DE69736581T2

DE69736581T2 - Neue zellulose produzierende bakterien

Info

Publication number: DE69736581T2
Application number: DE69736581T
Authority: DE
Inventors: Takayasu Bio Polymer Research Co. TSUCHIDA; Naoto Bio Polymer Research Co. TONOUCHI; Akira Bio Polymer Research Co. SETO; Yukiko Bio Polymer Research Co. KOJIMA; Masanobu Bio Polymer Research Co. MATSUOKA; Fumihiro Bio Polymer Research Co. YOSHINAGA
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Cp Kelco Aps Atlanta Ga Us
Priority date: 1996-04-23
Filing date: 1997-02-24
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2017-02-25
Also published as: US6110712A; EP0834555A1; KR19990022043A; EP0834555B1; US5962278A; DE69736581D1; WO1997040135A1; JP3341017B2; EP0834555A4

Description

Bereich der Technik
Diese Erfindung betrifft einen Mikroorganismus, welcher zur Herstellung eines Celluloseprodukts fähig ist, (hier nachstehend als ein „celluloseerzeugendes Bakterium" bezeichnet) und betrifft eine neue Subspezies, welche im Wesentlichen bei der Oxidation von Acetaten und Laktaten negativ oder sehr gering positiv ist. Diese Erfindung betrifft auch neue Saccharidanalogon-resistente Stämme, Aminosäureanalogon-resistente Stämme und Levan Sucrase-defiziente Stämme.
Ferner betrifft diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Cellulosematerial (bakterielle Cellulose: „BC"), welches das Kultivieren dieser neuen Bakterien umfasst, und bakterielle Cellulose, die so erhalten werden kann.
Stand der Technik
Da BC essbar sowie geschmacklos und geruchlos ist, wird sie in der Nahrungsmittelindustrie verwendet. Die hohe Dispensierbarkeit von BC in Wasser stellt zudem dafür viele industrielle Verwendungen, wie die Aufrechterhaltung von Feuchtigkeit und Viskosität von Nahrung, Kosmetika oder Beschichtungsmitteln, die Stärkung von Nahrungsmittelmaterialien, die Verbesserung der Stabilität von Nahrung und die Verwendung als Additive mit wenig Kalorien und als ein Emulsionsstabilisator, bereit.
BC ist durch eine Schnittbreite ihrer Fibrillen, welche um zwei Größenordnungen kleiner ist als die von anderen Cellulosearten, wie jene, welche von Holzzellstoff abgeleitet sind, charakterisiert.
Wegen einem solchen Struktur- und physikalischen Merkmal der Mikrofribrillen hat eine homogenisierte BC eine Vielzahl von industriellen Verwendungen als ein Verstärkungsmittel für Polymere, insbesondere hydrophile Polymere. Produkte, welche durch Verfesti gen der mazerierten BC in der Form eines Klumpens oder Papiers hergestellt werden, zeigen ein hohes Elastizitätsmodul bei Spannung wegen dem vorstehenden Merkmal und es wird deshalb erwartet, dass sie ausgezeichnete mechanische Eigenschaften zur Verwendung in verschiedenen Arten von industriellen Materialien aufweist.
Die Stämme, welche herkömmlicherweise bei der Herstellung von BC verwendet werden, schließen Acetobacter-Stämme wie Acetobacter xylinum Subspezies Sucrofermentans wie den BPR 2001-Stamm, Acetobacter xylinum ATCC23768, Acetobacter xylinum ATCC23769, Acetobacter pasteurianus ATCC10245, Acetobacter xylinum ATCC14851, Acetobacter xylinum ATCC11142, Acetobacter xylinum ATCC10821; und Stämme, welche von jenen Stämmen abgeleitet und gezüchtet wurden, mittels verschiedenen Arten von Mutagenesebehandlung und Rekombination von Genen; und Stämme, welche von jenen Stämmen abgeleitet und erzeugt wurden, unter Verwendung von bekannten Mutagenen wie NTG (Nitrosoguanidin) ein.
Die taxonomischen Kennzeichen des BPR 2001-Stammes sind wie folgt:
Morphologie: Stäbchen, Gramfärbung: negativ, Sporenbildungsfähigkeit: negativ, Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob, Katalase: positiv, Oxidase: negativ, Bildung von Essigsäure aus Ethanol: positiv, Oxidation von Acetaten: positiv, Oxidation von Laktaten: positiv.
Der nicht PQQ erzeugende Stamm, der aus dem BPR 2001-Stamm erhalten wurde, wurde auch verwendet. Ein Beispiel des vorstehenden nicht PQQ erzeugenden Stamms, welcher als der BPR 3001c bezeichnet wird, wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 Japan) am 02. Mai 1994 unter der Zugangsnummer FERM P-14297 hinterlegt und dann am 12. Mai 1995 bezogen auf den Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke Patentverfahren und -regulierung in die Hinterlegung unter der Zugangsnummer FERM BP-5100 umgewandelt.
Mutanten schließen eine Levan Sucrase-defiziente Mutante ein, bei welcher die Herstellung von Levan unterdrückt ist.
Andere Mutanten schließen den Schwefelmittel-resistenten Stamm, welcher als BPR 3001D bezeichnet wird, den Pyrimidinanalogon-resistenten Stamm, der als BPR 3001I bezeichnet wird, und den DHO-DHase-Inhibitoren-resistenten Stamm, der als BPR3001N bezeichnet wird, ein, welche auch beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology am 25. Mai 1994 unter der Zugangsnummer FERM P-14330, am 10. Juni 1994 unter der Zugangsnummer FERM P-14362 beziehungsweise am 10. Juni 1994 unter der Zugangsnummer FERM P-14361 hinterlegt wurden. Weiter wurden die celluloseerzeugenden Bakterien, welche mit einem Gen für ein Enzym transformiert wurden, das in den Saccharose-Metabolismus einbezogen ist, (WO 95/32279) und die celluloseerzeugenden Bakterien, welche mit einem extrazellulären Invertasegen und seinem Sekretion-beschleunigenden Gen transformiert wurden, (Japanische Patentanmeldung Hei 7 (1995)-252021) offenbart.
BPR 2001 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 Japan) am 24. Februar 1993 unter der Zugangsnummer FERM P-13466 hinterlegt und dann am 07. Februar 1994 bezogen auf den Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke Patentverfahren und -regulierung in die Hinterlegung unter der Zugangsnummer FERM BP-4545 umgewandelt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung führten viele Arten von Untersuchungen durch, um neue celluloseerzeugende Bakterien zur Herstellung einer großen Menge an BC unter Verwendung von Saccharose oder Glukose als Zuckerquelle in einer effizienten Weise bereit zu stellen und sie fanden eine neue Subspezies, welche im Wesentlichen bei der Oxidation von Acetaten und Laktaten negativ oder sehr gering positiv ist.
