SU416958A3 - - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к ферментной промышленности , а именно к способу получени  липазы.

Известен способ получени  липазы путем выращивани  ее Продуцентов на питательной среде, содержащей источники углеводов, азота и жиры, например оливковое, рапсовое, соевое масла, в присутствии минеральных солей с последующим выделением липазы из культуральной жидкости.

Предлагаемый способ позвол ет раснгирить ассортимент примен емых продуцентои.

Дл  этого в качестве продуцента используют бактерии рода Chromobacterium viscosum или СЬготоЬас1ег1цт violaceum.

Предлагаемый способ заключаетс  в следующем .

Бактерии Chromobacterium viscosum или Chromobacterium violaceum выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода , азота и жиры в присутствии минеральных солей.

В качестве источников углерода могут быть использованы глюкоза, сахароза, лактоза, мальтоза, растворимый «рахмал, обычный крахмал, декстрин, меласса.

В качестве источника азота может быть использовано любое подход щее азотсодержащее соединение, обычно используемое дл  этих целей, например измельченные соевые бобы, обезжиренна  .мука из соевых бобов, мука из хлонковых сем н, пептон, м сной экстракт , дрожжевой экстракт, измельченные сухие дрожжи, мочевина, гидролизат «казеина, соль аммони .

В качестве минеральных солей примен ют соли ортофосфорной «ислоты, например магпиевые , кальциевые и калийные соли.

В питательную среду ввод т как растительные , так и животные жиры, такие как оливковое , соевое, хлопковое масла, свиное сало, ГОВЯЖ1ИЙ жир, сливочное масло.

Жиры ввод т Б количестве равном 0,5-5% от веса культуральной среды.

Выращивание продуцента можно производить как поверхностным, так и глубинным методом , но целесообразнее использовать последний .

Выращивание осуществл ют при температуре 24-28 С Б течение 2-6 дней и при рН 6,0-7,0, установленном в начале процесса.

Выделение и очистку липазы производ т обычным способом.

.ч

При использовании твердой среды липазу экстрагируют водой.

При использовании жидкой среды из последней отдел ют клетки, например фильтрованием под вакуумом или центрифутированием .

Полученный таким образом фильтрат или экстракт конденсируют или в него ввод т осадители ферментов, такие как хлористый натрий, сульфат аммони  или органические растворители, нанрвмер этанол, ацетон.

Фильтрат или конденсат можно высушивать распылением после введени  в них стабилизаторов , например мальтодекстрина, лактозы, карбоксиметилцеллюлозы, полиэтиленгликол , сн того молока, казеина, сорбита.

Липаза, полученна  предлагаемым способом , обладает стойкостью и активностью.

После выдерживани  липазы при рП равном 4,0-9,0 .в течение 24 час при температуре 20С, остаточна  активность ее составила йО%. Даже при рП равном 3,0-10,0 остаточна  активность липазы составл ет не менее 70%.

ОптИМальное действие липазы при рП равном 4,0-9,0 .максимальное 6,0-7,0 при температуре 50° С.

Пример 1. В 100 мл стерильной жидкой питательной среды (рП 6,5), содержащей, %; свиного сала 2, крахмала 2, порошкообразных обезжиренных соевых бобов 2, (Nn4)2-SO4 0,3, КП2РО4 0,2, СаСОз 0,5, MgSO4-7H20 0,1, внос т Chromobacterium viscosum var раralipolyticum .

Культивирование осуществл ют при 26° С в течение четырех дней при непрерывном перемешивании .

Затем отдел ют мицелий и получают 75 мл фильтрата культуры.

Активность фильтрата, определ ема  методом , при котором в качестве субстрата используют свиное сало, составл ет 11,5 ед/мл.

К фильтрату добавл ют этанол до достижени  концентрации спиртового раствора 75%.

Таким образо,м, получили 3,43 г порошкообразной неочищенной липазы.

Пример 2. Полностью повтор ют процесс, описанный в примере 1, но из питательной среды исключают свиное сало. В результате получают 26 г липазы.

(Титр - 15 ед/г).

