CH618606A5 - - Google Patents

Description

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REVENDICATION

Procédé de préparation d'un nouvel inhibiteur de glyco-hydrolases possédant les caractéristiques suivantes: c'est une poudre blanche lyophilisée, soluble dans l'eau à raison de plus de 1000 g/1, dont la solubilité diminue rapidement dans les solutions hydroalcooliques et hydroacétoniques et tombe à moins de 0,1 g/1 dans les alcools anhydres, l'acétone, l'hexane, l'acétate d'éthyle, l'éther et les solvants chlorés.

Après hydrolyse acide, l'analyse révèle principalement de la lysine et du glucose.

— sa composition élémentaire est voisine de:

C% =46,2 H%=6,05 0%=46,11 N% = 1,44 S% =0,20

— son poids moléculaire est compris entre 10000 et 20000

— son pouvoir rotatoire (c=0,4, eau) est de:

[oc]d° = +149,5 ±2,5°

[a]!§6 = +295 ±4,0°

[a]§65 = +448 ±5,5°

— il ne présente pas d'absorption caractéristique dans l'ultraviolet,

— son spectre infrarouge présente des bandes d'absorption à: 3470, 3400, 3350, 3270,3100, 3050, 3000,2980,2930,2900, 2830,2780,2540,2350,2100,1985,1945,1900,1850,1760, 1630,1450,1410,1370,1335,1305,1240,1160,1100,1075, 1030, 935, 920, 850, 785, 770, 760, 720, 700, 640, 610, 580, 525,440,410,370 cm-1,

— son activité antienzymatique se manifeste chez le rat à des doses comprises entre 2 et 50 mg/kg p.o.,

caractérisé en ce que l'on cultive en aérobiose Streptomyces calidus DS 26320(NRRL 8141) ou ses mutants producteurs sur un milieu nutritif et dans des conditions convenant pour la culture des Streptomyces, puis on sépare ledit produit du milieu de culture et on le purifie.

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un nouveau glycopeptide, désigné par le numéro 31177 RP.

Ce nouveau produit présente un intérêt tout particulier comme inhibiteur des glyco-hydrolases telles que les amylases, les maltases ou les saccharases, et particulièrement celles du tractus digestif.

Le glycopeptide 31177 RP est obtenu par culture, dans des conditions appropriées, d'un micro-organisme appartenant au genre Streptomyces, désigné par l'appellation Streptomyces calidus DS 26320. Un échantillon de cette souche a été déposé à l'United States Department of Agriculture à Peoria, Illinois, où il a été enregistré sous le numéro NRRL 8141 le 12 novembre 1975.

Le glycopeptide 31177 RP présente les caractères physicochimiques suivants:

— il est soluble à raison de plus de 1000 g/1 dans l'eau, sa solubilité diminue rapidement dans les solutions hydroalcooliques et hydroacétoniques et tombe à moins de 0,1 g/1 dans les alcools anhydres, l'acétone, l'hexane, l'acétate d'éthyle, l'éther et les solvants chlorés;

— il donne certaines réactions colorées des sucres [soit directement (réaction à l'acide dinitro-3,5 salicylique), soit après hydrolyse acide (réaction avec l'acide dinitro-3,5 salicylique, avec l'aldéhyde anisique, avec la naphtorésorcine, avec le phtalate d'aniline et avec le réactif de Somogyi-Nelson)] ; en revanche le dosage des peptides par le réactif de Folin-Ciocalten se révèle négatif sur le 31177 RP mais, après hydrolyse acide, l'analyse révèle principalement la présence de lysine;

— il contient du carbone, de l'hydrogène, de l'oxygène, de l'azote et du soufre; sa composition élémentaire est voisine de: C% =46,2 H%=6,05 0% =46,11 N% = 1,44 S% =0,20.

Il est fortement retardé sur des gels poreux d'acrylamide réticulée et de dextrane réticulé, ce qui interdit toute estimation de la masse moléculaire par ces méthodes.

D'après son comportement en ultrafiltration sur des mem-5 branes à porosité contrôlée, son poids moléculaire est compris entre 10000 et 20000.

L'hydrolyse par de l'acide sulfurique normal à 95° C pendant 2'A h ne fournit dans les hydrolysats que de la lysine, identifiée à l'auto-analyseur Technicon et, après silylation et chromato-io graphie en phase gazeuse, que des monosaccharides constitués essentiellement de glucose.

Le glycopeptide 31177 RP est caractérisé par les propriétés physiques suivantes:

— aspect: poudre blanche lyophilisée;

15 — spectre ultraviolet: absence de maximums caractéristiques de 220 à 400 mm;

— spectre infrarouge: détermination à partir de comprimés en mélange avec KBr.

Ce spectre est représenté par la fig. 1 dans laquelle on a 20 porté en abcisses, d'une part, les longueurs d'onde exprimées en microns (échelle supérieure) et, d'autre part, les nombres d'ondes en cm-1 (échelle inférieure) et en ordonnées les densités optiques.

Dans le tableau I sont indiquées les principales bandes d'absorption infrarouge dii 31177 RP exprimées en nombre 25 d'ondes (cm-1).