Die celluloseerzeugenden Bakterien wachsen und stellen BC her, während Kohlenstoffquellen wie Saccharide aufgenommen und metabolisiert werden und Aminosäuren biosynthetisiert werden oder sie aus einem Kulturmedium aufgenommen und metabolisiert werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben deshalb viele Arten von Untersuchun gen durchgeführt, wobei der Anstieg des Vermögens der Aufnahme und des Metabolismus von Sacchariden und Aminosäuren berücksichtigt wurde, so dass Stämme, welche bei der Celluloseherstellung verbessert sind, erhalten werden können. Als ein Ergebnis haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung überraschenderweise gefunden, dass die Zugabe von einigen Verbindungen (Saccharidanaloga oder Aminosäureanaloga) das Wachstum der Bakterien verhindern konnte. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Stämme mit einem verbesserten Vermögen zur Herstellung von BC durch Auswählen der resistenten Stämme gegen diese Analoga erhalten und vervollständigten die vorliegende Erfindung.
Es ist bekannt, dass Levan Sucrase (EC 2.4.1.10) Saccharose zersetzt und metabolisiert. Dieses Enzym hat zwei Aktivitäten, (1) Hydrolyseaktivität von Saccharose zu Glukose und Fruktose und (2) Transfruktosylierungsaktivität zur Herstellung von Glukose und Levan aus Saccharose. Letztere Aktivität ist bezogen auf die BC-Herstellung nicht bevorzugt, da sie Levan als ein Nebenprodukt herstellt. Es wird bei der Herstellung und Reinigung von BC stark vorteilhaft sein, wenn die Akkumulation von Levan unterdrückt ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben bereits in der Japanischen Patentanmeldung Hei 7 (1995)-252021 offenbart, dass durch Ableiten des Levan Sucrase-defizienten Stamms und Aufnehmen des Gens einer extrazellulären Invertase oder einer Levan Sucrase mit einem verringerten Vermögen zur Herstellung von Levan in den Stamm die Akkumulation von Levan verringert wird und die Cellulose wirksam hergestellt werden kann.
Offenbarung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans, welche im Wesentlichen bei der Oxidation von Acetaten und Laktaten defizient (negativ) oder sehr gering positiv sind.
Der vorliegende Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans schließt Stämme ein, welche als S-35'-3, 757-3-5-11 und 184-2-2 bezeichnet werden, die beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 Japan) am 12. April 1996 unter der Zugangsnummer FERM P-15563, FERM P-15564 beziehungsweise FERM P-15565 hinterlegt wurden und dann am 10. Februar 1997 bezogen auf den Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke Patentverfahren und -regulierung in die Hinterlegung unter der Zugangsnummer FERM BP-5814, FERM BP-5815 beziehungsweise FERM BP-5816 umgewandelt wurden.
Diese Erfindung betrifft auch neue Saccharidanalogon-resistente Stämme und Aminosäureanalogon-resistente Stämme der celluloseerzeugenden Bakterien, bei welchen es sich um FERM BP-5817, FERM BP-5818, FERM BP-5819 und FERM BP-5820 handelt.
Das „Saccharidanalogon" ist in der vorliegenden Erfindung so definiert, dass es die Verbindung bedeutet, die analog zu dem Material ist, welches für Kohlenstoffquellen, wie Glukose, verwendet wird und die Zugabe davon wird das Wachstum der Bakterien oder die Celluloseherstellung wegen der Konkurrenz mit den Sacchariden verhindern oder unterdrücken.
Folglich schließt das Saccharidanalogon 2-Deoxy-D-glukose (DG), 6-Deoxyglukosamin, 1-Thio-D-glukose, 5-Thio-D-glukose, 1-Methylglukose und Phlorizin ein.
Das „Aminosäureanalogon" ist in der vorliegenden Erfindung so definiert, dass es die Verbindung bedeutet, die analog zu Aminosäuren ist, und die Zugabe davon wird das Wachstum der Bakterien oder die Celluloseherstellung wegen der Konkurrenz mit den Aminosäuren verhindern oder unterdrücken.
Folglich schließt das Aminosäureanalogon analoge Verbindungen zu den Aminosäuren wie Phenylalanin, Serin und Methionin, zum Beispiel p-Fluorphenylalanin, o-Methylserin und Ethionin ein.
Die vorliegenden neuen resistenten Stämme können aus den vorstehend erwähnten verschiedenen Stämmen wie dem vorliegenden Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans unter Verwendung von bekannten Mutagenen wie NTG (Nitrosoguanidin) erzeugt werden.
Die Erfindung betrifft ferner Levan Sucrase defiziente Stämme der celluloseerzeugenden Bakterien der Erfindung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung den defizienten Stamm FERM BP-5789.
Der neue Levan Sucrase-defiziente Stamm LD-2 wurde vom vorstehenden 757-3-5-11-Stamm unter Verwendung eines ähnlichen Mutageneseverfahrens abgeleitet und gezüchtet. Dieser Stamm wurde bezogen auf den Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke Patentverfahren und -regulierung beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 Japan) am 22. Januar 1997 unter der Zugangsnummer FERM BP-5789 hinterlegt.
Diese Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Cellulosematerial, welches Kultivieren der celluloseerzeugenden Bakterien der Erfindung umfasst, und bakterielle Cellulose, welche so erhalten werden kann.
Der vorliegende Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans wurde durch Isolieren von Acetobactern mit einem hohen Vermögen zur Herstellung von Cellulose aus natürlichen Quellen wie Blumen und Früchten, Durchmustern (engl. screening) nach gewünschten Stämmen und Identifizieren ihrer bakteriellen Eigenschaften hergestellt. Es wurde aus dem Vergleich der bakteriellen Eigenschaften unter den Stämmen, welche in der folgenden Tabelle 1 gezeigt sind, gefunden, dass der vorliegende Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans unterschiedlich vom IF015237-Stamm oder Acetobacter xylinum Subspezies Sucrofermentans wie dem BPR 2001-Stamm ist, aber eine neue Subspezies ist, welche im Wesentlichen bei der Oxidation von Acetaten und Laktaten defizient (negativ) oder sehr gering positiv ist. Tabelle 1: Bakterielle Eigenschaften

