JP3341017B2 - 新規セルロース生産菌 - Google Patents
新規セルロース生産菌Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/02—Acetobacter
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/823—Acetobacter
Description
【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、セルロース性物質を生産する能力を有する
微生物（この微生物を以後「セルロース生産菌」と称す
る。）であって、酢酸塩及び乳酸塩の酸化能が実質的に
ないか、又は微弱であることを特徴とする新規な亜種、
並びにセルロース生産菌を誘導、育種して得られた新規
な糖アナログ耐性株、アミノ酸アナログ耐性株及びレバ
ンシュクラーゼ欠損株に関する。
微生物（この微生物を以後「セルロース生産菌」と称す
る。）であって、酢酸塩及び乳酸塩の酸化能が実質的に
ないか、又は微弱であることを特徴とする新規な亜種、
並びにセルロース生産菌を誘導、育種して得られた新規
な糖アナログ耐性株、アミノ酸アナログ耐性株及びレバ
ンシュクラーゼ欠損株に関する。
更に本発明は、これらの新規な菌株を培養して、該セ
ルロース性物質（以下、「バクテリアセルロース」又は
「BC」という。）を製造する方法、及び該製造方法によ
って得ることの出来るセルロース性物質に関する。
ルロース性物質（以下、「バクテリアセルロース」又は
「BC」という。）を製造する方法、及び該製造方法によ
って得ることの出来るセルロース性物質に関する。
BCは可食性であり無味無臭である為、食品分野で利用
されるほか、水系分散性に優れているので食品、化粧品
又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、水分の
保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳化安定
化助剤としての産業上利用価値がある。
されるほか、水系分散性に優れているので食品、化粧品
又は塗料等の粘度の保持、食品原料生地の強化、水分の
保持、食品安定性向上、低カロリー添加物又は乳化安定
化助剤としての産業上利用価値がある。
BCは木材パルプ等から製造されるセルロースに較べ、
フィブリルの断片幅が２桁程度も小さいことを特徴とす
る。
フィブリルの断片幅が２桁程度も小さいことを特徴とす
る。
従って、BCの離解物はミクロフィブリルのかかる構造
的物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤
として各種の産業用用途がある。このようなセルロース
性離解物を紙状または固型状に固化した物質は高い引張
弾性率を示すのでミクロフィブリルの構造的特徴に基づ
くすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材として
の応用がある。
的物理的特徴に基づき高分子、特に水系高分子用補強剤
として各種の産業用用途がある。このようなセルロース
性離解物を紙状または固型状に固化した物質は高い引張
弾性率を示すのでミクロフィブリルの構造的特徴に基づ
くすぐれた機械特性が期待され、各種産業用素材として
の応用がある。
このようなBCの生産にこれまで使用されてきた菌株に
は、例えば、BPR2001株に代表されるアセトバクター・
キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタ
ンス（Acetobacter xylinum subsp.sucrofermentan
s）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylin
um）ATCC23768、アセトバクター・キシリナムATCC2376
9、アセトバクター・パスツリアヌス（A.pasteurianu
s）ATCC10245、アセトバクター・キシリナムATCC1485
1、アセトバクター・キシリナムATCC11142及びアセトバ
クター・キシリナムATCC10821等の酢酸菌、並びにそれ
らの菌株より各種突然変異処理及び遺伝子組み換え技術
などによって誘導・育種して得られた菌株、更にそれら
からNTG（ニトロソグアニジン）等を用いる公知方法に
よって変異処理して創製される各種変異株がある。
は、例えば、BPR2001株に代表されるアセトバクター・
キシリナム・サブスピーシーズ・シュクロファーメンタ
ンス（Acetobacter xylinum subsp.sucrofermentan
s）、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylin
um）ATCC23768、アセトバクター・キシリナムATCC2376
9、アセトバクター・パスツリアヌス（A.pasteurianu
s）ATCC10245、アセトバクター・キシリナムATCC1485
1、アセトバクター・キシリナムATCC11142及びアセトバ
クター・キシリナムATCC10821等の酢酸菌、並びにそれ
らの菌株より各種突然変異処理及び遺伝子組み換え技術
などによって誘導・育種して得られた菌株、更にそれら
からNTG（ニトロソグアニジン）等を用いる公知方法に
よって変異処理して創製される各種変異株がある。
この中でも、BPR2001株と命名された株の分類学的性
質は、形態は桿菌、グラム染色性は陰性、胞子形成能は
陰性、酸素に対する態度は好気性、カタラーゼ反応陽
性、オキシダーゼ反応陰性、エタノールからの酢酸生成
は陽性、酢酸塩の塩化は陽性、乳酸塩の酸化は陽性であ
る。更に、かかるBPR2001株から得られたPQQ非生成株も
ある。かかるPQQ非生成株の一例であるBPR3001c株は199
4年５月２日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３
号（郵便番号305）の通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され、受託
番号FERM Ｐ−14297を付され、その後1995年５月12日
付で特許手続上の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約に基づく寄託（受託番号FERM BP−5100）に移管さ
れている。
質は、形態は桿菌、グラム染色性は陰性、胞子形成能は
陰性、酸素に対する態度は好気性、カタラーゼ反応陽
性、オキシダーゼ反応陰性、エタノールからの酢酸生成
は陽性、酢酸塩の塩化は陽性、乳酸塩の酸化は陽性であ
る。更に、かかるBPR2001株から得られたPQQ非生成株も
ある。かかるPQQ非生成株の一例であるBPR3001c株は199
4年５月２日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３
号（郵便番号305）の通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され、受託
番号FERM Ｐ−14297を付され、その後1995年５月12日
付で特許手続上の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約に基づく寄託（受託番号FERM BP−5100）に移管さ
れている。
変異株としては、例えば、レバンの生成が抑制された
レバンシュクラーゼ欠損変異株がある。
レバンシュクラーゼ欠損変異株がある。
その他の各種変異株、即ち、サルファ剤耐性株（BPR3
001D株；受託番号FERM Ｐ−14330,1994年５月25日
付）、ピリミジンアナログ耐性株（BPR3001I株；受託番
号FERM Ｐ−14362,1994年６月10日付）及びDHO−DHase
等阻害剤耐性株（BPR3001N株；受託番号FERM Ｐ−1436
1,1994年６月10日付）も、夫々、日本国茨城県つくば市
東１丁目１番３号（郵便番号305）の通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに
寄託されている。更に、シュクロース代謝に関する酵素
の遺伝子によって形質転換されたセルロース生産菌（国
際公開WO95/32279）や、菌体外インベルターゼ遺伝子及
び分泌遺伝子によって形質転換されたセルロース生産菌
（特願平７−252021）もある。
001D株；受託番号FERM Ｐ−14330,1994年５月25日
付）、ピリミジンアナログ耐性株（BPR3001I株；受託番
号FERM Ｐ−14362,1994年６月10日付）及びDHO−DHase
等阻害剤耐性株（BPR3001N株；受託番号FERM Ｐ−1436
1,1994年６月10日付）も、夫々、日本国茨城県つくば市
東１丁目１番３号（郵便番号305）の通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに
寄託されている。更に、シュクロース代謝に関する酵素
の遺伝子によって形質転換されたセルロース生産菌（国
際公開WO95/32279）や、菌体外インベルターゼ遺伝子及
び分泌遺伝子によって形質転換されたセルロース生産菌
（特願平７−252021）もある。
尚、BPR2001株は、平成５年２月24日に日本国茨城県
つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）の通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託セ
ンターに寄託され（受託番号FERM Ｐ−13466）、その
後1994年２月７日付で特許手続上の寄託の国際的承認に
関するブダペスト条約に基づく寄託（受託番号FERM BP
−4545）に移管されている。
つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）の通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託セ
ンターに寄託され（受託番号FERM Ｐ−13466）、その
後1994年２月７日付で特許手続上の寄託の国際的承認に
関するブダペスト条約に基づく寄託（受託番号FERM BP
−4545）に移管されている。
本発明者は、シュクロース又はグルコース等を糖源と
して用いて、BCを効率良く、より多量に生産することの
出来る新規なセルロース生産菌を創製すべく種々の研究
を行ない、今回、酢酸塩及び乳酸塩の酸化能が実質的に
ないか、又は微弱であることを特徴とする新規な亜種を
見いだした。
して用いて、BCを効率良く、より多量に生産することの
出来る新規なセルロース生産菌を創製すべく種々の研究
を行ない、今回、酢酸塩及び乳酸塩の酸化能が実質的に
ないか、又は微弱であることを特徴とする新規な亜種を
