DE69825852T2 - Riboflavin Glucosid - Google Patents

Description

• Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Riboflavinglucosid aus Stärke durch Fermentation. Der wie in dieser Beschreibung verwendete Begriff „Riboflavinglucosid" umfasst Riboflavinglucoside, die durch eine oder mehrere Glucoseeinheiten pro Molekül Riboflavin gekennzeichnet sind.
• Riboflavinglucosid ist als einer der Metaboliten von Riboflavin bekannt, die im Urin gefunden werden. Es ist löslicher in Wasser als Riboflavin. Die Löslichkeit von Riboflavinglucosid bei 20 °C und 37 °C ist 2, 2 bzw. 3, 5 mg/ml. Im Vergleich dazu hat Riboflavin eine Löslichkeit von 0,1 und 0,2 mg/ml bei diesen Temperaturen [siehe Methods in Enzymology, Academic Press, 18B, 404–417 (1971)].
• Riboflavin selbst wird vielfach als ein Zusatz in Getränken zum Färben und/oder zur Ernährung verwendet, jedoch werden die Getränke aufgrund seiner niedrigen Löslichkeit in Wasser trüb. Riboflavin-enthaltende Lösungen für intravenöse Tropfinjektion werden ebenfalls trüb und blockieren in der Regel die Injektionsschläuche. Um solche Löslichkeitsprobleme zu lösen, könnte das löslichere Riboflavinglucosid anstelle von Riboflavin verwendet werden, um klare Getränke und (Injektions)-Lösungen herzustellen.
• Riboflavinglucosid wurde zuerst von Whitby mit einem Aceton-getrockneten Pulver von Rattenleber erhalten [Biochem. J. 50, 433 (1952)]. Die Glucosidierung von Riboflavin findet statt, wenn Riboflavin in eine Lösung, enthaltend Transglucosidase, und Glucosyldonoren, wie Maltose, Dextrin, Stärke, Glycogen und Salicin, inkubiert wird. Es wurde mitgeteilt, dass Transglucosidase in Tierorganen, Mikroorganismen und Pflanzen, wie Rattenleber, Aspergillus oryzae, Escherichia co li, Leuconostoc mesenteroides, und Cotylendonen von Kürbis, Cucurbita pepo, und Zuckerrübe, Beta vulgaris, weit verbreitet ist. Die Produktivität von Riboflavinglucosid durch diese enzymatischen Reaktionsvorgänge oder Fermentation in Medien, die Riboflavin und Glucosyldonoren enthalten, war jedoch eher niedrig und ihr Reinigungsverfahren zur praktischen Verwendung zu kompliziert [siehe J. Vitaminology 6, 139–144 (1960) und Methods in Enzymology 18B, 404–417 (1971)].
• Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, Riboflavinglucosid in einer viel höheren Ausbeute, auch ohne die Zugabe von Riboflavin, durch die Fermentation eines Riboflavinglucosid-erzeugenden Mikroorganismus in einem eine Stärke enthaltenden Medium herzustellen. Das Verfahren umfasst Züchten eines Mikroorganismus, der zu der Gattung Bacillus gehört, welcher in der Lage ist, Riboflavinglucoside in einem wässrigen Medium, enthaltend eine Stärke unter aeroben Bedingungen zu erzeugen.
• Die Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, schließen alle Stämme ein, die zu der Gattung Bacillus gehören, eine Amylaseaktivität besitzen, beispielsweise Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus und Bacillus subtilis, und ihre Rekombinanten, die Riboflavin erzeugen können.
• Einige von diesen Mikroorganismusstämmen sind am Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO), hinterlegt. Diese haben die Zugriffsbezeichnungen Bacillus brevis IFO 15304, Bacillus cereus IFO 15305, Bacillus circulans IFO 13626, Bacillus coagulans IFO 12583, Bacillus licheniformis IFO 12200, Bacillus megaterium IFO 15308, Bacillus pumilus IFO 12092 und Bacillus subtilis IFO 13719 und werden in der IFO „List of Cultures", Mikroorganismen, 10. Ausgabe 1996, angeführt. Als solche sind Proben der Mikroorganismen von dem IFO öffentlich zugänglich.