Tabelle 1: Bakterielle Eigenschaften (Fortsetzung)

NG: im Testmedium nicht gewachsen

Kohlenstoffquellen in den Kulturmedien, welche im vorliegenden Herstellungsverfahren nützlich sind, können Saccharose, Glukose, Fruktose, Mannitol, Sorbitol, Galaktose, Maltose, Erythritol, Glycerol, Ethylenglykol, Ethanol und dergleichen einschließen. Zusätzlich kann Saccharose mit Dextrin-Hydrolysat, Melasse von Zitrusfrüchten, Rübenmelasse, gepresstem Saft von Rüben oder Zuckerrohr, Saft von Zitrusfrüchten und dergleichen kombiniert werden.
Stickstoffquellen, welche im vorliegenden Herstellungsverfahren nützlich sind, schließen organische oder anorganische Quellen ein, wie Ammoniumsalze, welche Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat umfassen; Nitrate und Harnstoff. Stickstoff haltige natürliche Nährstoffe können auch verwendet werden, einschließlich Bact-Pepton, Bact-Soyton, Hefeextrakt und Bohnenkondensat. Eine Spurenmenge von organischen Nährstoffen kann ferner zugegeben werden, einschließlich 2,7,9-Tricarboxy-1H-pyrrolo[2,3,5]-chinolin-4,5-dion.
Wenn zum Beispiel die Mutanten mit dem Nährstoffbedarf für Aminosäuren verwendet werden, sollte das Kulturmedium mit solchen notwendigen Nährstoffen ergänzt werden. Anorganische Nährstoffe schließen Phosphatsalze, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Eisensalze, Mangansalze, Kobaltsalze, Molybdatsalze, Hämatitsalze, Chelatsalze und dergleichen ein.
Verfahren zur Herstellung von Cellulose durch Kultivieren von celluloseerzeugenden Bakterien wie jenen, welche zur Gattung Acetobacter gehören, waren im Stand der Technik, wie zum Beispiel die Offenlegung der Japanischen Patentanmeldung Sho 62(1987)-265990, die Offenlegung der Japanische Patentanmeldung Sho 63(1988)-202394 und die Japanische Patentveröffentlichung Hei 6(1994)-43443, bekannt. Als ein Nährstoffmedium, welches für die Kultur der celluloseerzeugenden Bakterien geeignet ist, ist Schramm/Hestrin-Medium bekannt, welches eine Kohlenstoffquelle, Pepton, Hefeextrakt, Natriumphosphat und Zitronensäure enthält (Schramm et al., J. General Biology, 11, S. 123–129, 1954).
Andere Kulturmedien, welche ferner Cornsteep-Lösung (CSL), Malzextrakt und dergleichen enthalten, sind auch bekannt.
Die Nährstoffe, welche bis heute als ein Beschleunigungsmittel für die Celluloseherstellung bekannt sind, schließen Inositol, Fitinsäure und Pyrrolochinolinchinon (PQQ) ein (Japanische Patentveröffentlichung Hei 5(1993)-1718; Mitsuo TAKAI, Japan TAPRI Journal, Bd. 42, Nr. 3, S. 237–244).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben auch gefunden, dass die Herstellung des Celluloseprodukts durch Zugabe von Carbonsäuren oder ihren Salzen (Offenlegung der Japanischen Patentanmeldung Hei 7 (1995)-39386), Invertase (Offenlegung der Japanischen Patentanmeldung Hei 7 (1995)-184677), Methionin (Offenlegung der Japanischen Patentanmeldung Hei 7 (1995)-184675), eines Saponins (Japanische Patentanmeldung Hei 6(1994)-214334) erhöht wird.
Der pH-Wertbereich für die Kultur gemäß der vorliegenden Erfindung wird zwischen 3 und 7, bevorzugt bei etwa 5, kontrolliert. Die Kulturtemperatur wird in einem Bereich zwischen 10 und 40°C, bevorzugt zwischen 25 und 35°C, gehalten. Eine Sauerstoffversorgung in einen Kulturtank kann 1 bis 100 % Sauerstoff, wünschenswerterweise 21 bis 80 %, enthalten. Die Gehalte dieser Komponenten in dem Kulturmedium und die Mengen der Bakterien, mit welchen die Medien angeimpft werden, können gegebenenfalls durch den Fachmann abhängig vom Kulturverfahren, welches verwendet wird, bestimmt werden.
Die Kultur gemäß der vorliegenden Erfindung kann unter jedweden Kulturbedingungen wie statische, Schüttel- und aerobe Bewegungsbedingungen durchgeführt werden. Es ist einer der Vorteile der vorliegenden Erfindung, dass das Vermögen zur Herstellung von Cellulose sogar unter Schüttelkultur-, oder aeroben Bewegungsbedingungen nicht beeinflusst wird. Die vorliegende Erfindung kann jedwedes Kulturarbeitsverfahren wie Chargenfermentation, Zuführungschargenfermentation, wiederholte Chargenfermentation und kontinuierliche Fermentation übernehmen. Diese Kulturbedingungen und -arbeitsverfahren können gegebenenfalls modifiziert werden.
Mittel zum Bewegen können gegebenenfalls von jedweden bekannten Mitteln wie Schnellrührern, Luftheberfermentern, durch eine Pumpe angetriebene Rückführung der Fermenternährflüssigkeit in den Kreislauf und jedweder Kombination dieser Mittel ausgewählt werden.
Das Celluloseprodukt, welches gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, kann als solches gesammelt werden oder einer Behandlung zur Entfernung von Materialien, welche verschieden von dem Celluloseprodukt sind, wie Bakterienzellen und dergleichen, unterworfen werden.
Solche Verunreinigungen können von den Celluloseprodukten durch zum Beispiel Waschen mit Wasser, verdünnten Säuren oder Basen, Dehydrieren unter Druck; Behandlung mit einem Bleichmittel wie Natriumhypochlorit und Wasserstoffperoxid, einem lytischen Enzym wie Lysozym; Behandlung mit einem grenzflächenaktiven Mittel wie Natriumlaurylsulfat und Deoxycholinsäure; Waschen mit Erwärmen auf von Raumtemperatur bis 200°C; oder Kombinationen davon entfernt werden.
Die so erhaltenen Celluloseprodukte gemäß der vorliegenden Erfindung bedeuten Cellulose, jene, welche Heteropolysaccharide, die Cellulose als eine Hauptkette enthalten, umfasst, oder jene, welche Glukane wie β-1, β-3, β-1,2 und dergleichen umfasst. Die von Cellulose verschiedenen Komponenten in den Heteropolysacchariden sind Saccharide mit sechs Kohlenstoffen wie Mannose, Fruktose, Galaktose, Xylose, Arabinose, Rhamnose und Glukonsäure, Saccharide mit fünf Kohlenstoffen, organische Säuren und dergleichen.
Die Polysaccharide können homogene Materialien sein oder aus zwei oder mehr Polysacchariden über Wasserstoffbrückenbindungen bestehen.
Beste Weise zur Durchführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird ferner mit Bezug auf die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1: Erzeugung von Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans
Es ist im Allgemeinen bekannt, dass Acetobacter-Stämme in Blumen und Früchten vorhanden sind (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1984) Bd. 1, S. 268). Die vorliegenden Stämme wurden aus diesen Materialien isoliert. Zuerst wurde das Ausgangsmaterial mit einem sterilisierten Flüssigmedium verdünnt, welches hauptsächlich aus Schramm/Hestrin-Medium (Biochemical Journal, 58 (1954), S. 345–352) bestand: Glukose 20 g/l, Hefeextrakt 5 g/l, Pepton 5 g/l, Na₂HPO₄ 2,7 g/l, Zitronensäure·H₂O 1,2 g/l, Ethanol 2 ml/l, Essigsäure 5 ml/l, Cycloheximid (Fungizid) 100 mg/l, pH-Wert 5,0. Das resultierende Gemisch wurde in das gleiche Flüssigmedium überimpft und in einer akkumulierten Kultur inkubiert, gefolgt von einer statischen Kultur für sieben Tage bei 28°C. Die Kulturnährflüssigkeit, welche gebildete Perikel enthielt, wurde verdünnt, auf eine flache Agarplatte, welche das vorstehende Medium plus 20 g/l Agar enthielt, überimpft und für sieben Tage bei 28°C inkubiert, gefolgt von einer Isolierung der Kolonien der celluloseer zeugenden Bakterien. Die gewünschten Stämme wurden aus diesen Kolonien durch Durchmustern erhalten und ihre bakteriellen Eigenschaften wurden durch ein Standardverfahren, welches auf dem Fachgebiet bekannt ist, identifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 2: Herstellung von bakterieller Cellulose durch die Kultur Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans
(1) Kultur im Glaszylinder

