DE2916155C2 - Verbindung DC-11, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zubereitung - Google Patents

Description

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung DC-Il des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Micromonospora chalcea NRRL 11289 in einem Nährmedium züchtet und die gebildete Verbindung DC-Il durch folgende Isolierungs-Maßnahmen aus der KuIturHüssigkeit erhältlich ist: das zellfreie Kulturfiltrat (pH-Wert 6,0) wird über eine mit einem nicht-ionischen porösen Austauscherharz bepackte Süule gegeben, mit Methanol, Aceton oder Äthylacetat desorbiert, das Eluat zur Trockene eingeengt, der Rückstand in Wasser gelöst, die Lösung durch eine mit Aktivkohle gefüllte Säule geleitet, mit Äthylacetat eluiert, d<u> Eluat zur Trockene eingeengt, der Rückstand in Chloroform gelöst, die Lösung durch eine Säule geleitet, die mit in Chloroform suspendiertem Kieselgel gefüllt ist, mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (98:2 Volumenteile) eluiert und das Eluat zur Trockene eingeengt."

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einer Temperatur von 25 bis 40° C während 1 bis 7 Tagen bei einem pH-Wert von 4 bis 10 vornimmt.

4. Pharmazeutische Zuberei.jng, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 1 und übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe.

Die Erfindung betrifft den In den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Es besteht ein ständiger Bedarf nach Verbindungen mit antibakterieller oder antineoplastische? Wirksamkeit. Von Seiten der Erfinder wurde eine neue Art eines Mikroorganismus aus einer Bodenprobe in Sendal-shl, Mlyagi-ken, Japan, isoliert. Die aufgefundene neue An bildet bei ihrer Züchtung in einem Nährmedium eine Verbindung mit antibakterieller Wirksamkeit.

Eine Untersuchung der morphologischen Eigenschaften des Mikroorganismus führt zu der Erkenntnis, daß es sich bei diesen um einen neuen Stamm der Gattung Mlkromonospora handelt.

4S Eine Untersuchung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Isolierten aktiven Verbindung führt zu dem Ergebnis, daß es sich dabei um eine neue Verbindung handelt, die als DC-II bezeichnet wird.

Erfindungsgemäß wird die neue Verbindung DC-Il hergestellt, indem men diesen Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, in einem Nährmedium züchtet. Nach beendeter Züchtung wird die erflndungsge-5n mäße neue Verbindung DC-Il aus der Kulturflüssigkeit in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz, isoliert (vgl. hierzu auch die Patentansprüche 2 und 3).

Die Verbindung DC-11 gemäß der Erfindung weist eine antibakteriell Wirksamkeit auf und Ist deshalb unter anderem auch zur Reinigung und Sterilisation von Laboratoriums-Glasgeräten und chirurgischen Instrumenten geeignet. Ferner kann sie zusammen mit Seifen, Waschmitteln und Waschlösungen für sanitäre Zwecke elnge-5< set*t werden. Die Verbindung der Erfindung ist aufgrund Ihrer antlbakterleilen Eigenschaften auch zur Behandlung von bakteriellen Infektionen bei Tieren geeignet. Darüber hinaus eignet sich die erfindungsgemäße Verbindung DC-Il. wie aus der nachstehenden Beschreibung deutlich wird, auch als antineoplastische Mittel bei Tieren.

Die neue Verbindung DC-H gemäß der Erfindung weist somit antibakterielle und antineoplastische Elgen- «i schäften auf und ist durch die nachstehenden physlkochemlschen Eigenschaften gekennzeichnet:

(1) Schmelzpunkt: 225 bis 228° C (unter Zersetzung),

(2) Elementaranalyse: H = 6,9«, C = 59,0, N = 2,0%;

(3) IR-Spektrum (KBr-Pressllng gemäß nachstehender Flg. 1),

(Λ (4) UV-Absorptionsspektrum In Methanol gemüß nachstehender Fig. 2,

(5) PMR-Spektrum In CDCIi (Internes TMS):

