KR100438394B1

KR100438394B1 - 박테리아셀룰로오즈의제조방법

Info

Publication number: KR100438394B1
Application number: KR1019970703540A
Authority: KR
Inventors: 토루 코우다; 타카아키 나리토미; 히사토 야노; 푸미히로 요시나가
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1995-09-29
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2004-08-16
Also published as: JP3800628B2; WO1997012987A1; EP0792935B1; EP0792935A1; DE69626489D1; EP0792935A4; US6017740A; DE69626489T2

Abstract

본 발명은 일반적으로 배양후기(생육감쇠기 및 정상기)에 즉, 배양액중의 셀룰로오즈성 물질의 농도가 약10g/L이상, 바람직하게는 약12g/L이상으로 증가된 단계, 또는 10(rad/s)이상, 또는 레올로지가 Power law모델에 따른다고 간주했을 때의 K값(consistency index)가 약10(Pa·Sⁿ)이상으로 증가된 배양단계, 또는 배양액의 소요구량이 약 35mmol/L·hr이상인 단계에 있어서 발효조의 내압을 약1.1kg/cm²A이상으로 유지하면서 셀룰로오즈 생산균을 배양하여 셀룰로오즈성 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명방법에 의해 BC의 생산에 있어서 배양시의 교반에 요구되는 소요동력을 대폭 줄이고, 동시에 BC의 생산속도 및 수율을 높일 수 있다.

Description

박테리아 셀룰로오즈의 제조방법

BC(박테리아 셀룰로오즈)는 가식성이며, 식품분야에서 사용되는 외에 수계분산성이 뛰어나므로 식품, 화장품 또는 도료 등의 점성의 유지, 식품원료생지의 강화, 수분유지, 식품안정성 향상, 저 칼로리 첨가물 또는 유화안정화 조제로서 산업상 이용가치가 있다.

본 발명은 배양의 어느 단계에서 발효조의 내압을 일정한 값이상으로 유지하고, 또는 기상중의 이산화탄소 농도를 일정치 이하로 유지하면서 셀룰로오즈성 물질을 생산하는 능력을 갖는 미생물(이하, 「셀룰로오즈 생산균」이라 한다.)에 속하는 균체를 사용하는 셀룰로오즈성 물질(이하, 「박테리아 셀룰로오즈」또는 「BC」라고 한다)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

제1도는 소요동력과 BC축적의 경시변화를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

이하 실시예에 따라 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

BC는 목재 펄프등으로부터 제조되는 셀룰로오즈에 비교하여, 피브릴의 단편폭이 2자리수 정도로 적은 것을 특징으로 한다.

따라서, BC의 이해물은 미크로 피브릴의 이러한 구조적 물리적 특징에 기초하여 고분자, 특히 수계 고분자용 보강제로서의 각종 산업용 용도가 있다. 이와 같은 셀룰로오즈성 이해물을 지상 또는 고형상으로 고체화시킨 물질은 높은 인장탄성율을 나타내므로 미크로 피브릴의 구조적 특징에 기초하여 우수한 기계특성이 기대되며, 각종 산업용 소재로서 다양하게 응용할 수 있다.

BC의 제조방법에 관해서는 특개소62-265990호, 특개소63-202394호 및 특공평6-43443호 등에 BC의 제조방법에 관한 기재가 있다.

셀룰로오즈 생산균을 배양할 때 적합한 영양배지로서는 탄소원, 펩톤, 효모엑기스, 인산나트륨 및 구연산으로 이루어지는 Schramm/Hestrin배지(Schramm이하, J. General Biology, 11, pp.123∼129, 1954)가 알려져있다. 또, 이와같은 영양배지에 배지중의 특정영양소에 의한 셀룰로오즈 생성촉진인자인 이노시톨, 피틴산 및 피롤로 퀴놀린 키논(PQQ)(특공평5-1718호 공보;高井光男, 紙パ技協誌, 제42권, 제3호, 제237∼244쪽) 등을 첨가하거나, 나아가서 카본산 또는 그 염(특원평5-191467호), 인베르타제(특원평5-331491호) 및 메티오닌(특원평5-335764호)을 첨가함으로써 셀룰로오즈성 물질의 생산성이 향상되는 것을 발견할 수 있다. 또, 특정범위의 산소이동용량계수(k_La)의 조건하에서 셀룰로오즈 생산균을 배양하는 방법도 제안되고 있다(특원평 7-31787호).