Hauptmedien: CSL(4 %)-Saccharose(4 %) oder CSL(4 %)-Glukose(4 %)
Stämme: 184-2-2, 757-3-5-11, BPR2001

Kulturverfahren:
Ein Roux-Kolben (750 ml Volumen), der 100 ml des vorstehenden Hauptmediums enthielt, wurde mit einer lyophilisierten Stammlösung der vorstehenden Stämme (1 ml) angeimpft. Man ließ die Kulturen für drei Tage bei 28°C unter Nichtschüttelbedingungen wachsen. Nach der Vollendung der statischen Kultur wurde der Roux-Kolben stark geschüttelt und die Inhalte wurden aseptisch durch Siebgewebe filtriert, um Cellulosestreifen von den Zellkörpern zu trennen. Ein Kolben mit Spirallenkplatten (300 ml Volumen), welcher 67,5 ml des vorstehenden Hauptmediums enthielt, wurde mit dem resultierenden Zellgemisch (7,5 ml) angeimpft und einer Impfkultur mit einer Schütteleinrichtung für drei Tage bei 28°C unter der Bewegung bei 180 UpM und einer Schüttelweite von 2 cm unterworfen.
Nach dem Vollenden der Kultur wurden die Kolbeninhalte in eine sterilisierte Mischvorrichtung überführt und für 3 min bei 10.000 UpM aufgebrochen. Die aufgebrochenen Inhalte wurden in der folgenden Hauptkultur als ein Impfzellgemisch verwendet.
Das Impfzellgemisch (60 ml) wurde aseptisch in einen kleinen Glaszylinderfermenter (Gesamtvolumen 1.000 ml), der 540 ml eines sterilisierten Hauptmediums enthielt, überimpft und der Hauptkultur bei 30°C unterworfen, wobei ein pH-Wert von 5,0 mittels 1 N NaOH oder 1 N H₂SO₄ aufrecht erhalten wurde und die Konzentration des gelösten Sauerstoffs (DO) im Bereich von 3,0 bis 21,0 % durch automatisches Kontrollieren einer Rotationsgeschwindigkeit von Schnellrührern (die Anfangsrotationsgeschwindigkeit war 400 UpM) gehalten wurde. Die akkumulierten Mengen an BC wurden in Tabelle 2 und Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 2: BC-Akkumulation unter der Kultur mit Saccharose nach 45 h
Tabelle 3: BC-Akkumulation unter der Kultur mit Glukose nach 45 h
(2) Statische Kultur

Hauptmedien: CSL(2 %)-Saccharose(4 %)
Stämme: S-35'-3, BPR2001

Kulturverfahren:
Ein Roux-Kolben (250 ml Volumen), der 50 ml des vorstehenden Hauptmediums enthielt, wurde mit einer lyophilisierten Stammlösung der vorstehenden Stämme (0,5 ml) angeimpft. Man ließ die Kulturen für drei Tage bei 28°C unter Nichtschüttelbedingungen wachsen. Nach der Vollendung der statischen Kultur wurde das resultierende Kulturgemisch dann der folgenden Hauptkultur unterworfen.

Das resultierende Kulturgemisch (5 ml) wurde in einen Roux-Kolben (250 ml Volumen), welcher 45 ml des vorstehenden Hauptmediums enthielt, überimpft. Die Kulturfläche des Kolbens war 75 cm² und seine Tiefe war 0,67 cm. Die statische Kultur wurde für drei Tage bei 28°C durchgeführt, wobei die BC-Akkumulation, wie in Tabelle 4 nachstehend gezeigt, erhalten wurde. Tabelle 4:

Tabelle 5: CSL-Suc (oder Glc)-Medium

Komponente	Endkonz. (mM)
(NH₄)₂SO₄	25
KH₂PO₄	7,3
MgSO₄·7H₂O	1,0
FeSO₄·7H₂O	0,013
CaCl₂·2H₂O	0,10
Na₂MoO₄·2H₂O	0,001
ZnSO₄·7H₂O	0,006
MnSO₄·5H₂O	0,006
CuSO₄·5H₂O	0,0002
Vitamingemisch (siehe nachstehend)	10 ml/l
Kohlenstoffquelle	wie spezifiziert
CSL	wie spezifiziert
Antischaummittel	0,01 v/v %
End-pH-Wert	5,0 ± 0,2

(Saccharose oder Glukose: 40 g/l; CSL: 40 oder 20 ml/l, wenn nicht anders spezifiziert)

Komponente	mg/l
Inositol	200
Niacin	40
Pyridoxin HCl	40
Thiamin HCl	40
Ca-Pantothenat	20
Riboflavin	20
p-Aminobenzoesäure	20
Folsäure	0,2
Biotin	0,2

Beispiel 3: Erzeugung von Saccharid-resistenten Stämmen
Bestätigung der Resistenz gegen 2-Deoxy-D-glukose (DG)
Der 757-3-5-11-Stamm wurde auf eine Platte überimpft, welche das in Tabelle 10 gezeigte Minimum-Medium mit verschiedenen Konzentrationswerten von DG enthielt. Nach einer Kultur für sieben Tage bei 28°C wurde die Anzahl der auf jeder Platte gebildeten Kolonien beobachtet. Tabelle 7: Die Anzahl der Kolonien von 757-3-5-1, welche auf der Platte beobachtet wurden, die DG enthielt.
Mutagenesebehandlung von 757-3-5-11
Man ließ die Stämme in CSL(2 %)-Fru-Medium (Tabelle 11) für drei Stunden bei 28°C wachsen. Diese Vorkultur wurde gesammelt, mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 6,0) gewaschen und der Mutagenesebehandlung in 10 mM Phosphat-Puffer, der 40 mg/ml NTG enthielt, für 30 min bei 30°C unterworfen. Die behandelten Zellen wurden gesammelt, wie vorstehend gewaschen und in CSL(2 %)-Fru-Medium bei 28°C über Nacht kultiviert, um die Mutation zu fixieren. Als ein Ergebnis wurden die Mutanten mit einer Überlebensrate von etwa 1 % erhalten.
Auswahl der Saccharidanalogon (DG)-resistenten Stämme
Die vorstehend behandelten 757-3-5-11-Stämme (etwa 4.000 Kolonien) wurden auf eine Platte überimpft, welche 200 mMol/l DG enthielt (etwa 170 Kolonien pro Platte). Sie wurden für sieben Tage bei 28°C kultiviert und 109 Stämme wurden von den gebildeten Kolonien ausgewählt.
Beispiel 4:
Die vorstehenden 109 Stämme wurden gemäß dem folgenden Verfahren kultiviert und der Umfang der BC-Akkumulation wurde bestimmt.
Zuerst wurde ein Roux-Kolben (250 ml Volumen), der 50 ml CSL(2 %)-Fru-Medium enthielt, mit den vorstehenden Stämmen angeimpft und für drei Tage bei 28°C unter Nichtschüttelbedingungen inkubiert.
(1) Kolbenkultur
Der Roux-Kolben wurde stark geschüttelt, um die Zellen von dem resultierenden Cellulosefilm abzulösen, und 7,5 ml dieses Kulturgemisches wurden in einen konischen Kolben mit Lenkplatten (300 ml Volumen), welcher 68 ml CSL(2 %)-Glc(2 %)-Medium enthielt, überimpft, gefolgt von einer Hauptkultur für drei Tage bei 28°C unter Bewegung bei 150 UpM.
Als ein Ergebnis zeigten sechs DG-resistente Stämme ein hervorragendes Vermögen zur Herstellung von BC in Bezug auf den Elternstamm 757-3-5-11, wie in Tabelle 8 gesehen wird.
Einer der vorstehenden sechs Stämme, d-40-3, wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 Japan) am 25. April 1996 unter der Zugangsnummer FERM
P-15603 hinterlegt und dann am 10. Februar 1997 bezogen auf den Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke Patentverfahren und -regulierung in die Hinterlegung unter der Zugangsnummer FERM BP-5817 umgewandelt. Tabelle 8: Anstieg des Vermögens zur Herstellung von BC von DG-resistenten Stämmen in einer Kolbenkultur
(2) Kultur im Glaszylinder