9,62, 6,92, 5,87-2,26 (viele Peaks), 2,09, 1,82, 1,64, 1,60, 1,53, 1,36, 1,29, 1,27, 1,21, 1,18, 1,13, 0,63 (ppm),

(6) CMR-Soektrum In CDCK (Internes TMS):

T) 16 ISS

14,0, 14,2, 15,1, 16,1, 16,9, 17,0-21,0 (ca. 5 Peaks) 22,1, 25,3 26,8-28,0 (ca. 2 Peaks), 29,7, 31,2, 34,0-37,0, (ca. 3 Peaks), 38,5, 41,8, 43,2 44,9 51,2, 52,8, 53,8, 54,3, 60,0-68,0 (ca. 4 Peaks), 69,3, 70,0-78,0 (ca. 5 Peaks), 83,9, 84,3, 91,4, 91,5-100,0 (ca. 5 Peaks), 100,8, lld,2, 123,0, 125,9, 126,3, 136,0, 136,3, 141,3, 149,6, 157,3, 166,5, 170,4, 192,6, 201,4; 206,4 (ppm) und

(7) Spezifischer Drehv/ert: [a]y = -86,3° (c= 1,0, Aceton

(8) Löslichkeit:

Die Verbindung DC-II ist löslich in Methanol, Äthanol, Butanol, Aceton, Äthyiacetat und Chloroform; geringfügig löslich in Benzol und Wasser und unlöslich in Diäthyläther, Petroläther und n-Hexan.

Das Massenspektrum zeigt kein ausgeprägtes Molekülion.

Aus der Elementaranalyse und dem CMR-Spektrum wird der Verbindung DC-11 die empirische Formel C₆₄^₇₂ H90-102 N₂ O₂₆__M zugeordnet, sowie ein Molekulargewicht von 1204 bis 1476.

Wie aus der nachstehenden Experimentalanalyse hervorgeht, wurde festgestellt, daß die Struktur der Verbindung DC-i 1 L-Digitoxose sowie L-Amicetose als Bestandteile enthält. !5

Gemäß der vorstehend genannten Experimentalanalyse wird 1,5 g der Verbindung DC-II in einem Lösungsmittelgemisch aus 75 ml 0,2 N HCl und 150 ml Aceton gelöst. Die Lösung wird 17 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Anschließend wird Aceton unter vermindertem Druck abdestilliert. Das entstandene Gemisch wird viermal mit jeweils 50 ml Chloroform extrahiert.

Die entstandene wäßrige Phase wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 10 ml eingeengt, und das entstandene Konzentrat wird durch eine mit einem Kationenaustauscherharz, Dowex 1 ^ 4 (OH-), gefüllte Säule, geleitet. Anschließend wird das Au:iauscherharz gründlich mit Wasser gewaschen.

Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingeengt und der entstandene Rückstand wird säulenchromatographisch, unter Verwendung von Kieselgei, behandelt. Die Säule wird mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol (9: 1 Volumenteile) entwickelt. Man erhält Fraktionen, die L-Amicetose enthalten, sowie Fraktionen, die L-Digitoxose enthalten.

Die ersteren Fraktionen werden eingeengt, bis ein Rückstand von 218 mg einer öiartigen Substanz verbleibt. Die letzteren Fraktionen werden zur Trockene eingeengt, um 196 mg eines Feststoffes zu ergeben.

Die ölartige Verbindung wird bei einem Druck von 0,1 Torr destilliert, wobei ein gereinigtes Öl entsteht. Die feste Substanz wird aus einem Gemisch von η-Hexan und Aceton umkristallisiert. Man erhält farblose Prismen.

Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften des gereinigten Öls zusammengestellt:

(1) Erscheinungsform: farbloses Öl;

(2) Siedepunkt: 75° C/0,1 Torr,

(3) spezifische Drehung: UIk =-50,9° (C= 1.08, Aceton);

(4) die physikochemischen Eigenschaften des 2,4-DinitrophenyIhydrazons, das durch Umsetzung der öiartigen Substanz mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin erhalten wird, sind nachstehend zusammengestellt: Schmelzpunkt: 160 bis 16TC,

PM'.'.-Spektrum des 2,4-Dinitrophenylhydrazons in ds-Pyridin und internem TMS (<5, ppm):

l,56(d, 6,1. 3H), 2,20(m, 2H), 2,85(m, 2H), 3,94(m, IHi 4,14(dq, 6,1, 6,1, IH), 7,91(d, 9,5, IH), 7,96(t, 5,3, IH), 8,29(dd, 9.5. 2,7, IH), 9,04(d, 2.7, IH).
Elementaranalyse des 2,4-Dinitrophenylhydrazons:
CjH₁₆N₄O₆: CHN

ber.: 46.15 5.16 17,94

gel: 46.13 :.14 17,94.

Aus dem Vorstehenden ergibt sich, daß die ölartie Substanz als L-Amicetose identifiziert wird.

Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften der vorstehend erwähnten unkristalllsierten farblosen Prismen zusammengeheilt: so

(!) Erscheinungsform: farblose Prismen,

(2) Schmelzpunkt: 110-112⁰C.

(3) Spezifische Drehung:

[*]}';·= -37.3 (c =1.11. Methanol).

(4) PMR-Spekirum in CD₁OD und mit internem TMS (<5, ppm): 5s 1.23(d. 6.1. 3H). 1.61(ddd. 13,7, 9,5, 2,8, IH), 2,02(ddd, 13,7, 3,7, 2,8, IH), 3,14(dd, 9,5, 3,2, IH;, 3,77(dq, 9.5. 6.1. IH), 4.00(ddd, 3,7. 3,2, 2,8. IH), 5,06(dd, 9,5, 2,4, IH).

(5) Elementaranalyse

CHuO₁: C H

ber.: 48,64 8.16 M

gef.: 48,47 8,34.

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daß die farblosen Prismen als L-Digitoxose identifiziert werden können.

In der nachsiehenden Tabelle 1 sind die /? ,-Werte der Verbindung DC-Il <*ei Kleselgel-Dünnschichtchromatographle (DC) unter Verwendung verschiedener Entwickler zusammengestellt:

Tabelle I

Träger *) II

Entwickler (V/V)

/{/-Werte

III

Benzol	Aceton	0,55
(35	65)
Tuluol	Aceton	0,48
(4	6)
Chloroform	Methanol	0,60
(9	1)
Chloroform	Dioxan	0,70
(92,5	7,5)
Chloroform	Tetrahydrofuran	0,67
(85	15)
Chloroform	Aceton	0,50
(9	1)
Aceton : Dioxan	10% Ammoniumacetat	0,35
(5 : 5	1)

I: Kieselgcl für DC, Nr. 5715, hergestellt von der Firma Merck & Co., Inc. II: Kieselgel für „reversed phase" DC, Nr. 5747, hergestellt von Merck & Co., Inc. III: Aluminiumoxid RIr DC, Nr. 5727, hergestellt von Merck & Co., Inc.

Die Verbindung DC-Il der Erfindung wird durch Züchtung vor; Micromonospora chalcea KY 11 091 hergestellt. Der vorstehende Stamm wurde bei der Kultursammlung der Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (ehemals Northern Regional Research Agriculture), Peoria, Illinois 61604 unter der Hlnterlegungs-Nr. NRRL 11289 hinterlegt und Ist öffentlich zugänglich.

Der genannte Stamm KY 11 091 Ist durch die nachstehenden Eigenschaften gekennzeichnet:

I. Morphologische Eigenschaften:

Gut entwickeltes, verzweigtes, nicht septlertes Substratmyzel mit einem Durchmesser von etwa 0,5 um, jedoch wird kein echtes Luftmyzel gebildet. Sporen werden sehr gut ausgebildet und einzelne Sporen werden an den Enden von einfachen Sporophoren (Länge etwa 0,3 bis 1,0 um), die sich aus dem Substratmyzel abzweigen, gebildet. Viele Sporen werden am Ende des Substratmyzels gebildet. Gerelfte Sporen weisen einen Durchmesser von etwa 1,0 μπι auf und sind kugelförmig.

