DE2530861A1

DE2530861A1 - Verfahren zur herstellung von 2- keto-l-gulonsaeure

Info

Publication number: DE2530861A1
Application number: DE19752530861
Authority: DE
Inventors: Tahiko Honjo; Bunji Kageyama; Kobee Kobayashi; Takayasu Sonoyama; Hiroyoshi Tani; Shigeo Yagi
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1974-09-20
Filing date: 1975-07-10
Publication date: 1976-04-01
Also published as: AU8185675A; GB1454249A; AU496804B2; JPS5419468B2; NL169899B; CH612440A5; JPS5135485A; DE2530861C3; IT1050602B; US3998697A; NL7511128A; FR2285456B1; CA1043283A; FR2285456A1; DE2530861B2; NL169899C; BR7506071A

Description

¹¹ Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure " Priorität: 20. September 1974, Japan, Nr. 109 314/74

2-Keto-L-gulonsäure, die ein wertvolles Zwischenprodukt zur Herstellung der L-Ascorbinsäure ist, wird technisch nach dem sogenannten "Reichstein'sehen Verfahren" hergestellt. Dieses Verfahren umfaßt jedoch eine Anzahl komplexer Schritte; deshalb ist eine Verbesserung der Gesamtausbeute sehr schwierig zu erzielen. Es wurde deshalb versucht, Verfahren zu entwickeln, die eine Verminderung der Reaktionsschritte und/oder eine Verbesserung der Gesamtausbeute ermöglichen. Beispielsweise ist ein biochemisches Verfahren, bei dem 5-Keto-D-gluconsäure, ein Oxidationsprodukt der D-Glucose, zur 2-Keto-L-gulonsäure reduziert wird, und ein Verfahren der direkten Umwandlung von L-Sorbose in 2-Keto-L-gulonsäure durch Behandlung mit Mikroorganismen bekannt.

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Diese bekannten Verfahren haben zwar theoretisch bei der Verminderung der Zahl der Schritte, die zur Herstellung der 2-Keto-L-gulonsäure benötigt werden, Erfolg gehabt, aber ausnahmslos bei der tatsächlichen Verbesserung der Gesamtausbeute und der Ausführbarkeit des Betriebs des gesamten Systems versagt.

Die begleitende unvorteilhafte Fülle der entstandenen Nebenprodukte sowohl in Art als auch Quantität, die Schwierigkeit bei der Trennung des gewünschten Produkts von den Nebenprodukten, und die komplexe Verfahrensweise verhindern eine technische Verwertung dieser Verfahren.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure zur Verfugung zu stellen, das.eine Verringerung der Zahl der Reaktionsschritte, die für den Erhalt des gewünschten Produkts in den früheren Verfahren benötigt werden, zur Folge hat. Die Verbesserung hinsichtlich der Verringerung der Zahl der Reaktionsschritte ist wichtig, da sie zu einem einschrittigen Reaktionsweg für die Herstellung der 2-Keto-L-gulonsäure aus D-Glucose führt, was einem zweischrittigen Reaktionsweg für die Herstellung der L-Ascorbinsäure aus D-Glucose entspricht. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren der vorgenannten Art -zu schaffen, bei dem die Bildung unerwünschter optischer Isomere des gewünschten Produkts verhindert wird. Die Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

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Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Im erfindungsgemäßen Verfahren nimmt das Zwischenprodukt, die 2,5-Diketo-D-gluconsäure, eine Schlüsselstellung ein, da aus ihr die 2-Keto-L-gulonsäure hergestellt wird. Da dieses Zwischenprodukt gegenüber Hitze und anderer Behandlung relativ instabil ist, ist eine Verwertung der Kulturbrühe, die sowohl die Säure als auch die säureproduzierenden Zellen der Mikroorganismen enthalten,.ohne einen Isolierungsschritt oder eine andere Behandlung erwünscht, die zum Abbau der Säure führen kann.

Daneben hat die reine ungemischte Züchtung der Stämme der Mikroorganismen, die 2,5-Diketo-D-gluconsäure in 2-Keto-L-gulonsäure umwandeln können, den Nachteil, daß zusätzlich zum gewünschten Produkt das unerwünschte optische Isomere, die 2-Keto-D-gluconsäure gebildet wird. Das hat eine erschwerte Trennung des D-Isomeren vom Produkt zur Folge. Die Bildung des D-Isomeren kann allerdings durch Verwendung von Mutanten oder Varianten unterdrückt werden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können der Stamm, der die -2,5-Diketo-D-gluconsäure produziert (2,5-Diketo-D-gluconsäurebildner), und der Stamm, der die 2-Keto-L-gulonsäure produziert (2-Keto-L-gulonsäurebildner), in der gleichen Fermentationsbrühe nebeneinander existieren. Die 2,5-Diketo-D-gluconsäure, die aus D-Glucose von dem 2,5-Diketo-D-gluconsäurebildner produziert

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wird, wird im Rohzustand angereichert und kann ohne Nachteile ■durch den 2-Keto-L-gulonsäurebildner verwertet werden. Das optische Isomere, das zusätzlich zum Endprodukt durch den 2-Keto-L-gulonsäurebildner produziert wird, wird nicht in der Fermentationsbrühe angereichert. Das Nebenprodukt, die 2-Keto-D-gluconsäure wird durch den 2,5-Diketo-D-gluconsäurebildner wieder in die 2,5-Diketo-D-gluconsäure umgewandelt.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismenstamm, der die 2,5-Diketo-D-gluconsäure aus der D-Glucose produziert (nachstehend als "Stamm A" bezeichnet), gehört zu den Gattungen Acetobacter, Acetomonas und Gluconobacter. Diese drei Stämme sind nach Bergey's Manual ,of Determinative Bacteriology, 7. Auflage nicht besonders verschieden.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismenstamm, der die 2,5-Diketo-D-gluconsäure in die 2-Keto-L-gulonsäure umwandeln kann, gehört zu den Gattungen Brevibacterium und Corynebacterium (nachstehend als "Stamm B" bezeichnet) .

Beide Mikroorganismen werden mit dem D-Glucose enthaltenden Medium zusammengebracht, wobei sie während wenigstens eines Teils des gesamten Verfahrens koexistieren. Hierunter ist' prinzipiell eine Mischkultur zu verstehen, bei der beide Mikroorganismen zusammen in einem Medium wachsen, obwohl ein derartiger Ausdruck auch den Umstand umfassen soll, daß irgendein durch Umsetzen der Mikroorganismenzellen erhaltenes Produkt, z.B. Ruhezellen, lyophilisierte Zellen, immobilisierte Zellen, L 6098U/1Ü49 -I

vermahlene Zellen oder ein ausgeschiedenes und/oder aus den Zellen extrahiertes Enzym, zusätzlich zur Inkubation mit den Mikroorganismen für das Verfahren angewandt wird.

Die Mischkultur kann nach verschiedenen Methoden durchgeführt werden. Beispielsweise werden beide Arten von Mikroorganismenstämmen gleichzeitig auf das Medium zur Züchtung überimpft oder der Stamm A wird zuerst überimpft und der Stamm B wird anschließend an eine bestimmte Inkubationsdauer überimpft oder beide Stämme werden getrennt auf besondere Medien überimpft und dann nach einer bestimmten Inkubationsdauer die eine Brühe

auf einmal,
zur anderen / anteilsweise oder kontinuierlich gegeben,

wobei eine andere Inkubationszeit nachfolgt.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jedes übliche Verfahren zur Züchtung der Stämme durch Verändern der Mischmethode entsprechend den individuellen Eigenschaften des einzusetzenden Stammes angewendet werden.

Beispielsweise hängen die Mengenverhältnisse der zu überimpfenden Stämme und die Überimpfungszeiten von den Wachsturnsgeschwindigkeiten der Stämme und ihrer Fähigkeit, die 2,5-Diketo-D-gluconsäure zu produzieren sowie diese in 2-Keto-L-gulonsaure umzuwandeln, und den Eigenschaften der Nährmedien ab. In einigen Fällen können Produkte, die durch Behandlung der Zellen mit enzymatischer Aktivität erhalten wurden, teilweise als Ersatz für einen der beiden wachsenden Zellstämme benutzt werden.

L 6Q98H/1049 ^J

_ ₆_

Im folgenden sind die Stämme A und B, die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden können, einschließlich der Stämme erläutert, die öffentlich z.B. beim Institute of Fermentation in Osaka, Japan (IFO) hinterlegt sind und auf Antrag redlichen Interessenten ausgehändigt werden. Ferner ist die Taxonomie der Stämme angegeben, die aus Bodenproben isoliert und beim Fermentation Research Institute (einer Abteilung der Agency of Industrial Science and Technology, Japan) als FERM-P und bei der American Type Culture Collection als ATCC hinterlegt wurden.

Stamm A:

1. Acetomonas albosesamae* FERM-P Nr. 2439, ATCO Nr. 21998.

2. Acetobacter melanogenum IFO Nr. 3293.

■κ··*)

3. G-luconobacter rubig;inosu3 IFO Nr. 3244.

Stamm B:

1. Brevibacterium ketosoreductum ASM-1005, FERM-P- Nr. 1905,

ATCC Nr. 21914.

2. Brevibacterium nov. s£. ASM-856-4, FERM-P Nr. 2686,

ATCC Nr. 31083.

3. Brevibacterlum sp. ASM-3356-31, FERM-P" Nr. 2685,

ATCC Nr. 31082.

4. Brevibacterium testaceum IFO Nr. 12675·

5. Corynebacterium s£. ASM-3311-6, FERM-P Nr. 2687,

ATCC Nr. 31081.

6. Corynebacterium s£. ASM-20A-77, FERM-P Nr. 2770,

ATCC Nr. 31090. L 6Q98i 4/1049 -1

7. Corynebacterium s£. ASM-T-I3, FERM-P Nr. 2771,

ATCC Nr. 31089.

8« Corynebacterium s£. ASM-K-106, FERM-P Nr. 2769,

ATCC 31088.

* Bergey's Manual of Determinative Bacteriology S. 187

(7. Auflage), M.¥. Beijerinck: Cent.Bakt., 2. Abt., Bd. 29 (1911), S. 169.

