DE2314631C3 - Verfahren zum Züchten von Bakterien, Pilzen, Hefen oder Actynomyceten in einem wässrigen Nährmedium - Google Patents

Description

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Zur Durchführung der Kultivierung aerober Mikroorganismen nach der Erfindung sind übliche bekannte Nährstoffquellen verwendbar. Typische geeignete Nährstoffquellen für Kohlenstoff sind z. B. die hierfür üblichen Saccharide (z. B. Glucose, Lactose, Galactose und Saccharose), Polysaccharide (z. B. Stärke und Dextrin), Zuckeralkohole (z. B. Sorbitol und Mannitol), Polyalkohole (z. B. Glycerin) und organische Säuren (z B. Essigsäure, Fumarsäure und Citronensäure), und geeignete Stickstoffquellen sind z. B. Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellwasser, Baumwollsamentreber, Sojabohnenpulver, Erdnußpulver, Proteinhydrolysate, anorganische Nitrate und organische oder anorganische Ammoniumsalze, und anorganische Elemente sind ebenfalls verwendbar. In einigen Fällen kann dem Nährmedium eine Vorläuferverbindung oder andere geringfügige Komponente zugesetzt werden die bei der fermentativen Produktion einer Aminosäure, einer Nucleinsäure oder eines Antibioticums erforderlich ist. Erforderlichenfalls kann außer- : dem auch ein oberflächenaktives Mittel zugesetzt werden.

Die zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung einzusetzende Flüssigkeit dient dazu, die Sauerstoffüberführungsrate aus der Gasphase in die flüssige phase zu erhöhen. Die Flüsisgkeit dient ferner dazu, Sauerstoff direkt in die flüssige Phase zu liefern, da der an der einzusetzenden Flüssigkeit adsorbierte Sauerstoff während der Kultivierung in das Medium freigesetzt wird. Es erweist sich daher als vorteilhaft, das erfindungsgemäße Verfahren unter Belüftung, Rühren und/oder Schütteln durchzuführen. In diesem Zusammenhang ist jedoch darauf hinzuweisen, daß das Verfahren der Erfindung auch ohne Belüftung, Rühren und/oder Schütteln durchführbar ist. So kann ζ B. eine geringe Menge der einzusetzenden Flüssigkeit aus dem Nährmedium nach einer geeigneten Kultivierungszeit entnommen werden und die auf diese Weise abgetrennte inerte organische Flüssigkeit wird mit frischer Luft oder Sauenstoffgas in Kontakt gebracht, um deren Sauerstoffgehalt zu erhöhen, worauf sie erneut dem Fermentationsmedium zugesetzt wird. Durch Wiederholung dieser Prozedur während der Kultivierung kann die Konzentration an in dem Nährmedium gelöstem Sauerstoff immer bei einem so hohen Niveau gehalten werden, daß die aerobe Kultivierung in besonders vorteilhafter Weise durchführbar ist.

Nach Beendigung der Kultivierung kann der Fluorkohlenstoff oder das Süiconöl von dem flüssigen Medium leicht abgetrennt werden auf Grund der Dichteunterschiede zwischen den Komponenten. Außerdem können die auf diese Weise isolierten Fluorkohlenstoffe oder Siliconöle erneut verwendet werden.

Das Verfahren der Erfindung kann die Fermentierunt' oder Kultivierung aerober Mikroorganismen ungewöhnlich stark fördern. So wird z. B. erfindungsgemäß das Wachstum oder die Vermehrung eines Stammes der Gattungen Streptomyces, Micromonospora, Saccharomyces, Aspergillus und Proteus, Escherichia, Serratia, Pseudomonas, Acromobacter, Corynebacterium, Micrococcus, Brevibacterium, Acetobacter oder die Produktivität an wertvollen fermentativen Produkten (z. B. Aminosäuren, Antibiotica, Eni'ymen, Coenzymen und Vitaminen) merklich erhöht. Außerdem kann die zur Fermentierung oder Kultivierung dieser Mikroorganismen erforderliche Zeit verkürzt werden wegen der merklichen Erhöhung der Wachstumsrate dieser Mikroorganismen oder der Produktivität an fermentativen Produkten.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1

