SU400116A1 - - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности.

Известен способ получени  щелочной протеазы путем культивировани  Bacillus licheniformis на питательной среде, содержащей источники углевода, азота и минеральные соли , при ш,елочном значении рН с последующим выделением фермента из культуральной жидкости.

При известном способе щелочна  протеаза про вл ет свою активность при значении рП 6,0-10,7.

При предлагаемом способе щелочна  протеаза  вл етс  типичной щелочной нротеазой субтилизированного типа, котора  про вл ет оптимальную активность при значении рН 10,0-10,5 и не тер ет свою активность при воздействии хелатирующего вещества (этилендиаминтетрауксусной кислоты ЕДТА), а подвергаетс  воздействию диизопропилфторфосфата (ДЕР).

Предлагаемый способ получени  щелочной протеазы осуществл ют путем использовани  штамма Bacillus licheniformis АТСС № 21471 или его мутантов, например № 202, 82, 82-44, 82--44- 02.

Предлагаемый штамм бактерий выращивают на обычных дл  бактерий питательных средах при 30-35°С в течение 40-72 час, включающих глюкозу и крахмал в качестве

источника углевода, пептон и казеин в качестве источника азота и минеральные солп. Кроме того, в среду добавл ют такие вещества , как дрожжевой экстракт или экстракт из обезжиренного соевого nipoTa и отрубей.

Пример 1. Bacillus licheniformis инкубируют в 1 л жидкой культуральной среды (рП 7,2), содержащей, %: глюкозы 1, пептона 1, дрожжевого экстракта 0,1, хлорида натри  0,2, хлорида кальци  0,2, фосфата кали  0,05, су.льфата магни  0,01 и сульфата железа и сульфата марганца по 0,001.

Bacillus liclieniforniis выращивают при встр хивании в течение 72 час при 30°С. Полученный бульон содержит алкалиновую протеазу , обладаюнгую активностью 1,930 ед па 1 мл. Бульон культуры дебактеризуют с помощью центрифуги или фильтра, после чего фильтрат смепп1вают с 0,8%-пым насыщенным раствором сульфата аммони , и смесь подвергают высаливанию и диализу. Дпализованный раствор пропускают через колонку, заполненную диолитовой смолой А-2 (или анионообменной смолой) дл  удалени  окрашивающих веществ. Обесцвеченный раствор подвергают колончатой хроматографии, использу  карбоксиметилцеллюлозу п ДЕАЕСерадекс , а затем сырую протеазу отдел ю г посредством гель-фильтровани , примен   Серадекс-75. Затем сырую протеазу подвергают осаждению с применением ацетона дл  получени  очищенной протеазы, после чего высушивают и измер ют, взвешива  47 мг высушенной протеазы, имеюнхей активность 4,110 ед/мг.

Пример 2. Bacillus licheniformis инкубируют в 1 л жидкой культуральной среды (рН 7,2), содержаш,ей экстракт, полученный экстрагированием обезжиренных соевых лепешек с 4%-ным алкалиновым раствороль Растворимый крахмал (1%) и Bacillus licheniformis культивируют в Jar-ферментаторе в течение 40 час при 35°С при аэрации и перемешивании , Полученный бульон культуры содержит алкалиновую протеазу, имеюш,ую активность 4,400 ед. па 1 мл. Бульон обрабатывают так же, как и в примере 1, дав 1,07 г очиш,енной высушенной протеазы с активностью 4,110 ед/мг.

Характеристика штамма Bacillus licheniformis .

Бактериологические свойства.

Растительные палочки (микробы) размером 0,6-0,8X1,5-3,0 мк, не в виде цепочек, без капсулей или теневых фор.м. Подвижные. Грам-ноложительны. Па глюкозном питательном агаре палочки (микробы) такие же, что и на питательном агаре, и содержат немного жировых шариков (глобул). Спорангии - ие четко набухшие, иапоминают палочки (микробы ) с бипол рнь М окрашиваиием.

Споры размером 0,6-0,9X1,0-1,5 мк, овальной или цилиндрической формы, центральные или парацентральные, тонкостепные, многочисленные за 48 час при 37°С.

Колонии на питательном агаре - груба  поверхность, волосатые отростки, рост культуры микробов на поверхиости. В услови х косого агара - обильный рост, груба  поверхность полупрозрачна , рост культуры по поверхности, поверхность матова , волосатые отростки.

Питательный бульон - прозрачные с т желой , морщинистой плотной оболочкой.

Культура микробов, пoлyчelп a  уколом в желатину, как питательную среду, -быстрое разжижение с переходом из бокалообразных фор.м в слоистые.

Питательный бульон с NaCl - .хороший рост в 5-8%-но.1 растворе NaCl, отсутствие роста в 12%-ном растворе NaCl.

В услови х питательной среды из глюкозы и косого агара - т желый рост, складчатость , морщинистость, выдавленные канельки и слизистый.

В услови х питательной среды из тирозина и косого агара - рост такой /lie, что и на питательном агаре.

Пспользование цитрата - положительно. Картофель - рост т желый, распростран ютс  по поверхности, морщппнстЕле, выдавленные , бородавчатые капельки, розовые, jqjacHbie и бурые па погруженной доле картофел .

В услови х нптательиой среды из соевых бобов и косого агара - рост более м гкий и более обильный, чем па питательном агаре, цвет от буроватого до красноватого, выдавленные капельки.

В услови х пптрата глюкозы и косого агара - рост медленный, волосистые отростки, впоследствии рост от умеренного до обильного .

Гидролиз крахмала - положительный. Продуцирование ацетилметилкарбинола - положительное (32°С) рП питательного бульона с глюкозой - рП 5,6 за педелю.

Ферментационный тест (опыт сбраживани ) - кислота без газа из арабинозы, ксилозы , глюкозы, сахарозы или манпитола (за 14 дней).

Гидролиз казеина - положительный, узка  зона осветлени .

Гидролиз желатины - положительный, широка  зона гидролиза. Восстановление нитрата в нитрит - положительное. Анаэробный рост в нитательном бульоне из глюкозы - положительный, рП 5,2 через 14 дней, получаетс  очень малое количество газа.

Температуры дл  роста - хороший рост при температуре от 32 до 45°С.

Морфологи  мутантов существенно не отличаютс  от основного шта.мма.

В данном способе могут быть использованы следующие .мутанты из Bacillus licheiiiformis АТСС 21471 (см. таблицу). Предмет изобретени  Способ получени  щелочной протеазы путем культивировани  Bacillus licheniformis на питательной среде, содержащей источники углевода , азота и минеральные соли, при щелочном значении рН с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, отличающийс  тем, что используют штамм Bacillus licheniformis АТСС N° 21471 или его мутанты, например, VI-25, № 202, 82, 8244 , 82-44-02.