DE3142400A1

DE3142400A1 - "neuer ss-galaktosidase-inhibitor gt-2558, seine derivate und verfahren zu seiner herstellung"

Info

Publication number: DE3142400A1
Application number: DE19813142400
Authority: DE
Inventors: Mitsuo Tondabayashi Osaka Ebata; Yoshimi Minoo Osaka Kawamura; Yukio Habikino Osaka Miyake
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1980-10-27
Filing date: 1981-10-26
Publication date: 1982-11-25
Also published as: JPS5774090A; GB2086394A; FR2492664B1; US4497797A; GB2086394B; FR2492664A1; NL8104832A; NZ198680A

Description

^ a «· ο ■ a * a * ν «. e

Γ Π

— 7 -

HoB. Bosmann ^/Bioehem. Biophys. Acta-, 26²I- (1972)_s S-berichtet j, daß die Glukosidase-Aktivität^, Insbesondere die ß-Galaktosidase-Aktivität in mit RNA Tumorvirus transformierten 3T3 Fibroblastzellen erhöht ist_o In diesem Zusammenhang wurden im Hinblick auf die Möglichkeit,, daß ß-Galaktosidase-Inhibitoren als karcinostatische Mittel verwendet werden könnten, verschiedene Untersuchungen durchgeführt und veröffentlicht, beispielsweise in der JP»OS 53-31238s The Journal of Antibiotics 28 (1975)* So looöj ibid* 32 (3) (1979), S. 212s ibid. 32 (3) (1979), S.· 217.

- - ■ .

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen neuen Stoff mit ß-Galaktosidase-inhibierender Wirksamkeit bereitzustellen und ein Verfahren zu seiner Herstellung zu schaffen» Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. 20

Der ß-Galaktosidase Inhibitor GT-2558 der Erfindung ist ein Gemisch aus A und B und weiteren untergeordneten Bestandteilen. Er kann nach üblichen Verfahren in GT-2558~A und GT-2558-B aufgetrennt werden« Ferner können diese Verbin-

düngen durch Acetylierung stabilisiert werden» Die Eigenschaften von GT-2558j, GT-2558-A. und B und ihrer Acetylderivate werden nachstehend erläutert« Gegenstand der Erfindung sind nicht nur diese Verbindungen sondern auch ihre pharmazeutisch verträglichen Salze»
30

(1) GT-2558

a) Stoffart

Schwach basisches Pulver

b) Löslichkeit
35

Frei löslich in Wasser,, löslich in Methanol,,

Γ Π

-δι Essigsäure und Pyridin, etwas löslich in Äthanol und Propanol, unlöslich in Aceton, Diäthyläther, Essigsäureäthylester, Chloroform und Benzol.

c) Farbreaktion

Ninhydrin-Reaktion positiv

Silberspiegel . positiv

Tollens-Reaktion (mit Phloroglucin und Salzsäure) ' gelb

d) UV-Spektrum

■ Keine charakteristische Absorption

e) Dünnschichtchromatogramm auf einer Kieselgelplatte Rp = 0,29 (entwickelt mit einem Gemisch aus Acetonitril, Essigsäure und Wasser im Verhältnis 5:1:2)

f) Spezifische ß-Galaktosidase-hemmende Wirkung 55 000 IU/mg (IC₅₀: 0,004-5 meg)

(2) GT-2558-A

a) Schmelzpunkt
106 bis 108°C

b) Molekulargewicht (Massenspektrum) Größte Masse m/e = 302

c) Elementaranalyse

Gefunden, £: C: 41,34; H: 6,16; N: 7,43; 0: 45,θ6 ' d) IR-Spektrum

' ²⁹⁰⁰' ^l6k0> ¹^, !505» 1455, 1415, 1360, 1300, 1270, il60, 1110, 1075» 1035, 955, 930,

890, 855, 795 cm"¹.
30

e) NMR-Spektrum
Fig. 1 und Fig. 2

f) ß-Galaktosidase-hemmende Wirksamkeit

- 9

1 )

Enzym	pH bei	Herkunft	^IC50 mcq
Taka ß- Gaiaktosidase		Asüergillus oryzae	0,.00l8
I!	^ 5	(Sankyo)	o_soo^5
Galantase			O_a0045
Rinder ß- Galaktosldase	7,2	⁵⁵ (Tokyo Tanabe)	26^6
Rinderleber. (Sigma)

15 20 25 30 35

g) Spezifische ß-Galaktosidase-hemmende Wirksamkeit 156 700 IU/mg (IC₅₀S O₅0018 meg)

(3) Acetyl-GT-2558-A

a) Stoffart

Farblose feine Kristalle (umkristallisiert aus einem Gemisch von Benzol und Methanol)

b). Löslichkeit

Löslich in Methanols Äthanol* Chloroform., Dioxan und Wasser, etwas löslich in Essigsäureäthylester, unlöslich oder kaum löslich in Tetrachlorkohlenstoff und Benzol=

■c) Farbreaktion

Ninhydrin-Reaktion positiv

Umsetzung mit ammoniakali-

schem Silbernitrat positiv

d) Schmelzpunkt und Zersetsungspunkt Schmelzpunkts 4l°Cj Zersetzungspunkts 149 *>

e) Spezifische Drehung

fej^i +2.9_S6° (c 1,0 Methanol)

f) Molekulargewicht (Massenspektrum) Größte Masse m/e =^91 (M + 1)

153°C

L.

g) Elementaranalyse

Gefunden,'%: C: 51,30; H: 6,27; N: 5,65; 0: 36,78 h) UV-Spektrum " " Keine charakteristische Absorption i) m-Spektrum

^3k3O> ^Z920> ^X7k5> ¹⁶3O» ^35, 1390, 1370, 1245, 1090, 1040, 820, 76Ο cm"¹.

j) NMR-Spektrum
Fig. 4 .

k) Spezifische ß-Galaktosidase hemmende Wirksamkeit 0,5 Iü/mg (IC₅₀ 500 meg)

(4) Acetyi-GT-2558-B
a) Stoffart

Farblose feine Kristalle (umkristallisiert aus einem Gemisch von Essigsäureäthylester und Methanol)

b) Löslichkeit

Löslich in Methanol, Äthanol und Wasser, etwas löslich in Essigsäureäthylester und Chloroform, unlöslich oder kaum löslich in Tetrachlorkohlenstoff und Benzol

c) Farbreaktion

Ninhydrin-Reaktion ■ positiv

Umsetzung mit ammoniakali-

schem Silbernitrat· positiv

d) Schmelzpunkt und Zersetzungspünkt

Schmelzpunkt: 76 bis 78⁰C;