• Beispiele für die Stämme, die in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt angewendet werden, sind Bacillus subtilis RB50::[pRF69]60::[pRF93]120Ade+, Bacillus subtilis RB50::[pRF69]60Ade+ und dergleichen [Europäische Patent-Veröffentlichungen (EP) 405370 A1 und 821063 A2]. Der Wirtsstamm, RB50, ist ein deregulierter Bacillus subtilis Stamm, der gegen Roseoflavin resistent ist. Ein Plasmid, pRF69, enthält den SPO 1–15-Promotor und cat Gen in der gleichen Richtung wie der rib Operon. Die Einzelheiten der Wirtsmikroorganismen und ein Plasmid pRF69 werden in EP 405370 A1 angegeben. Der Wirtsmikroorganismus RB50 und Plasmid pRF69 wurden unter dem Budapester Vertrag bei der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, Illinois, bzw. der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, unter den nachstehenden Hinterlegungsnummern bei den gegebenen Daten hinterlegt:
  Bacillus subtilis RB50: (NRRL) B-18502 (ursprünglich 23. Mai 1989; hinterlegt am 24. August 1989), pRF69: ATCC 68338 (6. Juni 1990).
• Die vorangehende Hinterlegung wurde von S.L. Misrock, c/o Pennie & Edmonds, 1155 Avenue of the Americas, New York, NY 10036, USA, ausgeführt. Im Ergebnis von verschiedenen Änderungen der Verantwortlichkeit für diese Hinterlegung ist der gegenwärtige Hinterleger, wirksam Hoffmann-La Roche Inc., 340 Kingsland Street, Nutley, New Jersey 07110. Die letztere Hinterlegung erfolgte von BioTechnica International, Inc., 85 Bolton Street, Cambridge, Massachusetts 02140, USA (der gegenwärtige Hinterleger in diesem Fall ist OmniGene Bioproducts, Inc., 763-D Concord Avenue, Cambridge, Massachusetts 02138).
• RB50::[pRF69]60Ade+ wird durch Einführen von pRF69 an die rib Seite von RB50 nach der Genverstärkung durch Auswählen von Kolonien, die in Gegenwart des ansteigenden Spiegels von Chloramphenicol wachsen, hergestellt. Ein Plasmid pRF93 wird von pRF89 (siehe 14 von EP 405370 A1 ) durch Austauschen von Chloramphenicol-resistentem Gen gegen Tetracyclin-resis tentes Gen (siehe Beispiel 8, Second site Integration von EP 405370 A1 ) abgeleitet. RB50::[pRF69]60::[pRF93]120Ade+ wird durch Integrieren des zweiten Plasmids, pRF93, an der bpr Seite des Chromosoms erhalten ( EP 821063 A2 ). Die rekombinanten Stämme, die modifizierten rib Operon anstelle von Chromosom besitzen, werden durch Arzneimittelresistenz verstärkt.
• Bacillus subtilis RB50::[pRF69]60::[pRF93]120Ade+ ist bekannt, dass es mehr als 14,0 g/l Riboflavin unter den optimierten Gefäßfermentationsbedingungen erzeugen kann ( EP 821063 A2 ). Die Herstellung eines Plasmids pRF93 wird auch in der Europäischen Patentveröffentlichung beschrieben.
• In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Herstellung von Riboflavinglucosiden durch Züchten des zuletzt erwähnten Mikroorganismusstamms in einem wässrigen Kulturmedium, enthaltend eine Stärke, insbesondere eine lösliche Stärke und/oder eine oder mehrere andere Stärken und ergänzt mit geeigneten Nährmitteln unter aerober Bedingung, bewirkt. Das Medium enthält eine lösliche Stärke und/oder eine oder mehrere andere Stärken bei einer (Gesamt) Konzentration von etwa 25 g/l bis etwa 400 g/l, vorzugsweise etwa 200 g/l bis etwa 300 g/l. Die Menge an Inokulum von Mikroorganismus ist im Allgemeinen etwa 1% bis etwa 30%, vorzugsweise etwa 5% bis etwa 20%.
