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Diese
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Riboflavinglucosid
aus Stärke
durch Fermentation. Der wie in dieser Beschreibung verwendete Begriff „Riboflavinglucosid" umfasst Riboflavinglucoside, die
durch eine oder mehrere Glucoseeinheiten pro Molekül Riboflavin
gekennzeichnet sind.
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Riboflavinglucosid
ist als einer der Metaboliten von Riboflavin bekannt, die im Urin
gefunden werden. Es ist löslicher
in Wasser als Riboflavin. Die Löslichkeit
von Riboflavinglucosid bei 20 °C
und 37 °C
ist 2, 2 bzw. 3, 5 mg/ml. Im Vergleich dazu hat Riboflavin eine
Löslichkeit
von 0,1 und 0,2 mg/ml bei diesen Temperaturen [siehe Methods in
Enzymology, Academic Press, 18B, 404–417 (1971)].
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Riboflavin
selbst wird vielfach als ein Zusatz in Getränken zum Färben und/oder zur Ernährung verwendet,
jedoch werden die Getränke
aufgrund seiner niedrigen Löslichkeit
in Wasser trüb.
Riboflavin-enthaltende Lösungen
für intravenöse Tropfinjektion
werden ebenfalls trüb
und blockieren in der Regel die Injektionsschläuche. Um solche Löslichkeitsprobleme
zu lösen,
könnte
das löslichere
Riboflavinglucosid anstelle von Riboflavin verwendet werden, um
klare Getränke
und (Injektions)-Lösungen
herzustellen.
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Riboflavinglucosid
wurde zuerst von Whitby mit einem Aceton-getrockneten Pulver von
Rattenleber erhalten [Biochem. J. 50, 433 (1952)]. Die Glucosidierung
von Riboflavin findet statt, wenn Riboflavin in eine Lösung, enthaltend
Transglucosidase, und Glucosyldonoren, wie Maltose, Dextrin, Stärke, Glycogen
und Salicin, inkubiert wird. Es wurde mitgeteilt, dass Transglucosidase
in Tierorganen, Mikroorganismen und Pflanzen, wie Rattenleber, Aspergillus
oryzae, Escherichia co li, Leuconostoc mesenteroides, und Cotylendonen
von Kürbis, Cucurbita
pepo, und Zuckerrübe,
Beta vulgaris, weit verbreitet ist. Die Produktivität von Riboflavinglucosid durch
diese enzymatischen Reaktionsvorgänge oder Fermentation in Medien,
die Riboflavin und Glucosyldonoren enthalten, war jedoch eher niedrig
und ihr Reinigungsverfahren zur praktischen Verwendung zu kompliziert
[siehe J. Vitaminology 6, 139–144
(1960) und Methods in Enzymology 18B, 404–417 (1971)].
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Mit
Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist es möglich,
Riboflavinglucosid in einer viel höheren Ausbeute, auch ohne die
Zugabe von Riboflavin, durch die Fermentation eines Riboflavinglucosid-erzeugenden
Mikroorganismus in einem eine Stärke
enthaltenden Medium herzustellen. Das Verfahren umfasst Züchten eines
Mikroorganismus, der zu der Gattung Bacillus gehört, welcher in der Lage ist,
Riboflavinglucoside in einem wässrigen
Medium, enthaltend eine Stärke
unter aeroben Bedingungen zu erzeugen.
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Die
Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
schließen
alle Stämme ein,
die zu der Gattung Bacillus gehören,
eine Amylaseaktivität
besitzen, beispielsweise Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus
circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus
megaterium, Bacillus pumilus und Bacillus subtilis, und ihre Rekombinanten,
die Riboflavin erzeugen können.
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Einige
von diesen Mikroorganismusstämmen
sind am Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO), hinterlegt.