Zersetzungspunkt: I6I bis 163⁰C

e) Spezifische Drehung

£>ΰψι +13,8° (c 1,0 Methanol)

f) Molekulargewicht (Massenspektrum) Größte Masse m/e = ^29 (M + 1)

g) Elementaranalyse

Gefunden, #: C: 46,58; H: 6,58; N: 6,56; 0: 38,51 h) UV-Spektrum " ' '

Keine charakteristische Absorption 35

Γ . . Π

- 11 -

ι i) IR-Spektrum

²⁹³⁰' ²⁷³⁵' ²^⁶⁰' ^l6k0> 1550, 1435,

1380, 1245, 1195, 1115. 109O₅ 1045, 8?5, 815 cm""¹.

j) NMR-Spektrum

FIg. 3
k) Spezifische ß~Galaktosidase~hemmende Wirksamkeit

1 640 IU/mg (IC₅₀? a,15 meg)ο

Die ß-Galaktosldase-hemmende Wirksamkeit und die spezifische ß-Galaktosidase-hemmende Wirksamkeit in. den vorstehenden Aufzählungen der Eigenschaften werden durch colorimetrische Bestimmung von ο-Nitrophenol gemessen_s das bei der durch ß-Galaktosidase katalysierten Hydrolyse des Substrates o-Nitrophenyl ß~D-Galaktopyranosid freigesetzt wird» Dazu wird zu 0,25 ml Lösung von ß-Galaktosidase_s gelöst In 0,1 M Essigsäurepuffer (pH 5_s0)₅ 0₅25 ml Lösung zugesetzt, die die zu prüfenden Verbindungen enthält. Das erhaltene Gemisch wird 10 Minuten bei 30⁰C inkubiert _s dann mit 0*5 ml O₅Ol M Substratlösung von o-Nitrophenyl ß~D-Galaktopyranosid, gelöst in den vorstehend genannten Puffern,vermischte Das Gemisch wird erneut I5 Minuten bei JO⁰C inkubiert<, Die Umsetzung wird durch Zugabe von 1 ml IM Natriumcarbonat angehalten. Darauf wird das Gesamtvolumen durch Zugabe von 8 ml Wasser auf 10 ml eingestellt und die Absorption (A) bei 420 nm gemessen. Gleichzeitig wird die Absorption (B) einer Eiciiösung bestimmt,, die nur den Puffer ohne die ge» nannten zu prüfenden Verbindungen enthält«, Der Inhibitions·- grad wird aus der Formel (B - A) / B χ 100 berechnet. Es wird ß-Galaktosidase verwendet _s die aus Taka-Diastase (Sankyo Co.) hergestellt ist» Eine Einheit der hemmenden 'Wirksamkeit (1 IU) ist als die Menge einer zu prüfenden Verbindung definiert, die für SOprozentige Inhibierung ₀) der ß-GalaktosIdase-Äktlvität unter den vorstehend

Γ "" " Π

genannten Bedingungen erforderlich ist.

Das GT-2558 ist ein neuer ß-Galaktosidase-Inhibitor, da seine Eigenschaften von den bekannten ß-Galaktosidase-Inhibitoren■verschieden sind. Als ein Mikroorganismus, der das GT-2558 erzeugt, wurde der Stamm PA-5726 aus einer Bodenprobe isoliert, die in Nakadori Island, Minami-Matsuura District, Nagasaki Pref., Japan, gesammelt wurde. "

Dieser Stamm wurde unter Klassifikationsgesichtspunkten als ein Stamm der Gattung Streptomyces lydicus bestimmt> Der Stamm PA-5726 wurde als Streptomyces lydicus PA-5726, FERM-BP 6l, bei Agency of Industrial Science & Technology, ATCC Nr. 31975, hinterlegt.

Die taxonomischen Eigenschaften dieses Stamms sind nachstehend aufgeführt:

(a) Morphologische Eigenschaften (Benett's Agar, Ik- Tage Kultur bei 28⁰C) ' ~

Es werden weder Sporenbehälter (Sporangium), Flagellatsporen (Geiselsporen), noch ein Dauermycel (Sclerotium)

festgestellt sowie keine Aufspaltung durch Fragmentierung 25

in Substrat Pilzfäden (Hyphae). Auf diesem Medium bildet der Stamm zahlreiche Lüfthyphae, die sich zu vielen Spiralen entwickeln. Die Oberflächenstruktur der Sporen erscheint unter dem Elektronenmikroskop glatt. In diesem Stamm wird die Oberfläche der Kolonie im Lauf der Zeit

feucht und wird sozusagen hygroskopisch. Ihre Farbe ändert sich in schwarz.

(b) Kultur auf verschiedenen Medien (I^ Tage kultiviert

Farbausdruck in Übereinstimmung mit "Guide to Color Standard"

L J

α β ί· ι*

β »«α

(Herausgebers Japan Color Institut),

Medium	Wachs tum	Lufthyphae	Farbe der Substrat- hyphae	LSsIi- ! ehe s Pigment
Sucrose . Nitrat Agar	befrie digend	Bildung Farbe	blaßgelb lich braun	nein
Glucose . Asparagin Agar	M	nein	St	«
Glycerin . Asparagin Agar	gut	befrie- hellbraun= digend lieh grau	St	S3
Anorganisches Salz . Stärke Agar	π	gut	!!	Si '
Tyrosin Agar	J!	bräunlich " grau ψ) .	gelblich braun	M
Nähr-Agar	t!	" hellbräun lich grau		!!
Hefeextrakt . Malzextrakt Agar	It	nein	8!	St
Hafermehl Agar	t!	bräunlich gut grau -f)	blaßgelb lich braun	SI
Bennett's Agar	η		gelblich braun	S!

Die Oberfläche der Kolonie ist befeuchtet und wird sozusagen hygroskopisch und ändert ihre Farbe in schwarz.