Wenn der Stamm im flüssigem Medium gezüchtet wird, 1st das Wachstum anfänglich hellorange und wechselt in den späteren Stadien in ein Dunkelbraun. Es werden viele Sporen gebildet.

Sofern der Stamm in einem A°ar-Medium gezüchtet wird, entsteht auf dem Medium, in dem die Sporen leicht gebildet werden, eine ziegelrote, glanzende, wachsartige Sporenschicht.

Il.Wuchsformen:

Wachstumsgrad, Farbe des Substratmyzels sowie das eventuelle Auftreten löslicher Pigmente bei der Züchtung des Stammes KY 11 091 in verschiedenen Nährböden sind In nachstehender Tabelle II zusammengefaßt. Die englischen Farbangaben richten sich nach der Klassifizierung in dem Color Harmony Manual (Container Corporation of America). Die Bestimmung der Eigenschaften erfolgt nach einer Züchtung bei 30° C während 2 Wochen.

Tabelle II

Nährboden	Wachstum	Farbe	PO),	Lösliche Pigmente
Saccharose-Nitrat-Agar	gut, flach.	Black-olive (I schwarz-oliv		keine
GIucose-Asparagin-Agar	spärlich, flach	White (a), weiß		keine
Giycerin-Asparagin-Agar	spärlich, flach	White (a), weiß	po),	keine
Stärke-anorganische Salze-Agar	gut, flach	Black-olive (1 schwarz-oliv	keine

29 16 ibt)

Fortsetzung

Nährboden

Wachstum

Farbe

Lösliche
Pigmente

Tyrosin-Agar	mäßig	Black-olive (1 po), schwarz-oliv	keine
Nähragrar	mäßig, flach	Apricot (4 ca), aprikosenfarben	keine
Hafermehl-Agar	mäßig, flach	Apricot (4 ca), aprikosenfarben	keine
Hefe-Ma!z-Agar	gut, erhaben	Black-olive (1 po), schwarz-oliv	keine
Pepton-Hefe-Agar	mäßig, flach	Orange (4 la),	keine
		orange

III. Physiologische Eigenschaften:

Die physiologischen Eigenschaften des Stammes KY 11 091 gehen aus der nachstehenden Tabelle 111 hervor, In der die optimale Wachstumstemperatur nach 5tilglger Züchtung festgestellt wird und die Eigenschaften gegenüber Milch sowie im Hinblick auf die Zersetzung von Cellulose nach lmonatiger Züchtung festgestellt werden. Die sonstigen Eigenschaften werden nach Züchtung bei 27° C wahrend 2 Wochen festgestellt.

Tabelle III

(1) Verwertung von Kohlenstoffquellen

Kohlenstoflquelle

Verwertung

D-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Fructose Saccharose inosit

L-Rhamnose D-Raffinose D-Mannitol Ribose

SaIi ei η

L-Arabinose Glycerin Melibiose

(2) Sonstige Eigenschaften Verflüssigung von Gelatine Verflüssigung von Milch Peptonisierung von Milch Zersetzung von Cellulose Hydrolyse von Stärke optimaler pH-Wert des Wachstums optimale Temperatur des Wachstums Bildung von Tyrosinase Bildung von mclanoiden Pigmenten

negativ

positiv

negativ

schwach

positiv

6,6 bis 7,5

28 bis 38° C

keine

keine

Wie aus den vorstehenden Ergebnissen hervorgeht, bildet der Stamm KY 11091 kein echtes Luftmyzel in einem Agar-Nührboden und bildet Einzelsporen an dem Substratmyzel. Durch Analyse der Zellwand kann festgestellt werden, daß der Stamm Mesodiaminopimelinsäure enthält.