** T. Asai "Acetic Acid Bacteria: Classification and Biochemical Activities" S. 46, University of Tokyo Press (Tokyo) and University Park Press (Baltimore) (I968).

*** K. Komagata et al., "New Species of Brevibacterium isolated from Rice", Nippon Nogeikagaku Kaishi, Bd. 38 (1964),

s. 496-502

Stamm A:

1. Acetomonas albosesamae (Wakisaka) ATCC Nr. 21998 A. Beobachtungen:

1. Gestalt der Zellen (Glucose-Hefe-Extrakt Schrägagar, 28°C, 3 Tage):

Stäbchen 0,6 bis 0,8 χ 1,2 bis 3,5 U mit abgerundeten Enden, vereinzelt und in schleimiger Masse vorkommend, kein Pleomorphismus, sondern nur fadenförmige Form beobachtet

2. Motilität (Glucose-Rindfleischbrühe und Weichagar, 30⁰C, 24 Stunden):

beweglich mit subpolarer Geißel, viele Zellen ohne

L Geißel" B 0 9 8 U / HU 9

3. Sporenbildung (Glucose-Hefe-Extrakt Schrägagar 28⁰C, 7 Tage):

nicht gebildet

4. Gramfärbung (Glucose-Hefe-Extrakt Schrägagar, 28⁰C, 12, 20, 36 und 72 Stunden):

negativ

5· Säurefeste Färbung (Glucose-Hefe-Extrakt-Schrägagar, 28⁰C, 72 und 360 Stunden):
negativ

B. Wachstum auf verschiedenen Medien:

1. Agarkolonien (Glucose-Hefe-Extrakt-Agar, 28⁰C, 1 bis 3 Tage):

kreisförmig, konvex, glattrandige Kolonien mit glatter Oberfläche, von durchscheinender bis opaker Dichte, grau weißer Farbe und brüchiger bis butterartiger Konsistenz

2. Schrägagar (Glucose-Hefe-Extrakt-Agar, 28⁰C, 1 bis 3 Tage):

mäßiges Wachstum, faserförmig, brüchige bis butterartige Struktur, grauweiße Wachstumsfarbe mit mattglänzender Oberfläche, durchscheinend bis etwas opake optische Dich te; im Frühstadium kein diffundierbares Pigment, aber im Endstadium blasses, gelbbraunes. Pigment beobachtet

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_ y —

3. Wachstum in einer KuItürbrühe (Emerson-Medium, 28°C, 1 bis 3 Tage):

im Frühstadium mäßiges, flockenartiges Wachstum, in der oberen Schicht keine Hautbildung

4. Fleischbrühe-Gelatine-Stich (27⁰C, 1 bis 30 Tage): spärliches Wachstum, keine Verflüssigung

5. Lakmusmilch:

schnelle Säurebildung unter Reduktion des Lakmus, keine Peptonisation* beobachtet

C. Physiologische Eigenschaften (beziehen sich auf Beobachtungsergebnisse bei 28⁰C und 1 bis 7-tägiger Inkubation, wenn nicht anders angegeben):

1. Nitritbildung aus Nitrat: positiv

2. Methylrot-Reaktion: positiv

3· Voges-Proskauer-Reaktion: negativ

4. Indolbildung: negativ .

5. Schwefelwasserstoffbildung (Bleipapiermethode): positiv

6. Stärkehydrolyse: negativ

7. Verwertung von Citrat als einziger Kohlenstoffquelle (Simmons-Medium 28⁰C, 1 bis 3 Tage): negativ

8. Ureasetest (28°C, 1 bis 3 Tage): positiv

9. Katalasetest (Glucose-Hefe-Extrakt-Schrägagar 28°C, 1 Tag): positiv

10. Temperatureinfluß (Emerson Medium, 1 Tag):

Wachstum bei 10 bis 45⁰C, Wachstumsoptimum bei 25 bis 35°C

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11. pH-Einfluß (Glucose-Fleischbrühe 28⁰C, 1 Tag): optimaler pH-Bereich des Wachstums: 6,0 bis 8,0, kein Wachstum beim pH-Wert von 2,55, dagegen leichtes Wachstum beim pH-Wert von 4,38

12. Sauerstoffbedarf: (Mannit-Hefe-Extrakt-Weichagar 28⁰C, 3 Tage): aerob

13. Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern:

a. Nur Säurebildung: L-Arabinose, D-Xylose, L-Raffinose, D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, D-Fructose, Maltose, Lactose, Glycerin, Mannit, Sorbit und Salicin; schwache Säurebildung aus Sorbit

b. Weder Säure noch Gasbildung: Sucrose, Stärke und Inulin

14. Säurebildung aus Äthanol (Hefe-Extrakt-Pepton 27⁰C): Sehr schwache Säurebildung bei Zusatz von 1,92^ wäßrigem Äthanol zum Medium, keine Säurebildung bei Zusatz von 3,5 und 7,5 % wäßrigem Äthanol.

Die Prüfung der vorstehend genannten Eigenschaften wurde, wenn nicht anders angeführt, anhand der Beschreibung in "Manual of Microbiological Methods" (1957), McGraw-Hill Books Co. Inc. (herausgegeben von der Society of American Bacteriologists) durchgeführt.

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_i

• Stamm B:

1. ASM-1005 Stamm, ATCC 21914 Ao Beobachtungen:

1. Form der Zellen (Fleischbrühe-Schrägagar und Fleischbrühe, 30⁰C, 3 Tage):

Stäbchen, 0,4 bis 0,7 x 0,8 bis 1,4 u, vereinzelt oder paarweise mit abgerundeten Enden vorkommend. Schnappende Teilung, aber keine Verzweigung beobachtet

2. Motilität: beweglich mit monotricher Geißel

3. Sporenbildung: nicht gebildet

4. Gramfärbung (Fleischbrühe-Schrägagar 30°C, 7 Tage): ' positiv

5. Säurefestigkeit: negativ

B. Wachstum auf verschiedenen Medien:

1. Fleischbrühe-Agarkolonie (30⁰C, 24 bis 48 Stunden): kreisförmig, glatt, glattrandig, konvex, glänzend, durchscheinend, orangegelb

2. Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur (3O⁰C, 24 bis 72 Stunden): mäßiges Wachstum, faserförmig, butterartig, orangegelb bis orange.

3. Fleischbrühe (30⁰C, 7 Tage):

mäßig trüb, membranartiges Oberflächenwachstum, viskoses Sediment, kein Geruch -

4. Fleischbrühe-Gelatine-Stich:

Verflüssigung: bei 20⁰C erst nach 2 Tagen eine leichte Verflüssigung, nach 7 Tagen eine sackförmige Vertiefung (etwa 4 mm Durchmesser und 7 mm Tiefe), bei 25°C und _L 30⁰C eine ausgeprägtere Verflüssigung feststellbar _J

6Q98U/1CU9 "

5. Lakmusmilch (3O°C, 14 Tage): sauer, leicht koaguliert

6. Kartoffelschrägkultur (30⁰C, 14 Tage): geringes Wachstum, blaßorangegelb glänzend

7. Fleischbrühe-D-Gluconat-Schrägagar (30⁰C, 72 Stunden): reichliches Wachstum, faserförmig, viskos hellorangegelb glänzend

C. Physiologische Eigenschaften (wenn nicht anders angegeben, beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach I4tägiger Züchtung bei 30⁰C):

1. Nitrit aus Nitrat: negativ

2. Denitrifikation: weder Wachstum noch Gasbildung in einem mit Paraffin verschlossenem Nährboden aus Fleischbrühe beobachtet

3. Methylrot-Test: positiv

4. Voges-Proskauer-Reaktion: negativ

5. Indolbildung: negativ

6. Schwefelwasserstoffbildung: positiv

7. Ammoniak: schwach positiv

8. Stärkehydrolyse: negativ 9· Wachstum auf Citratmedium:

a) Koser-Medium: spärliches Wachstum

b) Christensen-Medium: Wachstum

10. Wachstum in Gegenwart-anorganischer Stickstoffquellen:

a) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium): kein Wachstum

b) Nitrat-Glucose-Dimmick-Medium: leichte Gelbfärbung des Mediums

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11. Pigment "bildung: negativ

12. Urease: positiv

13· Katalase-Test: positiv

14. Oxidase-Test (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur, 18 bis 24 Stunden, Tetramethy!phenylendiamin): schwach positiv

15. Temperatureinfluß:

a) Wachstum im Temperaturbereich von 10 bis 40 C, kein Wachstum bei 4°C und 45°C

b) optimales Wachstum bei 28 bis 35⁰C

16. pH-Einfluß

a) Wachstum beim pH-Wert von 5,0 bis 10,0

b) optimales Wachstum bei 6,0 bis 8,0.

17. Sauerstoffbedarf: fakultativ

a) mit Paraffin verschlossene Stichkultur färbt sich einheitlich gelb (30°C, 7 Tage, Glucose-BCP-Medium).

b) Wachstum wird nach der Shotensack-Methode nach Inkubation von 16 Tagen beobachtet

18. O-F-Test (Hugh-Leifson-Methode):

Anaerobe Säurebildung aus D-Glucose, weder Säure noch Gasbildung aus Lactose

19. Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern (Barsiekow-Medium): '

a) Nur Säurebildung aus D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Sucrose, Trehalose, b-Mannit und Glycerin (schwach)

b)'Weder Säure- noch Gasbildung aus L-Arabinose, Lactose, D-Sorbit, Inosit und Stärke

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20. Cellulose (Peptonwasser und mikrokristalline Cellulose): nicht hydrolysiert

21. Methylenblau (Fleischbrühe, 18 bis 24 Stunden): reduziert

22. D-Gluconsäure: verwertet

23· 2-Keto-D-gluconsäure: schwach verwertet

D. Herkunft: Bodenproben.

Der Vergleich der vorstehend genannten taxonomen Eigenschaften mit den Angaben in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7. Auflage) (nachstehend als "Manual?' bezeichnet) läßt den Schluß zu, daß der genannte Stamm zur Gattung Brevibacterium gehört, da er fakultativ aerob oder anaerob ist, aus gram-positiven kurzen Stäbchen besteht, keine Sporen bildet und eine schnappende Zellteilung, aber keine Verzweigungen aufweist.