500 ml eines wäßrigen Nähnnediums mit einem Gehalt an 20% (G/V) Sorbit, 1 % (G/V) Maisquel!wasser und 0,3% (G/V) Calciumcarbonat wurden in einen

»ο 1-1-Fermenter eingebracht. Eine gewisse Menge an Perfluortributylamin wurde dem Nährmedium zugesetzt. Das Medium wurde in einem Autoklav sterilisiert und anschließend auf 30° C abgekühlt. Das Nährmedium wurde so dann mit Acetobacter suboxydans ATCC 621 beimpft. Danach wurde das Medium bei 30⁰C unter Belüftung (250 ml/min) und Rühren (500 UpM) kultiviert, bis die Oxidation von Sorbitol zu Sorbose vervollständigt war. Die Ergebnisse der Kultivierung sind in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

Menge an zugesetztem

Perfluortri- A BCD

butylaiT.in (Mol Sorbose/

%(V/V) ml/h) (h) (h) (%)

0 10 20 40

5,8
7,2
8,9
9,6

10-⁵

10-⁵

ίο-⁶
\g-^s

8 bis 24 27 6 bis 18 20 5 bis 14 15 5 bis 12 12

96 97 95 96

In der Tabelle bedeuten:

die maximale Fermentationsgeschwindigkeit, d. h. die maximale Geschwindigkeit der Oxidation von Sorbitol zu Sorbose,

die Dauer der maximalen Fermentierungsgeschwindigkeit, d. h. die Zeitspanne, während welcher die maximale Fermentierungsgeschwindigkeit zu beobachten ist,

die zur Vervollständigung der Fermentierung erforderliche Zeit und

die Ausbeute an Sorbose, d. h. die Umwandlungsrate von Sorbitol in Sorbose.

Beispiel 2

100 ml eines wäßrigen Nährmediums der in Beispiel 1 angegebenen Zusammensetzung wurden in einen 500 ml-Schüttelkolben eingebracht. 20 ml Perfluortributylamin wurden dem Nährmedium zugesetzt. Das Nährmedium wurde sterilisiert und anschließend auf 30⁰C abgekühlt. Das Nährmedium wurde so dann mit Acetobacter suboxydans ATCC 621 inokuliert. Danach wurde das Nährmedium bei 30⁰C unter Schütteln (140 Cyclen/min, Anschlagsfrequenz 8,5 cm) kultiviert. Die maximale Fermentierungsgeschwindigkeit (5,21 · 10~⁶ Mol Sorbose/ml/h) wurde während 10 bis 28 h nach Kultivierungsbeginn beobachtet. Die Fermentierung war nach etwa 30 h vollständig.

Wurde die Kultivierung ohne Perfluortributylamin durchgeführt, so war die Fermentierung in 40 h vollständig bei einer maximalen Fermentierungsgeschwindigkeit von 3,8 · 10-⁶ Mol Sorbose/ml/h.

Beispiel 3 Die Kultivierung von Acetobacter

_w._w .„ _.._o suboxydans

ATCC 621 wurde nach dem in Beispiel 2 beschriebenen

Verfahren durchgefühlt, jedoch mit der Ausnahme, daß 100 ml Siliconöl an Stelle von Perfluortributylamin verwendet wurden. In diesem falle war die Fermentierung in etwa 20 h vollständig bei einer maximalen Fermentierungsgeschwindigke.it von 7,45 · 10"^fi Mol 5 Sorbose/ml/h.