Пример 3. В 20 л стерильной жидкой среды (рН 6,5), содержащей, %; свиного сала 2, порошкообразных обезжиренных соевых бобов 2, (NH4)2SO4 0,3, КП2РО4 0,2, СаСОз 0,5, MgSO4-71 20 0,1 ввод т 5 мл нротивопенного агента и засеивают микроорганизмами Chroraobacterium viscosum var paralipolyticum, предварительно культивируемыми в жидкой среде при 26° С в течение двух .

Процесс выращивани  осуществл ют при 26° С в течение четырех дней при аэрации со скоростью 20 л в 1 мин и перемешивании мешалкой со скоростью 300 об/мин.

.I

Затем удал ют мицелий фильтрованием и получают 14,8 л фильтрата. Титр полученного фильтрата составл ет 11,4 ед/мл.

К фильтрату добавл ют 490 г мальтодекстрина и высушивают (температура на входе 120°С, ка выходе 70°С).

Таким образом, получают 927 г неочищенной порошкообразной липазы, титр которой составл ет 126 ед/г (определ ют по методу, при котором в качестве субстрата используют свиное сало).

Пример 3. Полностью повтор ют процесс, описанный в примере 1, но в качестве продуцентов используют Chromobacterium viscosum АТСС 6918 и Chromobacterium violaceum АТСС 12472.

Получают соответственно 1,3 г порошкообразной липазы с активностью 38 ед и 1,5 г с титром 35 ед/г.

Метод определени  титра липазы.

Состав реакционной смеси, мл Раствор фермента1

Фосфатный буфер

(0,1 моль) рН - 7,05

Эмульси  свиного сала10

Эмульсию получают следующим образом: 20 г термически расплавленного сала добавл ют к 10 мл «твина 60 и 70 мл воды, полученную смесь центрифугируют со скоростью 11000 об/мин дл  гомогенизации.

Реакционную смесь загружают в Г-образпую пробирку и вибрируют с помощью взбалтывател  Моно при 40° С в течение 60 мин. Затем добавл ют 30 мл смеси этанола и ацетона в соотношении 1 : 1 дл  разрушени  эмульсии. Титруют 0,05 н. раствором NaOH с применением в качестве индикатора 1%-ного раствора фенолфталеина.

Такое же определение производ т с денатурированным ферментом (предварительно обработанным при 100°С в течение 10 мин).

Затем из первого результата титровани  вычитают второй результат и разность, выраженна  в расчете на 1 1л, представл ет собой титр, который принимают за единицу на 1 мл.

Характеристика продуцентов.

Морфологи . Палочка размером 0,6-1,2 мк. Споры пе образуют, малоподвижны, грамотрицательные .

Культуральные признаки. В качестве сред используют следующие: мaннитнoдpoжжeвvю, среду из дрожжевого экстракта и агара, глюкозопептопную , смесь картофельного экстракта и агара.

Колонии на твердой питательной среде круглые, выпуклые, блест щие и в зкие, светло-желтовато-коричневого цвета. Пигмента не образует.

Физиологическа  характеристика.

Оптимальные услови  роста: рН среды 6,5, температура 26° С, аэробные.

Биохимические признаки.

Реакци  па метил - красный отрицательна . 5 Реащи  Вожа-Проскауэра отрицательна . Индола не образует, сероводорода не выдел ет , образует аммиак, нитраты восстанавливает , образует каталазу, желатину разжижает , крах-мал не гидролизует, молоко не коагулирует , соли аммони  и мочевины не уаваивает , метилен - голубой не восстанавливает, лакмус восстанавливает, лимонную кислоту усваивает. Отношение к источникам углерода. Арабинозу , маннозу, глюкозу, фруктозу, галаа тозу, сахарозу усваивает. Ксилозу, лактозу, мальтозу , раффинозу, сорбит, иннозит, глицерин, 6 салицин, инулин, декстрин, целлюлозу не усваивает . Ппе мет изобоетени  предмет изооретени  Способ получени  липазы путем выращивани  ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углеводов, азота и жиры , например оливковое, рапсовое, соевое масла , в присутствии мннеральных солей с последующим выделением липазы из культуральной жидкости, отличающийс  тем, что в качестве продуцента используют микроорганизмы Chromobacterium viscosum или Chromobacterium violaceum.