• Das Kulturmedium enthält Stärke, wovon im Prinzip jede Sorte verwendet werden kann, wie lösliche Stärke, Kartoffelstärke, Maisstärke und Weizenstärke. Es ist gewöhnlich erforderlich, dass das Kulturmedium auch Nährmittel enthält. Diese können verdaubare Stickstoffquellen sein, wie organische Substanzen, beispielsweise Pepton, Hefeextrakt, Sojamehl, Maisaufbrühflüssigkeit, Baumwollsaatabfall, getrockneter Hefe- und Fleischextrakt; anorganische Substanzen, beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Kaliumnitrat und Kaliumphosphat; Vitamine, Metalle, Aminosäuren, Spurenelemente und zusätzliche assimilierbare Kohlenstoffquellen, beispielsweise D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, D-Sorbit, D-Man nit, Saccharose, Melassen, Stärkehydrolysate, Essigsäure und, falls erforderlich, Ethanol.
• Die Züchtung erfolgt zweckmäßigerweise bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 9,0, vorzugsweise etwa 4,5 bis etwa 8,0. Der Züchtungszeitraum variiert in Abhängigkeit von dem einzelnen Mikroorganismus und verwendetem Nährmedium und liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis etwa 150 Stunden. Der Temperaturbereich zum Ausführen der Züchtung ist geeigneterweise etwa 20 bis etwa 45 °C, vorzugsweise 25 bis 40 °C.
• Die so akkumulierten Riboflavinglucoside bestehen aus einem Gemisch von jenen mit einer oder mehreren Glucoseeinheiten pro Molekül Riboflavin. Falls erwünscht, können die so hergestellten Riboflavinglucoside leicht zu Riboflavinmonoglucosid auf konzentriert werden, und dies kann beispielsweise durch das nachstehende Verfahren gewonnen werden: Die Riboflavin- und Riboflavinglucoside-enthaltende Kulturbrühe wird zuerst zum Entfernen von Zellen filtriert oder zentrifugiert. Dann wird das abgetrennte Filtrat mit Glucoamylase behandelt, wobei Riboflavinglucoside zu Riboflavinmonoglucosid aufkonzentriert werden. Etwa 1 Einheit Glucoamylase/mg Riboflavinglucoside ist gewöhnlich ausreichend für diesen Zweck (eine Einheit setzt 1,0 mg Glucose aus Stärke in 3 Minuten bei pH 4,5 und 55 °C frei). Die Menge an angewendetem Enzym hängt von der Inkubationstemperatur, dem Zeitraum und anderen Reaktionsbedingungen, beispielsweise pH-Wert, ab. Wenn die Enzymkonzentration und/oder Temperatur niedrig sind, ist ein langer Inkubationszeitraum erforderlich. Zwei bis drei Tage Inkubation bei 37 °C wurden versucht und zeigten gute Ergebnisse. Unter Berücksichtigung dieser Daten werden 0,001 bis 100 Einheiten/mg bei 25 bis 70 °C für 1 Minute bis 100 Stunden, vorzugsweise 0,1 bis 10 Einheiten/mg bei 30 bis 60 °C für 3 Minuten bis 70 Stunden, geeigneterweise angewendet. Zur weiteren Reinigung kann, falls erwünscht, die behandelte Lösung auf ein Rdsorptionsmittelharz aufgetragen werden. Ungeachtet dessen, ob Riboflavinmonoglucosid selbst erhalten werden soll, kann das in der Fermentation akkumulierte Riboflavinglucosid aus dem Fermentationsmedium durch Standardtechniken, vorzugsweise unter Einbezug von Adsorptionsmittelharz und Gelfiltrationsharz für die Abtrennung von jeder Komponente, erhalten werden.