Beispiel 4

20 g Glucose, 6 g Diammoniumphosphat, 2,5 g L-Asparaginsäüre, 5 g Hefeextrakt, 1 g Trinatriumcitrat, 0,25 g Magnesiumsulfat · 7 Hydrat, 2 mg Zinksulfat · 7 Hydrat und 1 mg Eisen(II)sulfat wurden in 11 Wasser gelöst. 500 ml des wäßrigen Mediums wurden auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt und in einen 1 1-Fermenter eingebracht. Eine bestimmte Menge an PerfJuortributylamin wurde dem Nährmedium zugesetzt. Das Nährmedium wurde sterilisiert und anschließend auf 30" C gekühlt. Danach wurde das Medium mit Saccharomyces cerevisiae beimpft. Danach wurde das Medium kultiviert bei 30^cC unter Be- *° lüftung (250 ml/min) und Rühren (5CO UpM), bis das Wachstum der Hefe aufhörte. Die Ergebnisse der Kultivierung sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II as

Menge an zugesetztem Perfluortri- ABC butylamin % (V/V) (h) (l/h) (h)

0	10 bis 30	0,14	48
25	10 bis 17	0,19	40
50	10 bis 20	0,22	30

30

In der Tabelle bedeuten:

A die Dauer der aktiven Phase der Vermehrung,

B die spezifische Wachstumsrate, d. h. die Wachstumsrate (g/ml/h) der Hefe in der aktiven Phase der Vermehrung/Konzentration/ml an Hefezellen im Medium, und

C die zur Vervollständigung der Kultivierung erforderliche Zeit.

Beispiel 5

500 ml eines wäßrigen Nährmediums mit einem Gehalt an 20% (G/V) Glycerin, 1,5% (G/V) Maisquellwasser, 0,5% (G/V) Ammoniurni'umarat und 1% (G/V) Calciumcarbonat wurden in einen 1 1-Fermenter eingebracht. Eine bestimmte Menge an Perfluortributylamin wurde dem Medium zugesetzt. Das Medium wurde sterilisiert und anschließend auf 30⁰C gekühlt. Danach wurde das Medium mit Acetobacter suboxydans ATCC 621 beimpft. Anschließend wurde das Medium kultiviert bei 30° C unter Belüftung (250 ml/ min) und Rühren (500 UpM), bis die Umwandlung des Glycerins in Dihydroxiaceton vervollständigt war. Die Ergebnisse der Kultivierung sind in der folgenden Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III

Zugesetzte Menge	A	B	C
an Perf luortributyl-	(MoI Di-
amin % (V/V)	hydroxi-
	aceton/ml/h)	(h)	(h)

3.8-10-⁶ 16 bis 65

5.2 · 10-⁶ 15 bis 60

6.3 · 10-⁶ 12 bis 50
7.2-10-⁶ 10 bis 45

72
64
56
56

In der Tabelle bedeuten:

A die maximale Fennentierungsgeschwindigkeit, d. h. die maximale Geschwindigkeit der Umwandlung von Glycerin in Dihydroxiaceton,

B die Dauer der maximalen Fermentierungsgeschwindigkeit und

C die zur Vervollständigung der Fermentierung erforderliche Zeit.

Beispiel 6

100 ml eines wäßrigen Nährmediums mit einem Gehalt an 3% (G/V) Stärke, 4% (G/V) Baumwollsamentreber, 0,2% (G/V) Hefeextrakt, 0,5% (G/V) Natriumchlorid, 0,3% (G/V) Calciumcarbonat und 0,002% (G/V) Kupfer(Il)sulfat · 5 Hydrat wurden bei 121 "C 20 min lang im Autoklav sterilisiert. Eine öse voll Streptomyces humidus var. sp. MCRL 0387 (hinterlegt bei der Agricultural Research Service Culture Collection des United States Department of Agriculture unter der Eingangsnummer NRRL 3885) wurde dem Medium zur Beimpfung zugesetzt, worauf das Nährmedium bei 27° C 72 h lang unttr Belüftung und Rühren kultiviert wurde. Auf diese Weise wurde die Impfkultur erhalten.