Wachstumstemperatur (Bennett's Agar^ 2 Wochen Kultur bei jeder Temperatur! das Wachstum bei 1O°C wird auch nach 3 Wochen beobachtet)

2 Wochen Beobachtungs Kaum Wachstum

3 Wochen Beobachtung? Gute Wachstumsbildung Lufthyphae befriedigend

10°C;

28°C: Wachstum j Entstehung von Lufthyphae und Sporenbildung Jeweils gut

57°C: Kein Wachstum

45⁰C: Kein Wachstum
5

(c) Physiologische Eigenschaften (14 Tage Kultur bei 28⁰C)

Verflüssigung von Gelatine positiv

Erzeugung von Melanoidpigment negativ

Tyrosinase-Reaktion negativ

Peptonisierung von Milch positiv

Koagulation von Milch positiv

Hydrolyse von Stärke positiv

(d) Verwendete Kohlenstoffquelle Für das Wachstum stark benötigte Zucker L-Arabinose, D-Xylose, D-Glukose, D-Fructose, Sucrose, Inosit, Raffinose und D-Mannit

Das Wachstum etwas beeinflussender Zucker: L-Rhamnose

Aus der vorstehenden Beschreibung verschiedener Eigenschaften geht hervor, daß der Stamm zur Art Streptomyces gehört.

m Waksman's "The Actinomycetes", Bd. 2 (1961), Shirling and Gottlieb's""International Streptomyces Project" report, /"international Journal of Systematic Bacteriology", Bd. (1968), S. 69 und S. 279, ibid. Bd. 19 (I969), S. 391, ibid. Bd. 22 (1972), S. 2657, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 8. Ausgabe (1974), und anderen Publikationen von neuen Arten von Actindmyceten, wurden die dem Stamm PA-5726 nahe verwandten Arten recherchiert. Streptomyces lydicus /international Journal of Systematic Bacteriology,

Bd. 19 (1969), S. 448, Bergey's Manual of Determinative 35

Bacteriology, 8. Ausgabe (1974), S. 772 und S. 777

und US-PS 3 160 560 (1964)7 erweist sich als die am'näch-L J

O Λ I

fi ^ O JI Ci# ϋ α ί>

Γ Π

- 15 -

sten verwandte Art. Beim Vergleich von verschiedenen Eigenschaften des Stamms PA-5726 mit den in den genannten Veröffentlichungen beschriebenen Stämmen von Stregtomjces_ lydicus wird eine gute Übereinstimmung festgestellt. Deshalb wird der Stamm PA-5726 als ein Stamm bestimmt^ der zu der Art Streptomyces lydicus gehört und mit Streptomyces lydicus PA-5726 bezeichnet.

Erfindungsgemäß können nicht nur der Stamm PA-5726 und seine natürlichen und künstlichen Varianten _s sondern auch alle Stämme, die.zur Art Streptomyces lyjlcus gehören und GT-2558 erzeugen, verwendet werden« Auch sie sind Gegenstand der Erfindung.

Die Herstellung von GT-2558 umfaßt die Kultivierung eines GT-2558 erzeugenden Stammes auf einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen und die Gewinnung des GT-2558 aus der Kulturbrühe nach der Kultivierung« Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von GT-2558 wird nachstehend beschrieben.

In bezug auf die· Komponenten des Mediums und die Kulturbedingungen können die bei der Herstellung von Antibiotika üblichen verwendet werden. Das Medium enthält im wesentliehen Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und anorganische Salze. Falls erfordernch_s können Vitamine oder Vorstufen zugegeben werden. Als Kohlenstoffquellen werden beispielsweise Glucose, Stärke,, Dextren* Glycerin^ Molassen und organische Säuren allein oder als Gemisch verwendet_o Als Stickstoff quellen werden beispielsweise Sojabohnenmehl,, Maiseintauchflüssigkeitp Fleischextrakt _g Hefeextrakt^ Baumwollsaatmehli Pepton^ Weizenkeimlinge _s Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat allein oder als Gemisch verwendet. Als anorganische Salze kommen beispielsweise Calciumcarbonate Ha-

triumchlorid* Kaliumchlorid,, Magnesiumsulfat, Kobalt(IX)-ehlorid und verschiedene Phosphate als Zusätze zu dem Me-

L J

Γ Π

ι dium in Präge, wenn sie erforderlich sind.

Die Kultivierung kann in Übereinstimmung mit den üblichecweise zur Herstellung von Antibiotika verwendeten Verfahren durchgeführt werden, vorzugsweise in flüssigem Medium unter submers aeroben Bedingungen im Fall einer Herstellung in großem Maßstab. Wenn eine Änderung des pH-Wertes des Mediums eintritt, kann dem Medium ein Puffer, wie CaI-ciumcarbonat, zugesetzt werden. Die Kultivierung wird vorzugsweise bei 20 bis ¹K), insbesondere bei 25 bis 32⁰C, durchgeführt. Die Kultivierungsdauer kann sich innerhalb verhältnismäßig weiten Grenzen in Abhängigkeit vom Maßstab der Fermentierung ändern. Beispielsweise sind etwa 20 bis 8o Stunden bei der Herstellung im großen Maßstab erforderlich. Falls während der Kultivierung starkes Schäumen eintritt, können beispielsweise Antischaummittel, wie Pflanzenöl, Lard oder Polypropylenglykol vor oder während der Kultivierung zugesetzt werden.

Nach Beendigung der Kultivierung kann ein übliches Verfahren zur Gewinnung von Fermentationsprodukten·in geeigneter Weise zur Abtrennung des GT-2558 von der Kulturbrühe verwendet werden. Beispielsweise können Filtration, Trennung durch Zentrifugieren, Adsorptions-Desorptions-Verfahren und Chromatographie mit verschiedenen Ionenaustauscherharzen und anderen Adsorbentien sowie"Extraktion mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln angewendet werden, vorzugsweise in geeigneter Kombination. Außerdem kann das Acetylderivat von GT-2558 als Mittel zur Reinigung abgetrennt werden. Um das Acetylderivat zu erhalten, wird rohes GT-2558 Pulver in Essigsäure gelöst. Sodann wird eine überschüssige Menge Essigsäureanhydrid zugesetzt und das Gemisch bei Raumtemperatur unter Rühren reagieren gelassen. Dabei kann zur Verhinderung der Zersetzung von GT-2558 gewünschtenfalls die Verwendung eines geeigneten Stabilisators in der Abtrennstufe in Betracht kommen.

et ö

^Γ 17

ι Gelegentlich ist es bevorzugt* daß das GT-2558 aus Gründen der Abtrennverfahren und der medizinischen Verwendung hei Mensch und Tier in ein Salz umgewandelt wirdo Spezielle Beispiele für geeignete Säuren* die mit GT-2558 Salze bilden, sind anorganische Säuren,, wie Salzsäure, Brorraiasserstoffsäure, Jodwasserstoffsäure^ Schwefelsaures Salpetersäure, Phosphorsäure und Kohlensäure_s sowie organische Säuren, wie Essigsäure^ Fumarsäure;, Apfelsäure^ Weinsäure., Maleinsäure, Citronensäure, Mandelsäure, Ascorbinsäure und Gallussäure.