Diese haben die Zugriffsbezeichnungen Bacillus brevis IFO 15304,
Bacillus cereus IFO 15305, Bacillus circulans IFO 13626, Bacillus
coagulans IFO 12583, Bacillus licheniformis IFO 12200, Bacillus
megaterium IFO 15308, Bacillus pumilus IFO 12092 und Bacillus subtilis
IFO 13719 und werden in der IFO „List of Cultures", Mikroorganismen,
10. Ausgabe 1996, angeführt.
Als solche sind Proben der Mikroorganismen von dem IFO öffentlich
zugänglich.
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Beispiele
für die
Stämme,
die in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt angewendet
werden, sind Bacillus subtilis RB50::[pRF69]60::[pRF93]120Ade+,
Bacillus subtilis RB50::[pRF69]60Ade+ und dergleichen [Europäische Patent-Veröffentlichungen
(EP) 405370 A1 und 821063 A2]. Der Wirtsstamm, RB50, ist ein deregulierter
Bacillus subtilis Stamm, der gegen Roseoflavin resistent ist. Ein
Plasmid, pRF69, enthält den
SPO 1–15-Promotor
und cat Gen in der gleichen Richtung wie der rib Operon. Die Einzelheiten
der Wirtsmikroorganismen und ein Plasmid pRF69 werden in
EP 405370 A1 angegeben.
Der Wirtsmikroorganismus RB50 und Plasmid pRF69 wurden unter dem
Budapester Vertrag bei der Agricultural Research Culture Collection
(NRRL), Peoria, Illinois, bzw. der American Type Culture Collection
(ATCC), Rockville, Maryland, unter den nachstehenden Hinterlegungsnummern
bei den gegebenen Daten hinterlegt:
Bacillus subtilis RB50:
(NRRL) B-18502 (ursprünglich
23. Mai 1989; hinterlegt am 24. August 1989), pRF69: ATCC 68338
(6. Juni 1990).
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Die
vorangehende Hinterlegung wurde von S.L. Misrock, c/o Pennie & Edmonds, 1155
Avenue of the Americas, New York, NY 10036, USA, ausgeführt. Im
Ergebnis von verschiedenen Änderungen
der Verantwortlichkeit für
diese Hinterlegung ist der gegenwärtige Hinterleger, wirksam
Hoffmann-La Roche Inc., 340 Kingsland Street, Nutley, New Jersey
07110. Die letztere Hinterlegung erfolgte von BioTechnica International, Inc.,
85 Bolton Street, Cambridge, Massachusetts 02140, USA (der gegenwärtige Hinterleger
in diesem Fall ist OmniGene Bioproducts, Inc., 763-D Concord Avenue,
Cambridge, Massachusetts 02138).
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RB50::[pRF69]60Ade+
wird durch Einführen
von pRF69 an die rib Seite von RB50 nach der Genverstärkung durch
Auswählen
von Kolonien, die in Gegenwart des ansteigenden Spiegels von Chloramphenicol wachsen,
hergestellt. Ein Plasmid pRF93 wird von pRF89 (siehe
14 von
EP 405370 A1 ) durch Austauschen von Chloramphenicol-resistentem
Gen gegen Tetracyclin-resis tentes Gen (siehe Beispiel 8, Second
site Integration von
EP
405370 A1 ) abgeleitet. RB50::[pRF69]60::[pRF93]120Ade+
wird durch Integrieren des zweiten Plasmids, pRF93, an der bpr Seite
des Chromosoms erhalten (
EP
821063 A2 ). Die rekombinanten Stämme, die modifizierten rib
Operon anstelle von Chromosom besitzen, werden durch Arzneimittelresistenz verstärkt.
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Bacillus
subtilis RB50::[pRF69]60::[pRF93]120Ade+ ist bekannt, dass es mehr
als 14,0 g/l Riboflavin unter den optimierten Gefäßfermentationsbedingungen
erzeugen kann (
EP 821063
A2 ). Die Herstellung eines Plasmids pRF93 wird auch in
der Europäischen
Patentveröffentlichung
beschrieben.
