll hauptsächlich assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, mineralische Elemente und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren und Verdickungsmittel enthalten, wobei alle diese Elemente in Form von gut definierten Produkten oder durch komplexe Mischungen eingebracht werden können, der Art, wie man sie bei biologischen Produkten verschiedenartigen Ursprungs antrifft.
Als assimilierbare Kohlenstoffquellen kann man Kohlenhydrate, wie Glucose, Invertzucker, Lactose, Dextrine, Stärke, Cellulose oder andere Kohlenstoff enthaltende Substanzen, wie die Zucker-
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alkohole, wie Glycerin oder Mannit oder wie bestimmte organische Säuren: Citronensäure, Milchsäure, Weinsäure ... verwenden. Bestimmte tierische oder pflanzliche öle, wie Specköl oder Sojaöl können in vorteilhafter Weise diese verschiedenen Kohlenstoffquellen ersetzen oder diesen beigefügt werden. Als besonders vorteilhafte Kohlenstoffquellen können Glucose und Glycerin verwendet werden.
Geeignete assimilierbare Stickstoffquellen sind außerordentlich verschieden. Sie können sehr einfache chemische Substanzen, wie die Nitrate, die Mineralsalze und organischen Ammoniumsalze, Harnstoff und die Aminosäuren sein. Sie können auch durch komplexe Substanzen eingebracht werden, die Stickstoff hauptsächlich in protidischer Form enthalten: Kasein, Lactalbumin, Gluten und deren Hydrolysate, Sojamehl, Erdnußmehl, Fischmehl, Fleischextrakte, liefeextrakte,"Distillers solubles", "Corn steep". Als besonders geeignete Stickstoffquellen können die Kaseinhydrolysate verwendet werden.
Unter den zugefügten mineralischen Elementen können bestimmte eine Pufferwirkung besitzen oder neutralisierend wirken, wie die Alkali- oder Erdalkaliphosphate oder die Calcium- und Magnesiumcarbonate. Andere führen zu dem für die Entwicklung von Streptomyces calidus DS 26 320 und für die Ausbildung des Glykohydrolaseninhibitors erforderlichen ionischen Gleichgewicht wie die Alkali- und Erdalkalichloride und -sulfate. Schließlich wirken bestimmte in besonders spezieller Weise als Aktivatoren für die metabolischen Reaktionen von Streptomyces calidus DS 26 320, wobei es sich hierbei um Eisen- und Kobaltsalze handelt.
Als besonders günstige Mineralsalze können die Eisen- oder Kobaltsalze verwendet werden.
Die Wachstumsfaktoren sind Produkte von vitaminischer Natur, wie das Riboflavin, die Folsäure und die Pantothensäure.
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Unter den Verdickungsmittel nind die am üblichsten verwendeten Stärke, Carboxymethylcellulose und Gelose.
Der pH des Ausgangsfermentationsrailieus soll zwischen 6,0 und 7,8, vorzugsweise zwischen 6,4 und 7>6 gehalten werden. Die für die Fermentation optimale Temperatur liegt zwischen 25 und 32°C, jedoch wird eine zufriedenstellende Produktion bei Temperaturen zwischen 23 und 35 G erhalten. Die Luftzufuhr für die Fermentation kann zwischen sehr breiten Bereichen variieren. Dementsprechend hat man gefunden, daß Luftzufuhren von 0,3 bis 2 1 Luft je Liter Brühe und je Hinute besonders gut geeignet sind. Die maximale Ausbeute an Glykohydrolaseninhibitor wird nach einer Kultur von 23 Stunden bis 5 Tagen erhalten, wobei diese Zeit im wesentlichen von dem verwendeten Milieu abhängt.
Aus dem vorstehenden ist zu schließen, daß die allgemeinen Bedingungen für die Kultur von Streptomyces calidus DS 26 320 zur Bildung von 31 177 RP in großem Ausmaß variieren können und jeden besonderen Anforderungen angepaßt werden können.
Das 31 ^77 RP kann aus den Fermentationsbrühen auf die folgende Weise isoliert werden:
Man kann den mikrobischen Bestandteil durch Zentrifugation oder durch Filtration bei einem pH vorzugsweise zwischen 6,0 und 7,0 abtrennen, anschließend das erhaltene Filtrat auf ein Volumen einengen, das zwischen einem Viertel und einem Sechstel des Anfangsvolumens beträgt, das Konzentrat gegen destilliertes Wasser dialysieren und in der Kälte ein schlechtes Lösungsmittel, wie Isopropanol, hinzufügen, um die Ausfällung des Rohprodukts zu bewirken.