Wie bereits erwähnt, ist GT-2558 ein Gemisch von A₅ B und weiteren weniger bedeutenden Komponenten, GT-2558 kann deshalb, falls gewünscht, weiter in jede dieser Korn= ponenten aufgetrennt werden. Zu dieser Trennung eignen sich beispielsweise verschiedene chromatographische Mit= tel und Gelfiltration. Acetylierung und Salzbildung wie vorstehend erläutert können ebenfalls verwendet werden»

GT-255Ö* seine Komponenten und Acety!derivate und seine· pharakologisch verträglichen Salze können als Reagentien ' zur Bestimmung der ß-Galaktosidase-Aktivität verwendet werden, wobei sie als ß-Galaktosidase-Inhibitoren wirken« Wie vorstehend gezeigt, können diese Verbindungen als karcinostatische Mittel Verwendung finden„ In diesem Fall können sie Mensch oder Tier oral oder parenteral verabreicht werden. Die Verbindungen können zusammen mit üblichen Verdünnungsmitteln, Stabilisatoren* Konservierungsmitteln, Benetzungsmitteln und oberflächenaktiven Stoffen,, oral als Tabletten^, Kapseln und Pulver oder parenteral als In^ektionspräparates Einreibemittel (Liniment) und Suppositorien verabreicht werden« Die Dosierung hängt vom therapeutischen Zweck, dem Alter und dem Zustand des Patienten und ähnlichen Faktoren ab„

^Γ - 18 - " . · ■

In der Zeichnung zeigen die Fig. 1 und 2 die NMR-Spektra von GT-2558-A, gemessen in Deuteronm ethanol bzw. D^-Pyridin. Fig. 3 zeigt das IMR-Spektrum von Aeetyl-GT-2558-B, gemessen in Deutercmethanol. Fig. k zeigt das NMR-Spektrum von Acetal-GT-2558-A, gemessen in Deuteroimethanol.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel" 1 Jeweils 100 ml Medien vom pH-Wert 7*0, enthaltend 1,056 Glucose, 0,2 % Casaminosäure, 0,2 $ Hefeextrakt und 0,1 % Fleischextrakt werden in 500 ml Schüttelkolben eingebracht und 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Dadurch werden Medien zur Saatkultur erhalten.

Eine Platinschleife der Schrägkultur, erhalten aus einem Stamm Streptomyces lydicus PA-5726, ATCC Nr. 31975, wird auf die vorstehend genannten Medien zur Saatkultur überimpft und unter Schütteln bei 28⁰C, I4o Hin- und Herbewegungen pro Minute und 7 cm Amplitude für 2 Tage kultiviert, um die Saatmaische zu erhalten.

Außerdem wird 0,1 % Lard zu einem Medium, mit dem pH-Wert 7,0 zugesetzt, das 4,0 % Glycerin, 1,5 # Fleischextrakt, 1,5 % Pepton, 0,076 % KCl, 0,0^2 % MgCIg.6H₃O, 0,0024-5 % PeCL₃,.6H₀O, 0,00219 % ZnSOh.7H_o0 und 0,00l8l % MnCl_o.4Hp0 enthält. Jeweils 80 ml dieses Mediums werden in 500 ml Schüttelkolben gebracht und 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Das erhaltene Produkt wird als Hauptfermentations-

medium verwendet. Die vorstehend genannte Saatraaische wird auf das Fermentationsmedium bei 2 % Gehalt überimpft und unter Schütteln bei 28°C, I¹K) Hin- und Herbewegungen pro Minute und 7 cm Amplitude 6 Tage lang kultiviert.

In dieser Kulturbrühe reichert sich der ß-Galaktosidase-

Inhibitor GT-2558 (48 100 IU/mg, IC₅₀ = 0,0052 mcl) an. L J

- I₉ -

. . Beispiel 2 Gemäß Beispiel 1 werden 8 Liter Hauptfermentationsmedium zur Kultur verwendet. Unmittelbar nach Beendigung der Kultur wird der Organismus durch Zentrifugieren abgetrennt _s wobei 6,3 Liter klares Filtrat erhalten werden=

Dieses Filtrat wird durch Zugabe von Salzsäure auf den pH-Wert 4,5 eingestellt und mit 94,5 g (1₅O5 %) Aktivkohle versetzt, an der unter Rühren für 30 Minuten Pigmente und Verunreinigungen absorbiert werden» Danach wird mit Hilfe von Celit filtriert, wobei 6,9 Liter klares Filtrat erhalten werden.

Dieses Filtrat wird durch 2 Liter eines stark basischen Anionenaustauscherharzes vom OH-Typ (Dowex -1x8, Dow

.geschickt
Chemical Co. J₃ um anionische Stoffe zu entfernen.

Die erhaltene Lösung wird sodann durch eine Säule mit 1 Liter eines stark sauren Kationaustauscherharzes vom H-Typ (Dowex - 50 W χ 8) geschickt, an dem GT-2558 adsorbiert

wird. Danach wird mit ausreichend Wasser gewaschen und mit 0,5 N Salzsäure eluiert.

Die eluierteri Fraktionen mit der ß-Galaktosidase inhibierenden Aktivität werden gesammelt und sofort durch Ent-

·

fernung überschüssiger Chloridionen mit einem schwach ba

sischen Anionenaustauscherharz vom OH-Typ (Amberlit Rohm & Haar Co.) neutralisiert» Dabei werden 400 ml GT-2558 Lösung erhalten. Die ß-Galaktosidase hemmende Wirkung dieser Lösung beträgt 454 500 IU/ml (IC_Kn = O_sOOO55 mcl)„

B e i s ρ .1 e 1 3

Die in Beispiel 2 erhaltene GT-2558 Lösung wird durch Lyophilisieren eingeengt, wobei ein gelblich-brauner öliger Stoff erhalten wird^ d.er in einer kleinen Menge 80-prozentiges Methanol gelöst wirdo Der Rückstand wird filtriert. Das Filtrat wird sodann mit 10 Volumenteilen Aceton

3 1 41 '-·< υ υ

Γ * ~1

- 20 - .

versetzt. Der ausgefallene Niederschlag wird von der überstehenden Acetonlösung abzentrifugiert.

Der Niederschlag wird erneut in einer kleinen Menge Methanol gelöst und nach und nach mit 5 bis 10 Volumenteilen Essigsäureäthylester versetzt. Es bildet sich ein Niederschlag, der abfiltriert und getrocknet wird. Es wird ein blaß-gelbes pulverförmiges Rohprodukt GT-2558 erhalten. Ausbeute: 8,090 mg. Die ß-Galaktosidase hemmende Wirkung dieses rohen Ί0 Pulvers beträgt 20 000 IU/mg (IC₅₀ = 0,013 meg). In dem

beschriebenen Verfahren wird dieser Stoff in einer Ausbeute von mehr als 50 % erhalten.