Tableau I

3470 épt

2540 épt

1335 épt

760 m

3400 épt

2350 tf (C02)

1305 épt

720 épt

3350 tF

2100 tf

1240 f

700 m

3270 épt

1985 tf

1160 F

640 épt

3100 épt

1945 tf

1100 épt

610 épt

3050 épt

1900 tf

1075 épt

580 m

3000 épt

1850 tf

1030 tF

525 f

2980 épt

1760 tf

935 épt

440 épt

2930 F

1630 m

920 m

410 épt

2900 épt

1450 épt

850 m

370 épt

2830 épt

1410 F

785 épt

2780 épt

1370 f

770 épt

tF =

très forte

F =

forte

m =

moyenne

f =

faible

tf =

très faible

épt = épaulement

— pouvoir rotatoire (détermination à partir d'une solution

50 à 0,4% dans l'eau)

[OC]d° = + 149,5+2,5°

[a]«6=+295 ±4,0°

[a]ig5=+448 ±5,5°

55 Le 31177 RP, inhibiteur très puissant de l'a-amylase pancréatique, qui diminue et retarde l'hyperglycémie et l'hyper-insulinémie consécutives à l'ingestion d'amidon, est également doué d'une activité antisaccharasique et antimaltasique remarquable. Il est de plus très peu toxique.

60

— Activité antienzymatique

Les activités inhibitrices vis-à-vis de l'a-amylase pancréatique, de la maltase et de la saccharase, ont été déterminées in vitro :

65 Activité inhibitrice de l'amylase

L'activité amylasique est dosée selon la méthode de Noelting G. et Bernfeld P. [«Helv. Chim. Acta», 31,286 (1948)] en présence et en l'absence du produit inhibiteur à doser. Elle est évaluée en

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unités internationales. Une unité d'amylase est la quantité d'enzyme qui libère un microéquivalent de fonction réductrice exprimée en maltose par minute au cours de l'hydrolyse des liaisons a 1-4 glucosidiques de l'amidon. Les fonctions réductrices réagissent à l'ébullition avec l'acide dinitros-3,5 salicyliques en 5 faisant apparaître une coloration qui est mesurée à 540 mji.

Avec des quantités d'enzyme assez faibles, on obtient des cinétiques linéaires durant plusieurs minutes et passant par l'origine. La courbe de référence est établie à l'aide de maltose.

L'activité inhibitrice est exprimée en unités d'inhibiteur (U.I.). io L'unité d'inhibiteur d'amylase est la quantité de produit qui inhibe 50% de l'activité correspondant à 2 unités d'amylase. On réalise des mélanges constitués de 0,5 ml d'une solution d'enzyme à 4 unités d'amylase par millilitre et 0,5 ml d'une solution aqueuse d'inhibiteur renfermant 0; 0,100; 0,200; 0,300 et 15 0,400 ng/ml de 31177 RP. Les mélanges sont réalisés à 35°C et maintenus à cette température durant 15 mn. L'activité enzyma-tique de chacun des mélanges est ensuite mesurée selon la technique mentionnée ci-dessus. De la courbe obtenue en portant en abscisse les unités d'activité amylasique et en ordonnées la quantité 20

d'inhibiteur en |ig/ml, on déduit la concentration inhibitrice 50% (Ci 50= 0,106 |ig/ml de 31177 RP). On traduit alors la Ci 50 en unités inhibitrices par milligramme d'inhibiteur (9430 U.I./mg de 31177 RP).

En variante, la concentration permettant de diminuer de 50% 25 l'action de l'a-amylase pancréatique vis-à-vis de l'amidon soluble, selon la méthode recommandée par la Fédération internationale pharmaceutique, «J. Mond. Pharm.», 3, 337 (1968), est de0,015 mg/1.

La transformation de cette concentration en unités d'inhibiteur de saccharase (UIS) s'opère avec la formule:

1000

■ UIS/mg

Activité inhibitrice de la saccharase

30

Une unité d'inhibiteur de saccharase (UIS) est définie par la quantité d'inhibiteur nécessaire pour inhiber à 50% deux unités de saccharase. Une unité de saccharase (US) est la quantité d'enzyme qui scinde en 1 mm, dans les conditions expérimentales ci-après, 1 limole de saccharose en a-glucose et ß-fructose. L'a-glucose est 35 dosé après mutarotation en ß-glucose, par le système glucose-oxydase et o-dianisidineperoxydase selon la méthode décrite par A. Dahlquist [«Methods in Enzymology», 8, S.P. Colowick, N.O. Kaplan, p. 584, Acad. Press (1963) et «Anal. Biochem.», 7, 18 (1964)]. 40

Pour la conduite de la mesure de l'activité antisaccharasique, on ajoute à 0,06 ml de suspension de saccharase (0,165 US/ml d'extrait de saccharase d'intestin grêle de rat préparé selon la méthode décrite par A. Dahlquist [«Methods in Enzymology», S, S.P. Colowick, N.O. Kaplan, p. 584, Acad. Press (1963)] 45

0,14 ml de la solution d'inhibiteur dans du tampon maléate de sodium 0,1 M pH = 6,0 (0-400 mg/1) et on laisse en contact pendant 30 mn à la température ambiante.

On ajoute ensuite 0,2 ml de solution de D(+) saccharose pur (qualité pour analyses) 0,056M dans du tampon maléate 50 de sodium 0,1M pH=6,0 et on laisse incuber au bain-marie à 37° C pendant 1 h. On arrête l'incubation en ajoutant 1,6 ml d'eau distillée et en plaçant ensuite le milieu au bain-marie bouillant pendant 2 mn. Le dosage du glucose libéré est effectué en prélevant une partie aliquote de 0,5 ml du milieu et en 55

engageant 3 ml du réactif glucose-oxydase/peroxydase-o-di-anisidine. La coloration se développe après 1 h à 37° C et on mesure la densité optique à 420 mm par rapport à un blanc effectué sur 0,5 ml de tampon maléate 0,1M pH=6,0.

On défalque des valeurs des densités optiques obtenues 60

la coloration provoquée par l'inhibiteur, d'une part, et par la saccharase, d'autre part.

On trace la courbe donnant la densité optique en fonction de la concentration en inhibiteur dans le milieu réactionnel.