또, 종래부터 미생물을 배양하는 배양형식으로서는 정치, 진탕 내지는 통기교반배양등이 이용되어왔다. 또 배양조작법으로서는 이른바 회분발효법, 첨가회분 발효법, 반복회분 발효법 및 연속 발효법등이 사용되어왔다.

한편, 교반수단으로서는 예를 들면 인펠러(교반날개), 에어 리프트 발효조, 발효블로스의 펌프구동순환, 및 이러한 수단의 조합등이 사용되고 있다.

임펠러의 종류로서는 원형날개, 터번날개, 헬리컬 리번 날개 및 스크류 날개등이 알려져있다.

한편, 미생물의 배양에 있어서 발효조의 내압을 높임으로써, 배양액에의 산소공급을 높여 생산성을 개선하는 방법이 일반적으로 행해지고 있다.

이러한 효과는 내압의 상승에 비례하여 기상중의 산소내압이 상승되고, 그 분압상승에 비례하여 다음식에 따라 산소이동이 높아지기 때문이다.

dC_L/dt＝k_La(C^※-C_L)＝Hk_La(P_G-P_L)

dC_L/dt : 산소이동속도(mmol/L·hr)

k_La : 산소이동용량계수(hr^-1)

C_L: 배양액중의 용존산소농도(mmol/L)

C^※: 기포의 산소분압과 평행한 용존산소농도(mmol/L)

H : 헨리 정수

P_G: 기상중의 산소분압(가압하면 높아진다)

P_L: 액상중의 산소분압

그런데, BC의 생산에 있어서 발효조의 내압의 효과는 지금까지 밝혀진 바가 없다.

BC의 생산에 있어서는 BC농도가 높아지면 배양액의 점도가 상승하여 배양액내어서의 산소이동이 곤란해지고, 소요되는 산소공급을 확보하기 위해서는 교반속도와 통기량을 높이는 등의 대처가 필요하게 된다. 그러나 이러한 방법은 많은 동력이 필요하게 되므로 경제적이지 않다. 그런이유로 지금까지 산소요구량을 충족시키기위해서 교반날개의 형상의 개선, 발효조형상의 개선등이 이루어져 왔다(특원평7-31787호). 그러나 발효조내의 가압에 의해 산소공급량을 확보할 수 있는지 없는지에 관해서는 아직 상세하게는 검토되고 있지 않다.

본 발명자들은 특별한 설비를 필요로 하지 않고 용이하게 실시할 수 있는 발효조내의 가압에 의한 산소공급의 향상을 목적으로하여 검토한 결과, 어느 특정한 조건에서 가압함으로써 예상외로 산소공급을 확보하기위한 교반에 필요한 소요동력을 대폭 절감할 수 있음을 발견하였다.

또, 배양중인 이산화탄소의 농도가 BC의 생산성에 미치는 영향에 대해서 아직 보고된 바가 없으므로 본 발명자들은 발효조의 기상중의 이산화탄소의 분압을 일정이하의 값으로 유지함에 의해 BC의 생산속도 및 수율이 향상됨을 발견했다.

본 발명은 이러한 지견에 기초하여 이루어진 것이다.