Das Rohprodukt kann nach den folgenden Methoden gereinigt werden:
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ty
Fraktionierte Ausfällung mit Hilfe von schlechten Lösungsmitteln für das 31 177 IiP, wie die Alkohole, vorzugsweise Isopropnnol oder die mit Wasser mischbaren Ketone, vorzugsweise Aceton.
Die Dialyse gegen eine Membran, vorzugsweise eine Membran aus regenerierter Cellulose, gegen Wasser, um die Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen.
Die Chromatographie von wässrigen Lösungen des 31 177 RP an verschiedenen Adsorptionsmitteln, wie die Aluminiumoxide, die Ionenaustauscher mit basischen Funktionen, vorzugsweise die D.E.A.E. Cellulose und die mokrovernetzten Gele, vorzugsweise mit Polyamidstruktur.
Im Verlauf der Ißolierungs- und Reinigungsoperationen werden
die verschiedenen Bestimmungen, die zur Bewertung des Produktgehalts an Inhibitor 31 177 RP notwendig sind, durchgeführt durch Übertragung der Methode von lioelting G. und Bernfeld P. [HeIv. Chira.Acta 31, 286 (1948)] auf dem automatischen Apparat, mit d-er Abänderung, daß die Inkubationsteinperatur 3O°C beträgt und die gebildeten Zucker durch Reduktion mit Ferri-ferricyamid festgestellt werden.
Der Titer, ausgedrückt in E/mg, wird durch Vergleich mit der Inhibierung, die mithilfe eines teilweise gereinigten Produkts mit einem Gehalt von etwa 1000 iE/mg erhalten wird, berechnet.
Im Verlauf der Isolierungs- und Reinigungsoperationen kann der Produktgehalt an Inhibitor 31 ^77 RP aufgrund seiner inhibierenden Aktivität gegenüber Schweine-Pankreas-a-Amylase unter Verwendung der durch die Federation Internationale de Pharmacie, «J. Mond. Phann. _3_, 337 (1968) definierten Einheiten und gegebenenfalls aufgrund seines Drehvermögens bestimmt werden.
Das folgende Beispiel erläutert, wie die Erfindung in die Praxis umgesetzt werden kann.
Beispiel
A) - Fermentation Man beschickt einen I70 1-Fermentator mit:
7 Π 9 8 3 Ü / 1 0 3 1
Pepton ^" 120Og Hefeextrakt 600 g
Glucosemonohydrat 1200 g Gelose 240 g
Leitungswasser ausreichend zur Erzielung von 110
Der pH wird mit 70 cirr 10 η Natronlauge auf 7,3 eingestellt. Man sterilisiert das Milieu durch Einleiten von Wasserdampf während 40 Minuten bei 122°C. Nach dem Abkühlen beträgt aufgrund der Kondensation des Wasserdampfs während der Sterilisation das Volumen der Brühe 120 1 und der pH liegt bei 6,65. Man setzt 200 cnr einer Streptomyccn calidus DS 26 320 Kultur in einem bewegten Erlenmeyer-Kolben pn. Die Kultur wird während 23 Stunden unter Bewegen bei 300C und unter Zufuhr von steriler Luft entwickelt. Sie ist dann für das Ansetzen der Produktionskultur geeignet.
Die Produktionskultur wird in einem 800 1 Fermentator durchgeführt, der mit den folgenden Substanzen beschickt wird:
"Distillers solubles" Bohnenkörner
Glucosemonohydrat
Sojaöl
Natriumchlorid
Magnesiumsulfat
Lösung von Kobaltchloridhexahydrat (20 g/l)
Leitungswasser q.s. für
Die Bohnen werden während 30 Minuten bei 1220C in 300 1 Wasser vorgekocht und nach dem Abkühlen fügt man die anderen Ausgangsmaterialien zu. Man stellt den pH durch Zugabe von 350 cm 10 η Natronlauge auf 7,5 ein und sterilisiert dann die Brühe durch Einleiten von Wasserdampf während 40 Minuten bei 122°C. Nach dem Abkühlen beträgt aufgrund der Kondensation des Wasserdampfs während der Sterilisation das Volumen der Brühe 400 1 und der pH des Milieus beträgt 6,6. Man setzt 40 1 der vorstehend beschriebenen Inoculum-Kultur in einem 170 1-Fermentator
2 kg
16 kg
2 kg
4 1
2 kg
800 6
o, 4 1
370 1
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an. Die Kultur wird während 100 Stunden unter Rühren mit einer sich mit 205 Upm drehenden Turbine bei 26°C und unter Zufuhr eines Volumens an steriler Luft von 20 m'/Sfd. entwickelt. Am Ende des Verfahrens beträgt der pH der Kultur 6,3 und das Volumen der Brühe 4-20 1. Die enzymatische Aktivität (die Inhibierung der Amylose) der Brühe beträgt 2 700 E/cm .