見いだした。
また、セルロース生産菌は糖等の炭素源を取り込み・
代謝することにより又、アミノ酸を生合成するか培地中
のアミノ酸を取り込み・代謝することにより、生育・セ
ルロース生産する。本発明者等はそこでセルロース生産
性の向上した株を取得するために、糖及びアミノ酸の取
り込み・代謝の強化に着目し種々の検討を行った。その
結果、驚くべきことに、ある種の化合物（糖アナログ又
はアミノ酸アナログ）の添加により生産菌の生育が阻害
されることを見出した。さらに、本発明者等はこれらの
アナログに対する耐性株を選択することにより更に生産
性が向上した株を取得することに成功し、本発明を完成
させた。
代謝することにより又、アミノ酸を生合成するか培地中
のアミノ酸を取り込み・代謝することにより、生育・セ
ルロース生産する。本発明者等はそこでセルロース生産
性の向上した株を取得するために、糖及びアミノ酸の取
り込み・代謝の強化に着目し種々の検討を行った。その
結果、驚くべきことに、ある種の化合物（糖アナログ又
はアミノ酸アナログ）の添加により生産菌の生育が阻害
されることを見出した。さらに、本発明者等はこれらの
アナログに対する耐性株を選択することにより更に生産
性が向上した株を取得することに成功し、本発明を完成
させた。
ところで、レバンシュクラーゼ（EC2.4.1.10）はシュ
クロースを分解、代謝する酵素として知られている。該
酵素は、シュクロースをグルコースとフラクトースに
分解するシュクロース加水分解活性と、シュクロース
からグルコースとレバンとを生成するフルクトシル転移
活性の２種の活性を有している。このうち、二番目の活
性はレバンを副生する為に、BCの生産上あまり好ましく
ない。そこで、この副生レバンの蓄積を抑制することが
できれば生産・精製上より有利である。本発明者等は既
に、特願平７−252021号において、レバンシュクラーゼ
欠損株を誘導し、菌体外インベルターゼあるいはレバン
生成能が低下したレバンシュクラーゼ遺伝子を導入する
ことにより、レバンの蓄積を低減し、効率的なセルロー
ス生産を行うことを開示している。
クロースを分解、代謝する酵素として知られている。該
酵素は、シュクロースをグルコースとフラクトースに
分解するシュクロース加水分解活性と、シュクロース
からグルコースとレバンとを生成するフルクトシル転移
活性の２種の活性を有している。このうち、二番目の活
性はレバンを副生する為に、BCの生産上あまり好ましく
ない。そこで、この副生レバンの蓄積を抑制することが
できれば生産・精製上より有利である。本発明者等は既
に、特願平７−252021号において、レバンシュクラーゼ
欠損株を誘導し、菌体外インベルターゼあるいはレバン
生成能が低下したレバンシュクラーゼ遺伝子を導入する
ことにより、レバンの蓄積を低減し、効率的なセルロー
ス生産を行うことを開示している。
従って、本発明は、酢酸塩及び乳酸塩の酸化能が実質
的にない（陰性）か、又は微弱である、アセトバクター
・キシリナム・サブスピーシーズ・ノンアセトオキシダ
ンス（Acetobacter xylinum subsp.nonacetoxidans）に
係わる。
的にない（陰性）か、又は微弱である、アセトバクター
・キシリナム・サブスピーシーズ・ノンアセトオキシダ
ンス（Acetobacter xylinum subsp.nonacetoxidans）に
係わる。
該アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・
ノンアセトオキシダンスに属する具体的な菌株の例とし
て、Ｓ−35′−３、757−３−５−11、及び184−２−２
と命名された株があり、これらは、1996年４月12日付で
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号30
5）の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特
許微生物寄託センターに寄託され、それぞれ、受託番号
FERM Ｐ−15563、FERM Ｐ−15564、及びFERM Ｐ−15
565を付され、その後、1997年２月10日付で特許手続上
の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく寄
託（夫々、受託番号FERM BP−5814、FERM BP−5815、
及びFERM BP−5816）に移管されている。
ノンアセトオキシダンスに属する具体的な菌株の例とし
て、Ｓ−35′−３、757−３−５−11、及び184−２−２
と命名された株があり、これらは、1996年４月12日付で
日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号30
5）の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特
許微生物寄託センターに寄託され、それぞれ、受託番号
FERM Ｐ−15563、FERM Ｐ−15564、及びFERM Ｐ−15
565を付され、その後、1997年２月10日付で特許手続上
の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づく寄
託（夫々、受託番号FERM BP−5814、FERM BP−5815、
及びFERM BP−5816）に移管されている。
更に、本発明は、セルロース生産菌の糖アナログ耐性
株及びアミノ酸アナログ耐性株に係わる。
株及びアミノ酸アナログ耐性株に係わる。
ここで、「糖アナログ」とは、グルコース等の炭素源
となる物質の類縁化合物であり、その添加により、糖と
競合し、生産菌の生育もしくは、セルロース生産が阻害
抑制される物質と定義する。
となる物質の類縁化合物であり、その添加により、糖と
競合し、生産菌の生育もしくは、セルロース生産が阻害
抑制される物質と定義する。
従って、糖アナログの例としては、２−デオキシ−Ｄ
−グルコース（DG）、６−デオキシ−グルコサミン、１
−チオ−Ｄ−グルコース、５−チオ−Ｄ−グルコース、
１−メチル−グルコース及びフロリジン等を具体的に挙
げることができるが、これらの物質に限定されるもので
はない。
−グルコース（DG）、６−デオキシ−グルコサミン、１
−チオ−Ｄ−グルコース、５−チオ−Ｄ−グルコース、
１−メチル−グルコース及びフロリジン等を具体的に挙
げることができるが、これらの物質に限定されるもので
はない。
また、「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸の類縁化
合物であり、その添加により、アミノ酸と競合し、生産
菌の生育もしくは、セルロース生産が阻害抑制される物
質と定義する。
合物であり、その添加により、アミノ酸と競合し、生産
菌の生育もしくは、セルロース生産が阻害抑制される物
質と定義する。
従って、アミノ酸アナログの例としては、フェニルア
ラニン、セリン又はメチオニン等のアミノ酸のアナログ
である、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｏ−メチルセ
リン又はエチオニン等を具体的に挙げることができる
が、これらの物質に限定されるものではない。
ラニン、セリン又はメチオニン等のアミノ酸のアナログ
である、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｏ−メチルセ
リン又はエチオニン等を具体的に挙げることができる
が、これらの物質に限定されるものではない。
本発明の新規な耐性株は、前に述べた各種菌株、例え
ば、本発明に係わる新規なアセトバクター・キシリナム
・サブスピーシーズ・ノンアセトオキシダンスにNTG
（ニトロソグアニン）などを用いる公知の化学的変異処
理方法によって創製することができる。
ば、本発明に係わる新規なアセトバクター・キシリナム
・サブスピーシーズ・ノンアセトオキシダンスにNTG
（ニトロソグアニン）などを用いる公知の化学的変異処
理方法によって創製することができる。
又、上記757−３−５−11株から、同様な変異手段に
よってレバンシュクラーゼ欠損株を誘導、育種して、新
規なLD−２株を得た。これは1997年１月22日付で日本国
茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）の通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物
寄託センターに特許手続上の寄託の国際的承認に関する
ブダペスト条約に基づく寄託がされ、受託番号FERM BP
−5789が付されている。
よってレバンシュクラーゼ欠損株を誘導、育種して、新
規なLD−２株を得た。これは1997年１月22日付で日本国
茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号305）の通
商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物
寄託センターに特許手続上の寄託の国際的承認に関する
ブダペスト条約に基づく寄託がされ、受託番号FERM BP
−5789が付されている。
更に、本発明は、これらの新規なアセトバクター・キ
シリナム・サブスピーシーズ・ノンアセトオキシダンス
及び各種耐性株並びに欠損株を培養することからなるセ
ルロース性物質の製造方法、及び該製造方法によって得
ることのできるセルロース性物質に係わる。
シリナム・サブスピーシーズ・ノンアセトオキシダンス
及び各種耐性株並びに欠損株を培養することからなるセ
ルロース性物質の製造方法、及び該製造方法によって得
ることのできるセルロース性物質に係わる。
本発明の新規なアセトバクター・キシリナム・サブス
ピーシーズ・ノンアセトオキシダンスは、花又は果物等
の天然の分離源から高セルロース生産能を有する酢酸菌
を単離し、本発明の目的を達成し得る菌株をスクリーニ
ングし、該当する菌株の菌学的性質を固定する、という
過程で創製されたものであり、以下の表１に示された各
菌株の菌学的性質の比較から、これらの菌株はIF015237
株やBPR2001株に代表される従来公知のアセトバクター
・キシリナム属に属する菌と異なり、酢酸塩及び乳酸塩
の塩化能が実質的にない（陰性）か、又は微弱である等
の特徴を有する新規な亜種であることが判明した。
ピーシーズ・ノンアセトオキシダンスは、花又は果物等
の天然の分離源から高セルロース生産能を有する酢酸菌
を単離し、本発明の目的を達成し得る菌株をスクリーニ
ングし、該当する菌株の菌学的性質を固定する、という
過程で創製されたものであり、以下の表１に示された各
菌株の菌学的性質の比較から、これらの菌株はIF015237
株やBPR2001株に代表される従来公知のアセトバクター
・キシリナム属に属する菌と異なり、酢酸塩及び乳酸塩