La concentration en inhibiteur qui correspond à une densité 65 optique égale à 50% de celle que l'on obtient en l'absence de l'inhibiteur, est appelée concentration inhibitrice 50% :

CI50 (mg/1). Pour le 31177 RP, on trouve CI5o = 16 mg/1.

CI50 x 0,4 x 200

L'activité du 31177 RP est donc de 0,8 UIS/mg.

Activité inhibitrice de la maltase

Une unité d'inhibiteur de maltase (UIM) est définie par la quantité d'inhibiteur nécessaire pour inhiber à 50% deux unités de maltase. Une unité de maltase (UM) est la quantité d'enzyme qui scinde en 1 mn, dans les conditions expérimentales ci-après, 1 immole de maltose en 2 |imoIes d'a-glucose. L'a-glucose est dosé après mutarotation en ß-glucose, par le système glucose-oxydase et o-dianisidineperoxydase selon la méthode décrite par A. Dahlquist [«Methods in Enzymology», 8, S.P. Colowick, N.O. Kaplan, p. 584, Acad. Press (1963)].

Pour la conduite de la mesure de l'activité antimaltasique, on ajoute à 0,06 ml de suspension de maltase [0,07 UM/ml d'extraits de maltase d'intestin grêle de rat préparé selon la méthode décrite par A. Dahlquist [«Methods in Enzymology», 8, S.P. Colowick, N.O. Kaplan, p. 584, Acad. Press (1963)]] 0,14 ml de la solution d'inhibiteur dans du tampon maléate de sodium 0,1M pH=6,0 (0-40 mg/1) et on laisse en contact pendant 30 mn à la température ambiante. On ajoute ensuite 0,2 ml de solution de D(+) maltose pur 0,056M dans du tampon maléate de sodium 0,1M pH=6,0 et on laisse incuber au bain-marie à 37° C pendant 1 h. On arrête l'incubation en ajoutant 1,6 ml d'eau distillée et en plaçant ensuite le milieu au bain-marie bouillant pendant 2 mn. Le dosage du glucose libéré est effectué en prélevant une partie aliquote de 0,5 ml du milieu et en engageant 3 ml de réactif glucose-oxydase/peroxydase-o-dianisidine. La coloration se développe après 1 h à 37° C et on mesure la densité optique à 420 mn par rapport à un blanc effectué sur 0,5 ml de tampon maléate 0,1M pH=6,0.

On défalque des valeurs des densités optiques obtenues la coloration provoquée par l'inhibiteur, d'une part, et par la maltase, d'autre part.

On trace la courbe donnant la densité optique en fonction de la concentration en inhibiteur dans le milieu réactionnel.

La concentration en inhibiteur qui correspond à une densité optique égale à 50% de celle que l'on obtient en l'absence d'inhibiteur est appelée concentration inhibitrice 50% : CI50 (mg/1). Pour le 31177 RP, on trouve CIso=2,5 mg/1.

La transformation de cette concentration en unités d'inhibiteur de maltase (UIM) s'opère avec la formule:

- UIM/mg

1000 ■ 0,004 CI50 x 0,4 x 2

L'activité du 31177 RP est donc de 2 UIM/mg.

Ces activités ont été confirmées in vivo chez le rat vis-à-vis de l'hyperglycémie provoquée par administration soit d'amidon de blé (2,5 g/kg p.o.), soit de saccharose (2,5 g/kg p.o.). Le 31177 RP est administré par voie orale en mélange soit avec de l'amidon,

soit avec le saccharose et, 1 h plus tard, le sang est prélevé dans l'aorte abdominale pour la détermination de la glycémie.

L'hyperglycémie consécutive à l'ingestion d'amidon est diminuée de 50% par rapport à sa valeur chez les rats témoins à la dose de 6 mg/kg p.o.

L'hyperglycémie consécutive à l'ingestion de saccharose est diminuée de 50% par rapport à sa valeur chez les rats témoins à la dose de 25 mg/kg p.o. La toxicité aiguë du 31177 RP a été étudiée principalement chez la souris; il est atoxique à la dose de 1 g/kg i.v.

L'organisme producteur de l'inhibiteur d'amylase 31177 RP est une souche de Streptomyces qui a été isolée à partir d'un

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échantillon de terre, et à laquelle a été attribué le numéro DS 26320 (NRRL 8141).

Cet organisme, présentant des caractères qui n'ont pas permis de l'identifier à une espèce déjà décrite, doit être considéré comme une espèce nouvelle et a été désigné par l'appellation Streptomyces calidus, DS 26320.

L'isolement en a été effectué en suivant la méthode générale qui consiste à mettre une petite quantité de terre en suspension dans de l'eau distillée stérile, à diluer la suspension à différentes concentrations, et à étaler un petit volume de chaque dilution sur la surface de boîtes de Pétri contenant un milieu nutritif gélosé. Après une incubation de quelques jours à 26° C, qui permet aux micro-organismes de se développer, les colonies que l'on veut isoler pour en poursuivre l'étude sont prélevées et repiquées sur des géloses nutritives afin d'en obtenir des cultures plus abondantes.

Streptomyces calidus DS 26320 forme des spores ovales à cylindriques à bouts arrondis, mesurant 1,0 à 1,2 |i/0,5 à 0,8 jx. Il présente des sporophores en grappe; les chaînes de spores, qui peuvent comprendre jusqu'à plusieurs dizaines de spores, sont lâches et flexueuses et se montrent susceptibles de prendre une forme sinueuse, ou encore de se recourber dans leur partie terminale pour décrire un crochet ou un enroulement très large. Par son mode de sporulation, Streptomyces calidus DS 26320 se situe dans la section Retinaculum apertum de la classification de Pridham.