Beispiel 4

800 mg des in Beispiel 3 erhaltenen rohen pulverförmigen Produktes werden in einer kleinen Menge 80prozentiges-Methanol gelöst, auf eine Säule (2,6 cm Durchmesser . 100 cm) mit einem schwach basischen Anionenaustauscherharz vom OH-. Typ (Amberlit IRA 47) in 8oprozentigem Methanol aufgebracht und mit dem gleichen 8oprozentigen Methanol als Entwickler eluiert. Das Eluat wird als 6 g Fraktionen gesammelt. ß-Galaktosidase hemmende Wirkung wird in den Fraktionen Nr. 53 his 90 festgestellt. Diese aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck ein-

gedampft. Ausbeute: 262 mg blaß-gelbliches Pulver. Die hemmende Wirkung dieses rohen Pulvers beträgt 35 600 IU/mg (IC₅₀ = 0,007 meg) und die Ausbeute 58,3 j£.

Beispiels 30

400 mg des pulverförmigen Rohprodukts von Beispiel 4 werden erneut in einer kleinen Menge 80prozentiges Methanol gelöst und auf eine Säule (3*1 cm Durchmesser.I30 cm) aufgebracht, die Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemical Co.),

equilibriert mit 80 # Methanol enthält, und mit dem glei-35

chen 80prozentigen Methanol als Entwickler eluiert. Das Eluat wird als 4 g Fraktionen gesammelt. Die ß-Galaktosi-

L J

dase hemmende Wirkung wird in den Fraktionen Nr, 125 bis " 135 festgestellt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampfte Ausbeute; 214 mg farbloses Pulver. Die hemmende Wirkung dieses pulverförmigen Rohprodukts beträgt 55 000 IU/mg (IC,-₀ = O₅₁OO¹I-S meg) und die Ausbeute 82,7 %.

Beispiel β 155 nig pulverförmiges Rohprodukt gemäß Beispiel 5 werden in einer kleinen Menge 0,2 N Pyridin-Essigsäure-Pufferlösung gelöst, auf eine Säule (2 cm Durchmesser„72 cm) mit. einem stark sauren Kationenaustauscherharz (Dowex-50 Ws8o) aufgebracht, die ausreichend mit der gleichen Pufferlösung equilibriert ist, und mit der gleichen Pufferlösung als Entwickler eluiert. Das Eluat wird in 7 g Fraktionen gesammelt. ß-Galaktosidase hemmende Aktivität wird in den Fraktionen 122 bis I58 und 141 bis I60 festgestellte Mit der Bezeichnung GT-2558-A und B in der Reihenfolge der Eluierung betragen die Ausbeuten 57*2 % (A) bzw* 18^3 % (B). Die Fraktionen werden unter vermindertem Druck getrennt eingedampft. Ausbeute; 57 mg GT-2558-A als hellgelbes Pulver mit einer hemmenden Wirkung von 75 500 IU/mg (IC₅₀ = 0,0054 meg) und 54 mg GT-2558-B als braunes Pulver mit einer hemmenden Wirkung von 24 500 IU/mg (lCj-₀ =

0,010 meg). .

Beispiel 7

57 mg pulverförmiges GT-2558-A gemäß Beispiel 6 werden in einer kleinen Menge 70prozentiges Äthanol gelöst^, auf eine Säule (2,6 cm Durchmesser»95 cm) Sephadex LH»20\auf-> gebracht, die mit 70prozentigem Äthanol equilibriert ist_s und mit dem gleichen 70prozentigen Äthanol als Entwickler eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von 5 S gesammelt= Die ß-Galaktosidase hemmende Aktivität wird in den Fraktionen Mr. 80 bis 95 festgestellte Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft_o

L ' J

Ausbeute: 32,6 rag farbloses Pulver mit einer hemmenden Aktivität von 117 8oo IU/mg (IC₅₀ = 0,0021 meg). Dieses farblose Pulver wird wiederholt aus einer geringen Menge eines Gemisches von Lösungsmitteln (Isopropanol-Kthano.l) umkristallisiert. Ausbeute: 19,4 mg GT-2558-A als farblose feine Kristalle mit einer hemmenden. Aktivität von 136 700 IU/mg (IC₅₀ = 0,0018 meg).

Beispiel 8 500 mg rohes pulverförmiges GT-2558 (IC₅₀ - 0,007 meg)-gemäß Beispiel 4 werden unter Eiskühlung in 10 ml Essigsäure gelöst, unter Rühren nach Zugabe von 10 ml Essigsäureanhydrid auf Raumtemperatur erwärmen gelassen und durch weitere Zugabe von 10 ml Essigsäureanhydrid acetyliert. Die Umsetzung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt und durch Zugabe von Alkohol beendet. Das Gemisch wird sodann unter vermindertem Druck in Gegenwart von Toluol eingeengt. Es wird Acetyl-GT-2558 als gelbes öl erhalten. Dieser Stoff wird durch Dünnschiehtchromatographie auf einer Kieselgelplatte mit Hexan, Chloroform und Methanol im Verhältnis 30 : 30 : 12 als Lösungsmittelsystem untersucht. Dabei wird das Acetyl -GT-2558-A bei einem R-,-Wert von O,4o und das Acetyl-GT-2558-B bei einem R^-Wert von 0,05 aufgefunden.
■·

Beispiel 9

Das Acetyl-GT-2558 in Form des gelben Öls gemäß Beispiel 8 wird in einer kleinen Menge Methanol gelöst, auf eine Säule (1,7 cm Durchmesser.ho cm) mit 50 g Kieselgel

aufgebracht," die mit Hexan, Chloroform und Methanol im Verhältnis 30 : 30 : I5 als Lösungsmittelsystem equilibriert ist und mit ho ml des gleichen Lösungsmittel- . systems sowie danach mit einem Lösungsmittelsystem aus Hexan, Chloroform und Methanol im Verhältnis 30 r 30 :

eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von 5 g gesammelt und durch Dünnschichtchromatographie auf einer Kieselgel-

L J

o U/.-'iUU ■■■-::. " : - *.-"

Γ -η

- 23 -

platte untersucht. Dabei ergibt sich, daß das Acetyl-GT-2558-A in den Fraktionen Nr. 30 bis 42 und das Acetyl-GT-2558-B in den Fraktionen -Nr. 115 bis 210 eluiert wurde. Die aktiven Fraktionen werden getrennt vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Acetyl~GT-2558~A und B werden jeweils als gelbe öle erhalten„