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In
einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform
wird die Herstellung von Riboflavinglucosiden durch Züchten des
zuletzt erwähnten
Mikroorganismusstamms in einem wässrigen
Kulturmedium, enthaltend eine Stärke,
insbesondere eine lösliche
Stärke
und/oder eine oder mehrere andere Stärken und ergänzt mit
geeigneten Nährmitteln
unter aerober Bedingung, bewirkt. Das Medium enthält eine
lösliche
Stärke und/oder
eine oder mehrere andere Stärken
bei einer (Gesamt) Konzentration von etwa 25 g/l bis etwa 400 g/l,
vorzugsweise etwa 200 g/l bis etwa 300 g/l. Die Menge an Inokulum
von Mikroorganismus ist im Allgemeinen etwa 1% bis etwa 30%, vorzugsweise
etwa 5% bis etwa 20%.
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Das
Kulturmedium enthält
Stärke,
wovon im Prinzip jede Sorte verwendet werden kann, wie lösliche Stärke, Kartoffelstärke, Maisstärke und
Weizenstärke.
Es ist gewöhnlich
erforderlich, dass das Kulturmedium auch Nährmittel enthält. Diese
können
verdaubare Stickstoffquellen sein, wie organische Substanzen, beispielsweise
Pepton, Hefeextrakt, Sojamehl, Maisaufbrühflüssigkeit, Baumwollsaatabfall,
getrockneter Hefe- und Fleischextrakt; anorganische Substanzen,
beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Kaliumnitrat und Kaliumphosphat; Vitamine, Metalle, Aminosäuren, Spurenelemente
und zusätzliche
assimilierbare Kohlenstoffquellen, beispielsweise D-Glucose, D-Fructose,
D-Mannose, D-Sorbit, D-Man nit, Saccharose, Melassen, Stärkehydrolysate,
Essigsäure
und, falls erforderlich, Ethanol.
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Die
Züchtung
erfolgt zweckmäßigerweise
bei einem pH-Wert
von etwa 4,0 bis etwa 9,0, vorzugsweise etwa 4,5 bis etwa 8,0. Der
Züchtungszeitraum
variiert in Abhängigkeit
von dem einzelnen Mikroorganismus und verwendetem Nährmedium
und liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis etwa 150 Stunden.
Der Temperaturbereich zum Ausführen
der Züchtung
ist geeigneterweise etwa 20 bis etwa 45 °C, vorzugsweise 25 bis 40 °C.
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Die
so akkumulierten Riboflavinglucoside bestehen aus einem Gemisch
von jenen mit einer oder mehreren Glucoseeinheiten pro Molekül Riboflavin.
Falls erwünscht,
können
die so hergestellten Riboflavinglucoside leicht zu Riboflavinmonoglucosid
auf konzentriert werden, und dies kann beispielsweise durch das
nachstehende Verfahren gewonnen werden: Die Riboflavin- und Riboflavinglucoside-enthaltende
Kulturbrühe
wird zuerst zum Entfernen von Zellen filtriert oder zentrifugiert.
Dann wird das abgetrennte Filtrat mit Glucoamylase behandelt, wobei
Riboflavinglucoside zu Riboflavinmonoglucosid aufkonzentriert werden.