발명의 개시

즉, 본 발명은 일반적으로 배양후기(생육감쇄기 및 정상기)에 있어서, 즉, 배양액중의 셀룰로오즈성 물질의 농도가 약10g/L이상, 바람직하게는 약12g/L이상으로 증가한 단계, 또는 10(rad/s), 또는 1(1/s)에 있어서 배양액의 겉보기 점도가 약10(Pa·S)이상, 또는 레올로지가 Power law모델에 따른다고 간주했을 때의K값(consistency index)이 약10(Pa·Sⁿ)이상으로 증가한 배양단계, 또는 배양액의 산소요구량이 약35mmol/L·hr이상인 단계에 있어서 발효조의 내압을 약 1.1kg/cm²

A이상, 바람직하게는 약 1.2kg/cm²A이상, 더욱 바람직하게는 약1.5kg/cm²A이상으로 유지하면서 셀룰로오즈 생산균을 배양하여 셀룰로오즈성 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

한편, 여기서 「발효조의 내압」이란 대기압을 1kg/cm²A라고 했을 때의 발효조내의 기상부분의 압력이다.

본 발명에 있어서, 상기 특정 단계에 한정하지 않고 배양의 전 과정을 통해 발효조내의 압력을 소정의 값이상으로 유지할 수도 있다.

발효조의 내압을 소정의 가압상태로 유지하기 위해서는 당업자에게는 주지의 방법, 예를 들면, 배기변을 조정하는 등 지극히 간단한 수단에 의해 실시할 수 있다.

또, 본 발명은 발효조의 기상중의 이산화탄소 분압을 약0.10atm이하, 바람직하게는 0.08atm이하로 유지하면서 셀룰로오즈 생산균을 배양하여 셀룰로오즈성 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이산화탄소의 분압을 유지하는 단계는 상술한 배양후기가 일반적으로 바람직하나, 배양의 전과정을 통해 유지할 수 있다.

이산화탄소의 분압을 일정치이하로 유지하는 구체적인 방법으로서는 예를 들면 발효조에의 통기량을 증가시키는 방법, 및 기상을 이산화탄소의 흡수탑으로 순환시키는 방법등이 있다.

더욱이 발효조의 내압을 상기 일정치이상으로 유지함과 동시에 기상중의 이산화탄소의 분압을 상기 일정치이하로 유지하면 보다 바람직하다.

또, 본 발명 방법을 실시하는데 있어서 전술한 배양형식·배양조작법과 함께 특원평6-192287호에 기재되어있는「배양장치와 부상분리장치 및 엣치필터 등의 분리장치의 사이에서 균체를 포함하는 배양액을 순환시키는 셀룰로오즈성 물질의 제조방법에 있어서, 해당 분리장치에 있어서 생산물인 셀룰로오즈성 물질을 균체 및 배양액으로부터 분리하는 것을 특징으로 하는, 상기 방법」을 채용할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 셀룰로오즈 생산균은, 예를 들면 BPR2001주로 대표되는 아세트박터·키실리넘·서브스피시즈·슈크로파멘턴스(Acetobacter xylinumsubsp.sucrofermentans), 아세트박터·키실리넘(Acetobacter xylinumATCC23768, 아세트박터·키실리넘 ATCC10245, 아세트박터·키실리넘ATCC14851, 아세트박터·키실리넘 ATCC11142 및 아세트박터·키실리넘ATCC10821 등의 초산균, 기타 아글로 박테리움속, 리조비움속, 살루시너속, 슈드모나즈속, 아클로모박터속, 알칼리게네즈속, 아에로박터속, 아조토박터속 및 즈글레어속 및 그것들을 NTG(니트로소그아니진) 등을 사용하는 공지의 방법에 의해 변이처리함으로써 창제되는 각종 변이주이다.

한편, BPR2001주는 1993년 2월 24일에 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술연구소 특허미생물 기탁센터에 기탁되어(수탁번호 FERM P-13466), 그후 1994년 2월 7일자로 특허절차상의 기탁의 국제적승인에 관한 부다페스트조약에 의거하는기탁(수탁번호 FERM BP-4545)으로 이관되었다.

NTG 등의 변이제를 이용한 화학적 변이처리방법에는 예를 들면 Bio Factors, Vol. 1, p. 297-302(1988) 및 J. Gen. Microbiol. Vol. 135, p.2917-2929(1989) 등에 기재되어 있는 것이 있다. 따라서, 당업자라면 이러한 공지의 방법에 기초하여 본 발명에서 사용하는 변이주를 얻을 수 있다. 또, 본 발명에서 사용하는 변이주는 변이방법, 예를 들면 방사선 조사 등에 의해서도 얻을 수 있다.