B) - Extraktion
Man filtriert 4-20 1 der unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen hergestellten Brühe, deren enzymatische Aktivität (Inhibierung von Amylase) 2700 E/cm beträgt, über eine Filterpresse mit Hilfe von 30 kg Filtrationshilfe. Man erhält so 400 1 Filtrnt.
200 1 des erhaltenen Filtrats werden unter vermindertem Druck bei 35°C bis auf ein Volumen von 40 1 eingeengt.
Das Konzentrat, dessen pH durch Zugabe von Salzsäure (50 cnr 6 η Säure) auf 6,5 eingestellt wird, wird abgekühlt, anschliessend während 12 Stunden durch Zirkulation in einem geschlossenen
Strom in einem Plattendiolysator, der mit einer Membran
ρ "Cuprophane" mit einer Oberfläche von 1 m versehen ist, dialysiert und mit auf 4°C abgekühltem destillierten Wasser versetzt. Das Endvolumen beträgt 4-5 1. Man fügt zu dem Konzentrat 45 1 auf -100C abgekühltes Isopropanol. Der sich bildende Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und anschließend werden 68 1 auf -100C abgekühltes Isopropanol dem überstehenden Teil zugefügt. Der erhaltene Niederschlag wird durch Zentrifugieren isoliert und in 4 1 auf 40C abgekühltem destillierten Wasser aufgenommen. Der pH der Lösung beträgt 6,5· Diese Lösung wird lyophilisiert und man isoliert auf diese Weise 682 g 31 177 RP, dessen enzymatische Aktivität 540 E/mg beträgt.
C) Reinigung - Phase 1
500 g des unter den vorstehenden Bedingungen mit Hilfe von Isopropanol ausgefällten Produkts mit einem Titer von 5^-0 E/mg werden in 10 1 destilliertem Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird durch Filtration geklärt und anschließend über eine
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_ ZtfV _
So
Aluminiumoxidkolonne mit einem Durchmesser von 15 cm und einer Höhe von 60 cm unter Verwendung von pH = 4- Salzsäure in cn. 5 Wasser als Lösungsmittel geleitet. Wenn die Lösung durchgeleitet ist, cetzt man das Eluieren mit destilliertem Wasser fort (ca. 11 1).
Die Elutionsgeschviindigkeit wird mit einer Pumpe von 500 cm pro Stunde geregelt und die optische Dichte der Eluate wird bei 254 nm mit einem Analysator kontinuierlich bestimmt. Die
"Z
Eluate werden in Form von 60 cnr Fraktionen gesammelt und man bestimmt den Drehwert für die Natrium-D-Linie der Fraktionen, die bei 25^ nm absorbieren. Die vorliegende Figur 2 zeigt in Form von relativen Werten die UV-Absorption und den Drehwert der Eluate. Die Fraktionen, die aufgrund des polarisierten Lichts den Wirkstoff enthalten, werden gesammelt (ca. 3,5 1), konzentriert und dann lyophilisiert.
Man erhält so 101,2 g mit einem Titer von 1350 E/mg.
D) - Reinigung - Phase 2
Han bringt 64 g des unter den vorstehenden Bedingungen erhaltenen Produkts mit einem Titer von 1350 E/mg in Lösung in 320 cm destilliertem V/asser, wobei anschließend 960 cm Isopropanol und
ca. 100 g Cellulose Whatman, Typ CFx] zugefügt wurden.