Beispiel 1 0 Das Acetyl-GT-2558-A in Form des gelben Öls gemäß Beispiel 9 wird zur Reinigung wiederholt an einer Kieselgelsäule chromatographiert. Dabei wird das Lösungsmittelsystem aus Hexan, Chloroform und Methanol im Verhältnis 30 : 30 : 6 verwendet. Es wird ein durchsichtiges farbloses öl erhalten, das in einer kleinen Menge Methanol gelöst und aus einem Gemisch von Benzol und Methanol umkristallisiert wird. Ausbeute: 5O₅8 mg Acetyl-GT-2558-A als farblose feine Kristalle. Die ß-Galaktosidase hemmende Wirkung dieses Produkts beträgt 0,5 IU/mg (IC_15n = 500 meg)-

on

Beispie 111

Das Acetyl-GT-2558-B in Form des gelben Öls gemäß Beispiel 9 wird zur Reinigung wiederholt an einer Kieselgelsäule chromatographiert, wobei ein Lösungsmittelsystem aus Hexan, Chloroform und Methanol im Verhältnis 30 ι 30 ; 20 verwendet wird. Anschließend wird das Produkt aus einem Gemisch von Essigsäureäthylester und Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 12,7 mg farblose feine Kristalle» Die ß-Galaktosidase hemmende Wirkung dieses Produkts beträgt 1 64O IU/mg (IC₁-,- = 0,15 meg)»
'50

Fraktionierte Enzymbestimmungen von ß-Galaktosidasen (Beispiele 12 bis 18)

Beispiel 12 35

Es werden Enzymlösungen als ein Gemisch von Rinderleber

ß-Galaktosidase-Lösung (A) mit Aspergillus ojgyzgg, ß-L j

Γ . ~1

Galaktosidase-Lösung (B) in einem Verhältnis von 4 : 0, 3 : 1, 2 : 2, 1 : J> und 0 : 4 (V/v) hergestellt.

0,5 ml Substrat ο,ΟΐΜ o-Nitrophenyl-ß-D-galaktopyranosid-(ONPG) Lösung ,· gelöst in Mcllvaine-Puff er vom pH-Wert 4,5/werdend),25 ml der GT-2558-A Lösung in dem

und

genannten Puffer/0,25 ml der genannten Enzymlösung versetzt. Die Enzymreaktion wird 15 Minuten bei 37° C durchgeführt. Die Konzentration von GT-2558-A beträgt dabei

m -4

^ιυ 1,9 χ Io M. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 1 ml IM Natriumcarbonat angehalten. Danach wird das Gesamtvolumen durch Zugabe von 8 ml Wasser auf 10 ml eingestellt. Die Enzymaktivität (a) wird sodann durch Messung der Absorption bei 420 nm bestimmt. Gleichzeitig wird bei einer Blindprobe der Puffer ohne Gehalt an GT-2558-A zugegeben, die Enzymreaktion durchgeführt, die Absorption gemessen und die Enzymaktivität (t) bestimmt. Die Differenz zwischen den Werten t und a ist die Menge der ß-Galak-

tosidase-Aktivität, die durch GT-2558-A inhibiert wird ■ 20

(b = t - a). In Bezug auf den Ausdruck für die Aktivität

ist eine Einheit der Aktivität (1 U) als die Aktivität des Enzyms definiert, die ein pMol ONPG pro Minute hydrolysiert und o-Nitrophenol freisetzt. In dieser Weise werden die Mengen an Rinderleber-ß-Galaktosidase-Aktivität 25

(a) und Aspergillus oryzae ß-Galaktosidase-Aktivität (b) fraktioniert bestimmt Werten.

In Tabelle I sind die Ergebnisse aufgeführt. Sie zeigen eine gute Übereinstimmung zwischen den praktischen Werten aus der Enzymbestimmung und den durch Berechnung ermittelten theoretischen.

Beispiel 1 3 Enzym A : Rinderleber ß-Galaktosidase

Enzym B : Rattenleber ß-Galaktosidase Substrat : 0,01 M ONPG

L J

Inhibitor : 1,9 χ 1θ"⁵Μ GT-2558-A Bedingungen (bei der

Umsetzung) : ' Mcllvaine Puffer (pH-¥ert 4,5),

27°C, 15 Minuten '

Das Verfahren wird gemäß Beispiel 12 durchgeführt * Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben.

Beispiel H

Enzym A : Rinderleber ß-Galaktosidase

Enzym B : Rattennieren ß-Galaktosidase

Substrat : 0,0lM ONPG

Inhibitor : 1,9 x 1O~V GT-2558-A

Bedingung ; Mcllvaine Puffer (pH-Wert 4*5) _s

'⁵ 57°C, 15 Minuten

Das Verfahren wird gemäß Beispiel 12 durchgeführte Die Ergebnisse sind in Tabelle III angegeben=

Beispiel 15

Enzym A : Rinderleber ß-Galaktosidase

Enzym B s Rattenmilz ß-Galaktosidase

Substrat : O₅OlM ONPG

Inhibitor : . 1,9 x 10"⁵M GT-2558-A

Bedingung : Mcllvaine Puffer (pH-Wert 4,5),

37°C, 15 Minuten

Das Verfahren wird gemäß Beispiel 12 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV angegeben»

Beispiel

Enzym A % Rinderleber ß-Galaktosldase Enzym B : Aspergillus ory_zae ß-Galaktosidase

. Substrat ; 0,01M ONPG ■ ' «.Κ ~

Inhibitor : 1,9 x 10 ³M GT-2558-A Bedingung ■% Mcllvaine Puffer (pH-Wert 7*2),

57°C_a 15 Minuten '

L J

3U24UU

- 26 -

W «

Das Verfahren wird gemäß Beispiel 12 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle V angegeben.

Beispiel 17

Enzym A : Rattennieren ß-Galaktosidase

Enzym B : Aspergillus oryzae ß-Galaktosidase

Substrat : Ο,ΟΐΜ ONPG

Inhibitor : 1,9XlO^-6M GT-2558-A

Bedingung : Mcllvaine Puffer (pH-Wert 7*2),

' 37⁰C, 15 Minuten '

Das Verfahren wird gemäß Beispiel 12 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI angegeben.