본 발명의 제조방법에 이용되는 배지의 조성물중, 탄소원으로서는 슈크로스, 글루코스, 플락토스, 만니톨, 소르비톨, 가락토스, 마르토즈, 에리스릿, 글리세린, 에틸렌글리콜, 에탄올 등을 단독 또는 병용하여 사용할 수 있다. 나아가서는 이것들을 함유하는 전분 분해물, 시트라스모라세스, 비트모라세스, 비트착즙, 사토우키비착즙, 감유류를 비롯한 과즙 등을 슈크로스에 부가하여 사용할 수 있다. 또 질소원으로서는 유산 암모늄, 염화 암모늄, 인산 암모늄 등의 암모늄염, 질산염, 요소등 유기 또는 무기의 질소원을 사용할 수 있고, 또는 Peptone, Soytone, Yeast-Extract, 대두가수분해물 등의 함 질소천연영양원으로써 사용해도 좋다. 유기미량영양소로서 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 2, 7, 9-트리카르복시-1H피롤로〔2, 3, 5〕- 퀴놀린-4, 5- 디온, 아류산 펄프 폐액, 리그닌 술폰산 등을 첨가해도 좋다.

생육에 아미노산 등을 요구하는 영양요구성 변이주를 사용하는 경우에는, 요구되는 영양소를 보충할 필요가 있다. 무기염류로서는 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염, 코발트염, 몰리부덴산염, 적혈염, 킬레이트금속류등이 사용된다.

나아가서는 전술한 셀룰로오즈 생성 촉진인자를 적당한 배지중에 첨가할 수도 있다. 예를 들면 초산균을 생산균으로써 사용하는 경우에는 배양의 pH는 3내지 7로, 바람직하게는 5정도로 제어한다. 배양온도는 10∼40℃, 바람직하게는 25∼35℃범위에서 행한다. 배양장치에 공급하는 산소농도는 1∼100%, 바람직하게는 21∼80%이면 좋다. 이러한 배지중의 각성분의 조성비율 및 배지에 대한 균체의 접종등은 배양방법에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 제조되는 BC는 균체를 그대로 남기고 회수해도 좋고, 본 물질중에 포함되는 균체를 포함하는 셀룰로오즈성 물질이외의 불순물을 제거하는 처리를 할 수 있다.

불순물을 제거하기 위해서는 수세, 가압탈수, 희산세정, 알칼리세정, 차아염소산 소다 및 과산화수소 등의 표백제에 의한 처리, 리조팀 등의 균체용해효소에 의한 처리, 라우릴 유산소다, 디옥시콜산 등의 계면활성제에 의한 처리, 상온에서 200℃범위의 가열세정 등을 단독 및 병용해서 행하고, 셀룰로오즈성 물질로부터 불순물을 거의 완전히 제거할 수 있다.

이렇게하여 얻어진 본발명에서 말하는 셀룰로오즈성 물질로는 셀룰로오즈 및 셀룰로오즈를 주쇄로 한 헤테로 다당을 포함하는 것 및 β-1, 3, β-1, 2 등의 글루칸을 포함하는 것이다. 헤테로다당의 경우의 셀룰로오즈이외의 구성성분은 만노즈, 플락토오즈, 갈락토오즈, 키실로오즈, 아라비노즈, 람노즈, 글루크론산 등의 6탄당, 5탄당 및 유기산등이다.

한편, 이들 다당이 단일물질인 경우도 있고 2종이상인 다당이 수소결합 등에 의해 혼재해도 좋다.

점도의 측정방법

점도는 평판형 회전식 점도계(Fluid spectrometer RFS-Ⅱ, Rheometrics Co., Ltd.)를 이용하여 동적점탄성측정법 및 정적측정법으로 측정한다.