Der Stamm zeigt gewisse Übereinstimmungen mit den Angaben des Manual für Brevibacterium acetylicum. Aufgrund der folgenden Beobachtungen wird angenommen, daß eine enge Verwandtschaft zur letztgenannten Spezies hinsichtlich nachfolgender Eigenschaften besteht: Beweglich, Gelatineverflüssigung, orangegelbe bis orange Färbung auf Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur und schwaches Wachstum unter blaßorange-gelber Färbung auf Kartoffel-Agar-Schrägkultur.

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Jedoch unterscheidet sich der Stamm aufgrund der nachstehend genannten taxonoraen Eigenschaften stark von der in- Manual angegebenen Beschreibung für Brevibacterium acetylicum: Eigenschaften, der Kolonien und der Kulturen auf Fleischbrühe., saure Reaktion mit Lakmusmilch und schwache Koagulierung der Lakmusmilch, keine Peptonisierung, keine Stärkehydrolyse, relativ hohes Temperaturoptimum bei 28 bis 35°C und negative Voges-Proskauer-Reaktion.

Da die Eigenschaften des Stammes auch nicht mit denen von anderen bekannten Spezies dieser Gattung übereinstimmen, wird er als neuer Stamm angesehen und mit Brevibacterium ketosoreductum nov. sp. bezeichnet.

Stamm B:

2. ASM-856-4-Stamm, ATCC Nr. 31083

Dieser Stamm besitzt zwei Arten von Kolonien: eine glatte und eine aufgerauhte Kolonie auf Fleischbrühe-Agar. Hauptsächlich sind die Kolonien glatt, wobei Übergang von glatten zu aufgerauhten Kolonien und umgekehrt beobachtet wird.

Soweit nicht anders angegeben, beziehen sich die nachstehend aufgeführten Daten auf die allgemeinen Charakteristiken beider Kolonien.

B 0 9 8 U / 1 Ü A 9.

A. Beobachtung:

1. Form der Zellen (Fleischbrühe-Schrägagar-Kultur und Fleischbrühe 30⁰C, 2 Tage):

Kurze Stäbchen von 0,6 bis 0,8 χ 1,2 bis 1,6^u mit abgerundeten Enden, vereinzelt oder paarweise vorkommend, schnappende Teilung, aber keine Verzweigung beobachtet

2. Motilität: nicht beweglich

3. Sporenbildung: nicht gebildet

4. Gram-Färbung: (Fleischbrühe-Schrägagar-Kultur- 30⁰C, 7 Tage): positiv

5. Säurefestigkeit: negativ

B. Wachstum auf verschiedenen Medien:

1. Fleischbrühe-Agar-Kolonien (30°C, 24 bis 48 Stunden):

a) Glatte Kolonie: kreisförmig, glatt, glattrandig, sich ausbreitend oder erhaben, glänzend, durchscheinend und schwach gelb

b) aufgerauhte Kolonie: kreisförmig, aufgerauht, wellig, sich ausbreitend, matt, durchscheinend und etwas gelb

2. Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur (3O⁰C, 24 bis 72 Stunden): mäßiges Wachstum, faserförmig und butterartig, blaßgelb.

3. Fleischbrühe (30⁰C, 7 Tage):

a) glatte Kolonie: leicht trüb, kein Oberflächenwachstum, schuppenartiges Sediment ohne Geruch

b) aufgerauhte Kolonie: klar, kein Oberflächenwachstum, flockiges Sediment ohne Geruch

4. Fleischbrühe-Gelatine-Stich (20°C und 30⁰C, 21 Tage): keine Verflüssigung

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B 0 9 8 U / 1 Q 4 a

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5. Lakmusmilch (3O⁰C, 21 Tage):

a) glatte Kolonie: schwach sauer

b) aufgerauhte Kolonie: schwach sauer in der oberen Schicht, Koagulierung und Reduktion in der unteren Schicht, keine Peptonisierung

6. Kartoffel-Schrägkultur (3O⁰C, 14 Tage):

mäßiges Wachstum, faserförmig, glänzend und leicht rötlichgelb

C. Physiologische Eigenschaften (sofern nicht anders angegeben, beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach 14 Tagen bei 30⁰C):

1. Nitritbildung aus IJitrat: negativ

2. Denitrifikation (mit Paraffin verschlossene Fleischbrühe, die 1 % KNO₃ enthält): negativ

3. Methylrot-Test: negativ

4. Voges-Proskauer-Reaktion: negativ

5. Indolbildung: negativ

6. Schwefelwasserstoffbildung: positiv

7. Ammoniakbildung: negativ

8. Stärkehydrolyse: positiv

9. Wachstum auf Citratmedien:

a) Koser-Medium: kein Wachstum

b) Simmcns-Medium: kein Wachstum

c) Christensen-Medium: Wachstum

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10. Wachstum in Gegenwart anorganischer Stickstoffquellen:

a) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium mit Zugabe eines Vitamingemischs): Wachstum

b) Nitrat (Glucose-Dimmick-Medium mit Zusatz eines Vitamingemischs) : Wachstum

11. Pigmentbildung: negativ 12« Urease-Test: negativ

13. Katalase-Test: positiv

14. Oxidase-Test: (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur, 18 bis 24 Stunden, Tetramethylphenylendiamin): positiv

15'. Temperatureinfluß:

a) Wachstum (72 Stunden) bei 10 bis 4O⁰C, kein Wachstum bei 5°C und, 45°C

b) Optimales Wachstum (24 Stunden) bei 20 bis 35°C

16. pH-Einfluß

a) Wachstum (72 Stunden) beim pH-Wert von 5,0 bis 10,0

b) Optimales Wachstum (24 Stunden) beim pH-Wert von 6,0 bis 7,0

17. Sauerstoffbedarf: aerob

18. O-F-Test (Hugh-Leifson-Methode):

Anaerobe Säurebildung aus D-Glucose. Die obere Schicht der mit Paraffin verschlossenen Stichkultur wird leicht gelb gefärbt. Keine Säure- und Gasbildung aus Lactose.

19. Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern: (Barsiekow-Medium):

a) glatte Kolonie:

i. Nur Säurebildung aus L-Arabinose, D-Xylose,

D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose,

. Maltose, Sucrose, D-Mannit. j

6098 U/1043-

ii. Weder Säure- noch Gasbildung aus Lactose,

Trehalose, D-Sorbit, Inosit, Glycerin und Stärke,
b) aufgerauhte Kolonie:

i. Nur Säurebildung aus D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose (schwach) und D-Mannit

ii. Weder Säure- noch Gasbildung aus L-Arabinose,

D-Xylose, Trehalose, D-Sorbit, Inosit, Glycerin und Stärke.

20. Cellulose (Peptonwasser und mikrokristalline Cellulose): nicht hydrolysiert.

21. Methylenblau (Flei-schbrühe, 18 bis 24 Stunden): nicht reduziert

22. D-Gluconsaureverwertung: verwertet

23. 2-Keto-D-gluconsaureverwertung: verwertet.

D. Herkunft: Bodenproben.

Der Vergleich der vorgenannten taxonomen Eigenschaften mit der Beschreibung im Manual läßt aufgrund folgender Feststellungen den Schluß zu, daß der Stamm zur Gattung Brevibacterium gehört: Gram-positiv, kurze Stäbchen, ohne Sporenbildung und schnappende Zellteilung, aber keine Verzweigungen.

Jedoch ist in der Gattung Brevibacterium, wie sie im Manual beschrieben ist, die einschlägige Spezies nicht beschrieben. Der Mikroorganismus wird deshalb als neuer Stamm angesehen.

L ' ^J

Stamm B:

3. ASM-3356-31 Stamm, ATCC-Nr. 31082

A. Beobachtungen:

1. Form der Zellen (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur und Fleischbrühe, 30°C, 2 Tage):

kurze Stäbchen von 0,7 bis 0,9 x 0,9 bis 1,6 μ mit abgerundeten Enden, vereinzelt oder paarweise vorkommend, schnappende Zellteilung, aber keine Verzweigung beobachtet.

2. Motilität: beweglich mit einer Geißel 3· Sporenbildung: nicht gebildet

4. Gram-Färbung (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur, 30⁰C, 7 Tage): positiv

5. Säurefestigkeit: negativ

B. Wachstum auf verschiedenen Medien:

1. Fleischbrühe-Agar-Kolonien (30⁰C, 24 bis 28 Stunden); kreisförmig, glatt, glattrandig, sich ausbreitend, glänzend, durchscheinend und lebendig orange.

2. Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur:

reichliches Wachstum, faserförmig, butterartig und kräftig orange

3. Fleischbrühe (30⁰C, 7 Tage):

mäßig trüb, membranartiges Oberflächenwachstum, flockiges Sediment, ohne Geruch.

SG98UM049

4. Fleischbrühe-Gelatine-Stich (2O⁰C und 3O⁰C): Verflüssigung! bei 20⁰C leichte Verflüssigung nach 3 Tagen beobachtet, sehr langsam fortschreitend, schichtförmig am und nach dem 12. Tag, etwa 8 mm tief; bei 30⁰C weitgreifendere Verflüssigung beobachtet, schneller fortschreitend.

5. Lakmusmilch (3O⁰C, 25 Tage):

schwach angesäuert und koaguliert, stark peptonisiert.

6. Kartoffel-Schrägkultur (30⁰C, 7 Tage):

mäßiges Wachstum, faserförmig, glänzend und hellorange.

C. Physiologische Eigenschaften (wenn nicht anders angegeben beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach 14 Tagen bei 30⁰C):

1. Nitritbildung aus Nitrat: negativ

2. Denitrifikation (mit Paraffin verschlossene Fleischbrühe, die 1 % KNO, enthält): negativ

3. MethyIrot-Test: positiv

4. Voges-Proskauer-Reaktion: negativ

5. Indolbildung: negativ

6. Schwefelwasserstoffbildung: positiv

7. Ammoniakbildung: negativ

8. Säurehydrolyse: negativ

9· Wachstum auf Citratmedien:

a) Koser-Medium: kein Wachstum

b) Simmons-Medium: kein Wachstum ·

c) Christens en-Medium: Wachs tum.