Die so erhaltene Paste wird in gleichmäßiger Schicht auf dem oberen Ende einer Kolonne von I5 cm Durchmesser aufgetragen, die 5i5 kg Cellulose Whatman CF^. in einem Gemisch von 3 Teilen Isopropanol je 1 Teil Wasser enthält. Die Beschickungshöhe beträgt 110 cm und die Dicke der mit Produkt beladenen Cellulose beträgt ca. 5 era. Man eluiert mit 27,5 1 eines Lösungsmittelgemisches (Isopropanol-Wasser; 3-1 in Volumina) mit einer Geschwindigkeit von 1,2 1/Std. und läßt anschließend linear den Wasseranteil in dem G«.misch bis zur Elution mit Wasser allein mit der gleichen Geschwindigkeit ansteigen (Gesamtvolumen an
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Eluat mit einem Gefälle der Zusammensetzung - 25 1). Die Eluate werden in Form von Fraktionen mit ca. 500 cm , deren optische Dichte kontinuierlich mit einem Analysator SEIVE Eliograph bei 280 rim bestimmt wird, gesammelt. Man mißt auch die Drehwerte der Fraktionen für die Natrium-D-Linie, insbesondere in dem Teil der durch das Gefälle der Zusammensetzung eluiert wurde. Das Diagramm der Figur 3 zeigt die UV-Absorption bei 280 nm in Abhängigkeit der Anzahl der Fraktionen und enthält mehrere Maxima. Die diesen Maxima entsprechenden Fraktionen, die von der Eluierung mit dem Gemisch Isopropanol-Wasser (3-1 in Volumina) und von dem Beginn des Zusammensetzungsgefälles stammen, besitzen kein Drehvermögen. Die Fraktionen, die die Ebene des polarisierten Lichts drehen, werden nach der Elution am Ende des Zusammensetzungsgefälles erhalten. Sie enthalten noch Fraktionen, die bei 280 nm absorbieren.
Man sammelt bzw. gruppiert die Fraktionen um, die dem Maximum im Hinblick auf die Wirkung gegenüber polarisiertem Licht entsprechen (Fraktionen 65 bis 105 entsprechend 19*6 1)· Man entfernt den Alkohol durch Verdampfen unter vermindertem Druck (2 mmHg) und lyophilisiert anschließend.
Man erhält so 29 g Produkt mit einem Titer von 2950 E/mg.
E) - Reinigung - Phase 3
Man löst 67»3 g Produkte, die von drei Verfahren stammen, die ähnlich bzw. analog dem vorstehend beschriebenen sind, in 1350 cnr destilliertem Wasser.
Die Lösung wird auf das obere Ende einer Chromatographiekolonne mit einem Durchmesser von 15 cm aufgebracht, die Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE-Cellulose Whatman, Typ DE 11, ca. 5 kg) bis zu einer Höhe von 110 cm enthält.
Vor der Verwendung wird der Ionenaustauscher mit 10 1 pro kg
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0,5 η Salzsäure mit Wasser mit 10 1 pro kg 0,5 η Natronlauge und mit Wasser gewaschen und schließlich in einem 3,025 g/l Tris-(h;ydroxymethyl)-aminomethan enthaltenden Puffer equilibriert und auf einen pH = 8,0 mit 26 bis 27 cm n-Snlzsäure eingestellt.
Die Kolonne wird mit 32 1 des gleichen Puffers mit einer Geschwindigkeit von 1,2 1/Std. eluiert. Die Eluate werden in Form von Fraktionen von ca. 3<°0 cm , deren Absorption kontinuierlich mit einem Analysator L.K.B. Uvicord Typ I bei 254 nm gemessen wird, um proteinische Verunreinigungen aufzudecken, gesammelt.
Man bestimmt gleichfalls die Drehwerte der Fraktionen für die Natrium-D-Linie.
Das Diagramm von Figur 4, die die UV-Absorption bei 254 nra in Abhängigkeit der Zahl der Fraktionen zeigt, besitzt zwei Maxima. Die Fraktionen 35 bis 50 (entsprechend 4,8 1), die dem ersten dieser Maxima entsprechen, besitzen einen merklichen Drehwert für die Natrium-D-Linie. Die Fraktionen 35 bis 50 werden vereinigt, auf ein Zehntel ihres Volumens eingeengt und bei +40C gegen 3 x 50 1 Wasser dialysiert. Das Dialysat wird lyophilisiert.
Man erhält so 15>85 g reines Produkt mit einem Titer von 9430 i.E./mg.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind hypoglykämische Zusammensetzungen, die 31 177 RP gegebenenfalls in Gegenwart eines weiteren hypoglykämischen oder antidiabeti chen Mittels enthalten. Diese Zusammensetzungen sind insbesondere zur Bekämpfung der Fettleibigkeit, der Diabetes,der Prädiabetes und der Arteriosklerose verwendbar.
Sie können vorzugsweise auf oralem Weg verabreicht werden.
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Als feste Zusammensetzung für die orale Verabreichung können Tabletten, Pillen, Pulver oder Granulate verwendet werden. In diesen Zusammensetzungen ist der erfindungsgemäße Wirkstoff ein oder mehreren inerten Verdünnungsmitteln oder Adjuvantien, wie Saccharose, Lactose oder Stärke, beigemischt. Diese Zusammensetzungen können auch andere Substanzen als die Verdünnungsmittel, beispielsweise ein Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, enthalten.