100 ml eines wäßrigen Nährmediums mit einem Gehalt an 20% (G/V) Maltosesirup (Maltosegehalt 50 bis 60%), 4% (G/V) Baumwollsamentreber, 1% (G/V) Natriumchlorid, 0,6% (G/V) Calciumcarbonat und 0,004% (G/V) Kupfer(ll)sulfat -5 Hydrat wurden in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolbcn eingebracht. Eine bestimmte Menge an Perfluortributylamin wurde dem Nährmedium zugesetzt. Das Medium wurde so dann bei 12TC 20 min lang im Autoklav sterilisiert und anschließend gekühlt. 3,1 ml der angegebenen Impfkultur wurden dem Medium zugesetzt. Danach wurde das Nährmedium bei 27 C unter Schütteln (140 Cyclen/min) kultiviert. Die Menge (Einheiten/ml) an im Nährmedium angereichertem Antibioticum YA-56 ist in der folgenden Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

45 Menge an zugesetztem Perfluortributylamin % (V/V)

Kultivierungszeit

14 Tage

15 Tage

18 Tage

7,5(7,0) 15,2(7,4) 33,0(7,3)

10,0(7,1) 17,1(7,3) 36,0(7,1)

14,2 (6,9) 23,2 (7,0) 43,0 (7,0)

15,2(6,9) 22,7(7,1) 46,0(7,1)

In obiger Tabelle ist zu beachten:

1. Die Menge an im Nährmedium angereichertem Antibioticum YA-56 wurde bestimmt mit Hilfe der Zylinderplattenmethode unter Verwendung von Escherichia coli NlHJ als empfindlicher Mikroorganismus und

2. die in Klammer angegebenen Werte bedeuten die pH-Werte des Mediums.

Beispiel 7

50 ml eines wäßrigen Nährmediums mit einem Gehalt an 2,0% (G/V) Polypepton, 0,5% (G/V) Fleischextrakt, I % (G/V) Glucose, 1 % (G/V) Calciumcarbonat und 0,5% (G/V) Natriumchlorid wurden im Autoklav sterilisiert. Das Medium wurde mit einer öse voll

Streptomyces Fradiae ISP-5063 beimpft, worauf das Tabelle V Nährmedium bei 25°C 48 h lang unter Schütteln kultiviert wurde. Auf diese Weise wurde die Impfkultur erhalten.

50 ml eines wäßrigen Nährmediums der angegebenen Zusammensetzung wurden in einen 250 ml-Erlenmeyerkolben eingebracht. Eine bestimmte Menge an Perfluortribulylamin wurde dem Medium zugesetzt. Das Nährmedium wurde so dann bei 121 C 20 min lang im Autoklav sterilisiert, worauf es gekühlt wurde. io Danach wurde 1 ml Impfkultur dem Medium zugesetzt. Anschließend wurde das Medium bei 25 C unter Schütteln (150 Cyclen/min) kultiviert. Die Menge (mcg/'ml) des im Nährmedium angereicherten Antibioticums Neomycin ist in der folgenden Tabelle V 15 aufgeführt.

Menge an zugesetztem Perfluortributylamin % (V/V) 2 Tage

Kultivierungszeit 3 Tage 5 Tage

0 20

0,852(8,2) 1,150(8,7) 1,142(9,0)
1,413(8,6) 1,650(8,8) 1,510(9,1)

In obiger Tabelle ist zu beachten:

Die Menge des an im Nährmedium angereicherten Antibioticums Neomycin wurde bestimmt mit Hilfe der Zylinderplattenmethode unter Verwendung von Staphylococcus aureus Terashima als empfindlicher Mikroorganismus und
die in Klammern angegebenen Werte bedeuten die pH-Werte des Mediums.

Claims (1)

1. die

   aus der Gasphase in _Wlc|?lllln

   Hefen oder Actynomycelen

   /„. an

   r Viskosität von 0,65 bis ,e zur Kulti-