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10. Wachstum in Gegenwart von anorganischen Stickstoffquellen:

a) Ammonium-(Glucose-Hucker-Medium mit Zusatz eines Vitamingemischs): Wachstum

b) Nitrat:(Glucose-Dimmick-Medium mit einem Zusatz eines Vitamingemischs): Wachstum.

11. Pigmentbildung: negativ

12. Urease-Test: negativ 13· Katalase-Test: positiv

14. Oxidase-Test (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur, 18 bis

24 Stunden, Tetramethylphenylendiamin): positiv 15· Temperatureinfluß:

a) Wachstum (72 Stunden) bei 10 bis 38⁰G, kein Wachstum bei 5°C und 43°C

b) optimales Wachstum (24 Stunden) bei 20 bis 37°C.

16. pH-Einfluß:

a) Wachstum (72 Stunden) beim pH-Wert von 5,0 bis 11,0

b) optimales Wachstum (24 Stunden) beim pH-Wert von 6,0 bis 8,0.

17. Sauerstoffbedarf: Aerob (eine mit Paraffin verschlossene Stichkultur wird in der gesamten Schicht gelb gefärbt; kein Wachstum unter anaeroben Bedingungen, nach der modifizierten von Kovacs-Zorkoczy-Methode behandelt)".

18. O-F-Test (Hugh-Leifson-Methode): Anaerobe Säurebildung aus D-Glucose und Lactose (die gesamte Schicht der mit Paraffin verschlossenen Stichkultur wird gelb gefärbt).

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19· Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern (Barsiekow-Medium):

a) Nur Säurebildung aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose, Trehalose und D-Mannit.

b) Weder Säure- noch Gasbildung aus D-Sorbit, D-Inosit, Glycerin und Stärke.

20. Cellulose (Pepton-Wasser und mikrokristalline Cellulose): nicht hydrolysiert.

21. Methylenblau (Fleischbrühe, 18 bis 24 Stunden): reduziert.

22. D-Gluconsäure-Verwertung: verwertet

23. 2-Keto-D-gluconsäur.e-Verwertung: verwertet.

D. Herkunft: Bodenproben.

Der Vergleich der vorgenannten taxonomisehen Eigenschaften mit der Beschreibung in Manual läßt aufgrund folgender Feststellung den Schluß zu, daß der Stamm zur Gattung Brevibacterium gehört: Gram-positive kurze Stäbchen ohne Sporenbildung mit schnappender Zellteilung.

Bei einem Vergleich der Eigenschaften dieses Stammes mit "denen des vorstehend beschriebenen Stammes Nr. ASM-1005 wird dieser Stamm ASM-3356-31 als eine Variante von Brevibacterium ketosoroduetum angesehen, da beide Stämme hinsichtlich ihrer Eigenschaften gewisse Übereinstimmung mit Ausnahme des unterschiedlichen Verhaltens bei der Lakmusmilch-, Sauerstoff- und

L -J

609814/1049

Harnstoff-Reaktion sowie der Reaktion gegenüber Zuckern (L-Arabinose, Lactose und Glycerin) zeigen.

Stamm B:

5. Stamm ASM-3311-6, ATCC Nr. 31081

A. Beobachtungen:

1. Form der Zellen (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur und Fleischbrühe 30⁰C, 2 Tage):

Stäbchen von 0,8 bis 1,0 χ 1,2 bis 2,1 μ mit abgerundeten Enden, vereinzelt oder paarweise vorkommend, schnappende Zellteilung, Pleomorphismus; Verzweigung und Stäbchen mit verdickten Enden in bestimmten Wachstumsphasen beobachtet.

2. Motilität: beweglich mit einer Geißel

3. Sporenbildung: nicht gebildet

4. Gram-Färbung (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur 30⁰C, 7 Tage): positiv

5. Säurefestigkeit: negativ

B. Wachstum in verschiedenen Medien:

1. Fleischbrühe-Agar-Kolonien (30⁰C, 24 bis 48 Stunden): kreisförmig, glatt, glattrandig, mit einem Umbo (Kuppe) versehen, glänzend, durchscheinend und hell rötlichgelbe Farbe.

2. Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur (30⁰C, 24 bis 72 Stunden): Reichliches Wachstum, faserförmig, butterartig und breite rötlichgelbe Farbe.

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3. Fleischbrühe (3O⁰C, 7 Tage): leicht trüb, flockiges Sediment; am und nach dem-7. Tag der Züchtung wird ringförmiges Oberflächenwachstum an der Wand des Teströhrchens beobachtet. Keine Geruchsbildung.

4. Fleischbrühe-Gelatine-Stich (20⁰C und 30⁰C):
Verflüssigung: bei 20⁰C wird Verflüssigung am und nach
dem 6. Tag (sehr langsam fortschreitend) beobachtet, wird am und nach dem 16. Tag schichtenförmig, ungefähr 5 mm
tief; bei 30⁰C wird eine weitgreifendere Verflüssigung beobachtet, die schneller fortschreitet.

5. Lakmusmilch (30⁰C, 25 Tage): unverändert

6. Kartoffel-Schrägkultur (30⁰C, 14 Tage): Reichliches
Wachstum, faserförmig, glänzend und lebendig gelblichorange Farbe.

C. Physiologische Eigenschaften (soweit nicht anders angegeben, beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach 14 Tagen bei 30⁰C):

1. Nitritbildung aus Nitrat: negativ

2. Denitrifikation (mit Paraffin verschlossene Fleischbrühe, die 1 % KnO, enthält): negativ.

3. Methylrot-Test: negativ

4. Voges-Proskauer-Reaktion: negativ

5. Indolbildung: negativ

6. Schwefelwasserstoffbildung: positiv

7. Ammoniakbildung: negativ

8. Stärkehydrolyse: positiv

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9. Wachstum auf Citratmedien:

a) Koser-Medium: kein Wachstum

b) Simmons-Medium: kein Wachstum

c) Christensen-Medium: Wachstum

10. Wachstum in Anwesenheit von anorganischen Stickstoffquellen:

a) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium unter Zusatz eines Vitamingemischs): Wachstum

b) Nitrat (Glucose-Dimmick-Medium unter Zusatz eines Vitamingemischs): Wachstum

11. PigmentMldung: negativ

12. Urease-Test: negativ 13· Katalase-Test: positiv

14. Oxidase-Test (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur, 18 bis

24 Stunden, Tetramethylphenylendiamin): positiv 15· Temperatureinfluß:

a) Wachstum (72 Stunden) bei 10 bis 40⁰C, kein Wachstum bei 5⁰C und 45⁰C

b) optimales Wachstum (24 Stunden) bei 15 bis 35°C

16. pH-Einfluß

a) Wachstum (72 Stunden) bei einem pH-Wert von 5,0 bis 11,0

b) optimales Wachstum (24 Stunden) beim pH-Wert von 8,0 bis 9,0

17. Sauerstoffbedarf: aerob

18. O-F-Test (Hugh-Leifson-Methode): Säure wird nur aerob aus D-Glucose gebildet; negativ gegen Lactose.

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19. Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern (Barsiekow-Medium):

a) Nur Säurebildung aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Fructose, D-Mannose, D-Galactose, Maltose, Sucrose, Trehalose, D-Mannit und Glycerin

b) weder-Säure- noch Gasbildung aus Lactose, Innosit, D-Sorbit und Stärke.

20. Cellulose (Peptonwasser und mikrokristalline Cellulose: nicht hydrolysiert.

21. Methylenblau (Fleischbrühe, 18 bis 24 Stunden): nicht reduziert.

22. D-Gluconsäureverwertung: verwertet.

23. 2-Keto-D-gluconsäur-everv,rertung: verwertet.

24. Milchsäure (Glucose Fleischbrühe, 48 und 96 Stunden): nicht aus D-Glucose gebildet.

25. Hitzeverträglichkeit (lOprozentige entrahmte Milch-Lösung, 72°C, 10 Minuten): negativ.

D. Herkunft: Bodenproben.

Der Vergleich der vorgenannten taxonoraisehen Eigenschaften mit der Beschreibung im Manual läßt aufgrund folgender Feststellungen den Schluß zu, daß der Stamm zur Gattung Corynebacter'ium gehört: Gram-positive, kurze Stäbchen ohne Sporenbildung, mit schnappender-Zellteilung,Pleomorphismus der Verzweigung und Stäbchen mit verdickten Enden, keine Fähigkeit zur Hydrolyse von Cellulose und zur Milchsäurebildung und ohne Hitzeverträglichkeit.

L -J

S 0 9 B H / 1 0 4 9

Aus diesen Gründen wird der erfindungsgemäße Stamm als Corynebacterium sp. Nr. ASM 3311-6 bezeichnet.

Stamm B:

6. ASM-2OA-77 Stamm, ATCC Nr. 31090

A. Beobachtungen:

1. Form der Zellen (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultüren und Fleischbrühe 30⁰C, 2 Tage):

Stäbchen von 0,6 bis 0,8 χ 0,9bis2,1 u vereinzelt oder paarweise mit abgerundeten Enden vorkommend, schnappende Zellteilung, Verzweigung und Stäbchen mit verdickten Enden beobachtet.

2. Motilität: nicht beweglich

3. Sporenbildung: nicht gebildet

4. Gram-Färbung (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur 30°C, 7 Tage): gram-variabel

5. Säurefestigkeit: negativ

B. Wachstum auf verschiedenen Medien:

1. Fleischbrühe-Agar-Kolonien (30⁰C, 24 bis 48 Stunden): Kreisförmig, glatt, glattrandig, konvex, glänzend, durchscheinend und hellgelbe Farbe.

2. Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur (30⁰C, 24 bis 72 Stunden): reichliches Wachstum-, faserförmig, butterartig und hellgrünlichgelbe Farbe.

3. Fleischbrühe (30⁰C, 7 Tage): leicht trüb, Wachstum einer Oberflächenmembran innerhalb von 4 Tagen beobachtet, schuppenartiges Sediment, keine Geruchsbildung.