Als flüssige Zusammensetzungen für die orale Verabreichung kann man pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere verwenden, die inerte Verdünnungsmittel, wie Wasser oder Paraffinöl, enthalten. Diese Zusammensetzungen können auch andere Substanzen als die Verdünnungsmittel, beispielsweise benetzende, süßende oder geschmackgebene Produkte, enthalten.
Das 31 177 RP kann auch in der Nahrungsmittelindustrie einesteils bei Nahrungsmitteln, die Stärke enthalten, um eine eventuelle Zersetzung zu verhindern und anderenteils in der Diätetik bei Nahrungsmitteln verwendet werden, die für von Fettleibigkeit befallene Individuen bestimmt sind. In diese Nahrungsmittel bringt man im allgemeinen von 0,15 bis Yß> an 31177 RP, bezogen auf das Gewicht der enthaltenen Stärke, ein.
Im allgemeinen wird der Arzt die Posologie bestimmen, die er in Abhängigkeit des Alters, des Gewichts und anderer, mit dem zu behandelnden Individuum verbundenen Faktoren für die geeignetste hält. Die Dosen liegen zwischen 20 und 200 mg/Tag an Wirkstoff bei oraler Verabreichung an einen Erwachsenen.
Das folgende Beispiel veranschaulicht eine erfindungsgemäße Zusammensetzung.
Beispiel
Man stellt gemäß der üblichen Technik Granulate mit der folgenden Zusammensetzung her:
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$1 177 RP O ,060 S
Maisstärke O ,060 S
Mannit O ,074 g
Polyvinylpyrrolidon O ,006 g
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Claims (1)

  1. Patentansprüche
    Glykohydrolaseninhibitor mit den folgenden Eigenschaften: es handelt sich um ein lyophilisiertes, weißes Pulver, das in einer Menge von mehr als 1000 g/l in Wasser löslich ist, dessen Löslichkeit sich rasch in wässrig-alkoholischen und wässrig-acetonischen Lösungen vermindert und auf weniger als 0,1 g/l in wasserfreien Alkoholen, Aceton, Hexan, Äthylacetat, Äther und chlorierten Lösungsmitteln abfällt, nach saurer Hydrolyse ergibt die Analyse hauptsächlich Lysin und Glucose,
    seine Elementarzusammensetzung beträgt etwa: C = 46,2 %, H = 6,05 %, 0 = 46,11 %, N = 1,44 %, S = 0,20 % sein Molekulargewicht liegt zwischen "1O 000 und 20 000, sein Drehwert (c = 0,4 Wasser) beträgt: 3° = +149,5 + 2,5°
    = +295 + 4,0° 20 = +448 + 5i5o
    er besitzt keine charakteristische Absorption im Ultraviolettbereich,
    sein Infrarotspektrum besitzt Absorptionsbanden bei:
    5470, 3400, 3350, 327Ο, 3100, 3050, 3000, 2980, 2930, 29ΟΟ,
    2830, 2780, 2540, 235Ο, 2100, 1985, 19^5, 1900, 1850, 1760,
    1630, 1450, 1410, 1370, 1335, 1305, 1240, 1160, 1100, 1075,
    1030, 935, 920, 850, 785, 770, 760, 720, 700, 640,
    610, 580, 525, 440, 410, 370 cm"1,
    seine antienzymatische Aktivität äußert sich bei der Ratte bei Dosen zwischen 2 und 50 mg/kg p.o.
    2. Verfahren zur Herstellung eines Produkts gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aerob Streptomyces calidus DS 26 320 (NHRL 8141) oder seine Mutantenbildner über einem
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    "RWMNAL INSPECTED
    Milieu und unter üblichen Bedingungen für die Kultur von Streptomyces kultiviert und anschließend das genannte Produkt aus dem Kulturmilieu abtrennt und es reinigt.
    5. Medizinische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine pharmazeutisch aktive Dosis eines Produkts gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem inerten oder pharmazeutisch aktiven verträglichen Produkt enthält.
    4. Neuer Mikroorganismus Streptomyces calidus DS 26 $20 (NRRL 8141).
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DE19772702417 1976-01-22 1977-01-21 Neuer glyko-hydrolasen-inhibitor und dessen herstellung durch kultur eines streptomyces Withdrawn DE2702417A1 (de)

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BE850653A (fr) 1977-07-22
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