Aufgrund der vorstehenden Ergebnisse und der Auswertung von »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology«, 8. Aufl. (1974), S. 846-849 und »International Journal of Systematic Bacteriology«, Bd. 21, Nr. 3,

S. 248-253, wurde der Stamm KY 11091 der Art Mlcromonospora chaSr.ea zugeordnet. Dieser Stamm KY 11 091 erzeugt In einer biologisch reinen Kultur bei der Züchtung die erfindungsgemäße Verbindung DC-H In ■ H verwertbarer Ausbeute.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können herkömmliche Verfahren zur Züchtung von

S Actlnomyzeten verwendet werden. Im Züchtungsmedium können verschiedene Nührstoffquellen eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Kohlenstoffqueiien sind Glucose, Starke, Mannose, Dextrin, Fructose, Saccharose und/odff Melassen. Beispiele für anorganische oder organische Stickstoffquellen sind Ammoniumchlorid, Ammonlumsviifat, Harnstoff, Ammoniumnitrat und Natriumnitrat. Diese können allein oder zusammen mit natürlichen Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Malsquellwasser, Soyaboh-

i" nenpulver, Kasamlnsüure und löslichen Pflanzenproteine^ verwendet werden. Gegebenenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Calciumcarbonat, Kaliumdihydrogenphosphat, Dlkallumhydrogenphosphat, Elsensulfat, Calciumchlorid, Mangansulfat, Zinksulfat, oder Kupfersuirat, dem Medium zugesetzt werden. Außerdem können organische und anorganische Produkte, beispielsweise Vitamin Β,, Biotin und dergleichen, die das Wachstum des speziellen Stammes und die Bildung der Verbindung DC-Il

fördern, dem Medium zugegeben werden.

Vorzugsweise wird die Züchtung In einem flüssigen Medium, insbesondere unter Rühren im Submersverfahren, durchgeführt. Die Züchtungstemperaturen betragen nach Möglichkeit 25 bis 4O⁰C, vorzugsweise 28 bis 38° C. Die Züchtung wird bevorzugt bei einem pH-Wert von 4 bis 10, Insbesondere 6 bis 8, durchgeführt, wobei der gewünschte pH-Wert mittels einer wäßrigen Ammoniaklösung oder einer Ammonlumcarbonatlösung elnge-

» stellt wird.

Im allgemeinen hat sich nach 1 bis 7täglger Züchtung im flüssigen Medium die Verbindung DC-Il In der Kulturflüssigkeit gebildet und angereichert. Wenn die Ausbeute der Verbindung DC-Il in der Kuiturflüssigkelt ein Maximum erreicht, wird die Züchtung abgebrochen. Das gewünschte Produkt wird nach dem Entfernen der Mlkroorganismenzcllen aus der Kulturfiüssigkeit, beispielsweise durch Abflltrteren, Isoliert und gereinigt.

Die Isolierung und Reinigung der Verbindung DC-U wird nach an sich üblichen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Mikroorganismen-Stoffwechselprodukten auf KulturflUsslgkelten durchgeführt. Beispielsweise wird das zellfreie Kulturflltrat (pH-Wert 6,0) über einen mit einem nlcht-lonlschen porösen Austauschharz, wie HP-20 (Warenzeichen der Firma Mitsubishi Chemical Industries) bepackte Säule gegeben, damit die aktiven Bestandteile adsorbiert werden. Die Desorption der aktiven Bestandteile erfolgt unter Verwendung von

-in Methanol, Aceton, Äthylacetat oder dergleichen. Das entstandene Eluat wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird In Wasser gelöst. Anschließend wird die Lösung durch eine mit Aktivkohle gefüllte Süule geleitet und die Elutlon erfolgt mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat. Das Eluat wird zur Trockene eingeengt und der Rückstand wird In Chloroform gelöst. Die entstandene Lösung wird sodann durch eine Säule geleitet, die mit In Chloroform suspendiertem Kieselgel gefüllt Ist, wobei gelbliche Verunreinigungen entfernt

werden. Die Elution erfolgt mit einem Lösungsmittelgemlsch aus Chloroform und Methanol (98:2 Volumlelle) und das Eluat wird zur Trockene eingeengt. Man erhalt die aktive Verbindung. Das gleiche, vorstehend beschriebene Chromaiograpnievcrfahren oder ein Chrornaiogrupuierverfanren unter Verwendung einss vernetzten Polysaccharld-Dextrans, wie Sephadex LH-20, kann zur weiteren Reinigung des erwünschten Produktes wiederholt werden. Die auf diese Welse erhaltene erfindungsgemaße Verbindung DC-11 weist die vorstehend

*) geschilderten physlkochemlschen Eigenschaften auf.