の塩化能が実質的にない（陰性）か、又は微弱である等
の特徴を有する新規な亜種であることが判明した。
本発明の製造方法に用いる培地の組成物中、炭素源と
してはシュクロース、グルコース、フラクトース、マン
ニトール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース、
エリスリット、グリセリン、エチレングリコール及びエ
タノール等を併用して使用することもできる。更にはこ
れらのものを含有する澱粉水解物、シトラスモラセス、
ビートモラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類
を始めとする果汁等を使用することもできる。
してはシュクロース、グルコース、フラクトース、マン
ニトール、ソルビトール、ガラクトース、マルトース、
エリスリット、グリセリン、エチレングリコール及びエ
タノール等を併用して使用することもできる。更にはこ
れらのものを含有する澱粉水解物、シトラスモラセス、
ビートモラセス、ビート搾汁、サトウキビ搾汁、柑橘類
を始めとする果汁等を使用することもできる。
また、窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸
塩、尿素等有機或いは無機の窒素源を使用することがで
き、或いはBact−Peptone、Bact−Soytone、Yeast−Ext
ract、豆濃などの含窒素天然栄養源を使用してもよい。
有機微量栄養素としてアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、2,7,9−トリカルボキシ−1Hピロロ〔2,3−５〕−キ
ノリン−4,5−ジオンを添加してもよい。
ニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硝酸
塩、尿素等有機或いは無機の窒素源を使用することがで
き、或いはBact−Peptone、Bact−Soytone、Yeast−Ext
ract、豆濃などの含窒素天然栄養源を使用してもよい。
有機微量栄養素としてアミノ酸、ビタミン、脂肪酸、核
酸、2,7,9−トリカルボキシ−1Hピロロ〔2,3−５〕−キ
ノリン−4,5−ジオンを添加してもよい。
生育にアミノ酸等を要求する栄養要求性変異株を使用
する場合には、要求される栄養素を補添することが必要
である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、
カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト塩、モリブ
デン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用される。
する場合には、要求される栄養素を補添することが必要
である。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、
カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、コバルト塩、モリブ
デン酸塩、赤血塩、キレート金属類等が使用される。
従来より、アセトバクター属に属する微生物のような
セルロース生産菌を培養して、セルロースを生産する方
法は知られており、本発明の製造方法は、以下に例示す
るこれらの従来の方法に従って行なうことができる。例
えば、特開昭62−265990号公報、特開昭63−202394号公
報及び特公平６−43443号公報等に、その記載がある。
セルロース生産菌の培養を行なう際に適当とされている
栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキス、燐
酸ナトリウム及びクエン酸からなるSchramm/Hestrin培
地（Schrammら,J.General Biology,11,pp.123〜129,195
4）が知られている。
セルロース生産菌を培養して、セルロースを生産する方
法は知られており、本発明の製造方法は、以下に例示す
るこれらの従来の方法に従って行なうことができる。例
えば、特開昭62−265990号公報、特開昭63−202394号公
報及び特公平６−43443号公報等に、その記載がある。
セルロース生産菌の培養を行なう際に適当とされている
栄養培地としては、炭素源、ペプトン、酵母エキス、燐
酸ナトリウム及びクエン酸からなるSchramm/Hestrin培
地（Schrammら,J.General Biology,11,pp.123〜129,195
4）が知られている。
また、上記栄養培地の他に、コーンスチープリカー
（CSL）や麦芽エキス等を加えた培地が知られている。
（CSL）や麦芽エキス等を加えた培地が知られている。
更に、培地中の特定栄養素によるセルロース生成促進
因子として、現在知られているものにはイノシトール、
フィチン酸及びピロロキノリンキノン（PQQ）（特公平
５−1718号公報；高井光男，紙パ技協誌，第42巻，第３
号，第237〜244頁）等がある。
因子として、現在知られているものにはイノシトール、
フィチン酸及びピロロキノリンキノン（PQQ）（特公平
５−1718号公報；高井光男，紙パ技協誌，第42巻，第３
号，第237〜244頁）等がある。
また、本出願人は、カルボン酸又はその塩（特開平７
−39386号）、インベルターゼ（特開平７−184677
号）、メチオニン（特開平７−184675号）及びサポニン
（特願平６−214334号）を培地中に添加することによっ
て、セルロース性物質の生産性が向上することを見い出
している。
−39386号）、インベルターゼ（特開平７−184677
号）、メチオニン（特開平７−184675号）及びサポニン
（特願平６−214334号）を培地中に添加することによっ
て、セルロース性物質の生産性が向上することを見い出
している。
培養のpHは３ないし７に、好ましくは５付近に制御す
る。培養温度は10〜40℃、好ましくは25〜35℃の範囲で
行う。培養槽に供給する酸素濃度は１〜100％、望まし
くは21〜80％であれば良い。これら培地中の各成分の組
成割合及び培地に対する菌体の接種等は培養方法に応じ
て当業者が適宜選択し得るものである。
る。培養温度は10〜40℃、好ましくは25〜35℃の範囲で
行う。培養槽に供給する酸素濃度は１〜100％、望まし
くは21〜80％であれば良い。これら培地中の各成分の組
成割合及び培地に対する菌体の接種等は培養方法に応じ
て当業者が適宜選択し得るものである。
本発明の製造方法では、培養形式に制限を受けず、静
置、振盪もしくは通気攪拌培養のいずれでもよい。振盪
もしくは通気攪拌下での培養であってもセルロース生産
性に影響を及ぼさないことも本発明方法の特徴の１つで
ある。また、培養操作方法についても、いわゆる回分発
酵法、流加回分発酵法、反復回分発酵法及び連続発酵法
のいずれも使用することができる。更に、これら培養形
式、培養操作方法に適宜、修正又は変更を加えた方法も
使用することができる。
置、振盪もしくは通気攪拌培養のいずれでもよい。振盪
もしくは通気攪拌下での培養であってもセルロース生産
性に影響を及ぼさないことも本発明方法の特徴の１つで
ある。また、培養操作方法についても、いわゆる回分発
酵法、流加回分発酵法、反復回分発酵法及び連続発酵法
のいずれも使用することができる。更に、これら培養形
式、培養操作方法に適宜、修正又は変更を加えた方法も
使用することができる。
更に攪拌手段としては従来公知の手段、例えばインペ
ラー、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循
環、及びこれら手段の組合せ等から任意に選択すること
ができる。
ラー、エアーリフト発酵槽、発酵ブロスのポンプ駆動循
環、及びこれら手段の組合せ等から任意に選択すること
ができる。
本発明の方法によって生成されるセルロース性物質は
そのまま回収してもよく、さらに本物質中に含まれる菌
体を始めとするセルロース性物質以外の物質を取り除く
処理をほどこしてもよい。
そのまま回収してもよく、さらに本物質中に含まれる菌
体を始めとするセルロース性物質以外の物質を取り除く
処理をほどこしてもよい。
不純物を取り除くためには水洗、加圧脱水、希酸洗
浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素な
どの漂白剤による処理、リゾチームなどの菌体溶解酵素
による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デオキシコール酸な
どの界面活性剤による処理、常温から200℃の範囲の加
熱洗浄などを単独及び併用してほどこすことによりセル
ロース性物質から不純物を除去することができる。
浄、アルカリ洗浄、次亜塩素酸ソーダ及び過酸化水素な
どの漂白剤による処理、リゾチームなどの菌体溶解酵素
による処理、ラウリル硫酸ソーダ、デオキシコール酸な
どの界面活性剤による処理、常温から200℃の範囲の加
熱洗浄などを単独及び併用してほどこすことによりセル
ロース性物質から不純物を除去することができる。
このようにして得られた本発明でいうセルロース性物
質とは、セルロース及び、セルロースを主鎖としたヘテ
ロ多糖を含むもの及びβ−1,3、β−1,2等のグルカンを
含むものである。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の
構成成分はマンノース、フラクトース、ガラクトース、
キシロース、アラビノース、ラムノース、グルクロン酸
等の六炭糖、五炭糖及び有機酸等である。
質とは、セルロース及び、セルロースを主鎖としたヘテ
ロ多糖を含むもの及びβ−1,3、β−1,2等のグルカンを
含むものである。ヘテロ多糖の場合のセルロース以外の
構成成分はマンノース、フラクトース、ガラクトース、
キシロース、アラビノース、ラムノース、グルクロン酸
等の六炭糖、五炭糖及び有機酸等である。
なおこれ等の多糖が単一物質である場合もあるし２種
以上の多糖が水素結合等により混在してもよい。
以上の多糖が水素結合等により混在してもよい。
以下の実施例により、本発明をさらに詳細に説明す
る。
る。
実施例１ アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・ノン
アセトオキシダンスの創製 アセトバクター属細菌は、一般に花、果物等に存在す
ることが知られており（Bergey's Manual of Systemati
c Bacteriology（1984）Vol.1,p268）、本菌もこれらを
分離源として単離した。先ず、分離源を殺菌したシュラ
ム／ヘストリン培地（Biochemical Journal,58（195
4）,345−352）を基本とする液体培地〔グルコース 20
g/l、酵母エキス 5g/l、ペプトン 5g/l、Na2HPO4 2.