• Die Erfindung wurde nun im Allgemeinen beschrieben. Die nachstehende Figur und die Beispiele werden zur genaueren Erläuterung der Erfindung dargereicht, ohne dieselbe in irgendeiner Weise zu begrenzen.
• 1: HPLC-Analyse einer typischen Kulturbrühe.
• Beispiel 1
• Eine Schleife voll Bacillus subtilis RB50::[pRF69]60::[pRF93]120Ade+, gewachsen auf einer Agarplatte von Tryptose-Blut-Agar-Grundlage (TBAB, DIFCO Laboratories, Detroit, USA) Medium, enthaltend 60 μg/ml Chloramphenicol und 120 μg/ml Tetracyclin, wurde in 8 ml Impfkulturmedium, die in einem Reagenzglas enthalten ist, inokuliert.
• Der Inhalt des Reagenzglases wurde bei 37 °C für 2,75 Stunden, unter Verwendung eines Reagenzglasschüttlers, inkubiert. Die so hergestellte Impfkultur (4 ml) wurde in ein Herstellungsmedium, aufgefüllt auf 40 ml nach Inokulation, in einen 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit Klammern inokuliert. Die Zusammensetzung der Impfkultur und das Herstellungsmedium waren wie nachstehend.

  

  
• Das Herstellungsmedium wurde bei 37 °C und 240 U/min für 3 Tage inkubiert. Die Brühe wurde dann hinsichtlich der erzeugten Menge von Riboflavin-verwandten Verbindungen durch Dünnschichtchromatographie analysiert. Ein μl der Brühe wurde auf eine Kieselgelplatte (Kieselgel 60F254, MERCK, Darmstadt, Deutschland) punktweise aufgetragen und durch ein Lösungsmittelsystem, bestehend aus Aceton, n-Butanol und Wasser, in einem Volumenverhältnis von 5:4:1 entwickelt. Mindestens drei Verbindungen, die von Riboflavin verschieden waren, bezeichnet Komponente A, B und C und alle gelb in der Farbe, wurden nachgewiesen. Die Rf-Werte für die Komponenten A, B, C und Riboflavin waren 0,27, 0,15, 0 (verblieb an punktweise aufgetragenem Punkt nach Entwicklung) bzw. 0,41. Folglich ist Komponente A vorherrschend. Im direkten Vergleich mit Flavinmononucleotid oder Flavinadenindinucleotid wurde gezeigt, dass keine der Komponenten diesen Nucleotiden entsprach.
• HPLC-Analyse der Kulturbrühe wurde unter den in 1 beschriebenen Bedingungen bewirkt. Die Retentionszeit der Komponente A war 8,6 Minuten, während jene von Riboflavin 9,6 Minuten war. Die UV-Vis-Absorptionsspektren der Komponenten A, B und C deckten sich gut mit jenen von Riboflavin.
• Die Gesamtproduktivität der Komponenten A, B und C, gemessen durch UV-Absorption bei 444 nm, war 3,51 g/l, bezogen auf Riboflavin.
• Beispiel 2
• Eine in ähnlicher Weise zu Beispiel 1 erhaltene Kulturbrühe wurde mit Glucoamylase (EC 3.2.1.3) von Aspergillus niger (Sigma Chemical Co., Missouri, USA) in Natriumacetatpuffer (pH 4,5) bei 55 °C für 2,5 Stunden behandelt. Durch Dünnschichtchromatographieanalyse wurden die Komponenten A, B und C in der Kulturbrühe als bei Komponente A zentriert beobachtet. Weiterhin wurde ein Fleck, der mit authentischer Glucose identisch ist, nachgewiesen. Somit wurde Glucose aus den Komponenten B und C durch die Behandlung freigesetzt. Die Lösung wurde dann auf eine Säule, gepackt mit einem Adsorptionsharz, Amberlite^® XAD-7 (Rohm and Haas Co., Philadelphia, USA), aufgetragen. Sowohl die Komponente A als auch Riboflavin wurden durch das Harz (Glucose wurde nicht adsorbiert) adsorbiert und mit einer wässrigen Acetonlösung 1:1 nach Waschen mit Wasser eluiert. Nach Aufkonzentrierung durch Verdampfung zur Entfernung von Aceton wurde das Eluat gefriergetrocknet. Das erhaltene Pulver wurde in einer kleinen Menge Natriumhydroxidlösung gelöst und auf eine Säule, gepackt mit Gelfiltrationsharz, Toyopearl HW-40F (TOYO SODA Mfg. Co. Ltd., Tokio, Japan), zum Trennen der Komponente A und Riboflavin aufgetragen. Die eluierte Komponente A-Fraktion wurde gefriergetrocknet. Die Reinheit des so erhaltenen Pulvers war 97%.