측정범위는 1∼100(rad/s) 및 0.1∼10(1/s)이다. 다만 동적점탄성측정법에 있어서 왜곡율은 10%이다. 각 전단조건에서 응력으로부터 겉보기 점도를 구하여, 10(rad/s), 또는 1(1/s)에서 겉보기 점도를 대표치로 한다. 또 박테리아 셀룰로오즈를 포함하는 배양액의 점도특성은 측정범위내에서 Power law모델에 따른다고 간주되며, 다음식으로 나타낼 수 있다.

η_ap＝K LEFT | Υ RIGHT |^(n-1)

η_ap(Pa·S)는 겉보기 점도, K는 consistency index(Pa·Sⁿ), γ(S^-1)는 평균전단속도, n은 Power law index(-)이다. n은 각 전단조건에서 K값이 평균치에서 벗어나는 것을 최소가 되도록 정한다.

산소요구량의 측정방법

배양액중의 산소요구량은 통기중의 산소농도와 배기중의 산소농도의 차이로부터 구할 수 있다. 즉 통기량과 산소농도차의 합계로 구할 수 있는 소비량을 배양액의 용량으로 나눈 값이 산소소비량이다. 배양중은 통기중의 산소농도와 배양액중의 용존산소농도는 일정하게 제한되며, 더욱이 산소는 충족하고 있으므로 산소요구량은 산소소비량과 동등하다.

발효조의 내압 및 기상중의 이산화탄소의 분압의 측정방법

당해 기술분야에 있어서 상법에 따라 측정할 수 있다.

예를 들면 발효조의 내압은 조에 직접 부착된 다이아그램식 압력계로 측정할 수 있다.

또, 기상중의 이산화탄소 농도는 배기중에서 온라인으로 비분산형 적외선 흡수방식의 측정장치를 사용하여 측정하고, 이에 발효조의 내압을 실어 이산화탄소 분압을 구할 수 있다.

실시예1

이하의 조건에서 본 발명의 제조방법을 실시하였다.

BPR2001주에서 얻어진 변이주로써 고중합도 셀룰로오즈 생산균인 BPR3001A주(1995년 6월 12일자 기탁, 수탁번호 FERM P-1482)를 이하의 조건에서 배양했다.

배양조건:

배양장치로는 50L용량의 항아리형 발효조를 이용하고, 배지는 CSL-Fru배지를 이 항아리형 발효조내에서 살균하여 사용하였다. 사용 액량은 30L, 통기량은 15L/분이다. 루·플라스크와 코니컬·플라스크를 사용하여 배양한 균액을 식균하고, 30℃로 보온하면서 약40시간 배양했다. 배양액의 점도는 도중에 뽑아낸 배양액을 사용하고, 동적점탄성측정법으로 측정했다. 통기중 및 배기중의 산소농도는 온라인 산소농도계를 사용하여 측정하였다. 소요동력은 교반 모터인 인펠러출력등으로부터 구했다.

[표 1]

배지조성

CSL-Fru

플럭토오스 7.0(%)KH₂PO₄0.1MgSO₄·7H₂O 0.025(NH₄)₂SO₄0.33비타민 혼합액 1.0염류혼합액 1.0CSL(옥수수 액) 4.0pH 5.0

[표 2]

비타민혼합물

화합물mg/L

이노시톨 200

나이아신 40

피리독신HCl 40

티아민HCl 40

판토텐산 칼슘 20

리보플라빈 20

p-아민 안식향산 20

엽산 0.2

비오틴 0.2

[표 3]

염류혼합액

구연산철암모늄 360mg/L

염화칼슘 1470mg/L

몰리부덴산 암모늄 242mg/L

유산아연7수염 173mg/L

유산망간4수염 139mg/L

유산동5수염 5mg/L

이상과 같이 얻어지는 교반에 필요로 하는 소요동력과 BC축적의 경시변화를 제1도로 나타내었다.