^L j

S098U/1049

4. Fleischbrühe-Gelatine-Stich: Verflüssigung: bei 20⁰C wird leichte Verflüssigung am 14. Tag beobachtet, wechselt dann von der Trichterform zur Schichtnorm auf der ausgebreiteten Kultur; bei 30⁰C wird ausgeprägte Verflüssigung beobachtet.

5. Lakmusmilch (3O⁰C, 21 Tage):

Die Peptonisierung beginnt am 11. Tag und ist .nach 3 Wochen vervollständigt. Der pH-Wert wird im Frühstadium der Züchtung leicht alkalisch und dann im Spätstadium sauer. Das Lakmus wird in der unteren Schicht reduziert. Es wird Wachstum einer Oberflächenmembran und leicht gelbes Sediment, dagegen keine Koagulation beobachtet.

6. Kartoffel-Schrägkultur (30⁰C, 14 Tage): reichliches Wachstum, hell- grünlichgelb glänzend.

C. Physiologische Eigenschaften (soweit nicht anders angegeben, beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach 14 Tagen und 30⁰C):

1. Nitritbildung aus Nitrat: negativ

2. Denitrifikation: weder Wachstum noch Gasbildung in mit Paraffin verschlossener Fleischbrühe, die 1 % KNO, enthält.

3. Methylrot-Test: negativ

4. Voges-Proskauer-Reaktion: negativ

5. Indolbildung: negativ

6. Schwefelwasserstoffbildung: negativ

7. Ammoniakbildung: negativ

8. Säurehydrolyse: hydrolysiert.

609814/1049

9. Wachstum auf Citratmedien:

a) Koser-Medium mit Zusatz eines Vitamin-Gemische; kein Wachstum.

b) Simmons-Medium mit Zusatz eines Vitamin-Gemischs: Wachstum

c) Christensen-Medium mit Zusatz eines Vitamin-Gemischs: Wachstum.

10. Wachstum in Anwesenheit anorganischer Stickstoffquellen:

a) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium mit Zusatz eines Vitamin-Gemischs): Wachstum.

b) Nitrit (Glucose-Dimmick-Medium mit Zusatz eines Vitamin-Gemischs) : Wachstum

11. Pigmentbildung: negativ

12. Urease-Test: negativ

13. Katalase-Test: positiv

14. Oxidase-Test (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur, 18 bis 24 Stunden, Tetramethylphenylendiamin): positiv

15. Temperatureinfluß:

a) Wachstum (72 Stunden) bei 10 bis 38°C

b) Optimales Wachstum (24 Stunden) bei 23 bis 28°C

16. pH-Einfluß:

a) Wachstum (72 Stunden) beim pH-Wert von 6,0 bis 10,0

b) Optimales Wachstum (24 Stunden) beim pH-Wert von 7,0 bis 8,0

17. Sauerstoffbedarf: aerob

18. O-F-Test (Hugh-Leifson-Methode):

Nur aerobe Säurebildung aus D-Glucose, dagegen weder

Säure- noch Gasbildung aus Lactose.

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19· Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern (Barsiekow-Medium):

a) nur Säurebildung aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Sucrose und Stärke

b) ¥eder Säure- noch Gasbildung aus Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit und Glycerin.

21. Methylenblau (Fleischbrühe 18 bis 24 Stunden): reduziert

22. D-Gluconsäureverwertung: verwertet

23. 2-Keto-D-gluconsäure-Verwertung: leicht verwertet.

Stamm B;

7. ASM-T-13 Stamm, ATCC 31089

A. Beobachtungen:

Stäbchen von 0,8 bis 0,9 x 1,0 bis 1,3 u, vereinzelt oder paarweise mit abgerundeten Enden vorkommend, schnappende Zellteilung, Verzweigung und Stäbchen mit verdickten Enden beobachtet.

2. Motilität: nicht beweglich.

3. Sporenbildung: nicht gebildet

4. Gram-Färbung (Fleischbrühe-Agar-Schrägkulturen 30⁰C, 7 Tage): positiv

5. Säurefestigkeit: negativ

-J S098U/1Q49

Γ Π

B. Wachstum auf verschiedenen Medien:

1. Fleischbrühe-Agar-Kolonien (3O°C, 24 Ms 48 Stunden): kreisförmig, glatt, glattrandig, kovex, glänzend, durchscheinend und hell gelblichorange Farbe

2. Fleischbrühe-Agar-Schrägkulturen (3O⁰C, 24 bis 72 Stunden): mäßiges Wachstum, faserförmig, butterartig und hell rötlichgelbe Farbe.

3. Fleischbrühe (30⁰C, 7 Tage):

leicht trüb, kein Oberflächenwachstum beobachtet, flockiges bis schuppenartiges Sediment, keine Geruchsbildung

4. Fleischbrühe-Gelatine-Stich: keine Verflüssigung

5. Lakmusmilch (30⁰C, j21 Tage):

Innerhalb von 4 Tagen unverändert; nach 8 Tagen alkalisch und sehr schwach koaguliert; am und nach dem 16.Tag wird das Lakmus völlig und einheitlich reduziert, sehr schwach peptonisiert und nicht koaguliert.

6. Kartoffel-Schrägkultur (30°C, 14 Tage): mäßiges Wachstum, leuchtend gelb glänzend.

C. Physiologische Eigenschaften (soweit nicht anders angegeben, beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach Tagen bei 30°C):

1. Nitritbildung aus Nitrat: negativ

: 2. Denitrifikation: weder Wachstum noch Gasbildung in einer mit Paraffin verschlossenen Fleischbrühe, die 1 % KNO, enthält
3. Methylrot-Test: negativ

L . J

609814/1Q49

4. Voges-Proskauer-Reaktion: negativ

5. Indolbildung: negativ

6. Schwefelwasserstoffbildung: negativ

7. Ammoniakbildung: negativ

8. Säurehydrolyse: schwach hydrolysiert

9. Wachstum auf Citratmedien:

a) Koser-Medium mit Zusatz eines Vitamin-Gemischs: kein Wachstum

b) Simmons-Medium mit Zusatz eines Vitamin-Gemischs: kein Wachstum

c) Christensen-Medium: Wachstum

10. Wachstum in Gegenwart von anorganischen Stickstoffquellen:

a). Ammonium (Glucose-Hucker-Mediuni unter Zugabe eines

Vitamin-Gemischs): kein Wachstum b) Nitrat (Glucose-Dimmick-Medium mit Zugabe eines

Vitamin-Gemischs): kein Wachstum

11. Pigmentbildung: negativ

12. Urease-Test: negativ

13. Katalase-Test: positiv

14. Oxidase-Test: (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultur 18 bis 24 Stunden, Tetramethylphenylendiamin): positiv

15- Temperatureinfluß:

a) Wachstum (72 Stunden) bei 10 bis 38⁰C

b) Optimales Wachstum (24 Stunden) bei 23 bis 28°C 16. pH-Einfluß:

a) Wachstum (72 Stunden) beim pH-Wert von 6,0 bis 8,0

b) Optimales Wachstum (24 Stunden) bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,0.

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17. Sauerstoffbedarf: aerob

18. O-F-Test (Hugh-Leifson-Methode):

Sowohl aerobe leichte Säurebildung aus D-Glucose (Die oben liegende Schicht der mit Paraffin verschlossenen Stichkultur schlägt wie eine normale Stichkultur nach Gelb um), aber keine Säure-Gasbildung aus Lactose.

19. Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern (Barsiekow-Medium):

a) Nur Säurebildung aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit (schwach), D-Mannit, Sucrose und Glycerin

b) Weder Säure- noch Gasbildung aus Inosit und Stärke.

21. Methylenblau (Fleischbrühe 18 bis 24 Stunden): nicht reduziert

22. D-Gluconsäure-Verwertung: leicht verwertet

23· 2-Keto-D-gluconsäure-Verwertung: leicht verwertet

Stamm B, 8. ASM-K-106-Stamm, ATCC Nr. 31088 A. Beobachtungen:

1. Forin der Zellen (Fleischbrühe-Agar-Schrägkulturen und Fleischbrühe, 30⁰C, 2 Tage):

Stäbchen von 0,6 bis 0,7 x 1,0 bis 1,3 u, einzeln und paarweise mit abgerundeten Enden vorkommend, schnappende Zellteilung, Verzweigung und Stäbchen mit verdickten Enden beobachtet

_l 609814/1049

2. Motilität: nicht beweglich

3. Sporenbildung: nicht gebildet

4. Gram-Färbung (Fleischbrühe-Agar-Schrägkultüren, 30⁰C, 7 Tage): positiv

5. Säurefestigkeit: negativ

B. Wachstum auf verschiedenen Medien:

1. Fleischbrühe-Agar-Kolonien (30⁰C, 24 bis 48 Stunden): kreisförmig, glatt, glattrandig, erhaben, glänzend, durchscheinend und leuchtend gelb

Z. Fleischbrühe-Agar-Schrägkultür (30⁰C, 24 bis 48 Stunden) : reichliches Wachstum, faserförmig, butterartig und leuchtend grünstichig gelbe Farbe

3. Fleischbrühe (30⁰C, 7 Tage):

leicht trüb, innerhalb 4 Tagen Wachstum einer Oberflächenmembran beobachtet, schuppenförmiges Sediment, keine Geruchsbildung.

4. Fleischbrühe-Gelatine-Stich:
Verflüssigung: Bei 20⁰C leichte Verflüssigung am 14. Tag beobachtet, wechselt von der Schichtform zur Trichterform auf ausgebreiteter Kultur; bei 30°C ausgeprägte Verflüssigung beobachtet.

5. Lakmusmilch (30⁰C, 21 Tage):

Peptonisierung beginnt am 11. Tag und ist nach 3 Wochen vollendet. Im Frühstadium der Züchtung ist der pH-Wert leicht alkalisch und im Endstadium sauer« Das Lakmus wird in der unteren Schicht reduziert. Es wird Wachstum einer Oberflächenmembran und hellgelbes Sedi-

ment, dagegen kerne Koagulation beobachtet. ^L

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ι - 253Ö861

6. Kartoffel-Schrägkultur (3O⁰C, 14 Tage):

reichliches Wachstum,- leuchtend gelb glänzend.