Streptomyces calidus DS 26320 se développe bien à 26° C et à 37° C, un peu plus modérément bien que positivement à 50° C, moins bien à 52° C et pas à 55° C. Il présente un mycélium aérien sporulé de couleur gris jaunâtre ou jaune grisâtre à gris. Sur l'ensemble de ses milieux de culture, il forme un mycélium végétatif qui va de brun plus ou moins foncé à brun-noir, le plus souvent caché par le mycélium aérien. Il possède la propriété de produire des pigments mélaniques sur les milieux organiques, en particulier sur la gélose spéciale tyrosine/extrait de levure de Waksman (Melanin formation medium), et aussi de former des pigments solubles de couleur brun foncé à brun-noir sur la plupart des milieux synthétiques.

Dans ses cultures, effectuées à 26° C, il présente les caractères biochimiques suivants:

— production de mélanine positive

— production de H2S

positive

— tyrosinase positive

— liquéfaction de la gélatine positive

— utilisation de la cellulose positive

— production de nitrites à

nulle sur bouillon nutritif nitraté;

partir des nitrates positive sur milieux synthétiques

— hydrolyse de l'amidon positive

■— culture sur lait écrémé

peptonisation rapide sans coagu

lation; alcalinisation modérée du

pH qui passe de 6,3 à 7,3 en 1 mois

Les caractères culturaux de Streptomyces calidus DS 26320 sont rassemblés dans le tableau II. Ce sont ceux de cultures arrivées à un bon stade de développement, c'est-à-dire d'environ 2 à 3 semaines à 26° C, sauf indications contraires. Ces caractères ont été observés sur des géloses nutritives et des bouillons habituellement utilisés pour déterminer les caractères morphologiques des souches de Streptomyces, les cultures sur milieux gélosés étant effectuées sur des géloses inclinées. Un certain nombre des milieux de culture employés ont été préparés d'après les formules indiquées dans "The Actinomycetes", S.A. Waksman, pp. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S.A., 1950; dans ce cas, ils sont indiqués par la lettre W suivie du numéro qui leur a été attribué dans "The

Actinomycetes". Les références ou constitutions des autres milieux de culture sont les suivantes:

— Réf. A - "Hickey and Tresner's Agar" - T. G. Pridham et coll. - "Antibiotics Annual", 1956-1957, p. 950.

— Réf. B - "Bennett's Agar" S.A. Waksman - "The Actino mycetes", vol. 2, p. 331, n° 30, The William and Wilkins Company, Baltimore 1961.

— Réf. C - Formule W-23, additionnée de 2% de gélose.

— Réf. D - "Yeast Extract Agar" - T. G. Pridham et coll. -

"Antibiotics Annual", 1956-1957, p. 950.

— Réf. E - "Tornato Paste Oatmeal Agar" - T. G. Pridham et coll. - "Antibiotics Annual", 1956-1957, p. 950.

— Réf. F - "Melanin formation medium" - "The Actino mycetes", vol. 2, p. 333, n° 42, S.A. Waksman, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1961.

— Réf. G - W.E. Grundy et coll. - "Antibiotics and Chem.", 2,

401,1952.

— Réf. H - "Inorganic Salts - Starch Agar" - T. G. Pridham et coll. - "Antibiotics Annual", 1956-1957, p. 951.

— Réf. I - correspond à la formule W-l, où 3% de saccharose sont remplacés par 1,5% de glucose.

— Réf. J - correspond à la formule W-l, où 3% de saccharose sont remplacés par 1,5% de glycérol.

— Réf. K - correspond à la formule W-18, où 3% de saccharose sont remplacés par 1,5% de glucose.

— Réf. L - correspond à la formule W-18, où le saccharose est supprimé et remplacé par de petites bandes de papier-filtre partiellement immergées dans le liquide.

— Réf. M - "Manual of Methods for Pure Culture Study of

Bacteria" de la Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., II50-18.

— Réf. N - "Plain Gelatin" - préparé suivant les indications du "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" de la Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., IIso-18.

— Réf. P - Lait écrémé en poudre commercial, reconstitué selon les indications du fabricant.

— Réf. Q - Milieu indiqué pour la recherche de la production de H2S par: H.D. Tresner et F. Danga - "Journal of Bacteriology", 76,239-244,1958.

(Tableau en pages suivantes)

En plus de la particularité qu'il possède de se développer à 50° C, Streptomyces calidus DS 26320 présente un ensemble de caractères qui ne coïncide exactement avec aucun de ceux des souches déjà décrites, et c'est pourquoi on doit le considérer comme une espèce nouvelle.

En considérant les espèces dont la description est donnée dans le «Bergey's Manual of Determinative Bacteriology» (7e éd., The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1957)

ainsi que dans «The Actinomycetes» (vol. 2, S.A. Waksman, The William and Wilkins Company, Baltimore, 1961), c'est de l'espèce Streptomyces phaeochromogenes que l'on pourrait rapprocher le plus volontiers Streptomyces calidus DS 26320 qui forme des pigments mélaniques sur les milieux organiques ainsi que des pigments solubles de coloration brun à brun-noir sur la plupart des milieux synthétiques, développe le plus souvent sur ses milieux de culture un mycélium végétatif brun à brun-noir, donne, en particulier sur pomme de terre, un mycélium végétatif brun-gris foncé en même temps qu'une abondante production de pigment soluble noir, et forme un mycélium aérien gris jaunâtre ou jaune grisâtre, devenant parfois gris-jaune brunâtre dans les cultures plus âgées, à gris. Il doit cependant en être différencié car, d'une part, S. phaeochromogenes forme des spores sphériques ou en bâtonnets courts et ses chaînes de spores sont susceptibles de décrire des spirales, alors que

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TABLEAU II

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Milieu Degré de Mycélium végétatif ou Appareil aérien Pigment soluble Observations et de culture dévelop- Envers de la culture (comprenant l'ensemble propriétés biochimiques pement du mycélium aérien et de la sporulation)