Die biologischen Eigenschaften der Verbindung DC-11 werden nachstehend geschildert.
In der nachstehenden Tabelle IV ist das in vitro gemessene antibakterielle Wirkungsspektrum der Verbindung DC-II, nach der Blättchen-Methode (Hemmhoftest-Methode) gemessen (pH 8,0) angegeben.

Tabelle IV
Mindesthemmkonzentration

Mikroorganismen MIC

Staphylococcus aureus ATCC 6538 P 100

Bacillus subtilus Nr. 10707 1,6

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 >100

Escherichia coli ATCC 26 >100

Shigella sonnei ATCC 9290 >100

Salmonella typhosa ATCC 9992 >100

Die akute Toxizität (LDso)-Wert) für die Verbindung DC-Il beträgt bei intraperitonealer Verabfolgung für Mäuse 54 mg/kg.

Die antineoplastische Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindung DC-11 ergibt sich aus den nachstehenden Untersuchungen:

Π) Wirkung bei Sarkom 180 Ascttestunioren

Sechs männliche ddY-Stamm-Mäuse mit einem jeweiligen Gewicht von 20 g werden für jede Grr.ppe als Testtiere eingesetzt. Es werden jeweils 5xlO⁶ Sarkom 180 Ascitestumorzellen den Tieren implantiert. 24 Stun-

den nach erfolgter Implantation wird den Tieren jeweils Intraperltoneal 0,2 ml Phosphat-gepuffertc Kochsulzlösung (PBS), die jeweils unterschiedliche Konzentrationen der erflndungsgemüßen Verbindung DC-Il enthalten, vcrabfolgu Die vorstehend genasinte PBS besteht aus 0,8 g/dl Kochsalz, 0,02 g/dl KCl, 1,15 g/dl Na₂HPO₄ und 0,02 g/dl KHiPO₁ (pH 7,2).

Zum Vergleich werden 0,2 ml PBS-Lösungcn, die als Testverbindung Mitomycin C enthalten, einer Gruppe von Tieren während der gleichen Zelt, bei der den anderen Versuchsgruppen die erfindungsgemäße Verbindung verabfolgt wird, gegeben.

7 Tage nach erfolgter Implantation wird bei den Versuchstieren das durchschnittliche Tumorvolumen T (mm¹) und der Wert TIC (T= durchschnittliches Tumorvolumen nach Verabfolgung der erfindungsgemäßen Testverbindung; C = durchschnittliches Tumorvolumen ohne Verabfolgung einer Testverbindung) bestimmt. Die Ergebnisse sind In der nachstehenden Tabelle V zusammengefaßt.

Tabelle V	Dosis (mg/kg)	7(mm3)	TlC
Testverbindung	0	1405
Kontrolle	"IC ■CJ	1096	Q,73
DC-H	50	730	0,52
DC-Il	70	590	0,42
DC-Il	4,2	450	0,32
Mitomycin

(2) Wirkung auf den Lymphozytenleukämie P-388 Tumor zs

|: Als Testtiere werden für jede Versuchsgruppe fünf mannliche CDF,-Mäuse mit einem jeweiligen Gewicht von

etwa 22 g verwendet. Den Testtieren werden jeweils 1 χ 10⁶-Zellen Lymphozytenleukämie P-388 Tumor-Zellen

\: Intraperltoneal Implantiert. ?<Λ Stunden nach erfolgter Implantation erfolgt die Intraperitoneale Zugabe von

0,2-ml-PBS-Lösung, die die Verbindung DC-11 In jeweils verschiedenen Konzentrationen enthalt. 3"

* Zum Vergleich mit einer Gruppe der Testtiere wird gleichzeitig eine Lösung von 0,2 ml PBS, die als Testverbindung Mitomycin C enthalt, intraperitoneal verabreicht.