C. Physiologische Eigenschaften (soweit nicht anders angegeben, beziehen sich die Ergebnisse auf Beobachtungen nach 14 Tagen bei 3O⁰C);

1. Nitritbildung aus Nitrat: positiv

2. Denitrifikation: Weder Wachstum noch Gasbildung auf mit Paraffin verschlossener Fleischbrühe, die 1 % KNO^ enthält

3. Methylrot-Test: negativ

4. Voges-Proskauer-Reaktion: negativ

5. Indolbildung: negativ

6. Schwefelwasserstoffbildung: negativ

7. Ammoniakbildung: negativ

8. Stärkehydrolyse: hydrolysiert.

9. Wachstum auf Citratmedien:

a) Koser-Medium unter Zusatz eines Vitamin-Gemischs: kein Wachstum

b) Simmons-Medium unter Zusatz eines Vitamin-Gemischs: Wachstum

c) Christensen-Medien: Wachstum

10. Wachstum in Anwesenheit von anorganischen Stickstoffquellen :

a) Ammonium (Glucose-Hucker-Medium unter Zusatz eines Vitamin-Gemischs): Wachstum

b) Nitrat (Glucose-Dimmick-Medium unter Zusatz eines Vitamin-Gemischs): Wachstum

J 609814/1049

11. Pigment; negativ

12. Urease-Test: negativ .'

13. Katalase-Test: positiv

15· Temperatureinfluß:

a) Wachstum (72 Stunden) bei 10 bis 38°C.

b) Optimales Wachstum (24 Stunden) bei 23 bis 3O°C

16. pH-Einfluß:

a) Wachstum (72 Stunden) beim pH-Wert von 6,0 bis 9,0

b) Optimales Wachstum (24 Stunden) beim pH-Wert von 7,0

17. Sauerstoffbedarf: aerob

18. O-F-Test (Hugh-Leifson-Methode):

aerobe wie anaerobe leichte Säurebildung aus D-Glucose (die oben liegende Schicht einer mit Paraffin verschlossenen Stichkultur schlägt nach Gelb wie eine normale Stichkultur um), dagegen weder Säure- noch Gasbildung aus Lactose

19· Bildung von Säuren und Gasen aus Zuckern (Barsiekow-Medium):

a) Nur Säurebildung aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Sucrose, Lactose (schwach), D-Mannit (schwach) und Stärke.

b) Weder Säure- noch-Gasbildung aus Trehalose, D-Sorbit, Inosit und Glycerin.

U ^J

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21. Methylenblau-Reaktion (Fleischbrühe 18 bis 24 Stunden): reduziert

22. D-Gluconsäure-Verwertung: verwertet

23. 2-Keto-D-glueonsäure-Verwertung: leicht verwertet.

Der Vergleich der taxonomen Eigenschaften der drei vorstehend genannten Stämme mit der Beschreibung im Manual läßt aufgrund folgender Feststellung den Schluß zu, daß diese Stämme zur Gattung Corynebacterium gehören. Für sie gilt das gleiche wie für den vorstehend genannten Stamm ASM-3311-β.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können auch Mutanten der vorgenannten Mikroorganismenstamme verwendet werden, die nach üblichen Methoden durch künstliche oder induktive Mutation erhalten worden sind. Beispielsweise kann die mutagene Behandlung durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder durch Behandlung mit mutagenen Verbindungen, wie Stickstofflost, durchgeführt v/erden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die vorgenannten Stämme auf ein Nährmedium überimpft und darin inkubiert. Das verwendete Nährmedium erhält das vorgenannte Substrat. Die Zellen des gewählten Stammes, beispielsweise Ruhezellen oder durch eine beliebige Behandlung dieser Zellen erhaltene Präparate, läßt man direkt auf das Substrat einwirken. Es können übliche Gefäße zur Fermentation verwendet werden. Besonders bevorzugt sind belüftbare Fermenter mit Rühreinrichtungen. Besonders gute Ergebnisse werden durch Inkubation eines flüssigen Nährmediums erhalten.

L -J

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Die Wahl des Nährmediums zur Züchtung der Mikroorganismen ist nicht kritisch. Besonders geeignet sind Nährmedien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze und gegebenenfalls geringe Mengen an anderen Nährstoffen enthalten.

Als Stickstoffquellen können anorganische oder organische Stickstoffverbindungen oder Produkte, die diese Verbindungen enthalten, verwendet werden. Spezielle Beispiele sind Ammoniumsalze,Ni tratsalze, Maisquellwasser, Peptoii, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Weizengluten, Hefeextrakt, Hefe und Harnstoff.

Als Kohlenstoffquellen können neben der als Ausgangsmaterial eingesetzten D-Glucose beispielsweise mehrwertige Alkohole oder Zucker verwendet werden, wie Glucose, Glycerin, Sucrose, Lactose, Dextrin, Maltose und Melassen.

Beispiele für verwendbare organische Salze sind die Salze von Calcium, Magnesium, Kalium, Zink, Kupfer, Eisen und anderen Metallen.

Gegebenenfalls wird das Nährmedium mit Wachstumsfaktoren versetzt.

Das Mengenverhältnis der genannten Nährstoffe hängt vom ver-'· wendeten Mikroorganismenstamm ab. Die Menge der als Ausgangsmaterial benutzten D-Glucose, der zu überimpfenden Stämme sowie die Überimpfungszeiten und Züchtungsbedingungen werden durch übliche Vorversuche im Einzelfall festgelegt. L -J

6 Q 9 8 U / 1 0 4 9

Im allgemeinen eignen sich zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens D-Glucose-Konzentrationen von etwa 20 bis 200 g/Liter, vorzugsweise etwa 20 bis 100 g/Liter.

Wie bereits erwähnt, werden die Züchtungsbedingungen im Einzelfall so festgelegt, daß die bestmöglichen Ausbeuten erreicht werden. Bevorzugte Züchtungstemperatüren liegen bei etwa 20 bis 35°C. Vorzugsweise wird das Medium dabei in einem pH-Bereich von 4 bis 9 gehalten. Im allgemeinen ist eine Inkubationsdauer von 10 bis 100 Stunden ausreichend. Innerhalb dieser Zeit reichert sich die maximale Menge des Produkts im Medium an.

Um den pH- Wert des Mediums in einem Bereich zu halten, der für die Aufrechterhaltung der gewünschten enzymatisehen Aktivität, die durch den Mikroorganismus erzeugt wird, am geeignetsten ist, wird das Medium zum gegebenen Zeitpunkt mit Säuren oder Basen versetzt. Eine andere Möglichkeit zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes besteht darin, das Medium zu Beginn der Inkubation mit einem entsprechenden Puffer zu versetzen.

Die erforderliche Menge der als Ausgangsmaterial verwendeten D-Glucose kann dem Nährmedium auf einmal oder während der Züchtung in mehreren Portionen zugegeben werden.

Abgesehen von der vorbeschriebenen Inkubation der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismenstämme können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren auch die Zellen des Mikroorganismus, beispielsweise Ruhezellen, mit Aceton behandelte Zellen lyophi-■

L -J

6098 U/1049

lisierte Zellen oder zerkleinerte Produkte, in direkten Kontakt mit dem die als Ausgangsmaterial verwendete D-Glucose enthaltenden Medium gebracht werden.

Die den Stamm A enthaltende KuItürbrühe kann mit .jedem aus dem Stamm B erhaltenen Produkt in Berührung gebracht werden. Ebenfalls können Zwischenprodukte, die zuvor durch Kontakt mit dem Stamm A erhalten wurden, als Substrat für die Züchtung des Stammes B im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden.

Im Falle des direkten Kontakts der Zellen oder der durch eine Behandlung der Zellen erhaltenen Präparate mit dem Substrat können die Temperaturbedingungen, pH-Werte und die übrigen Bedingungen ähnlich wie bei der Inkubation der Mikroorganismenstämme gewählt werden, sofern die Zellen oder die durch eine Behandlung der Zellen erhaltenen Präparate enzymatisch aktiv sind. Außerdem können zur Aufrechterhaltung eines konstanten pH-Werts des Reaktionsgemischs Pufferlösungen verwendet werden.

Die 2,5-Diketo-D-gluconsäure, die durch Züchtung des Stammes A in dem Medium oder durch direkten Kontakt des Substrats mit einem durch eine Behandlung der Zellen erhaltenen Präparat hergestellt und in der Brühe im Rohzustand angereichert wird', kann ohne Isolieren durch den Stamm B oder ein durch eine Behandlung des Stammes B erhaltenes Präparat in die 2-Keto-L-gulonsäure umgewandelt werden. Dagegen kann das Nebenprodukt, die 2-Keto-D-gluconsäure, wenn die reine, ungemischte Kultur des Stammes B zugegeben werden soll, durch den Stamm A verwertet werden

6098

mit einem
oder / durch Behandlung des Stammes A erhaltenen Präparat oxidiert werden. Dabei wird"die 2,5-Diketo-D-gluconsäure gebildet, die anschließend wieder in 2-Keto-L-gulonsäure umgewandelt werden kann.

Die entstandene und im Medium angereicherte 2-Keto-L-gulonsäure kann nach bekannten Verfahren abgetrennt und gereinigt werden. Die 2-Keto-L-gulonsäure kann als freie Säure oder als Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Ammoniumsalz isoliert werden.

Wird die 2-Keto-L-gulonsäure als freie Säure erhalten, so kann .. sie nach bekannten Verfahren in die entsprechenden Salze überführt werden. Gleichermaßen können die Salze in die freie Säure oder in andere Salze überführt v/erden.

Zur Abtrennung des gewünschten Produkts aus dem Medium können "beliebige Verfahren verwendet werden, beispielsweise können die folgenden Schritte wiederholt angewendet bzw. miteinander kombiniert werden:
a.) Entfernung der Mikroorganismenzellen aus der Gärmaische durch Filtrieren, Zentrifugieren oder Behandlung mit Aktivkohle ;

b) Fällung des Rohprodukts in Form von Kristallen durch Einengen des Gärmai s chefiltra'ts;

c) Gewinnung der ausgefällten Kristalle durch Filtrieren oder Zentrifugieren des eingesetzten Filtrats;

d) Umkristallisieren der rohen Kristalle;

e) Lösungsmittelextraktion;

f) chromatographische Abtrennung.