Gélose de Bon Hickey et Tresner (Réf. A)

Envers brun foncé à brun-noir

Blanc grisâtre à gris

Moyennement développé

Brun-noir

Gélose de Bon

Bennett

(Réf. B)

Gélose Bon d'Emerson (Réf. C)

Gélose Bon à l'extrait de levure de Pridham (Réf. D)

Gélose à Bon la farine d'avoine età

l'extrait de tomate de

Pridham (Réf. E)

Gélose Modéré

glucose/

peptone

(W-7)

Gélose nutritive (W-5)

Gélose Moyen tyrosine/

extrait de levure pour formation de mélanine (Réf. F)

Gélose au Modéré malate de calcium de Krainsky (Réf. G)

Gélose à Modéré

l'ovalbu-

mine (W-12)

Envers brun orangé très foncé

Envers brun orangé très foncé

Envers noir

Envers noir

Envers brun-noir

Modéré Envers brun-jaune

Envers brun-noir

Envers brun jaunâtre clair

Envers brun foncé

Gélose glucose/

aspa-

ragine (W-2)

Assez bon Envers brun orangé

Blanc grisâtre à gris. Bien développé

Jaune grisâtre clair à gris. Moyennement développé

Gris jaunâtre clair à gris. Assez bien développé

Grisâtre clair à gris; nombreuses gouttelettes d'exsudation jaune-brun. Bien développé

Gris jaunâtre clair à gris. Modérément développé

Blanchâtre. Pauvrement développé

Grisâtre très clair. Modérément développé

Brun-noir

Brun orangé foncé

Noir, abondant

Noir, abondant

Brun-noir

Brun-jaune

Noir

Blanc grisâtre à gris. Modérément développé

Grisâtre clair. Modérément développé

Gris jaunâtre clair à gris. Assez bien développé

Gris brunâtre

Brun noirâtre

Brun orangé foncé

Spores ovales à cylindriques à bouts arrondis, mesurant 1,0 à 1,2/0,5 à 0,8 (x. Sporophores en grappe. Chaînes de spores flexueuses pouvant prendre une forme sinueuse ou se recourber à leur extrémité pour former un crochet ou un enroulement très large.

Production de mélanine: positive (lectures effectuées selon les recommandations de l'auteur)

Solubilisation du malate: positive, assez bonne

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Milieu de Degré de Mycélium végétatif ou Appareil aérien Pigment soluble Observations et culture dévelop- Envers de la culture (comprenant l'ensemble propriétés biochimiques pement du mycélium aérien et de la sporulation)

Gélose glycérine/

aspa-

ragine

(W-3)

Gélose amidon/ sels minéraux de Pridham (Réf. H)

Bon

Bon

Envers brun orangé très foncé, allant vers brun-noir

Envers brun-jaune

Gélose amidon/

nitrate (W-10)

Gélose Très synthéti- pauvre que de Czapek au saccharose (W-l)

Gélose Bon synthétique de Czapek au glucose (Réf. I)

Gélose Bon synthétique de Czapek à la glycérine (Réf. J)

Bouillon Bon amidon/

nitrate (W-19)

Bouillon Modéré de Czapek au glucose (Réf. K)

Bouillon Très bon de Czapek à la cellulose (Réf. L)

Bouillon Assez bon nutritif nitraté

(Réf. M)

Culture Bon sur pomme de terre (W-27)

Assez bon Envers brun-jaune

Envers jaune brunâtre clair

Envers brun-noir

Envers brun-noir

Voile épais. Envers brun foncé

Voile brun foncé

M.v. brun foncé

Voile assez épais. Envers brun foncé

M.v. épais et plissé, brun gris foncé

Blanc grisâtre à gris. Assez bien développé

Blanc grisâtre à gris. Bien développé

Brun-noir

Gris-brun assez foncé

Blanc grisâtre à gris.

Moyennement développé

Brun-jaune

Grisâtre clair. Très Nul pauvrement développé,

presque à l'état de traces

Grisâtre clair à gris Brun-noir jaunâtre clair.

Modérément développé

Grisâtre clair à gris Brun-noir jaunâtre clair.

Modérément développé

Blanc grisâtre. Brun

Bien développé

Nul Brun

Grisâtre clair. Brun foncé

Abondant sur le papier émergeant du bouillon

Blanc grisâtre.

Assez bien développé

Blanc grisâtre à jaune grisâtre clair.

Bien développé

Brun foncé

Noir

Hydrolyse de l'amidon: positive, bonne.

Spores ovales à cylindriques à bouts arrondis, mesurant 1,0 à 1,2/0,5 à 0,8 ji. Sporophores en grappe. Chaînes de spores flexueu-ses pouvant prendre une forme sinueuse ou se recourber à leur extrémité pour former un crochet ou un enroulement très large.

Hydrolyse de l'amidon: positive, modérée

Production de nitrites: positive

Production de nitrites: positive

- Utilisationdelacellulose: positive

- Production de nitrites: positivé

Production de nitrites: négative

P.s. noir commençant à diffuser dans la pomme de terre après 24 h d'incubation

7

618 606

Milieu de Degré de culture développement

Gélatine Bon pure à 12% (Réf. N)

Lait écrémé (Ref. P)

Bon

Gélose de Modéré Tresner et Danga (Réf. Q)

Mycélium végétatif ou Envers de la culture

Appareil aérien (comprenant l'ensemble du mycélium aérien et de la sporulation)

Pigment soluble Observations et propriétés biochimiques

Culture bien développée à la surface. Envers brun très foncé

Anneau brun-jaune

Brun noirâtre

Blanc grisâtre. Modérément développé

Nul

Nul

Brun très foncé

Brun foncé

Noir

Liquéfaction de la gélatine: positive, bonne

Pas de coagulation. Peptonisation rapide. pH passant de 6,3 à 7,3 en 1 mois

Production de H2S : positive (lectures effectuées selon les recommandations de l'auteur)