Etwa 1 Einheit Glucoamylase/mg Riboflavinglucoside ist gewöhnlich ausreichend
für diesen
Zweck (eine Einheit setzt 1,0 mg Glucose aus Stärke in 3 Minuten bei pH 4,5
und 55 °C
frei). Die Menge an angewendetem Enzym hängt von der Inkubationstemperatur,
dem Zeitraum und anderen Reaktionsbedingungen, beispielsweise pH-Wert,
ab. Wenn die Enzymkonzentration und/oder Temperatur niedrig sind,
ist ein langer Inkubationszeitraum erforderlich. Zwei bis drei Tage
Inkubation bei 37 °C
wurden versucht und zeigten gute Ergebnisse. Unter Berücksichtigung
dieser Daten werden 0,001 bis 100 Einheiten/mg bei 25 bis 70 °C für 1 Minute
bis 100 Stunden, vorzugsweise 0,1 bis 10 Einheiten/mg bei 30 bis
60 °C für 3 Minuten
bis 70 Stunden, geeigneterweise angewendet. Zur weiteren Reinigung
kann, falls erwünscht,
die behandelte Lösung
auf ein Rdsorptionsmittelharz aufgetragen werden. Ungeachtet dessen,
ob Riboflavinmonoglucosid selbst erhalten werden soll, kann das
in der Fermentation akkumulierte Riboflavinglucosid aus dem Fermentationsmedium
durch Standardtechniken, vorzugsweise unter Einbezug von Adsorptionsmittelharz
und Gelfiltrationsharz für
die Abtrennung von jeder Komponente, erhalten werden.
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Die
Erfindung wurde nun im Allgemeinen beschrieben. Die nachstehende
Figur und die Beispiele werden zur genaueren Erläuterung der Erfindung dargereicht,
ohne dieselbe in irgendeiner Weise zu begrenzen.
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1: HPLC-Analyse
einer typischen Kulturbrühe.
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Beispiel 1
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Eine
Schleife voll Bacillus subtilis RB50::[pRF69]60::[pRF93]120Ade+,
gewachsen auf einer Agarplatte von Tryptose-Blut-Agar-Grundlage
(TBAB, DIFCO Laboratories, Detroit, USA) Medium, enthaltend 60 μg/ml Chloramphenicol
und 120 μg/ml
Tetracyclin, wurde in 8 ml Impfkulturmedium, die in einem Reagenzglas
enthalten ist, inokuliert.
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Der
Inhalt des Reagenzglases wurde bei 37 °C für 2,75 Stunden, unter Verwendung
eines Reagenzglasschüttlers,
inkubiert. Die so hergestellte Impfkultur (4 ml) wurde in ein Herstellungsmedium,
aufgefüllt
auf 40 ml nach Inokulation, in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit
Klammern inokuliert. Die Zusammensetzung der Impfkultur und das
Herstellungsmedium waren wie nachstehend.
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Das
Herstellungsmedium wurde bei 37 °C
und 240 U/min für
3 Tage inkubiert. Die Brühe
wurde dann hinsichtlich der erzeugten Menge von Riboflavin-verwandten
Verbindungen durch Dünnschichtchromatographie
analysiert. Ein μl
der Brühe
wurde auf eine Kieselgelplatte (Kieselgel 60F254, MERCK, Darmstadt, Deutschland)
punktweise aufgetragen und durch ein Lösungsmittelsystem, bestehend
aus Aceton, n-Butanol und Wasser, in einem Volumenverhältnis von
5:4:1 entwickelt. Mindestens drei Verbindungen, die von Riboflavin
verschieden waren, bezeichnet Komponente A, B und C und alle gelb
in der Farbe, wurden nachgewiesen. Die Rf-Werte für die Komponenten
A, B, C und Riboflavin waren 0,27, 0,15, 0 (verblieb an punktweise
aufgetragenem Punkt nach Entwicklung) bzw. 0,41. Folglich ist Komponente
A vorherrschend. Im direkten Vergleich mit Flavinmononucleotid oder
Flavinadenindinucleotid wurde gezeigt, dass keine der Komponenten
diesen Nucleotiden entsprach.
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HPLC-Analyse
der Kulturbrühe
wurde unter den in 1 beschriebenen Bedingungen
bewirkt. Die Retentionszeit der Komponente A war 8,6 Minuten, während jene
von Riboflavin 9,6 Minuten war. Die UV-Vis-Absorptionsspektren der
Komponenten A, B und C deckten sich gut mit jenen von Riboflavin.