Stämme: DG-resistenter Stamm (d-40-3), 757-3-5-11

Kulturverfahren:
Ein Roux-Kolben (750 ml Volumen), der 100 ml CSL(2 %)-Glc(2 %)-Medium enthielt, wurde mit einer lyophilisierten Stammlösung von jedem Stamm (1 ml) angeimpft. Man ließ die Kulturen für drei Tage bei 28°C unter Nichtschüttelbedingungen wachsen. Nach der Vollendung der statischen Kultur wurde der Roux-Kolben stark geschüttelt und die Inhalte wurden aseptisch durch Siebgewebe filtriert, um Cellulosestreifen von den Zellkörpern zu trennen. Ein Kolben mit Spirallenkplatten (300 ml Volumen), welcher 67,5 ml des vorstehenden Mediums enthielt, wurde mit dem resultierenden Zellgemisch (7,5 ml) angeimpft und einer Impfkultur mit einer Schütteleinrichtung für drei Tage bei 28°C unter der Bewegung bei 180 UpM und einer Schüttelweite von 2 cm unterworfen.
Nach dem Vollenden der Kultur wurden die Kolbeninhalte in eine sterilisierte Mischvorrichtung überführt und für 3 min bei 10.000 UpM aufgebrochen. Die aufgebrochenen Inhalte wurden in der folgenden Hauptkultur als ein Impfzellgemisch verwendet.
Das Impfzellgemisch (60 ml) wurde aseptisch in einen kleinen Glaszylinderfermenter (Gesamtvolumen 1.000 ml), der 540 ml eines sterilisierten CSL(4 %)-Glc(4 %)-Mediums (Tabelle 11) enthielt, überimpft und der Hauptkultur bei 30°C unterworfen, wobei ein pH-Wert von 5,0 mittels Ammoniakgas oder 1 N H₂SO₄ aufrecht erhalten wurde und die Konzentration des gelösten Sauerstoffs (DO) im Bereich von 3,0 bis 21,0 % durch automatisches Kontrollieren einer Rotationsgeschwindigkeit von Schnellrührern (die Anfangsrotationsgeschwindigkeit war 400 UpM) gehalten wurde. Die akkumulierten Mengen an BC wurden in Tabelle 9 gezeigt. Tabelle 9: Anstieg des Vermögens zur Herstellung von BC von einem DG-resistenten Stamm in einer Kultur im Glaszylinder
Tabelle 10: Minimum-Medium

K₂HPO₄ 0,01 (%)

KH₂PO₄ 0,5

MgSO₄·7H₂O 0,025

KCl 0,01

CaCl₂·2H₂O 0,01

FeCl₃·6H₂O 0,005

Na-Glutamat·H₂O 0,4

Glukose 1,0

pH-Wert 5,0

Tabelle 11: CSL-Fru(oder Glc)-Medium

Komponente (%)

Fruktose oder Glukose 2,0 oder 4,0

KH₂PO₄ 0,1

MgSO₄·7H₂O 0,025

(NH₄)₂SO₄ 0,33

Vitamingemisch 1,0

Salzgemisch 1,0

CSL 2,0 oder 4,0

pH-Wert 5,0

Tabelle 12: Salzgemisch

FeSO₄·7H₂O 360 (mg/l)

CaCl₂·2H₂O 1470

Na₂MoO₂·2H₂O 242

ZnSO₄·7H₂O 173

MnSO₄·5H₂O 139

CuSO₄·5H₂O 5

Tabelle 13: Vitamingemisch

Komponente (mg/l)

Inositol 200

Niacin 40

Pyridoxin HCl 40

Thiamin HCl 40

Ca-Pantothenat 20

Riboflavin 20

p-Aminobenzoesäure 20

Folsäure 0,2

Biotin 0,2
Beispiel 5: Erzeugung von p-Fluorphenylalanin (PFP)-resistenten Stämmen
Bestätigung der Resistenz gegen PFP
Der 184-2-2-Stamm wurde auf eine Platte überimpft, welche das in Tabelle 10 gezeigte Minimum-Medium mit verschiedenen Konzentrationswerten von PFP enthielt. Nach einer Kultur für sieben Tage bei 28°C wurde die Anzahl der auf jeder Platte gebildeten Kolonien beobachtet. Tabelle 14: Die Anzahl der Kolonien von 184-2-2, welche auf der Platte beobachtet wurden, die PFP enthielt.
Mutagenesebehandlung von 184-2-2
Man ließ die Stämme in CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) für drei Stunden bei 28°C wachsen. Diese Vorkultur wurde gesammelt, mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 6,0) gewaschen und der Mutagenesebehandlung in 10 mM Phosphat-Puffer, der 40 mg/ml NTG enthielt, für 30 min bei 30°C unterworfen. Die behandelten Zellen wurden gesammelt, wie vorstehend gewaschen und in CSL(2 %)-Suc-Medium bei 28°C über Nacht kultiviert, um die Mutation zu fixieren. Als ein Ergebnis wurden die Mutanten mit einer Überlebensrate von etwa 1 % erhalten.
Auswahl der PFP-resistenten Stämme
Die vorstehend behandelten 184-2-2-Stämme (etwa 12.000 Kolonien) wurden auf eine Platte überimpft, welche 1 mM PFP enthielt (etwa 120 Kolonien pro Platte). Sie wurden für sieben Tage bei 28°C kultiviert und 62 Stämme wurden von den gebildeten Kolonien ausgewählt.
Herstellung von PC
Die vorstehenden 62 Stämme wurden gemäß dem folgenden Verfahren kultiviert und der Umfang der BC-Akkumulation wurde bestimmt.
Zuerst wurde ein Roux-Kolben (750 ml Volumen), der 100 ml CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) enthielt, mit den vorstehenden Stämmen angeimpft und für drei Tage bei 28°C unter Nichtschüttelbedingungen inkubiert.
(1) Kolbenkultur
Der Roux-Kolben wurde stark geschüttelt, um die Zellen von dem resultierenden Cellulosefilm abzulösen, und 7,5 ml dieses Kulturgemisches wurden in einen konischen Kolben mit Lenkplatten (300 ml Volumen), welcher 68 ml CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) enthielt, überimpft, gefolgt von einer Hauptkultur für drei Tage bei 28°C unter Bewegung bei 150 UpM.
Als ein Ergebnis zeigten sechs PFP-resistente Stämme ein hervorragendes Vermögen zur Herstellung von BC in Bezug auf ihren Elternstamm 184-2-2, wie in Tabelle 15 gesehen wird.
Einer der vorstehenden sechs Stämme, BPR-M6, wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 Japan) am 30. Mai 1996 unter der Zugangsnummer FERM P-15657 hinterlegt und dann am 10. Februar 1997 bezogen auf den Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke Patentverfahren und -regulierung in die Hinterlegung unter der Zugangsnummer FERM BP-5820 umgewandelt. Tabelle 15: Anstieg des Vermögens zur Herstellung von BC von PFP-resistenten Stämmen in einer Kolbenkultur
(2) Kultur im Glaszylinder