7g/l、クエン酸・H2O 1.2g/l、エタノール 2ml/l、酢
酸 5ml/l、シクロヘキシミド（抗カビ剤） 100mg/l、
pH5.0〕で希釈し、この希釈液を同様の液体培地に植菌
し集積培養を実施した後、28℃で７日間静置培養を行な
い、ベリクル形成の認められたカルチャーの培養ブロス
を希釈し、上記培地に寒天20g/lを加えた寒天平板プレ
ートに接種し28℃で７日間培養し、セルロース生産菌コ
ロニーを単離した。このコロニーの中から、本発明の目
的にかなう菌株をスクリーニングし、該当する菌株の菌
学的性質を当該技術分野に於いて周知の標準的方法によ
って同定した。その結果が、前記表１に示されている。
アセトオキシダンスの創製 アセトバクター属細菌は、一般に花、果物等に存在す
ることが知られており（Bergey's Manual of Systemati
c Bacteriology（1984）Vol.1,p268）、本菌もこれらを
分離源として単離した。先ず、分離源を殺菌したシュラ
ム／ヘストリン培地（Biochemical Journal,58（195
4）,345−352）を基本とする液体培地〔グルコース 20
g/l、酵母エキス 5g/l、ペプトン 5g/l、Na2HPO4 2.
7g/l、クエン酸・H2O 1.2g/l、エタノール 2ml/l、酢
酸 5ml/l、シクロヘキシミド（抗カビ剤） 100mg/l、
pH5.0〕で希釈し、この希釈液を同様の液体培地に植菌
し集積培養を実施した後、28℃で７日間静置培養を行な
い、ベリクル形成の認められたカルチャーの培養ブロス
を希釈し、上記培地に寒天20g/lを加えた寒天平板プレ
ートに接種し28℃で７日間培養し、セルロース生産菌コ
ロニーを単離した。このコロニーの中から、本発明の目
的にかなう菌株をスクリーニングし、該当する菌株の菌
学的性質を当該技術分野に於いて周知の標準的方法によ
って同定した。その結果が、前記表１に示されている。
実施例２ アセトバクター・キシリナム・サブスピーシーズ・ノン
アセトオキシダンスの培養によるバクテリアセルロース
の製造 （１）ジャー培養 培地：メイン培地 CSL（４％）−シュクロース（４
％）又はCSL（４％）−グルコース（４％） 菌株:184−２−２、757−３−５−11、BPR2001 培養方法：上記メイン培地100mlを張り込んだ750ml容Ro
uxフラスコに上記菌株の凍結保存菌液1mlを植菌し、低
温培養槽内で28℃で３日間静置培養を行なった。静置培
養終了後、Rouxフラスコをよく振盪し、その内容物を無
菌条件下でガーゼ濾過してセルロース片と菌体を分離し
た。得られた菌液7.5mlをメイン培地67.5mlを張り込ん
だ300ml容スパイラルバッフルフラスコに植菌し、振盪
培養器を用いて振幅2cm、回転速度180rpm、温度28℃の
条件で回転振盪しながら３日間シード培養を行なった。
アセトオキシダンスの培養によるバクテリアセルロース
の製造 （１）ジャー培養 培地：メイン培地 CSL（４％）−シュクロース（４
％）又はCSL（４％）−グルコース（４％） 菌株:184−２−２、757−３−５−11、BPR2001 培養方法：上記メイン培地100mlを張り込んだ750ml容Ro
uxフラスコに上記菌株の凍結保存菌液1mlを植菌し、低
温培養槽内で28℃で３日間静置培養を行なった。静置培
養終了後、Rouxフラスコをよく振盪し、その内容物を無
菌条件下でガーゼ濾過してセルロース片と菌体を分離し
た。得られた菌液7.5mlをメイン培地67.5mlを張り込ん
だ300ml容スパイラルバッフルフラスコに植菌し、振盪
培養器を用いて振幅2cm、回転速度180rpm、温度28℃の
条件で回転振盪しながら３日間シード培養を行なった。
培養終了後、フラスコの内容物を無菌ブレンダーに移
し、10,000rpmで３分間破砕処理を行なった。この破砕
された内容物をシード菌液とし、以下のメイン培養に使
用した。
し、10,000rpmで３分間破砕処理を行なった。この破砕
された内容物をシード菌液とし、以下のメイン培養に使
用した。
上記シード菌液60mlを滅菌済み検討培地540mlを張り
込んだ小型ジャーファメンター（全容量1,000ml）に無
菌的に植菌し、30℃、pHをIN NaOHもしくはIN H2SO4
でpH5.0にコントロールしながら、また、攪拌回転数を
初発400rpmで、溶存酸素量（DO）が3.0〜21.0％内に入
るように回転数を自動制御しながらメイン培養を行なっ
た。その結果、得られたBC蓄積量を表２及び表３に示
す。
込んだ小型ジャーファメンター（全容量1,000ml）に無
菌的に植菌し、30℃、pHをIN NaOHもしくはIN H2SO4
でpH5.0にコントロールしながら、また、攪拌回転数を
初発400rpmで、溶存酸素量（DO）が3.0〜21.0％内に入
るように回転数を自動制御しながらメイン培養を行なっ
た。その結果、得られたBC蓄積量を表２及び表３に示
す。
結果： （２）静置培養 培地：メイン培地 CSL（２％）−Suc（４％） 菌株:S−35′−３、BPR2001 培養方法：前培養として、凍結保存菌液0.5mlを250ml容
ルーフラスコに50ml張り込んだ培地に植菌し、３日間、
28℃、静置培養した。培養後、その培養液をメイン培地
への植菌液とした。
ルーフラスコに50ml張り込んだ培地に植菌し、３日間、
28℃、静置培養した。培養後、その培養液をメイン培地
への植菌液とした。
メイン培養は250ml容ルーフラスコに45ml張り込んだ
培地に植菌液を5ml植菌した。これにより培養スケール
は、培養表面積が75cm2、液深が0.67cmとなった。以上
の条件でメイン培養を３日間、28℃、静置培養した結果
以下の表４に示すようなBC蓄積が得られた。
培地に植菌液を5ml植菌した。これにより培養スケール
は、培養表面積が75cm2、液深が0.67cmとなった。以上
の条件でメイン培養を３日間、28℃、静置培養した結果
以下の表４に示すようなBC蓄積が得られた。
実施例3:糖アナログ耐性株の創製 ２−デオキシ−Ｄ−グルコース（DG）耐性の確認 757−３−５−11株を、表10に示す最少培地に各濃度
のDGを含むプレートに塗抹した。28℃、７日間培養後、
各プレート上のコロニー出現数を観察した。
のDGを含むプレートに塗抹した。28℃、７日間培養後、
各プレート上のコロニー出現数を観察した。
757−３−５−11株の変異処理 菌体をCSL（２％）−Fru培地（表11）で28℃、３時間
培養し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、10mM隣
酸酸緩衝液（pH6.0）で洗浄し、40μgNTG/ml（10mM燐酸
緩衝液）中で30℃、30分間で変異処理した。変異処理し
た菌体を集菌し、前記のように洗浄し、次にCSL（２
％）−Fru培地で28℃、一夜培養し変異を固定化した。
培養し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、10mM隣
酸酸緩衝液（pH6.0）で洗浄し、40μgNTG/ml（10mM燐酸
緩衝液）中で30℃、30分間で変異処理した。変異処理し
た菌体を集菌し、前記のように洗浄し、次にCSL（２
％）−Fru培地で28℃、一夜培養し変異を固定化した。
この結果、生存率約１％で変異株を得た。
糖アナログ（DG）耐性株の取得 上記で変異処理した757−３−５−11株（約4,000コロ
ニー）を最少培地にDG200mmol/Lを含むプレートに塗抹
した。（約170コロニー／プレート） 28℃、７日間培養し出現したコロニーのうち、109株
を取得した。
ニー）を最少培地にDG200mmol/Lを含むプレートに塗抹
した。（約170コロニー／プレート） 28℃、７日間培養し出現したコロニーのうち、109株
を取得した。
実施例４ 実施例３で得られた109株につき、以下の方法で培養
を行ない、BC蓄積量を求めた。
を行ない、BC蓄積量を求めた。
前培養として、50mlCSL（２％）−Fru培地の入った25
0ml容ルーフラスコに菌株を植菌し、28℃、３日間静置
培養した。
0ml容ルーフラスコに菌株を植菌し、28℃、３日間静置
培養した。
（１）フラスコ培養 ルーフラスコを良く振り菌膜から菌体を剥がし、この
菌液を68mlCSL（２％）−Glc（２％）培地（表11）の入
った300ml容三角フラスコ（バッフル付き）に7.5ml植菌
した。28℃、３日間、150rpmで振盪することによって本
培養した。
菌液を68mlCSL（２％）−Glc（２％）培地（表11）の入
った300ml容三角フラスコ（バッフル付き）に7.5ml植菌
した。28℃、３日間、150rpmで振盪することによって本
培養した。