제1도에 나타난 대로, 배양24시간째 이후, 축적10g/L이상의 조건에서는 내압1kg/cm²A에 비교하여 1.1kg/cm²A에서는 최대소요동력은 약50%, 1.2kg/cm²A에서는 약38%, 1.5kg/cm²A에서는 약25%로 절감할 수 있게 되었다. 이러한 절감율은 상기식으로 예상되는 비율에 비교할 때 예상외로 큰 것이었다.

실시예2

실시예1과 마찬가지 균주 및 같은 배양장치를 사용하여, 교반수, 통기량, 및 내압을 변화시켜 기상중의 이산화탄소분압, BC의 생산속도 및 수율을 각각 구했다. 결과는 표4로 나타내었다.

통기량(vvm)	1/4	1/4	1/2	1/2	1/1
최고교반수(rpm)	450	400	400	350	400
내압(kg/cm²A)	1.5	2.0	1.5	2.5	1.5
최대CO₂분압(atm)	0.12	0.16	0.06	0.10	0.03
생산속도(g/L·h)	0.38	0.37	0.44	0.41	0.44
수율(%)	23	22	26	25	26

한편, 도면중, BC축적량(g/L)은 배양종료후 배양액중의 고형물을 집적하고, 수세하여 배지성분을 제거한 후, INNaOH수용액중에서 80℃, 20분간처리하여 균체를 제거했다. 그 다음에는 세정액이 중성에 가까워질때까지 생성 셀룰로오즈를 수세한 후, 80℃에서 12시간 진공건조하여 건조중량을 측정하였다. 또 수율 또는 소비당수율(%)은 다음과 같이 구하였다.

소비당수율(%)의 계산

Y_BC＝BC/(RC_MF-RC_BF)*100

Y_BC: 소비당수율(%)

BC : BC축적량(g/L)

RC_MF: 배지의 당농도(g/L)

RC_BF: 배양후 배지의 당농도(g/L)

본 발명의 방법에 의해, BC의 생산에 있어서 배양시의 교반에 요구되는 소요동력을 대폭 줄이고, 동시에 BC의 생산속도 및 수율을 높일 수 있다.

Claims

발효조내에서 셀룰로오즈 생산균을 배양하는 단계를 포함하며,

상기 배양단계 중 생육감쇄기와 정상기를 포함하는 배양 후기에 상기 발효조내의 기상부분의 이산화탄소의 부분압을 0.10 atm 이하로 유지하면서 상기 셀룰로오즈 생산균을 배양하는 단계를 포함하는, 박테리아 셀룰로오즈의 제조방법.
발효조내에서 셀룰로오즈 생산균을 배양하는 단계를 포함하며,

배양액 중의 박테리아 셀룰로오즈의 농도가 약 10 g/L 이상에 도달하는 배양 정상기 및 생육감쇄기에 상기 발효조내의 기상부분의 이산화탄소의 부분압을 0.10 atm 이하로 유지하면서 상기 셀룰로오즈 생산균을 배양하는 단계를 포함하는, 박테리아 셀룰로오즈의 제조방법.
발효조내에서 셀룰로오즈 생산균을 배양하는 단계를 포함하며,

10(rad/s), 또는 1(1/s)에서 배양액의 겉보기 점도가 약 10(Pa·S) 이상, 또는 레올로지가 Power law모델에 따른다고 간주했을 때의 K값(consistency index)이 약10(Pa·Sⁿ) 이상으로 증가되는 배양 정상기 및 생육감쇄기에 발효조내의 기상부분의 이산화탄소의 부분압을 0.10 atm 이하로 유지하면서 상기 셀룰로오즈 생산균을 배양하는 단계를 포함하는, 박테리아 셀룰로오즈의 제조방법.
발효조내에서 셀룰로오즈 생산균을 배양하는 단계를 포함하며,

배양액의 산소요구량이 약 35mmol/L·hr이상으로 증가된 배양 정상기 및 생육감쇄기에 발효조내의 기상부분의 이산화탄소의 부분압을 0.10 atm 이하로 유지하면서 상기 셀룰로오즈 생산균을 배양하는 단계를 포함하는, 박테리아 셀룰로오즈의 제조방법.