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Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte 2-Keto-L-gulonsäure kann "beispielsweise durch die Elementaranalyse identifiziert werden. Ferner können zur Identifikation auch physikochemische Eigenschaften herangezogen werden, wie Schmelzpunkt, IR-Spektrum und optische Drehung. "

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 1. Saatkulturenι

Es wurden Acetomonas albosesamae ATCC 21998 als Stamm A und die in Tabelle I zusammengefaßten Spezies als Stamm B eingesetzt. Je eine Platinöse des betreffenden Stammes wird auf 100 ial eines Mediums überimpft, das in einem 500 ml fassenden Schüttelkolben enthalten ist und dessen pH-Wert vor dem Sterilisieren (115°C, 20 Minuten) auf 7,0 eingestellt wurde. Die Kulturen werden auf einer Drehschüttelmaschine (240 U/min) 15 Minuten

bei 30⁰C geschüttelt.

eingesetzt für Züchtung

Saat-Medium	Stamm A	von	Stamm B
	0,2 %
D-Glucose		0,2 %
Glycerin	0,1 %
Hefeextrakt	0,5 %	0,2 %
Polypepton	0,1 %	0,1 %
Kaliumdihydrogenphosphat	0,05%	0-,02Sfi
Magnesiumsulfat·7H_o0

J 809814/1049

2. Vorbereitungen:

Während die in der Kulturbrühe enthaltene 2,5-Diketo-D-gluconsäure zur Herstellung des Endprodukts, namentlich der erfindungsgemäßen Mischkultur eingesetzt wird, wurde eine solche Rulturbrühe vorher durch Überimpfen einer den Stamm A enthaltenden Saatkultur auf ein Nährmedium folgender Zusammensetzung hergestellt:

D-Glucose 5,0 %

Hefeextrakt 0,2 %

Polypepton 0,6 %.

Kaliumdihydrogenphosphat 0,1 %

Magnesiumsulfat · 7H₂O 0,02 % und

Calciumcarbonat . 1,75 %·

Jeweils 100 ml des Nährmediums, dessen pH-Wert vor dem Sterilisieren (115⁰C, 20 Minuten) auf 7,0 eingestellt wurde, werden mit einer Impfflüssigkeit (Volumenanteil 10 %) in einen 500 ml fassenden Schüttelkolben gegeben und 24 Stunden geschüttelt.

In gleicher Weise wird ein Nährmedium folgender Zusammensetzung

D-Glucose 0,2 %

Hefeextrakt 0,4 %

Polypepton 0,4 %

Kaliumdihydrogenphosphat 0,2 % und

Magnesiumsulfat · 7H^O 0,04 %

für die Fermentation des Stammes B hergestellt. Jeweils 50 ml des Nährmediums, dessen pH-Wert vor dem Sterilisieren (115⁰C, 20 Minuten) auf 7,0 eingestellt wurde, werden in einen 500 ml fassenden Schüttelkolben gegeben und mit jeweils 5 ml einer l_ Saatkultur des Stammes B versetzt. _j

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Γ ~1

3. Gemischte Kultur

Zusätzlich zu der vorstehend beschriebenen Kulturbrühe des Stammes A, die im erfindungsgemäßen Verfahren ohne Vorbehandlung, wie Sterilisieren durch Filtrieren, benutzt wurde, wird eine sterilisierte Brühe der gleichen Kultur sowie eine 5prozentige wäßrige Lösung von reinem Calcium-2,5-diketo~D-gluconat (sterilisiert durch Filtrieren) in parallel verlaufenden Kontrolluntersuchungen benutzt.

Zu Beginn und nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden (240 U/min, 30⁰C) werden diese 2,5-Diketo-D-gluconsäure enthaltenden Lösungen mit den den Stamm B enthaltenden Fermentationsbrühen so versetzt, daß die Endkonzentration der 2,5-Diketo D-gluconsäure in den Gemischen etwa 2,5 % beträgt. Die Inkubationen werden danach unter denselben Bedingungen 72 Stunden durchgeführt.

Die Ergebhisse der Inkubationen sind in Tabelle I zusammengefaßt, aus der die vorteilhaften Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens ersichtlich sind. Das Endprodukt ist völlig frei von unerwünschten Nebenprodukten wie der 2-Keto-D-gluconsäure, während bei der Kontrolluntersuchung dieses Nebenprodukt neben dem Endprodukt, der 2-Keto-L-gulonsäure, enthalten ist.

4* Quantitative Bestimmung:

Quantitative Bestimmungen wurden mit Hilfe der Gaschromatographie durchgeführt (Säule mit Siliciumkautschuk SE-52 gepackt; sylilierte Probe).

L -J

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cn
o
to

Tabelle I - 46 -

Anreicherung der 2»Keto-L-gulonsäure (2KLG) und 2-Keto-D-gluconsäure (2KDG) (mg/ml)

Stamm B

Brevl bacterium so. ASM-856-4 FERM-P 2686, ATGG 31083

Brevibacterium sp. ASM-3356-31 FERM-P 2685,, ATGG 31082

Brevibacterium testacium IPO 12675

Gorvnebacterium sp. ASM-3311-6 FERM-P 2687, ATGG 31081

Brevibacterium ketosoreductum ASX-IQO5, FERM-P 1905, ATGG 21914

Corvnebacterium sp. ASM-20A-77 FERId-P 2770, ATGG 3IO9O

Corvnebacterium sp. ASM-T-I3 FERM-P 2771, ATGG 31089

Gorynebacterium sp. ASM-K-IO6 FSRM-P 2769, ATGG 3IO88

Zugabezeit (Std.)

flach- Beginn, der Inkubation

0 24

0· 24

0 24

24

zugegebene 2,g-Diketo-P-gluconsäure

Kulturbrühe mit Acetomonas arbpsesamae

vräbrige" Lösung des Calciumsalzes

Mlischkultur
(ohne Sterilisation)

2KDG

rein, unvermischt, gezüchtet

mit Sterilisieren nach Filtrieren

0
0

2KLG

2KDG

2_;86

0.25 l_;6r

0.09

0,23 1,18

0,64 1₇77

1,17 4^3

0,72. l_?08

0,54 2,39

0,20 00

0,08 0,75

0.01 0^02

0,07 1,04

0,34 0,85

0.22

1,78

0,16 0,32

0.02

0,85

2KLG

0,84 2,49

0.18 O95

0.4.9 1,23

1,23 4,15

0,65 0,96

0.80 2_;83

2KDG

0.16 O₇

0,19 0,05 1/51 0,51

O_r59 0,74

0,22 0^69

0,34 1,46

O_f25 0,19

0.05 0,79

Beispiel 2

In ähnlicher Weise,wie in Beispiel 1 beschriebe^werden die in Tabelle II zusammengefaßten gemischten Kulturen zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure unter "Verwendung der Stämme A und B eingesetzt. Die nicht sterilisierte Kulturbrühe des Stammes A wird mit der KuI tür brühe des Stammes B versetzt', die vorher 24 Stunden inkubiert wurde.

In Tabelle II sind die Ergebnisse der quantitativen Bestimmung der Kulturbrühen zusammengefaßt, die mit Hilfe der in Beispiel 1 beschriebenen Gaschromatographie und PapierChromatographie durchgeführt wurde. Die Bildung von 2-Keto-D-gluconsäure wird ■ nicht beobachtet.

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Tabelle II Anreicherung der 2-Keto-L-gulonsäure (mg/ml)

Stamm A Acetomona3 . Acetobacter Gluconobacter

■ albosesamae melanogenum rubip;inosu3

FERM-P 2439 _lvn

Stamm B ATCC 21998 ^XJ!U

Brevibacterium sp.

ASM-856-4 ο ₀A \

FERM-P 2686 /^ ^J

ATCC 31083 Brevibacterium sp.

ASM-3356-31 _{Ί 1Q} ,

FERM-P 2685 * ^y

ATCC 31082 Brevibacterium

testacium 0,15 0,06 0,08

IFO 12675 Corynebacterium ep..

ASM-3311-6 17R OR? TPR

FERM-P 2687 ¹J ⁿ f ^t ^?

ATCC 31081

Brevibacterium

ASM-IOO5 1,28 0.57 0,97

'FERM-P 1905 ATCC 21914

Corynebacterium sp.

ASM-20A-77 _{4 48 2 02} , _4q

FERM-P 2770 ⁴J⁴⁰ ^dt^Od 'I^

ATCC 31090 Corynebacterium sp.

A3M-T-13 _{0 17} o 62 0 71

FERM-P 2771 ' ' / >'

ATCC 31089 Corynebacterium sp.

ASM-K-106 ρ f-_Q ' η _ΊΛ im

FERM-p 2769 ²;⁶⁹ °;^{16 1}^⁸¹

ATCC 31088

_! 609814/1049

Vergleichsversuch

Gemäß Beispiel 1 werden der Stamm A von Beispiel 1 und die in Tabelle III zusammengefaßten Stämme B zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure verwendet. Die durch Filtrieren sterilisierten Kulturbrühen des Stammes A werden mit den Kulturmedien des Stammes B vermischt, die zuvor 24 Stunden inkubiert wurden.

Die Zellen in jeder Kulturbrühe, die weitere 16 Stunden inkubiert wurden, werden gesammelt, zweimal mit sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 100 ml 0,05 Mol Trispuffer (pH-Wert 7,5) mit einem Mischungsverhältnis der Zellen von 4,1 mg (Trockengewicht)/ml suspendiert. Diese Suspension wird mit Calcium-2,5-diketo-D-gluconat bis zu einer Konzentration von 1 Prozent versetzt und 24 Stunden bei 30⁰C inkubiert.

Zu bestimmten Zeiten während der Kontaktbehandlung v/erden dem Reaktionsgemisch Proben zur quantitativen Bestimmung der 2-Keto-L-gulonsäurebildung (vgl. Beispiel 1) entnommen. In Tabelle III sind die Ergebnisse nach der Behandlung zusammengefaßt. Bei jeder Untersuchung wird geprüft., ob die 2-Keto-D-gluconsäure zusammen mit der 2-Keto-L-gulonsäure gebildet wird.