Stämme: PFP-resistenter Stamm (BPR-M6), 184-2-2

Kulturverfahren:
Ein Roux-Kolben (750 ml Volumen), der 100 ml CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) enthielt, wurde mit einer lyophilisierten Stammlösung von jedem Stamm (1 ml) angeimpft. Man ließ die Kulturen für drei Tage bei 28°C unter Nichtschüttelbedingungen wachsen. Nach der Vollendung der statischen Kultur wurde der Roux-Kolben stark geschüttelt und die Inhalte wurden aseptisch durch Siebgewebe filtriert, um Cellulosestreifen von den Zellkörpern zu trennen. Ein Kolben mit Spirallenkplatten (300 ml Volumen), welcher 67,5 ml des vorstehenden Mediums enthielt, wurde mit dem resultierenden Zellgemisch (7,5 ml) angeimpft und einer Impfkultur mit einer Schütteleinrichtung für drei Tage bei 28°C unter der Bewegung bei 150 UpM unterworfen.
Nach dem Vollenden der Kultur wurden die Kolbeninhalte in eine sterilisierte Mischvorrichtung überführt und für 3 min bei 10.000 UpM aufgebrochen. Die aufgebrochenen Inhalte wurden in der folgenden Hauptkultur als ein Impfzellgemisch verwendet.
Das Impfzellgemisch (60 ml) wurde aseptisch in einen kleinen Glaszylinderfermenter (Gesamtvolumen 1.000 ml), der 540 ml eines sterilisierten CSL(2 %)-Suc-Mediums (Tabelle 23) enthielt, überimpft und der Hauptkultur bei 30°C unterworfen, wobei ein pH-Wert von 5,0 mittels Ammoniakgas oder 1 N H₂SO₄ aufrecht erhalten wurde und die Konzentration des gelösten Sauerstoffs (DO) im Bereich von 3,0 bis 21,0 % durch automatisches Kontrollieren einer Rotationsgeschwindigkeit von Schnellrührern (die Anfangsrotationsgeschwindigkeit war 400 UpM) gehalten wurde. Die akkumulierten Mengen an BC wurden in Tabelle 16 gezeigt. Tabelle 16: Anstieg des Vermögens zur Herstellung von BC von einem PFP-resistenten Stamm in einer Kultur im Glaszylinder
Beispiel 6: Erzeugung von o-Methylserin-resistenten Stämmen
Bestätigung der Resistenz gegen o-Methylserin
Der 184-2-2-Stamm wurde auf eine Platte überimpft, welche das in Tabelle 10 gezeigte Minimum-Medium mit verschiedenen Konzentrationswerten von o-Methylserin enthielt. Nach einer Kultur für sieben Tage bei 28°C wurde die Anzahl der auf jeder Platte gebildeten Kolonien beobachtet. Tabelle 17: Die Anzahl der Kolonien von 184-2-2, welche auf der Platte beobachtet wurden, die o-Methylserin enthielt.
Mutagenesebehandlung von 184-2-2
Man ließ die Stämme in CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) für drei Stunden bei 28°C wachsen. Diese Vorkultur wurde gesammelt, mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 6,0) gewaschen und der Mutagenesebehandlung in 10 mM Phosphat-Puffer, der 40 mg/ml NTG enthielt, für 30 min bei 30°C unterworfen. Die behandelten Zellen wurden gesammelt, wie vorstehend gewaschen und in CSL(2 %)-Suc-Medium bei 28°C über Nacht kultiviert, um die Mutation zu fixieren. Als ein Ergebnis wurden die Mutanten mit einer Überlebensrate von etwa 1 % erhalten.
Auswahl der o-Methylserin-resistenten Stämme
Die vorstehend behandelten 184-2-2-Stämme (etwa 12.000 Kolonien) wurden auf eine Platte überimpft, welche 40 mM o-Methylserin enthielt (etwa 120 Kolonien pro Platte). Sie wurden für sieben Tage bei 28°C kultiviert und 60 Stämme wurden von den gebildeten Kolonien ausgewählt.
Herstellung von PC
Die vorstehenden 60 Stämme wurden gemäß dem folgenden Verfahren kultiviert und der Umfang der BC-Akkumulation wurde bestimmt.
Zuerst wurde ein Roux-Kolben (750 ml Volumen), der 100 ml CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) enthielt, mit den vorstehenden Stämmen angeimpft und für drei Tage bei 28°C unter Nichtschüttelbedingungen inkubiert.
(1) Kolbenkultur
Der Roux-Kolben wurde stark geschüttelt, um die Zellen von dem resultierenden Cellulosefilm abzulösen, und 7,5 ml dieses Kulturgemisches wurden in einen konischen Kolben mit Lenkplatten (300 ml Volumen), welcher 68 ml CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) enthielt, überimpft, gefolgt von einer Hauptkultur für drei Tage bei 28°C unter Bewegung bei 150 UpM.
Als ein Ergebnis zeigten sieben o-Methylserin-resistente Stämme ein hervorragendes Vermögen zur Herstellung von BC in Bezug auf ihren Elternstamm 184-2-2, wie in Tabelle 18 gesehen wird.
Einer der vorstehenden sieben Stämme, BPR-N52, wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 Japan) am 30. Mai 1996 unter der Zugangsnummer FERM P-15655 hinterlegt und dann am 10. Februar 1997 bezogen auf den Buda pester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke Patentverfahren und -regulierung in die Hinterlegung unter der Zugangsnummer FERM BP-5818 umgewandelt. Tabelle 18: Anstieg des Vermögens zur Herstellung von BC von o-Methylserin-resistenten Stämmen in einer Kolbenkultur
(2) Kultur im Glaszylinder