• Das Molekulargewicht der Komponente A wurde durch Massenspektrometrie mit m/z 539 bestimmt. Dieser Wert entspricht dem Molekulargewicht von Riboflavinmonoglucosid. Die Komponente A wurde dann durch 1N Salzsäure bei 95 °C für 2,5 Stunden hydrolysiert, um die Möglichkeit zu untersuchen, dass eine Glucoseeinheit an Riboflavin gebunden ist. Das Hydrolysat wurde dann punktweise auf eine Dünnschichtchromatographieplatte, zusammen mit authentischen Proben von Riboflavin und Glucose, aufgetragen und entwickelt. Im Ergebnis zeigte sich, dass Riboflavin und Glucose sich von Komponente A freigesetzt hatten. Weiterhin zeigte Analyse der ¹H- und ¹³C-NMR-Spektren von Komponente A, dass die glucosidische Bindung aus einer α-Bindung an der 5'-Position von Riboflavin bestand. Aus diesen Ergebnissen wird geschlussfolgert, dass Komponente A identisch mit 5'-D-Riboflavin-α-D-glucosid:6,7-dimethyl-9-(5'-[α-D-glucopyranosyl]-D-ribityl)-isoalloxazin ist.
• Beispiel 3
• Bacillus pumilus RLX3, ein gelb gefärbter, Riboflavinerzeugender Mutantenstamm, abgeleitet von Bacillus pumilus RC15 (FERM-BP Nr. 2834, JP Kokai Nr. 203982/1995), mit zwei N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin-Behandlungen, wurde in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, kultiviert, mit der Ausnahme, dass keine Antikörper für diesen Stamm zugesetzt wurden. Im Ergebnis wurden 0,25 g/l Riboflavinglucosid (basierend auf Riboflavin, gemessen durch die UV-Absorption bei 444 nm) nach 3 Tagen Züchtung erzeugt.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von Riboflavinglucosid, das das Züchten eines Mikroorganismus, der zu der Gattung Bacillus gehört, welcher Riboflavinglucoside erzeugen kann, in einem wässrigen Medium, das eine Stärke enthält, unter aerober Bedingung umfasst, wobei der Mikroorganismus zu der Art Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus oder Bacillus subtilis gehört.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Bacillus brevis IFO 15304, Bacillus cereus IFO 15305, Bacillus circulans IFO 13626, Bacillus coagulans IFO 12583, Bacillus licheniformis IFO 12200, Bacillus megaterium IFO 15308, Bacillus pumilus IFO 12092 oder Bacillus subtilis IFO 13719 darstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus Bacillus subtilis RB50::[pRF69]60Ade+ oder Bacillus subtilis RB50::[pRF69]60[pRF93]120Ade+ ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine Anfangskonzentration an Stärke in dem Kulturmedium 25 g/l bis 400 g/l, vorzugsweise 200 g/l bis 300 g/l, ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Züchten bei einem pH-Wert von 4,0 bis 9,0, vorzugsweise 4,5 bis 8,0, ausgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Züchten bei einer Temperatur von 20 bis 45 °C, vorzugsweise 25 bis 40 °C, ausgeführt wird.