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Die
Gesamtproduktivität
der Komponenten A, B und C, gemessen durch UV-Absorption bei 444
nm, war 3,51 g/l, bezogen auf Riboflavin.
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Beispiel 2
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Eine
in ähnlicher
Weise zu Beispiel 1 erhaltene Kulturbrühe wurde mit Glucoamylase (EC
3.2.1.3) von Aspergillus niger (Sigma Chemical Co., Missouri, USA)
in Natriumacetatpuffer (pH 4,5) bei 55 °C für 2,5 Stunden behandelt. Durch
Dünnschichtchromatographieanalyse
wurden die Komponenten A, B und C in der Kulturbrühe als bei
Komponente A zentriert beobachtet. Weiterhin wurde ein Fleck, der
mit authentischer Glucose identisch ist, nachgewiesen. Somit wurde
Glucose aus den Komponenten B und C durch die Behandlung freigesetzt.
Die Lösung
wurde dann auf eine Säule,
gepackt mit einem Adsorptionsharz, Amberlite® XAD-7
(Rohm and Haas Co., Philadelphia, USA), aufgetragen. Sowohl die
Komponente A als auch Riboflavin wurden durch das Harz (Glucose
wurde nicht adsorbiert) adsorbiert und mit einer wässrigen
Acetonlösung
1:1 nach Waschen mit Wasser eluiert. Nach Aufkonzentrierung durch
Verdampfung zur Entfernung von Aceton wurde das Eluat gefriergetrocknet.
Das erhaltene Pulver wurde in einer kleinen Menge Natriumhydroxidlösung gelöst und auf eine
Säule,
gepackt mit Gelfiltrationsharz, Toyopearl HW-40F (TOYO SODA Mfg.
Co. Ltd., Tokio, Japan), zum Trennen der Komponente A und Riboflavin
aufgetragen. Die eluierte Komponente A-Fraktion wurde gefriergetrocknet.
Die Reinheit des so erhaltenen Pulvers war 97%.
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Das
Molekulargewicht der Komponente A wurde durch Massenspektrometrie
mit m/z 539 bestimmt. Dieser Wert entspricht dem Molekulargewicht
von Riboflavinmonoglucosid. Die Komponente A wurde dann durch 1N
Salzsäure
bei 95 °C
für 2,5
Stunden hydrolysiert, um die Möglichkeit
zu untersuchen, dass eine Glucoseeinheit an Riboflavin gebunden
ist. Das Hydrolysat wurde dann punktweise auf eine Dünnschichtchromatographieplatte,
zusammen mit authentischen Proben von Riboflavin und Glucose, aufgetragen
und entwickelt. Im Ergebnis zeigte sich, dass Riboflavin und Glucose
sich von Komponente A freigesetzt hatten. Weiterhin zeigte Analyse
der 1H- und 13C-NMR-Spektren
von Komponente A, dass die glucosidische Bindung aus einer α-Bindung
an der 5'-Position
von Riboflavin bestand. Aus diesen Ergebnissen wird geschlussfolgert,
dass Komponente A identisch mit 5'-D-Riboflavin-α-D-glucosid:6,7-dimethyl-9-(5'-[α-D-glucopyranosyl]-D-ribityl)-isoalloxazin
ist.
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Beispiel 3
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Bacillus
pumilus RLX3, ein gelb gefärbter,
Riboflavinerzeugender Mutantenstamm, abgeleitet von Bacillus pumilus
RC15 (FERM-BP Nr. 2834, JP Kokai Nr. 203982/1995), mit zwei N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin-Behandlungen,
wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, kultiviert,
mit der Ausnahme, dass keine Antikörper für diesen Stamm zugesetzt wurden.
Im Ergebnis wurden 0,25 g/l Riboflavinglucosid (basierend auf Riboflavin,
gemessen durch die UV-Absorption bei 444 nm) nach 3 Tagen Züchtung erzeugt.