s Die nach der Implantation erhaltenen Versuchsergebnisse sind In der nachstehenden Tabelle VI zusammenge-

faßt. In der Tabelle bedeuteten die Ausdrücke ASP die durchschnittliche Überlebensdauer nach der Verabfol-

gung, ausgedrückt in Tagen. Der Quotient ASPIC stellt das Verhältnis der durchschnittlichen Überlebensdauer (In Tagen) aus der Gruppe der Versuchstiere, denen die erflndungsgemäße Testverbindung verabfolgt wurde und der durchEchp.U'Hchen Überlebensdauer (in Tagen) C von Versuchstieren, denen keine Testverbindung verabfolgt wurde, dar.

Tabelle VI	Dosis (mg/kg)	ASP (Tage)	ASPlC
Testverbindung	0	9,4
Kontrolle	6,25	11,2	1,20
DC-Il	12,5	13,4	1,43
DC-Il	25,0	13,0	1,33
DC-Il	4,2	14,2	1,51
Mitomycin C

Wie die vorstehenden Ergebnisse zeigen, ist die erfindungsgemäße Verbindung DC-11 sowohl als antineoplastlsches als auch als antibakterielles Mittel wirksam.

Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen Verbindung als pharmazeutische Präparate kann enteral, parenteral oder lokal erfolgen.

Die erflndungsgamäßen pharmazeutischen Zubereitungen enthalten übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe.

Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen kann in an sich bekannter Weise in Form von Tabletten, Kapseln oder als Flüssigkeiten, z. B. in Form von Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, erfolgen.

Die Verabfolgung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen zur Verwendung als antineoplastische Mittel erfolgt vorzugsweise in Form von Injektionspräparaten.

Die jeweils geeignete Dosierung hängt von der erwünschten therapeutischen Wirkung der Verabfolgungsweise und der geplanten Behandlungsdauer ab. Im allgemeinen sind tägliche Dosierungen von etwa 0,1 bis 0,5 mg/kg Körpergewicht zum Erzielen einer antineoplastlschen Wirksamkeit ausreichend.

Das Beispiel erläutert die Erfindung. Hierbei wird die Anwesenheit der Verbindung DC-Il durch ein bioxssav-Verfahren unter Verwendung von Bacillus subtilus Nr. 10 707 als Test-Mikroorganismus nachgewiesen.

Beispiel

Der Stamm Micromonospora chalcea NRRL 11 289 wird in einen 2 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft, der 300 ml eines Kulturmediums enthält, das wie folgt zusammengesetzt ist: 4 g KCI/Liter, 0,5 g MgSO₄ - 7H₂O/LLer, 1,5 g KH₂PO₄, 5,0 g (NH₄)₂SO₄/Liter, 20 g Saccharose/Liter, 10 g Fructose/Liter, 10 g Glucose/Liter, 5,0 g Maiquellwasser/Liter und 20 g CaCO₃/Liter (pH 7,0). Die Züchtung wird 48 Stunden unter Rühren (220 Uprn) bei 30° C durchgeführt. Sodann werden 0,75 Liter der auf diese Welse erhaltenen Vorkullur in einen 30 Liter fassenden Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des dort enthaltenen Ku'turmediums ist wie folgt:

») 40 g lösliche Stärke/Liter, 8 g Hefeextrakt/Liter, 0,09 g MgSO₄ ■ 7H₂O/Liter, 0,15 g KH₂PO₄/Liter, 0,21 g

K₂HPO₄/Liter, 10 mg Vitamin B, ■ HCl/Liter, 30 ug Biotln/Liter, 10 mg FeSO₄ ■ 7H₂O/Liter, 30 mg !

CaClj/Liter, 4 mg MnSO₄/Liter, 30 mg ZnSO₄ · 7H₂O/Liter und 2 mg CuSO₄ ■ 5H₂O/Liter. :

Vor der Sterilisation wird das Nährmedium mit NaOH auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Die Züchtung in dem Fermenter wird 72 Stunden unter Belüftung und Rühren (15 Liter/min, Belüftung; 150 Upm) bei 30° C

>' durchgeführt. Der pH-Wert des Nährmediums wird während der Züchtung nicht kontrolliert.