この結果、以下の表８に示すように、特にDG耐性株６
株が親株である757−３−５−11株に較べて更に優れたD
C生産性を示すことが判った。
株が親株である757−３−５−11株に較べて更に優れたD
C生産性を示すことが判った。
これらのDG耐性株のうち、ｄ−40−３は、1996年４月
25日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便
番号305）の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM
Ｐ−15603を付され、その後、1997年２月10日付で特
許手続上の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に
基づく寄託（受託番号FERM BP−5817）に移管されてい
る。
25日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便
番号305）の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM
Ｐ−15603を付され、その後、1997年２月10日付で特
許手続上の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に
基づく寄託（受託番号FERM BP−5817）に移管されてい
る。
（２）ジャー培養 菌株:DG耐性株（ｄ−40−３）、757−３−５−11 培養方法:CSL（２％）−Glc培地100mlを張り込んだ750m
l容Rouxフラスコに上記菌株の凍結保存菌液のそれぞれ1
mlを植菌し、恒温培養槽内で28℃で３日間静置培養を行
なった。静置培養終了後、Rouxフラスコをよく振り、そ
の内容物を無菌条件下でガーゼ濾過してセルロース片と
菌体を分離した。得られた菌液7.5mlをCSL（２％）−Gl
c（２％）培地67.5mlを張り込んだ300ml容スパイラルバ
ッフルフラスコに植菌し、振盪培養器を用いて振幅2c
m、回転速度180rpm、温度28℃の条件で回転振盪しなが
ら３日間シード培養を行なった。
l容Rouxフラスコに上記菌株の凍結保存菌液のそれぞれ1
mlを植菌し、恒温培養槽内で28℃で３日間静置培養を行
なった。静置培養終了後、Rouxフラスコをよく振り、そ
の内容物を無菌条件下でガーゼ濾過してセルロース片と
菌体を分離した。得られた菌液7.5mlをCSL（２％）−Gl
c（２％）培地67.5mlを張り込んだ300ml容スパイラルバ
ッフルフラスコに植菌し、振盪培養器を用いて振幅2c
m、回転速度180rpm、温度28℃の条件で回転振盪しなが
ら３日間シード培養を行なった。
培養終了後、フラスコの内容物を無菌ブレンダーに移
し、10,000rpmで３分間破砕処理を行なった。この破砕
された内容物をシード菌液とし、以下のメイン培養に使
用した。
し、10,000rpmで３分間破砕処理を行なった。この破砕
された内容物をシード菌液とし、以下のメイン培養に使
用した。
上記シード菌液60mlを滅菌済みCSL（４％）−Glc（４
％）培地（表11）540mlを張り込んだ小型ジャーファメ
ンター（全容量1,000ml）に無菌的に植菌し、30℃、pH
をアンモニアガスもしくは1N H2SO4でpH5.0にコントロ
ールしながら、また、攪拌回転数を初発400rpmで、溶存
酸素量（DO）が3.0〜21.0％内に入るように回転数を自
動制御しながらメイン培養を行なった。その結果、得ら
れたDC蓄積量を表９に示す。
％）培地（表11）540mlを張り込んだ小型ジャーファメ
ンター（全容量1,000ml）に無菌的に植菌し、30℃、pH
をアンモニアガスもしくは1N H2SO4でpH5.0にコントロ
ールしながら、また、攪拌回転数を初発400rpmで、溶存
酸素量（DO）が3.0〜21.0％内に入るように回転数を自
動制御しながらメイン培養を行なった。その結果、得ら
れたDC蓄積量を表９に示す。
実施例5:p−フルオロフェニルアラニン（PFP）耐性株 PFP耐性の確認 184−２−２株を、表10に示す最少培地に各濃度のPFP
を含むプレートに塗抹した。28℃、７日間培養後、各プ
レート上のコロニー出現数を観察した。
を含むプレートに塗抹した。28℃、７日間培養後、各プ
レート上のコロニー出現数を観察した。
184−２−２株の変異処理 菌体をCSL（２％）−Suc培地（表23）で28℃、３時間
培養し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、10mM燐
酸緩衝液（pH6.0）で洗浄し、40μgNTG/ml（10mM燐酸緩
衝液）中で30℃、30分間で変異処理した。変異処理した
菌体を集菌し、前記のように洗浄し、次にCSL（２％）
−Suc培地で28℃、一夜培養し変異を固定化した。
培養し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、10mM燐
酸緩衝液（pH6.0）で洗浄し、40μgNTG/ml（10mM燐酸緩
衝液）中で30℃、30分間で変異処理した。変異処理した
菌体を集菌し、前記のように洗浄し、次にCSL（２％）
−Suc培地で28℃、一夜培養し変異を固定化した。
この結果、生存率約１％で変異株を得た。
PFP耐性株の取得 上記で変異処理した184−２−２株（約12,000コロニ
ー）を最少培地にPFP1mMを含むプレートに塗抹した。
（約120コロニー／プレート） 28℃、７日間培養し出現したコロニーのうち、62株を
取得した。
ー）を最少培地にPFP1mMを含むプレートに塗抹した。
（約120コロニー／プレート） 28℃、７日間培養し出現したコロニーのうち、62株を
取得した。
BCの生産 こうして得られた62株につき、以下の方法で培養を行
ない、BC蓄積量を求めた。
ない、BC蓄積量を求めた。
前培養として、100mlCSL（２％）−Suc培地（表23）
の入った750ml容ルーフラスコに菌株を植菌し、28℃、
３日間静置培養した。
の入った750ml容ルーフラスコに菌株を植菌し、28℃、
３日間静置培養した。
（１）フラスコ培養 ルーフラスコを良く振り菌膜から菌体を剥がし、この
菌液を68mlCSL（２％）−Suc培地（表23）の入った300m
l容三角フラスコ（バッフル付き）に7.5ml植菌した。28
℃、３日間、150rpmで振盪することによって本培養し
た。
菌液を68mlCSL（２％）−Suc培地（表23）の入った300m
l容三角フラスコ（バッフル付き）に7.5ml植菌した。28
℃、３日間、150rpmで振盪することによって本培養し
た。
この結果、以下の表15に示すように、特にPFP耐性株
６株が親株である184−２−２株を較べて更に優れたBC
生産性を示すことが判った。
６株が親株である184−２−２株を較べて更に優れたBC
生産性を示すことが判った。
これらのPFP耐性株のうち、BPR−M6は、1996年５月30
日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番
号305）の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM
Ｐ−15657を付され、その後、1997年２月10日付で特許
手続上の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基
づく寄託（受託番号FERM BP−5820）に移管されてい
る。
日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番
号305）の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所特許微生物寄託センターに寄託され、受託番号FERM
Ｐ−15657を付され、その後、1997年２月10日付で特許
手続上の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基
づく寄託（受託番号FERM BP−5820）に移管されてい
る。
（２）ジャー培養 菌株:PFP耐性株（BPR−M6）、184−２−２ 培養方法:CSL（２％）−Suc培地（表23）100mlを張り込
んだ750ml容ルーフラスコに上記菌株の凍結保存菌液の
それぞれ1mlを植菌し、恒温培養槽内で28℃で３日間静
置培養を行なった。静置培養終了後、ルーフラスコをよ
く振り、その内容物を無菌条件下でガーゼ濾過してセル
ロース片と菌体を分離した。得られた菌液7.5mlをCSL
（２％）−Suc培地（表23）67.5mlを張り込んだ300ml容
三角フラスコ（バッフル付き）に植菌し、振盪培養器を
用いて回転速度150rpm、温度28℃の条件で回転振盪しな