S. calidus DS 26320 forme des spores ovales à cylindriques à 20 bouts arrondis mais jamais sphériques, et l'aspect de ses chaînes de spores correspond à celui des souches de la série Retinaculum apertum de Pridham. D'autre part S. phaeochromogenes produit, sur gélose nutritive, un pigment soluble brun-rouge foncé,

ne forme pas de mycélium aérien sur pomme de terre et donne, 2s sur gélose synthétique nitratée au saccharose, un bon développement qui se traduit par un mycélium végétatif brun à presque noir, un mycélium aérien abondant blanc avec une nuance brunâtre ainsi que la production d'un pigment soluble brun,

tandis que S. calidus DS 26320 produit, sur gélose nutritive, 30 un pigment soluble brun-jaune, forme sur pomme de terre un mycélium aérien bien développé blanc grisâtre à jaune grisâtre clair, et ne produit pas de pigment soluble sur gélose synthétique nitratée au saccharose de Czapek, sur laquelle il ne se développe que très pauvrement.

La capacité de Streptomyces calidus DS 26 320 à utiliser diverses sources de carbone ou d'azote pour assurer son développement a été déterminée suivant le principe de la méthode de Pridham et Gottlieb («J. of Bact.», 56,107-114,1948); le degré de développement a été observé sur le milieu de base indiqué par les auteurs en remplaçant soit le glucose par les diverses sources de carbone respectivement essayées, soit S04(NH4)2 par les diverses sources d'azote respectivement essayées. Les résultats sont indiqués dans le tableau III.

Tableau III

Sources de carbone

Utilisation

Sources d'azote

Utilisation essayées

essayées

D-Ribose positive

NOaNa positive

D-Xylose positive

N02Na positive

L-Arabinose positive so4(nh4)2

positive

L-Rhamnose positive, lente po4h(nh4)2

positive

D-Glucose positive

Adénine positive

D-Galactose positive

Adénosine positive

D-Fructose positive

Uracile négative

D-Mannose positive

Urée positive

L-Sorbose négative

L-Asparagine positive

Lactose positive, lente

Glycocolle positive

Maltose positive

Sarcosine négative

Saccharose négative

DL-Alanine positive

Tréhalose positive

DL-Valine positive

Cellobiose positive

Acide DL-aspartique positive

Raffinose négative

Acide L-glutamique positive

Dextrine positive

L-Arginine positive

Inuline négative

L-Lysine positive

Amidon positive

DL-Thréonine positive

Cellulose positive

DL-Méthionine négative

Glycogène positive

Taurine négative

Glycérol positive

L-Tyrosine positive

Erythritol négative

DL-Proline positive

Adonitol négative

L-Histidine positive

Dulcitol négative

L-Tryptophane positive

D-Mannitol positive

Bétaïne négative

D-Sorbitol négative

Inositol négative

Salicine négative

618 606

Le procédé de préparation de l'inhibiteur de glyco-hydrolases 31177 RP consiste essentiellement à cultiver en aérobiose Streptomyces calidus DS 26320 ou ses mutants producteurs sur un milieu nutritif et dans des conditions appropriées à la culture des Streptomyces et à séparer ensuite l'inhibiteur de glyco-hydrolases formé au cours de la culture.

La culture de Streptomyces calidus DS 26320 peut être effectuée par toute méthode de culture aérobie en surface ou en profondeur, mais cette dernière est à préférer pour des raisons de commodité. On utilise à cette fin les différents types d'appareils qui sont maintenant d'un usage courant dans l'industrie des fermentations.

On peut en particulier adopter la marche suivante pour la conduite des opérations:

Streptomyces calidus DS 26320

i culture sur gélose

I

culture en fiole agitée

1

culture inoculum en fermenteur i

culture de production en fermenteur

Le milieu de fermentation doit contenir essentiellement des sources de carbone et d'azote assimilables, des éléments minéraux et éventuellement des facteurs de croissance et des épaississants, tous ces éléments pouvant être apportés sous forme de produits bien définis ou par des mélanges complexes tels qu'on en rencontre dans des produits biologiques d'origines diverses.

Comme sources de carbone assimilable, on peut utiliser des hydrates de carbone tels que le glucose, le sucre interverti, le lactose, les dextrines, l'amidon, la cellulose ou d'autres substances car-bonnées comme les sucres alcools, tels que le glycérol ou le mannitol, ou comme certains acides organiques, les acides citrique, lactique, tartrique, etc. Certaines huiles animales ou végétales telles que l'huile de lard ou l'huile de soja peuvent avantageusement remplacer ces différentes sources carbonées ou leur être adjointes. Comme sources de carbone particulièrement favorables, peuvent être utilisés le glucose et le glycérol.

Les sources convenables d'azote assimilable sont extrêmement variées. Elles peuvent être des substances chimiques très simples comme les nitrates, les sels minéraux et organiques d'ammonium, l'urée, les acides aminés. Elles peuvent être aussi apportées par des substances complexes contenant principalement l'azote sous forme protidique: caséine, lactalbumine, gluten et leurs hydrolysats, farines de soja, d'arachide, de poisson, extraits de viande, de levure, distiller's solubles, corn steep. Comme sources d'azote particulièrement favorables, peuvent être utilisés les hydrolysats de caséine.