Die erfiandene Kulturflüssigkeit wird danach filtriert. Man erhält 13 Liter Filtrat. Das Filtrat wird auf eine mit 1 Liter eines nicht-ionischen, porösen Austauscherharzes HP-10 gegeben, um die aktiven Bestandteile zu adsorbieren. Anschließend wird das Austauscherharz zur Entfernung der Verunreinigungen mit einem Gemisch ^

aus Wasser und 30« (V/V) Aceton gewaschen. Die Elution erfolgt mit Aceton. Die vereinigten Acetonfraktio- |

:r> ne-n werden zur Trockene eingeengt. Man erhält einen Rückstand» der In einer 30¥!gen Aretonlosung gelöst f

wird. I

Die entstandene Lösung wird auf eine mit 5£ ml Aktivkohle gefüllte Säule gegeben. Anschließend wird die |

Säule mit einer 30%Igen Acetonlösung gewaschen. Die Elution erfolgt mit Aceton, wobei der größte Teil der in |

der Lösung als Verunreinigungen anwesenden Pigmente entfernt wird. -F

-⁷^ Die aktiven Fraktionen werden vereint und zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wird In etwa 10 ml ChIo-

reform gelöst. Die Chloroformlösung wird auf eine mit 500 ml Kieselgel (SlIIc AR CC-4), das In Chloroform j

suspendiert ist, gefüllte Säule gegeben und mit etwa 2 Liter Chloroform gewaschen. {

Die Elution erfolgt mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol (98: 2 Volumteile). Man 1

erhält DC-11 enthaltende Fraktionen. Die Fraktionen werden vereint und zur Trockene eingeengt. Man erhält |

31' 55 mg eines Rohproduktes. Das Rohprodukt wird wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von Kieselgel, i

Chromatographien. Man erhält 32 mg eines gereinigten Pulvers, dessen physikochemische Eigenschaften und 1

dessen antibakterielle und antineoplastische Wirksamkeit mii den vorstehend geschilderten Eigenschaften über- t

einstimmen. j>

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

. '·■*

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verbindung DC-Il mit antibakterielier Wirksamkeit, gekennzeichnet durch folgende Kenndaten:

(1) Schmelzpunkt: 225 bis 228° C (unter Zersetzung),

(2) Elementaranalyse: H = 6,9s, C = 59,0, N = 2,0»,

(3) IR-Spektrum (KBr-PressÜng) gemäß nachstehender Fig. 1, die Bestandteil dieses Anspruchs ist,

(4) UV-Absorptionsspektrum in Methanol gemäß nachstehender Fig. 2, die Bestandteil dieses Ansprurhs ist,

(5) PMR-Spektrum in CDCl₃ (internes TMS):

9,62, 6,92, 5,87-2,26 (viele Peaks), 2,09, 1,82, 1,64, 1,60, 1,53, 1,36, 1,29, 1,27, 1,21, 1,18, i,13, 0,63 (ppm),

(6) CMR-Spektrum in CDCI₃ (internes TMS):

14 0 14 2 15 1 16,1, 16,9, 17,0-21,0 (ca. 5 Peaks\ 22,1, 25,3, 26,8-28,0 (ca.

2 Peaks), 29,7, 31,2, 34,0-37,0 (ca.

3 Peaks), 38,5, 41,8, 43,2, 44,9, 51,2, 52,8, 53,8, 54,3, 60,0-68,0 (ca.

4 Peaks), 69,3, 70,0-78,0 (ca. 5 Peaks), 83,9, 84,3, 91,4, 91,5-100,0 (ca.

5 Peaks), 100,8, 118,2, 123,0, 125,9, 126,3, 136,0, 136,3, 141,3, 149,6, 157,3, 166,5, 170,4, 192.6, 201,4, 206,4 (ppm) und

(7) Spezifischer Drehwert:

[cr]?i =-26,3° (C= 1,0, Aceton).