がら３日間シード培養を行なった。
んだ750ml容ルーフラスコに上記菌株の凍結保存菌液の
それぞれ1mlを植菌し、恒温培養槽内で28℃で３日間静
置培養を行なった。静置培養終了後、ルーフラスコをよ
く振り、その内容物を無菌条件下でガーゼ濾過してセル
ロース片と菌体を分離した。得られた菌液7.5mlをCSL
（２％）−Suc培地（表23）67.5mlを張り込んだ300ml容
三角フラスコ（バッフル付き）に植菌し、振盪培養器を
用いて回転速度150rpm、温度28℃の条件で回転振盪しな
がら３日間シード培養を行なった。
培養終了後、フラスコの内容物を無菌ブレンダーに移
し、10,000rpmで３分間破砕処理を行なった。この破砕
された内容物をシード菌液とし、以下のメイン培養に使
用した。
し、10,000rpmで３分間破砕処理を行なった。この破砕
された内容物をシード菌液とし、以下のメイン培養に使
用した。
上記シード菌液60mlを滅菌済みCSL（２％）−Suc培地
（表23）540mlを張り込んだ小型ジャーファメンター
（全容量1,000ml）に無菌的に植菌し、30℃、pHをアン
モニアガスもしくは1N H2SO4でpH5.0にコントロールし
ながら、また、攪拌回転数を初発400rpmで、溶存酸素量
（DO）が3.0〜21.0％内に入るように回転数を自動制御
しながらメイン培養を行なった。その結果、得られたBC
蓄積量を表16に示す。
（表23）540mlを張り込んだ小型ジャーファメンター
（全容量1,000ml）に無菌的に植菌し、30℃、pHをアン
モニアガスもしくは1N H2SO4でpH5.0にコントロールし
ながら、また、攪拌回転数を初発400rpmで、溶存酸素量
（DO）が3.0〜21.0％内に入るように回転数を自動制御
しながらメイン培養を行なった。その結果、得られたBC
蓄積量を表16に示す。
実施例6:o−メチルセリン耐性株 ｏ−メチルセリン耐性の確認 184−２−２株を、表10に示す最少培地に各濃度のｏ
−メチルセリンを含むプレートに塗抹した。28℃、７日
間培養後、各プレート上のコロニー出現数を観察した。
−メチルセリンを含むプレートに塗抹した。28℃、７日
間培養後、各プレート上のコロニー出現数を観察した。
184−２−２株の変異処理 菌体をCSL（２％）−Suc培地（表23）で28℃、３時間
培養し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、10mM燐
酸緩衝液pH6.0）で洗浄し、40μgNTG/ml（10mM燐酸緩衝
液）中で30℃、30分間で変異処理した。変異処理した菌
体を集菌し、前記のように洗浄し、次にCSL（２％）−S
uc培地（表23）で28℃、一夜培養し変異を固定化した。
培養し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、10mM燐
酸緩衝液pH6.0）で洗浄し、40μgNTG/ml（10mM燐酸緩衝
液）中で30℃、30分間で変異処理した。変異処理した菌
体を集菌し、前記のように洗浄し、次にCSL（２％）−S
uc培地（表23）で28℃、一夜培養し変異を固定化した。
この結果、生存率約１％で変異株を得た。
ｏ−メチルセリン耐性株の取得 上記で変異処理した184−２−２株（約12,000コロニ
ー）を最少培地にｏ−メチルセリン40mMを含むプレート
に塗抹した。（約120コロニー／プレート） 28℃、７日間培養し出現したコロニーのうち、60株を
取得した。
ー）を最少培地にｏ−メチルセリン40mMを含むプレート
に塗抹した。（約120コロニー／プレート） 28℃、７日間培養し出現したコロニーのうち、60株を
取得した。
BCの生産 こうして得られた60株につき、以下の方法で培養を行
ない、BC蓄積量を求めた。
ない、BC蓄積量を求めた。
前培養として、100mlCSL（２％）−Suc培地（表23）
の入った750ml容ルーフラスコに菌株を植菌し、28℃、
３日間静置培養した。
の入った750ml容ルーフラスコに菌株を植菌し、28℃、
３日間静置培養した。
（１）フラスコ培養 ルーフラスコを良く振り菌膜から菌体を剥がし、この
菌液を68mlCSL（２％）−Suc培地（表23）の入った300m
l容三角フラスコ（バッフル付き）に7.5ml植菌した。28
℃、３日間、150rpmで振盪することによって本培養し
た。
菌液を68mlCSL（２％）−Suc培地（表23）の入った300m
l容三角フラスコ（バッフル付き）に7.5ml植菌した。28
℃、３日間、150rpmで振盪することによって本培養し
た。
この結果、以下の表18に示すように、特にｏ−メチル
セリン耐性株７株が親株である184−２−２株に較べて
更に優れたBC生産性を示すことが判った。
セリン耐性株７株が親株である184−２−２株に較べて
更に優れたBC生産性を示すことが判った。
これらのｏ−メチルセリン耐性株のうち、BPR−N52
は、1996年５月30日付で日本国茨城県つくば市東１丁目
１番３号（郵便番号305）の通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託さ
れ、受託番号FERM Ｐ−15655を付され、その後、1997
年２月10日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関する
ブダペスト条約に基づく寄託（受託番号FERM BP−581
8）に移管されている。
は、1996年５月30日付で日本国茨城県つくば市東１丁目
１番３号（郵便番号305）の通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託さ
れ、受託番号FERM Ｐ−15655を付され、その後、1997
年２月10日付で特許手続上の寄託の国際的承認に関する
ブダペスト条約に基づく寄託（受託番号FERM BP−581
8）に移管されている。
（２）ジャー培養 菌株:o−メチルセリン耐性株（BPR−N52）、184−２−
２ 培養方法:CSL（２％）−Suc培地100mlを張り込んだ750m
l容ルーフラスコに上記菌株の凍結保存菌液のそれぞれ1
mlを植菌し、恒温培養槽内で28℃で３日間静置培養を行
なった。静置培養終了後、ルーフラスコをよく振り、そ
の内容物を無菌条件下でガーゼ濾過してセルロース片と
菌体を分離した。得られた菌液7.5mlをCSL（２％）−Su
c培地（表23）67.5mlを張り込んだ300ml容三角フラスコ
（バッフル付き）に植菌し、振盪培養器を用いて回転速
度150rpm、温度28℃の条件で回転振盪しながら３日間シ
ード培養を行なった。
２ 培養方法:CSL（２％）−Suc培地100mlを張り込んだ750m
l容ルーフラスコに上記菌株の凍結保存菌液のそれぞれ1
mlを植菌し、恒温培養槽内で28℃で３日間静置培養を行
なった。静置培養終了後、ルーフラスコをよく振り、そ
の内容物を無菌条件下でガーゼ濾過してセルロース片と
菌体を分離した。得られた菌液7.5mlをCSL（２％）−Su
c培地（表23）67.5mlを張り込んだ300ml容三角フラスコ
（バッフル付き）に植菌し、振盪培養器を用いて回転速
度150rpm、温度28℃の条件で回転振盪しながら３日間シ
ード培養を行なった。
培養終了後、フラスコの内容物を無菌ブレンダーに移
し、10,000rpmで３分間破砕処理を行なった。この破砕
された内容物をシード菌液とし、以下のメイン培養に使
用した。
し、10,000rpmで３分間破砕処理を行なった。この破砕
された内容物をシード菌液とし、以下のメイン培養に使
用した。
上記シード菌液60mlを滅菌済みCSL（２％）−Suc培地
（表23）540mlを張り込んだ小型ジャーファメンター
（全容量1,000ml）に無菌的に植菌し、30℃、pHをアン
モニアガスもしくは1N H2SO4でpH5.0にコントロールし
ながら、また、攪拌回転数を初発400rpmで、溶存酸素量
（DO）が3.1〜21.0％内に入るように回転数を自動制御
しながらメイン培養を行なった。その結果、得られたBC
蓄積量を表19に示す。
（表23）540mlを張り込んだ小型ジャーファメンター
（全容量1,000ml）に無菌的に植菌し、30℃、pHをアン
モニアガスもしくは1N H2SO4でpH5.0にコントロールし
ながら、また、攪拌回転数を初発400rpmで、溶存酸素量
（DO）が3.1〜21.0％内に入るように回転数を自動制御
しながらメイン培養を行なった。その結果、得られたBC
蓄積量を表19に示す。
実施例7:エチオニン耐性株の創製 エチオニン耐性の確認 757−３−５−11株を、表10に示す最少培地に各濃度
のエチオニンを含むプレートに塗抹した。28℃、７日間