Parmi les éléments minéraux ajoutés, certains peuvent avoir un effet tampon ou neutralisant comme les phosphates alcalins ou alcalino-terreux, ou les carbonates de calcium et de magnésium. D'autres apportent l'équilibre ionique nécessaire au développement du Streptomyces calidus DS 26320 et à l'élaboration de l'inhibiteur de glyco-hydrolases comme les chlorures et sulfates alcalins et alcalino-terreux. Enfin, certains agissent plus spécialement comme activateurs des réactions métaboliques du Streptomyces calidus DS 26320; ce sont les sels de fer et de cobalt.

Comme sels minéraux particulièrement favorables, peuvent être utilisés les sels de fer ou de cobalt.

Les facteurs de croissance sont des produits de nature vita-minique, tels que la riboflavine, l'acide folique, l'acide pan-tothénique.

Parmi les épaississants, les plus habituellement employés sont l'amidon, la carboxyméthylcellulose, la gélose.

Le pH du milieu de fermentation de départ doit être compris entre 6,0 et 7,8, de préférence de 6,4 à 7,6. La température optimale pour la fermentation est comprise entre 25 et 32° C,

mais une production satisfaisante est obtenue pour des températures comprises entre 23 et 35° C. L'aération de la fermentation peut varier entre des valeurs assez larges. On a cependant trouvé que des aérations de 0,3 à 21 d'air par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement bien. Le rendement maximal en inhibiteur de glyco-hydrolases est obtenu après 23 h à 5 j de culture, ce temps dépendant essentiellement du milieu utilisé.

D'après ce qui précède, on perçoit que les conditions générales de la culture de Streptomyces calidus DS 26320 pour la production du 31177 RP peuvent varier dans une large mesure et être adaptées à chaque nécessité particulière.

Le 31177 RP peut être isolé des moûts de fermentation de la manière suivante:

On peut séparer le corps microbien par centrifugation ou par filtration à un pH compris de préférence entre 6,0 et 7,0, puis concentrer le filtrat obtenu à un volume compris entre le quart et le sixième du volume initial, dialyser le concentrât contre de l'eau distillée et ajouter à froid un mauvais solvant tel que l'isopropanol pour provoquer la précipitation du produit brut. Le produit brut peut être purifié par les méthodes suivantes:

— précipitation fractionnée par de mauvais solvants du 31177 RP comme des alcools, de préférence l'isopropanol, ou des cétones miscibles à l'eau, de préférence l'acétone;

— dialyse à travers une membrane, de préférence une membrane de cellulose régénérée, contre de l'eau pour éliminer les substances à bas poids moléculaire;

— Chromatographie de solutions aqueuses de 31177 RP sur divers adsorbants tels que les alumines, les échangeurs d'ions à fonctions basiques, de préférence la DEAE-cellulose, et les gels macroréticulés, de préférence à structure polyamide. Au cours des opérations d'isolement et de purification, les séries de dosages nécessaires pour apprécier la teneur des produits en 31177 RP sont réalisées par une transposition de la méthode de Noelting G. et Bernfeld P. [«Helv. Chim. Acta», 31,286 (1948)] sur appareil automatique, avec les variantes suivantes:

température d'incubation 30° C, révélation des sucres formés par la réduction du ferricyanure ferrique.

Le titre exprimé en U/mg est calculé par comparaison à l'inhibition obtenue à l'aide d'un produit partiellement purifié titrant environ 1000 Ul/mg.

L'exemple suivant, donné à titre non limitatif, montre comment l'invention peut être mise en pratique.

Exemple:

A) Fermentation

On charge dans un fermenteur de 1701:

Peptone 1200 g

Extrait de levure 600 g

Glucose monohydraté 1200 g

Gélose 240 g

Eau de ville complément pour 1101

Le pH est ajusté à 7,3 avec 70 cm3 de soude 10N. On stérilise le milieu par barbotage de vapeur à 122° C pendant 40 mn.

Après refroidissement, du fait de la condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 1201, le pH est de 6,65; on ensemence avec 200 cm3 d'une culture en erlenmeyer agité du Streptomyces calidus DS 26320. La culture est développée à 30° C pendant 23 h en agitant et en aérant avec de l'air stérile; elle est alors convenable pour l'ensemencement de la culture productrice.

La culture productrice est effectuée dans un fermenteur de 8001 chargé avec les substances suivantes:

Distiller's solubles 2 kg

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

618 606

Haricots en grains 16 kg

Glucose monohydraté 2 kg

Huile de soja 41

Chlorure de sodium 2 kg

Sulfate de magnésium 800 g Solution de chlorure de cobalt hexahydraté à 20 g/1 0,41

Eau de ville q.s.p. 3701

Les haricots sont précuits pendant 30 mn à 122° C dans 3001 d'eau puis, après refroidissement, on ajoute les autres matières premières. Le pH du milieu est ajusté à 7,5 par addition de 350 cm3 de soude 10N, puis on stérilise le bouillon par bar-botage de vapeur à 122° C pendant 40 mn. Après refroidissement, du fait de la condensation de vapeur au cours de la stérilisation, le volume du bouillon est de 4001; le pH du milieu est de 6,6; on ensemence par 401 de la culture inoculum en fermenteur de 1701 décrite ci-dessus. La culture est développée à 26° C durant 100 h en agitant avec une turbine tournant à 205 t/mn et en aérant avec un volume d'air stérile de 20 m3/h. En fin d'opération, le pH de la culture est de 6,3 et le volume du bouillon de 4201. L'activité enzymatique (inhibitrice d'amylase) du moût est de 2700 U/cm3.

B) Extraction

4201 du moût préparé dans les conditions décrites précédemment, dont l'activité enzymatique (inhibitrice d'amylase) est de 2700 U/cm3, sont filtrés sur filtre-presse avec l'aide de 30 kg d'adjuvant de filtration. On obtient ainsi 4001 de filtrat.

2001 du filtrat obtenu sont concentrés sous pression réduite à 35° C jusqu'à un volume de 401.