Beispiel. 18

Enzym A : Rinderleber ß-rGalakt ο sidase

Enzym B : Ej_ coli ß~Galaktosidase

Substrat : Ο,ΟΐΜ ONPG

inhibitor : 4,8 χ 10"⁵M GT-2558-A

Bedingung : Mcllvaine Puffer (pH-Wert 7,2),

37°C, 15 Minuten '

Das Verfahren wird gemäß Beispiel 12 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII angegeben. 25

L J

31 A 2 'V O G

- 27 -

Ta belle Nr.	Herkunft der - gemischten ß-Galaktosi- dase	pH- Wert	.Konzen-, tration des GT- 2558-A (M)	Enzym- Aktivi tat	>bensPraktischer Wert -unten jTheoreti scher Werfe
I	Sl Rinderleber 3 Aspergillus pryzae		L,9x10"	t	Vo* 3/1 2/2 1/3 .0/4 (TjfaO (vM) (Tjfos) (u/ü) (ij6l)
II.	^ Rinderleber 3 Rattenleber		L>9xio""⁵	a	Ο.32 0.28 Ο.25 0.22 O.I9 Ο.32 0.28 Ο.25 0.22 O.I9
Ill·-	^- Rinderleber ₃ RattenniereE		Ij9x10"	b	b'too 0.04 0.08 0.14 0.19 0.00 0.05 0.09 o.i4 0.19
17	\ Rinderleber 3 Rattenmilz		L, 9xlO"⁵	t	Ο.32 0.24 Ο.17 0.08 0.00 Q.32 0.23 O.I6 0.08 0.00
V	^- Rinder leber ■ 3 Aspergillus oryzae	7,-2	1, 9x10" ⁵	a	O.I6 0.18 0.20 0.22 0.24 0«l6 0.18 0.20 0.22 0«24
b	0.01 O.O7 0.13 O0I9 0o24 0.00 O.O6 O0I2 O0I8 0.24
t	O.I5 0.11 O0O7 0o04 0.00 O.I6 0.12 0.08 0o04 0.00
a	Ο.35 Ο.32 Ο.29 0.26 Ο.25 Ο.35 Ο.33 0.30 Ο.27 Ο.25
b	0.01 0.08 O0I2 0.18 0.24 0.00 0.06 0.12 0.19 Ο.25
t	Ο.34 0.24 0.17-0.08 0.01 0-35 Ο.27 0.18 0.08 0.00
a	Ο.39 Ο.35 Ο.31 0.26 0.24 Ο.39 Ο.36 Ο.32 O.28 0.24
b	0.01 O.O7 0.11 O.I? 0.24 0.00 0.06 0.12 0.18 0.24
t	0.38 0.28 0.20 O.O9 0.00 Ο.39 Ο.3Ο 0.20 0.10 0.00
a	O.3O 0.28 0.27 Ο.26 Ο.26 O.3O Ο.29 0.28 Ο.27 0.26
b	0.00 O.O6 0.12 0.19 Ο.25 0.00 O.O6 -0.13 0.20 0.26
O.3O 0.22 Ο.15 Ο.Ο7 0.01 0.30 0.23 0.15 0.07 0.00

Fortsetzung .

Portsetzung

VI

A

Rattennieren

7,2

4,8xlO~⁵

t

0
0

UJUO
UJUJ

0.32
O.33

O
O

•32
• 32

0.31
0.31

O
O

•30
•30

B

Aspersillus

0

.01

O.O9

O

•15

0.22

O

•29

oryzae

0

.00

0.08

O

•15

Ο.23

O

.30

b

0
0

• 32
• 33

Ο.23
Ο.25

O
O

• 17
•17

O.O9
0.08

O
O

.01
.0Oj

VII

A

Rinderleber

t

0
0

CM CM

00
ίο ίο
UJUJ

O
O

« ft
ro ίο
UiUi

Ο.27
Ο.27

O
O

^Γ"ΟΝΟΝ
CM CM

B

E. coil

a

0
0

.01
.00

0.07
0.07

O

•15

0.21
0.22

O
O

•29i
•29j

b

0
0

.20
.21

0.16
O.l6

O
O

.11
.10

O.O6
O.O5

O
O

.0Oi
.0Oi
I

15

20 25 30

A: Das Enzym, das nicht vollständig durch GT-2558-A der angegebenen Konzentrationen inhibiert wird

B: Das Enzym, das vollständig durch GT-2558-A in den angegebenen Konzentrationen inhibiert wird

t: Die in Abwesenheit von GT-2558-A gemessene ß-Galaktosidase-Aktivität (Gesamtaktivität)

a: Die in Gegenwart von GT-2558-A gemessene ß-Galaktosidase-Aktivität (die Enzymaktivität von A)

br b = T - a, die Differenz zwischen T und a, der Betrag der durch GT-2558-A inhibierten Enzymaktivität (die Enzymaktivität von B)

-$-; B/A, das Mischungsverhältnis des Enzyms A und des Enzyms B.

35

Leerseit

Claims

VOSSIUS VOSSIUS- TA UCHN E»R i Kit li ή E fv/fX?N N ■ RAUH PATENTANWÄLTE SIEBERTSTRASSE 4 · 8OOO MÜNCHEN 86 ■ PHONE: (Ο89) 47 4Ο75 / CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN . TELEX 5-29 4-53 VO P AT D u.Z.:. R 509 (Ra/ko) 26, 10. 1981 Case:. P Λ265 JT SHIONOGI & CO., LTD. ' 0saka5 Japan " Neuer ß-Galaktosidase-Inhibitor GT-2558, seine Derivate . und Verfahren zu seiner Herstellung " Patentansprüche . ■£

1. GT-2558 mit den folgenden Eigenschaften und seine pharmazeutisch verträglichen Salze;

a) Stoffart

Schwach basisches Pulver

b) Löslichkeit.

Frei löslich in Wasser-, löslich In Methanols Essigsäure und Pyridine etwas löslich in Äthanol und Propanol, unlöslich in Aceton^ Diäthyläther_a Essigsäureäthylester_a Chloroform und Benzol»

c) Farbreaktion . Ninhydrin-Reaktion positiv Silberspiegel . positiv Tollens-Reaktion (mit Phloroglucin und Salzsäure) gelb

L J

10

15

20 25 30

d) UV-Spektrum

Keine charakteristische Absorption

e) Dünnschichtchromatogramm auf einer Kieselgelplatte Hg. = 0,29 (entwickelt mit einem Gemisch aus Acetonitril, Essigsäure und Wasser im Verhältnis 5:1:2)

f) Spezifische ß-Galaktosidase hemmende Wirkung " 55 000 iu/mg (IC₅₀: Ο,Οθ45 meg).