培養後、各プレート上のコロニー出現数を観察した。
のエチオニンを含むプレートに塗抹した。28℃、７日間
培養後、各プレート上のコロニー出現数を観察した。
757−３−５−11株の変異処理 菌体をCSL（２％）−Suc培地（表23）で28℃、３時間
培養し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、10mM燐
酸緩衝液（pH6.0）で洗浄し、40μgNTG/ml（10mM燐酸緩
衝液）中で30℃、30分間で変異処理した。変異処理した
菌体を集菌し、前記のように洗浄し、次にCSL（２％）
−Suc培地（表23）で28℃、一夜培養し変異を固定化し
た。
培養し、菌体を増した。この前培養液を集菌後、10mM燐
酸緩衝液（pH6.0）で洗浄し、40μgNTG/ml（10mM燐酸緩
衝液）中で30℃、30分間で変異処理した。変異処理した
菌体を集菌し、前記のように洗浄し、次にCSL（２％）
−Suc培地（表23）で28℃、一夜培養し変異を固定化し
た。
この結果、生存率約１％で変異株を得た。
エチオニン耐性株の取得 上記で変異処理した757−３−５−11株（約6,000コロ
ニー）を最少培地にエチオニン0.2mMを含むプレートに
塗抹した。（約60コロニー／プレート） 28℃、７日間培養し出現したコロニーのうち、76株を
取得した。
ニー）を最少培地にエチオニン0.2mMを含むプレートに
塗抹した。（約60コロニー／プレート） 28℃、７日間培養し出現したコロニーのうち、76株を
取得した。
BCの生産 こうして得られた76株につき、以下の方法で培養を行
ない、BC蓄積量を求めた。
ない、BC蓄積量を求めた。
前培養として、100mlCSL（２％）−Cuc培地（表23）
の入った750ml容ルーフラスコに菌株を植菌し、28℃、
３日間静置培養した。
の入った750ml容ルーフラスコに菌株を植菌し、28℃、
３日間静置培養した。
（１）フラスコ培養 ルーフラスコを良く振り菌膜から菌体を剥がし、この
菌液を68mlCSL（２％）−Suc培地（表23）の入った300m
l容三角フラスコ（バッフル付き）に7.5ml植菌した。28
℃、３日間、150rpmで振盪することによって本培養し
た。
菌液を68mlCSL（２％）−Suc培地（表23）の入った300m
l容三角フラスコ（バッフル付き）に7.5ml植菌した。28
℃、３日間、150rpmで振盪することによって本培養し
た。
この結果、以下の表21に示すように、特にエチオニン
耐性株７株が親株である757−３−５−11株に較べて優
れたBC生産性を示すことが判った。
耐性株７株が親株である757−３−５−11株に較べて優
れたBC生産性を示すことが判った。
これらのエチオニン耐性株のうち、BPR−P35は、1996
年５月30日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
（郵便番号305）の通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され、受託番
号FERM Ｐ−15656を付され、その後、1997年２月10日
付で特許手続上の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約に基づく寄託（受託番号FERM BP−5819）に移管さ
れている。
年５月30日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号
（郵便番号305）の通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所特許微生物寄託センターに寄託され、受託番
号FERM Ｐ−15656を付され、その後、1997年２月10日
付で特許手続上の寄託の国際的承認に関するブダペスト
条約に基づく寄託（受託番号FERM BP−5819）に移管さ
れている。
（２）ジャー培養 菌株：エチオニン耐性株（BPR−P35）、757−３−５−1
1 培養方法:CSL（２％）−Suc培地（表23）100mlを張り込
んだ750ml容ルーフラスコに上記菌株の凍結保存菌液の
それぞれ1mlを植菌し、恒温培養槽内で28℃で３日間静
置培養を行なった。静置培養終了後、ルーフラスコをよ
く振り、その内容物を無菌条件下でガーゼ濾過してセル
ロース片と菌体を分離した。得られた菌液7.5mlをCSL
（２％）−Suc培地（表23）67.5mlを張り込んだ300ml容
三角フラスコ（バッフル付き）に植菌し、振盪培養器を
用いて回転速度150rpm、温度28℃の条件で回転振盪しな
がら３日間シード培養を行なった。
1 培養方法:CSL（２％）−Suc培地（表23）100mlを張り込
んだ750ml容ルーフラスコに上記菌株の凍結保存菌液の
それぞれ1mlを植菌し、恒温培養槽内で28℃で３日間静
置培養を行なった。静置培養終了後、ルーフラスコをよ
く振り、その内容物を無菌条件下でガーゼ濾過してセル
ロース片と菌体を分離した。得られた菌液7.5mlをCSL
（２％）−Suc培地（表23）67.5mlを張り込んだ300ml容
三角フラスコ（バッフル付き）に植菌し、振盪培養器を
用いて回転速度150rpm、温度28℃の条件で回転振盪しな
がら３日間シード培養を行なった。
培養終了後、フラスコの内容物を無菌ブレンダーに移
し、10,000rpmで３分間破砕処理を行なった。この破砕
された内容物をシード菌液とし、以下のメイン培養に使
用した。
し、10,000rpmで３分間破砕処理を行なった。この破砕
された内容物をシード菌液とし、以下のメイン培養に使
用した。
上記シード菌液60mlを滅菌済みCSL（２％）−Suc培地
（表23）540mlを張り込んだ小型ジャーファメンター
（全容量1,000ml）に無菌的に植菌し、30℃、pHをアン
モニアガスもしくは1N H2SO4でpH5.0にコントロールし
ながら、また、攪拌回転数を初発400rpmで、溶存酸素率
（DO）が3.0〜21.0％内に入るように回転数を自動制御
しながらメイン培養を行なった。その結果、得られたBC
蓄積量を表22に示す。
（表23）540mlを張り込んだ小型ジャーファメンター
（全容量1,000ml）に無菌的に植菌し、30℃、pHをアン
モニアガスもしくは1N H2SO4でpH5.0にコントロールし
ながら、また、攪拌回転数を初発400rpmで、溶存酸素率
（DO）が3.0〜21.0％内に入るように回転数を自動制御
しながらメイン培養を行なった。その結果、得られたBC
蓄積量を表22に示す。
尚、塩類混合液及びビタミン混合液は、夫々、表12及
び表13に記載の組成のものを使用した。
び表13に記載の組成のものを使用した。
実施例8:レバンシュクラーゼ欠損株の創製 757−３−５−11株を上記と同様の方法で変異処理を
行い、表10のグルコースをシュクロースに代えた最少培
地に塗布した。レバンを生成しない小さな非ムコイド状
のコロニーを候補株として単離し、それらの内グルコー
ス−CSL培地（表11）で良好にセルロースを生産する株
２株（LD−１、LD−２）を選択した。これらの株のCSL
−グルコースおよびCSL−シュクロース培地（表５）に
おけるセルロース生産と副生多糖の蓄積を表24に示す。
また、これらの株についてレバンシュクラーゼ活性を通
常の方法（H.Yanaseら、Biosci.Biotech.Biochem.55
巻、1383−1390頁（1991年））によって測定したとこ
ろ、活性が検出されず、これらの株がレバンシュクラー
ゼ欠損株であることを確認した。
行い、表10のグルコースをシュクロースに代えた最少培
地に塗布した。レバンを生成しない小さな非ムコイド状
のコロニーを候補株として単離し、それらの内グルコー
ス−CSL培地（表11）で良好にセルロースを生産する株
２株（LD−１、LD−２）を選択した。これらの株のCSL
−グルコースおよびCSL−シュクロース培地（表５）に
おけるセルロース生産と副生多糖の蓄積を表24に示す。
また、これらの株についてレバンシュクラーゼ活性を通
常の方法（H.Yanaseら、Biosci.Biotech.Biochem.55
巻、1383−1390頁（1991年））によって測定したとこ
ろ、活性が検出されず、これらの株がレバンシュクラー
ゼ欠損株であることを確認した。
このレバンシュクラーゼ欠損株LD−２を宿主株として
用いて、特願平７−252021号記載のザイモモナス菌由来
菌体外インベルターゼ遺伝子及びその分泌促進遺伝子を
含むプラスミドpSAZE3S、並びに枯草菌由来レバン生成
活性が低下したレバンシュクラーゼ遺伝子を含むプラス
ミドpSARHを導入した。これら導入株によるCSL−シュク
ロース培地（表５）でのセルロース生産の例を表25に示