Le concentrât, dont le pH est ajusté à 6,5 par addition d'acide chlorhydrique (50 cm3 d'acide 6N), est refroidi puis est dialysé pendant 12 h par circulation en circuit fermé dans un dialyseur à plaques équipé d'une membrane Cuprophane de 1 m2 de surface et alimenté en eau distillée refroidie à 4°C; le volume final est de 45 1. Au concentrât on ajoute 451 d'isopropanol refroidis à —10° C. Le précipité qui se forme est éliminé par centrifugation, puis 68 1 d'isopropanol, refroidis à —10° C, sont ajoutés au surnageant; le précipité obtenu est isolé par centrifugation et repris par 41 d'eau distillée refroidie à 4°C. Le pH de la solution est de 6,5. Cette solution est lyophilisée et on isole ainsi 682 g de 31177 RP dont l'activité enzymatique est de 540 U/mg.

C) Purification, phase 1

500 g du produit précipité par l'isopropanol selon les conditions ci-dessus et titrant 540 U/mg sont dissous dans 101 d'eau distillée. La solution obtenue est clarifiée par filtration puis passée sur une colonne de 15 cm de diamètre contenant une hauteur de 60 cm d'alumine à pH=4 chlorhydrique dans environ 5 1 d'eau comme solvant. Quand la solution est passée, on continue d'éluer par de l'eau distillée (environ 111).

La vitesse d'élution est réglée par une pompe à 500 cm3/h et la densité optique des éluats est mesurée à 254 nm par un analyseur en continu. Les éluats sont recueillis par fractions de 60 cm3 et le pouvoir rotatoire pour la raie D du sodium des fractions absorbant à 254 nm est mesuré. La fig. 2 représente, en valeurs relatives, l'absorption U.V. et le pouvoir rotatoire des éluats. Les fractions contenant le produit actif sur la lumière polarisée sont rassemblées (3,5 1 environ), concentrées puis lyophilisées.

On obtient ainsi 101,2 g titrant 1350 U/mg.

D) Purification, phase 2

64 g de produit obtenu dans les conditions précédentes et titrant 1350 U/mg sont mis en solution dans 320 cm3 d'eau distillée, puis additionnés de 960 cm3 d'isopropanol et d'environ 5 100 g de cellulose Whatman type CFi.

La pâte ainsi obtenue est placée en couche régulière au sommet d'une colonne de 15 cm de diamètre, contenant 5,5 kg de cellulose Whatman CFi dans un mélange de 3 parties d'isopropanol pour 1 partie d'eau. La hauteur de la charge est de 110 cm 10 et l'épaisseur de la cellulose chargée en produit d'environ 5 cm. On élue par 27,51 d'un mélange solvant (isopropanol/eau; 3/1 en volumes) à un débit de 1,21/h, puis fait croître de façon linéaire la proportion d'eau dans le mélange jusqu'à élution par de l'eau seule au même débit (volume total de l'éluat à 15 gradient de composition = 251). Les éluats sont recueillis par fractions de 500 cm3 environ et leur densité optique est mesurée en continu par un analyseur Seive Eliograph à 280 nm. On mesure également les pouvoirs rotatoires des fractions pour la raie D du sodium, particulièrement dans la partie éluée par le gradient de composition. Le diagramme de la fig. 3, représentant l'absorption U.V. à 280 nm en fonction du numéro des fractions, présente plusieurs pics. Les fractions correspondant à ces pics qui proviennent de l'élution par le mélange isopropanol/eau (3/1 en volumes) et par le début du 25 gradient de composition ne possèdent pas de pouvoir rotatoire. Les fractions déviant le plan de la lumière polarisée sont obtenues après élution par la fin de gradient de composition. Elles contiennent encore des fractions absorbant à 280 nm.

On regroupe les fractions correspondant au pic actif sur la 30 lumière polarisée (fractions 65 à 105, soit 19,61). On élimine l'alcool par évaporation sous pression réduite (2 mm de mercure), puis on lyophilise.

On obtient ainsi 29 g de produit titrant 2950 U/mg.

35 E) Purification, phase 3

67,3 g de produits provenant de trois opérations semblables à celle décrite ci-dessus sont dissous dans 1350 cm3 d'eau distillée.

La solution est placée au sommet d'une colonne à chroma-40 tographie de 15 cm de diamètre contenant une hauteur de 110 cm de diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose Whatman,

type DE 11, environ 5 kg).

Préalablement à l'emploi, l'échangeur d'ions est lavé par 101/kg d'acide chlorhydrique 0,5N, par de l'eau, par 101/kg de soude 0,5N, par de l'eau et finalement est équilibré dans un tampon contenant 3,025 g par litre de tris(hydroxyméthyl)-aminométhane et ajusté à pH=8,0 par 26 à 27 cm3 d'acide chlorhydrique N.

La colonne est éluée par 32 1 du même tampon avec un débit de 1,2 1/h. Les éluats sont recueillis par fractions de 320 cm3 environ et leur absorption est mesurée en continu par un analyseur L.K.B. Uvicord type I à 254 nm pour détecter les impuretés protéiques.

55 On mesure également les pouvoirs rotatoires des fractions pour la raie D du sodium.

Le diagramme de la fig. 4, donnant l'absorption U.V. à 254 nm en fonction du numéro des fractions, présente 2 pics. Les fractions 35 à 50 (soit 4,8 1) qui correspondent au premier de ces pics possèdent un pouvoir rotatoire notable pour la raie D du sodium. Les fractions 35 à 50 sont réunies, concentrées au dixième de leur volume et dialysées à +4°C contre 3 fois 501 d'eau. Le dialysat est lyophilisé.

On obtient ainsi 15,85 g de produit pur titrant 9430 Ul/mg.

20

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3 feuilles dessins