2. GT-2558-A mit den folgenden Eigenschaften und seine pharmazeutisch verträglichen Salze:

a) Schmelzpunkt 106 bis 1O8°C

b) Molekulargewicht (Massenspektrum) Größte Masse m/e =

c) Elementaranalyse

Gefunden, £: C: 4ΐ>34; H: 6,l6; N: 7,43; 0: 45,06

d) IR-Spektrum

Ϋ ^S 3400, 2900, 1640, 1565, 1505, 1455, 1415,. 1360, 1300, 1270, 1160, HlO, 1075, 1035, 955, 930, 890, 855, 795 cm"¹.

e) EMR-spektrum Pig. I und Pig.

f) ß-Galaktosidase hemmende Wirksamkeit

35

Enzym pH
bei Herkunft ^IC50 _mog Taka ß-
Galaktosidase 5,0 AsOereillus oryzae 0,0018 U 4,5 (Sankyo) o,oo45 Galantase 4,5 " ( " ) 0,0045 Rinder ß-
Galaktosidase 7,2 " (Tokyo Tanabe) 26,6 Rinderleber (Sigma)

• a O a

^Γ -3-' "

g) Spezifische ß-Galaktosidase hemmende Wirksamkeit 136 700 IU/mg (IC₅₀: 0_s00l8 meg)

3. GT-.2558-B₅ dessen Acetylderivat die folgenden Eigenschäften aufweist, und dessen pharmazeutisch verträgliche Salze:

a) Stoffart

Farblose feine Kristalle (umkristallisiert aus ' einem Gemisch von Essigsäureäthylester und Methanol)

b) Löslichkeit

Löslich in Methanol,, Äthanol und Wasser;, etwas löslich in Essigsäureäthylester und Chloroform* unlöslich oder kaum löslich in Tetrachlorkohlenstoff und Benzol

c) Farbreaktion

Ninhydrin-Reaktion positiv

Umsetzung mit ammoniakalischem Silbernitrat positiv

d) Schmelzpunkt und Zersetzungspunkt

Schmelzpunkt: 76 bis 78⁰Ci

Zersetzungspunkt: !öl bis I63 C

e) Spezifische Drehung

^i +13,8° (c 1,0 Methanol)

f) Molekulargewicht (Massenspektrum) Größte Masse m/e = 429 (M + 1)

g) Elementaranalyse

Gefunden, %% C% 46,58| Hs 6,581 Ns 6_S56| Os 38,51 h) W-Spektrum

Keine charakteristische Absorption i) IR-Spektrum

²⁹⁵°* ²⁷³⁵* ^{25β0ί) l62K)i)} ^{155Os U35s}

1380^ 12^5, II95* 1115* 1090, 1045, 875, 815 cm NMR-Spektrum

Fig. 3

L J

k) Spezifische ß-Galaktosidase hemmende Wirksamkeit 1 64o IU/mg (IC₅₀: 0,15 meg).

4. Acetyl-GT-2558-A mit den folgenden Eigenschaften und seine pharmazeutisch verträglichen Salze:

a) Stoffart ■

b) Löslichkeit

Löslich in Methanol, Äthanol, Chloroform, Dioxan und Wasser, etwas löslich in Essigsäureäthylester, unlöslich oder kaum löslich in Tetrachlorkohlenstoff und Benzol.

c) Farbreaktion

Ninhydrin-Reaktion positiv

Umsetzung mit ammoniakali-

schera Silbernitrat positiv

d) Schmelzpunkt und Zersetzungspunkt

Schmelzpunkt: 4l°C;

Zersetzungspunkt: 149 bis 153°C

e) Spezifische Drehung

^D : +29,6°. (c 1,0 Methanol)

f) Molekulargewicht '(Massenspektrum) Größte Masse m/e = 491 (M + 1)

g) Elementaranalyse

Gefunden, %: C: 51,30; H: 6,27; N: 5,65; 0: 36,78 h) UV-Spektrum

Keine charakteristische Absorption 30

i) m-Spektrum

y'SäX 3430, 2920, 1745, I630, 1435, 1390, I37O,

1245, I090, 1040, 820, 76O cm"¹, j) NMR-Spektrum Fig. 4
k) Spezifische ß-Galaktosidase heiratende Wirksamkeit 0,5 IU/ma <^IC5Q ⁵⁰°

5. Acetyl-GT-2558-B mit den folgenden Eigenschaften und seine pharmazeutisch verträglichen Salze.

L J

9 β O β
β α OQ

a) Stoffart

b) Löslichkeit

Löslich in Methanol* Äthanol und' Wasser₅ etwas löslich in Essigsäureäthylester und Chloroform* unlöslich oder kaum löslich in Tetrachlorkohlenstoff unä Benzol

c) Farbreaktion

Ninhydrin-Reaktion positiv

Umsetzung mit ammoniakalischetn Silbernitrat positiv

d) Schmelzpunkt und Zersetzungspunkt

Schmelzpunkt: J6 bis 78°C

Zersetzungspunkt; · l6l bis 163

e) Spezifische Drehung

βχ/ψ: -S-13,8⁰ (c 1,0 Methanol)

f) Molekulargewicht (Massenspektrum) Größte Masse m/e = 429 (M + 1)

. g) Elementaranalyse

Gefunden, %% Cs 46₅58j H: 6„58s Ns 6^561 Os h) UV-Spektrum" ' " ' ■

Keine charakteristische Absorption i) IR-Spektrum

1380, 12^5* 1195* 1115, 1090, /075, 815 cm"¹ 3) MR-Spektrum

Fig. 3

k) Spezifische ß-Galaktosidase-hemmende Wirksamkeit 1 64o IU/mg (IC₅₀S 0,15 meg).

6» Verfahren zur Herstellung von GT-2558,, dadurch gekennzeichnet^ daß man einen GT-2558 erzeugenden Stamm der Art Streptomyces auf einem Kulturmedium kultiviert _s das GT-2558 aus der Kulturbrühe abtrennt und gegebenenfalls in GT-2558-A und/oder GT~2558-B auftrennt=

L J

Γ "Ί

7· Arzneimittel, gekennzeichnet durch, einen Gehalt an einem der Stoffe gemäß Anspruch 1 bis 5 und übliche Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffe.

8. Verwendung der Stoffe gemäß Anspruch 1 bis 5 zur Behandlung maligner Neoplasien.

9. Verwendung der Stoffe gemäß Anspruch 1 bis 5 als Diagnostika bei ß-Galaktosidase-Mangel.

10. Verwendung der Stoffe gemäß Anspruch 1 bis 5 zur Reinigung von Enzymen.

11. Verwendung der Stoffe gemäß Anspruch 1 bis 5 in der

Erforschung neuer ß-Galaktosidasen.

12. Verwendung der Stoffe nach Anspruch 1 bis 5 in der Permentationstechnik.