す。これらレバンシュクラーゼ欠損株への遺伝子導入に
より、シュクロースからのセルロース生産において副生
のレバンが顕著に低減した株が得られることが示され
た。
用いて、特願平７−252021号記載のザイモモナス菌由来
菌体外インベルターゼ遺伝子及びその分泌促進遺伝子を
含むプラスミドpSAZE3S、並びに枯草菌由来レバン生成
活性が低下したレバンシュクラーゼ遺伝子を含むプラス
ミドpSARHを導入した。これら導入株によるCSL−シュク
ロース培地（表５）でのセルロース生産の例を表25に示
す。これらレバンシュクラーゼ欠損株への遺伝子導入に
より、シュクロースからのセルロース生産において副生
のレバンが顕著に低減した株が得られることが示され
た。
実施例9:フロリジン耐性株の取得 実施例３と同様な方法にて得られた親株ｄ−40−３の
NTG変異株より、糖アナログであるフロリジンに対し耐
性を示す菌株を取得（表26）し、そのBC生産性を評価
（表27）した。
NTG変異株より、糖アナログであるフロリジンに対し耐
性を示す菌株を取得（表26）し、そのBC生産性を評価
（表27）した。
Glc2％含む最少培地（表10）プレートに、ｄ−40−３
は3000cell/プレート、ｄ−40−3NTG変異株は4000cell/
プレートの割合でスプレッドし、28℃で約１週間培養し
た結果、以下に示す結果を得た。
は3000cell/プレート、ｄ−40−3NTG変異株は4000cell/
プレートの割合でスプレッドし、28℃で約１週間培養し
た結果、以下に示す結果を得た。
表26より、ｄ−40−3NTG変異株で5mMフロリジンプレ
ートに出現したコロニーからランダムに100株を選択し
て、実施例４と同様にフラスコ培養した。その結果、表
27に示す通り、親株ｄ−40−３より高い蓄積を示した株
として、ｅ−51、ｅ−61及びｅ−87が得られた。
ートに出現したコロニーからランダムに100株を選択し
て、実施例４と同様にフラスコ培養した。その結果、表
27に示す通り、親株ｄ−40−３より高い蓄積を示した株
として、ｅ−51、ｅ−61及びｅ−87が得られた。
尚、本明細書中、セルロース量（g/L）は、培養終了
後、フラスコ内の固形物を集積し、水洗して培地成分を
除去した後、１％NaOH水溶液中で80℃、20分間処理して
菌体を除去した。さらに、洗浄液が中性付近になるまで
生成セルロースを水洗した後、80℃で12時間真空乾燥し
て乾燥重量を測定することで求めた。
後、フラスコ内の固形物を集積し、水洗して培地成分を
除去した後、１％NaOH水溶液中で80℃、20分間処理して
菌体を除去した。さらに、洗浄液が中性付近になるまで
生成セルロースを水洗した後、80℃で12時間真空乾燥し
て乾燥重量を測定することで求めた。
また収率（％）は以下のようにして求めた。
収率（％）の計算 収率は、対消費糖収率として以下のように計算した。
YBC＝BC/（RCMF−RCBF）＊100 YBC :対消費糖収率（％） BC :BC蓄積量（g/l） RCMF:培地の糖濃度（g/l） RCBF:培養後の培地の糖濃度（g/l） 〔産業上の利用分野〕 本発明のアセトバクター・キシリナム・サブスピーシ
ーズ・ノンアセトオキシダンス及びセルロース生産菌か
ら誘導、育種して得られた各種耐性株並びにレバンシュ
クラーゼ欠損株を培養することにより、炭素源として特
にシュクロースあるいはグルコースを用いて従来のBPR2
001株を培養した場合と比較して、バクテリアセルロー
スがより多量に生産することができた。
ーズ・ノンアセトオキシダンス及びセルロース生産菌か
ら誘導、育種して得られた各種耐性株並びにレバンシュ
クラーゼ欠損株を培養することにより、炭素源として特
にシュクロースあるいはグルコースを用いて従来のBPR2
001株を培養した場合と比較して、バクテリアセルロー
スがより多量に生産することができた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:02） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５８１５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５８１７ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５８１８ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５８１９ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２０ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−５７８９ (72)発明者 瀬戸 光 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１ 号 株式会社バイオポリマー・リサーチ 内 (72)発明者 小島 由貴子 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１ 号 株式会社バイオポリマー・リサーチ 内 (72)発明者 松岡 昌伸 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１ 号 株式会社バイオポリマー・リサーチ 内 (72)発明者 吉永 文弘 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１ 号 株式会社バイオポリマー・リサーチ 内 (56)参考文献 特開 平７−135966（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/00 - 7/08 C12P 19/04 C08B 37/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (13)
- 【請求項１】酢酸塩及び乳酸塩の酸化能が陰性である、
アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinu
m）。 - 【請求項２】FERM BP−5815である請求項１記載のアセ
トバクター・キシリナム。 - 【請求項３】２−デオキシ−Ｄ−グルコース耐性株であ
る、請求項１記載のアセトバクター・キシリナム。 - 【請求項４】FERM BP−5817である請求項３記載の耐性
株。 - 【請求項５】ｏ−メチルセリン耐性株である、請求項１
記載のアセトバクター・キシリナム。 - 【請求項６】FERM BP−5818である請求項５記載の耐性
株。 - 【請求項７】エチオニン耐性株である、請求項１記載の
アセトバクター・キシリナム。 - 【請求項８】FERM BP−5819である請求項７記載の耐性
株。 - 【請求項９】ｐ−フルオロフェニルアラニン耐性株であ
る請求項１記載のアセトバクター・キシリナム。 - 【請求項１０】FERM BP−5820である請求項９記載の耐
性株。 - 【請求項１１】請求項１又は２記載のアセトバクター・
キシリナムのレバンシュクラーゼ欠損株。 - 【請求項１２】FERM BP−5789である請求項11記載の欠
損株。 - 【請求項１３】請求項１ないし12のいずれか一項に記載
のアセトバクター・キシリナムを培養することからなる
セルロース性物質の製造方法。
Applications Claiming Priority (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12395196 | 1996-04-23 | ||
| JP14976396 | 1996-05-22 | ||
| JP8-123951 | 1996-06-14 | ||
| JP8-174393 | 1996-06-14 | ||
| JP17439396 | 1996-06-14 | ||
| JP8-149763 | 1996-06-14 | ||
| PCT/JP1997/000514 WO1997040135A1 (fr) | 1996-04-23 | 1997-02-24 | Nouvelles bacteries produisant de la cellulose |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3341017B2 true JP3341017B2 (ja) | 2002-11-05 |
Family
ID=27314835
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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