Stämme: o-Methylserin-resistenter Stamm (BPR-N52), 184-2-2

Kulturverfahren:
Ein Roux-Kolben (750 ml Volumen), der 100 ml CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) enthielt, wurde mit einer lyophilisierten Stammlösung von jedem Stamm (1 ml) angeimpft. Man ließ die Kulturen für drei Tage bei 28°C unter Nichtschüttelbedingungen wachsen. Nach der Vollendung der statischen Kultur wurde der Roux-Kolben stark geschüttelt und die Inhalte wurden aseptisch durch Siebgewebe filtriert, um Cellulosestreifen von den Zellkörpern zu trennen. Ein Kolben mit Spirallenkplatten (300 ml Volumen), welcher 67,5 ml des vorstehenden Mediums enthielt, wurde mit dem resultierenden Zellgemisch (7,5 ml) angeimpft und einer Impfkultur mit einer Schütteleinrichtung für drei Tage bei 28°C unter der Bewegung bei 150 UpM unterworfen.
Nach dem Vollenden der Kultur wurden die Kolbeninhalte in eine sterilisierte Mischvorrichtung überführt und für 3 min bei 10.000 UpM aufgebrochen. Die aufgebrochenen Inhalte wurden in der folgenden Hauptkultur als ein Impfzellgemisch verwendet.
Das Impfzellgemisch (60 ml) wurde aseptisch in einen kleinen Glaszylinderfermenter (Gesamtvolumen 1.000 ml), der 540 ml eines sterilisierten CSL(2 %)-Suc-Mediums (Tabelle 23) enthielt, überimpft und der Hauptkultur bei 30°C unterworfen, wobei ein pH-Wert von 5,0 mittels Ammoniakgas oder 1 N H₂SO₄ aufrecht erhalten wurde und die Konzentration des gelösten Sauerstoffs (DO) im Bereich von 3,0 bis 21,0 % durch automatisches Kontrollieren einer Rotationsgeschwindigkeit von Schnellrührern (die Anfangsrotationsgeschwindigkeit war 400 UpM) gehalten wurde. Die akkumulierten Mengen an BC wurden in Tabelle 19 gezeigt. Tabelle 19: Anstieg des Vermögens zur Herstellung von BC von einem o-Methylserinresistenten Stamm in einer Kultur im Glaszylinder
Beispiel 7: Erzeugung von Ethionin-resistenten Stämmen
Bestätigung der Resistenz gegen Ethionin
Der 757-3-5-11-Stamm wurde auf eine Platte überimpft, welche das in Tabelle 10 gezeigte Minimum-Medium mit verschiedenen Konzentrationswerten von Ethionin enthielt. Nach einer Kultur für sieben Tage bei 28°C wurde die Anzahl der auf jeder Platte gebildeten Kolonien beobachtet. Tabelle 20: Die Anzahl der Kolonien von 757-3-5-11, welche auf der Platte beobachtet wurden, die Ethionin enthielt.
Mutagenesebehandlung von 757-3-5-11
Man ließ die Stämme in CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) für drei Stunden bei 28°C wachsen. Diese Vorkultur wurde gesammelt, mit 10 mM Phosphat-Puffer (pH-Wert 6,0) gewaschen und der Mutagenesebehandlung in 10 mM Phosphat-Puffer, der 40 mg/ml NTG enthielt, für 30 min bei 30°C unterworfen. Die behandelten Zellen wurden gesammelt, wie vorstehend gewaschen und in CSL(2 %)-Suc-Medium bei 28°C über Nacht kultiviert, um die Mutation zu fixieren. Als ein Ergebnis wurden die Mutanten mit einer Überlebensrate von etwa 1 % erhalten.
Auswahl der Ethionin-resistenten Stämme
Die vorstehend behandelten 757-3-5-11-Stämme (etwa 6.000 Kolonien) wurden auf eine Platte überimpft, welche 0,2 mM Ethionin enthielt (etwa 60 Kolonien pro Platte). Sie wurden für sieben Tage bei 28°C kultiviert und 76 Stämme wurden von den gebildeten Kolonien ausgewählt.
Herstellung von PC
Die vorstehenden 76 Stämme wurden gemäß dem folgenden Verfahren kultiviert und der Umfang der BC-Akkumulation wurde bestimmt.
Zuerst wurde ein Roux-Kolben (750 ml Volumen), der 100 ml CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) enthielt, mit den vorstehenden Stämmen angeimpft und für drei Tage bei 28°C unter Nichtschüttelbedingungen inkubiert.
(1) Kolbenkultur
Der Roux-Kolben wurde stark geschüttelt, um die Zellen von dem resultierenden Cellulosefilm abzulösen, und 7,5 ml dieses Kulturgemisches wurden in einen konischen Kolben mit Lenkplatten (300 ml Volumen), welcher 68 ml CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) enthielt, überimpft, gefolgt von einer Hauptkultur für drei Tage bei 28°C unter Bewegung bei 150 UpM.
Als ein Ergebnis zeigten sieben Ethionin-resistente Stämme ein hervorragendes Vermögen zur Herstellung von BC in Bezug auf ihren Elternstamm 757-3-5-11, wie in Tabelle 21 gesehen wird.
Einer der vorstehenden sieben Stämme, BPR-P35, wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1–3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 Japan) am 30. Mai 1996 unter der Zugangsnummer FERM P-15656 hinterlegt und dann am 10. Februar 1997 bezogen auf den Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke Patentverfahren und -regulierung in die Hinterlegung unter der Zugangsnummer FERM BP-5819 umgewandelt. Tabelle 21: Anstieg des Vermögens zur Herstellung von BC von Ethionin-resistenten Stämmen in einer Kolbenkultur
(2) Kultur im Glaszylinder

Stämme: Ethionin-resistenter Stamm (BPR-P35), 757-3-5-11

Kulturverfahren:
Ein Roux-Kolben (750 ml Volumen), der 100 ml CSL(2 %)-Suc-Medium (Tabelle 23) enthielt, wurde mit einer lyophilisierten Stammlösung von jedem Stamm (1 ml) angeimpft. Man ließ die Kulturen für drei Tage bei 28°C unter Nichtschüttelbedingungen wachsen. Nach der Vollendung der statischen Kultur wurde der Roux-Kolben stark geschüttelt und die Inhalte wurden aseptisch durch Siebgewebe filtriert, um Cellulosestreifen von den Zellkörpern zu trennen. Ein Kolben mit Spirallenkplatten (300 ml Volumen), welcher 67,5 ml des vorstehenden Mediums enthielt, wurde mit dem resultierenden Zellgemisch (7,5 ml) angeimpft und einer Impfkultur mit einer Schütteleinrichtung für drei Tage bei 28°C unter der Bewegung bei 150 UpM unterworfen.
Nach dem Vollenden der Kultur wurden die Kolbeninhalte in eine sterilisierte Mischvorrichtung überführt und für 3 min bei 10.000 UpM aufgebrochen. Die aufgebrochenen Inhalte wurden in der folgenden Hauptkultur als ein Impfzellgemisch verwendet.
Das Impfzellgemisch (60 ml) wurde aseptisch in einen kleinen Glaszylinderfermenter (Gesamtvolumen 1.000 ml), der 540 ml eines sterilisierten CSL(2 %)-Suc-Mediums (Tabelle 23) enthielt, überimpft und der Hauptkultur bei 30°C unterworfen, wobei ein pH-Wert von 5,0 mittels Ammoniakgas oder 1 N H₂SO₄ aufrecht erhalten wurde und die Konzentration des gelösten Sauerstoffs (DO) im Bereich von 3,0 bis 21,0 % durch automatisches Kontrollieren einer Rotationsgeschwindigkeit von Schnellrührern (die Anfangsrotationsgeschwindigkeit war 400 UpM) gehalten wurde. Die akkumulierten Mengen an BC wurden in Tabelle 22 gezeigt. Tabelle 22: Anstieg des Vermögens zur Herstellung von BC von einem Ethioninresistenten Stamm in einer Kultur im Glaszylinder
Tabelle 23: CSL-Suc-Medium

Komponente (%)

Saccharose 4,0

KH₂PO₄ 0,1

MgSO₄·7H₂O 0,025

(NH₄)₂SO₄ 0,33

Vitamingemisch 1,0 (siehe Tabelle 13)

Salzgemisch 1,0 (siehe Tabelle 12)

CSL 2,0

pH-Wert 5,0
Beispiel 8: Erzeugung von Levan Sucrase-defizienten Stämmen
Der 757-3-5-11-Stamm wurde der gleichen Mutagenesebehandlung wie vorstehend unterworfen und auf eine Platte überimpft, welche das in Tabelle 10 gezeigte Minimum-Medium unter Verwendung von Saccharose anstelle von Glukose enthielt. Die kleinen nicht-mukoidalen Kolonien, welche kein Levan herstellten, wurden als potentielle Stämme ausgewählt. Ferner wurden zwei Stämme (LD-1 und LD-2), welche gut Cellulose in dem Glc-CSL-Medium (Tabelle 11) herstellten, aus den vorstehenden potentiellen Stämmen ausgewählt. Tabelle 24 zeigt die Herstellung von Cellulose und Polysaccharid als Nebenprodukt durch diese zwei Stämme in CSL-Glc- und CSL-Suc-Medien (Tabelle 5). Es wurde keine Aktivität von Levan Sucrase in diesen zwei Stämmen durch das normale Verfah ren (H. Yanase et al., Biosci. Biotech. Biochem., Bd. 55, S. 1383–1390, 1991) beobachtet, was bestätigt, dass diese zwei Stämme Levan Sucrase-defiziente Stämme sind. Tabelle 24: Herstellung von Cellulose und Akkumulation von Polysaccharid aus Glukose und Saccharose durch die Levan Sucrase-defizienten Stämme
Der Levan Sucrase-defiziente Stamm, LD-2, wurde mit dem Plasmid pSAZE3S, welches das exozelluläre Invertasegen und sein Sekretion-beschleunigendes Gen des Zymomonas mobilis-Stamms, welches in der Japanischen Patentanmeldung Hei 7 (1995)-252021 offenbart wird, enthält, oder dem Plasmid pSARH, welches das Gen Bacillus subtilis enthält, wobei eine Levan Sucrase codiert wird mit ihrer verringerten Aktivität für eine Bildung von Levan, transformiert. Die Herstellung von Cellulose durch diese Transformanten im CSL-Suc-Medium (Tabelle 5) ist in Tabelle 25 gezeigt. Die Einbringung der vorstehenden Gene in den Levan Sucrase-defizienten Stamm hat die Menge an Levan als Nebenprodukt bei der Herstellung von Cellulose aus Saccharose beträchtlich verringert. Tabelle 25: Herstellung von Cellulose durch den transformierten LD-2
Beispiel 9: Erzeugung von Phlorizin-resistenten Stämmen
Die Stämme, welche Resistenz gegen das Saccharidanalogon Phlorizin zeigen, wurden aus den Mutanten, die durch die NTG-Behandlung des Elternstamms d-40-3 wie in Beispiel 3 (Tabelle 26) erzeugt wurden, erhalten und ihr Vermögen zur Herstellung von BC wurde bewertet (Tabelle 27).
Der Stamm d-40-3 und seine NTG-behandelten Mutanten wurden auf eine Platte, welche das Minimum-Medium mit Glc(2 %) enthielt, in einer Konzentration von 3.000 Zellen pro Platte beziehungsweise 4.000 Zellen pro Platte überimpft und für etwa eine Woche bei 28°C kultiviert. Tabelle 26: Koloniebildung
Zufällig wurden einhundert Stämme aus den Kolonien der NTG-behandelten Mutanten, welche in dem Medium gebildet wurden, das 5 mM Phlorizin enthielt, ausgewählt und einer Kolbenkultur unterworfen. Als ein Ergebnis wurden die folgenden e-51-, e-61- und e-87-Stämme erhalten, welche ein höheres Vermögen zur Herstellung von BC zeigen als der Elternstamm d-40-3. Tabelle 27
Nach der Vollendung der Kultur wurden die festen Inhalte in dem Kolben gesammelt, mit Wasser gewaschen, um die Mediumkomponenten zu entfernen, und mit 1 %iger wässriger NaOH-Lösung für 20 min bei 80°C behandelt, um die bakteriellen Zellen zu entfernen. Die resultierende Cellulose wurde gewaschen, bis das Waschwasser ungefähr neutral wurde, und unter Vakuum für 12 Stunden bei 80°C getrocknet, wobei die trockene Cellulose gewogen wurde.
Berechnung der Ausbeute (%) gegen die verbrauchten Zucker YBC = BC/(RCMF – RCBF)·100

Y_BC:: Ausbeute (%) gegen die verbrauchten Zucker
BC:: Akkumulierte Menge an BC (g/l)
RC_MF:: Zuckerkonzentration des Mediums (g/l)
RC_BF:: Zuckerkonzentration des Mediums nach der Kultur (g/l)

Industrielle Verwendbarkeit
Eine größere Menge an bakterieller Cellulose kann hergestellt werden durch Kultivieren von Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans, die vorliegenden resistenten Stämme und die Levan Sucrase-defizienten Stämme, welche abgeleitet und gezüchtet wurden aus den celluloseerzeugenden Bakterien, dann durch Kultivieren des BPR 2001-Stamms in dem Medium, welches insbesondere Saccharose oder Glukose als Kohlenstoffquellen enthält.

Claims

Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans, bei der es sich um FERM BP-5814, FERM BP-5815, FERM BP-5816 oder FERM BP-5817 handelt.
Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans, bei der es sich um FERM BP-5818 handelt.
Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans, bei der es sich um FERM BP-5819 handelt.
Acetobacter xylinum Subspezies Nonacetoxidans, bei der es sich um FERM BP-5820 handelt.
Levan Sucrase-defiziente Stämme der celluloseerzeugenden Bakterien nach Anspruch 1.
Defizienter Stamm nach Anspruch 5, bei dem es sich um FERM BP-5789 handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Celluloseprodukts, das das Kultivieren der celluloseerzeugenden Bakterien nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.