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Tabelle III

Stamm B Anreicherung der 2-Keto-L-gulonsäure

nach der Inkubation (mff/ml) ^_

ASM-856-4 1,12

ASM-3356-31 0,58

ASM-3311-β 0,64 .

ASM-20A-77 1,85

ASM-K-106 1,32

ASM-T-13 0,55

Beispiel 3 - "

Als Stamm A v/erden die in Tabelle IV zusammengefaßten Stämme verwendet, während Brevibacterium ketosoreductum ASM-1005, FERM-P 1905, ATCC 21914 als Stamm B eingesetzt wird.

Die Saatmedien sind identisch mit denen von Beispiel 1, die vor dem Überimpfen in ähnlicher "Weise behandelt wurden.

Es wird jeweils eine Platinöse des betreffenden Stammes aus einer Fleischbrühe-Schrägkultur auf 100 ml Saatmedium überimpft, das in einem 500 ml fassenden Schüttelkolben enthalten ist, und auf einer Drehschüttelmaschine (220 U/min) 6 Stunden bei 30⁰C geschüttelt wird.

Die Saatkulturen der Stämme-A und B werden in den in Tabelle IV zusammengefaßten Zellkonzentrationsverhältnissen gemischt und als 5prozentiges Inoculum auf 100 ml eines Fermentationsmediums überimpft, das

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2,0 % D-Glucose

0,5 % Hefeextrakt

0,5 % Polypepton

0,1 % Kaliumdihydrogenphosphat

0,02 % Magnesiumsulfat * 7HpO und

0,7 % Calciumcarbonat

enthält, in einem 500 ml fassenden Schüttelkolben eingesetzt und vor dem Sterilisieren auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt wurde. Die Kulturen werden danach 60 Stunden geschüttelt.

Nach der Inkubation wird die Bildung der 2-Keto-L-gulonsäure als ein rosa Flecken bei der Papierchromatographie nachgewiesen (Entwicklungsmittel : Phenol : Wasser : Ameisensäure (75:25:4), Nachweisreagenz: Anilin-hydrogenphthalat). Xn keinem Versuchsansatz wird eine Anreicherung der unerwünschten 2-Keto-D-gluconsäure durch PapierChromatographie nachgewiesen.

Die quantitative Bestimmung wird durch Gaschromatographie gemäß Beispiel 1 durchgeführt; die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt, die ebenfalls auf keine Anreicherung der 2-Keto-D-gluconsäure neben der 2-Keto-L-gulonsäure hinweisen.

Tabelle IV

Stamm A Verhältnis der Anreicherung

in jedem Ansatz wird als Stamm B Zellkonzentra- der 2-Keto-L-

Brevibacterium ketosoreductum tion gulonsäure

verwendet (A:B) (mg/ml)

1:1 0,3

Acetomonas albosesamae

FERM-P 2439, ATCC 21998 1:3 0,57

6:1 0,1

Acetobacter melanogenum IFO 3293 1:1 0,3

Gluconobacter rubiginosus IFO 3244 1:1 0,23

L . ^J

6Q9BU/10A9

Beispiel 4

Die Stämme (vgl. Tabelle IV)-und die Saatkultur des Stammes B sind die gleichen wie in Beispiel 3- Für die Züchtung von Acetomonas albosesamae als Stamm A wird ein Nährmedium verwendet, das . ·

10 % D-Glucose

0,1 % Hefeextrakt

0,4 % Polypepton

- Ο,Λ % Kaliumdihydrogenphosphat . -

_..-Ό,-05%., Magnesiumsulfat · 7H₂O und . .

3,4 % Calciumcarbonat

enthält und dessen pH-Wert vor dam-Sterilisieren auf 7,0 eingestellt wurde.

In einem anderen Ansatz, bei dem anstatt Acetomonas albosesamae Acetobacter melanogenum oder Gluconobac.ter rubiginosus verwendet werden, beträgt der.Gehalt des Mediums an D-Glucose bzw. an Calciumcarbonat 4 % bzw. 1,4 %.

Jeweils eine Platinöse der Saatkulturen vom Stamm A wird auf 50 ml dieser Medien überimpft, die in einem. 500 ml fassenden Schüttelkolben vorgelegt und 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert wurden. Zur Herstellung der 2,5-Diketo-D-gluconsäure wird die Inkubation gemäß Beispiel 3 durchgeführt.

Während der Inkubation werden zu den in Tabelle V angegebenen Zeiten die Saatkultürbrühen des Stammes B mit den die Zellen des Stammes A enthaltenden Brühen (20 ml, wenn Acetomonas albosesamae und 50 ml, wenn Acetobacter melanogenum oder

L . ^J

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Gluconobacter rubiginosus verwendet wird), mit den in Tabelle IV angegebenen Zellkonzentra-tionsverhältnissen versetzt. Die gemischte Brühe wird in einem 500 ml fassenden Kolben mit 100 ml einer Nährlösung versetzt, mit sterilisierter Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,3 eingestellt und 60 Stunden geschüttelt.

Die Nährlösung ist ein konzentriertes Gemisch von Hefeextrakt und Polypepton (1:1), das 20 Minuten bei 120⁰C sterilisiert, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und "so verdünnt wurde, daß die Konzentration des Polypeptons oder Hefeextrakts in jeder der gemischten Brühen 0,2 % beträgt.

Die Ergebnisse der Inkubation, die in ähnlicher Weise_i wie in Beispiel 3 beschrieben₍ analysiert wurden, sind in Tabelle V zusammengefaßt. Neben der Anreicherung von 2-Keto-L-gulonsäure wird in den entsprechenden Ansätzen keine Bildung von 2-Keto-D-gluconsäure beobachtet.

Tabelle V

Stamm A In jedem Ansatz wird als Stamm B Brevibacterium ketoso- reductum verwendet	Verhält nis der Zellkon zentra tion (A:B)	Inkubationszeit (Std.)	ge misch te Kul tur	Anrei cherung der 2-Keto- L-gulon säure (mg/ml)
Acetomonas albosesamae	1 : 1 1 : 10 3 : 1	Fermenta tionszeit zur Bil dung der 2,5-Diketo- D-glueon- säure	60 60 60	0,95 V5 2,3
Acetobacter melanogenum	7 : 1	60 60 60	60	0,46
aluconobacter rubiginosus	10 : 1	30	60	0,73
30

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Γ Π

Beispiel 5

In diesem Versuch v/erden als. Stamm A Acetomonas albosesamae und als Stamm B Brevibacterium ketosoreductum verwendet. Sowohl Medium wie Inkubationsmethode des Stammes A zur Herstellung der 2,5-Diketo-D-gluconsäure sind identisch mit der Beschreibung in Beispiel 4, während die Saatkultur des Stammes B identisch mit der von Beispiel 3 ist.

Jede Nährlösung enthält jeweils 5 % Hefeextrakt und Polypepton, ist auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und 20 Minuten bei 12O⁰C sterilisiert worden.

80 ml der Saatkultur des Stammes B werden in einem 500 ml fassenden Schüttelkolben mit 8 ml der Fermentationsbrühe versetzt, die die Zellen des Stammes A und die angereicherte 2,5-Diketo-D-gluconsäure enthält, und anschließend geschüttelt.

Zu jeder Zeit während der Inkubation, jedoch spätestens 25 und h2 Stunden nach ihrem Beginn, werden 10 ml der Fermentationsbrühe, die die angereicherte .2,5-Diketo-D-gluconsäure enthält, und 5 ml der Nährlösung zu dem Gemisch gegeben. Die gesamte Inkubationszeit beträgt 90 Stunden. Als Ergebnis der Analyse gemäß Beispiel 3 beträgt die Konzentration der 2-Keto-L-gulonsäure 1,6 mg/ml; es wird keine 2-Keto-D-gluconsäure gebildet.

L · _J

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Claims

Patentansprüche

.) Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure und deren Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismenstamm der Gattung Acetobacter, Acetomonas oder Gluconobacter, der aus D-Glucose 2,5-Diketo-D-gluconsäure herstellt (nachstehend als 2,5-Diketo-D-gluconsäurebildner bezeichnet) oder aus diesem gewonnene Enzyme oder Enzymanreicherungen und einen Mikroorganismenstamm der Gattung Brevi"bacterium oder Corynebacterium, der 2,5-Diketo-D-gluconsäure in 2-Keto-L-gulonsäure umwandeln kann (nachstehend als 2-Keto-L-gulonsäurebildner bezeichnet),oder aus diesem gewonne ne Enzyme oder Enzymanreicherungen mit einem D-Glucose enthaltenden Medium zusammenbringt, wobei beide Mikroorganismen oder aus diesen gewonnene Enzyme oder Enzymanreicherungen in dem Medium während wenigstens eines Teils des gesamten Verfahrens genügend lange koexistieren, um die 2-Keto-L-gulonsäure oder deren Salze in dem Medium herzustellen und anzureichern, und das entstandene Produkt aus dem Reaktionsgemisch abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den 2,5-Diketo-D-gluconsäürebildner und den 2-Keto-L-gulonsäurebildner in ein D-Glucose enthaltendes Medium überimpft und inkubiert, wobei beide Mikroorganismen koexistieren und zusammen in dem Medium während wenigstens eines Teils des gesamten Verfahrens wachsen,und daß man die durch den 2-Keto-L-gulonsäurebildner hergestellte 2-Keto-D-gluconsäure mit dem 2,5~Diketo-D-gluconsäurebildner unter Bildung der 2,5-Diketo-D-gluconsäure umsetzt, die von dem 2-Keto-L-gulonsäurebildner wiel_der in die 2-Keto-L-gulonsäure umgewandelt wird.

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j5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als 2,5-Diketo-D-gluconsäurebildner einen Mikroorganismenstamm der Gattung Acetobacter und als 2-Keto-L-gulonsäurebildner einen Mikroorganismenstamm der Gattung Brevibacterium einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als 2,5-Diketo-D-gluconsäurebildner einen Mikroorganismenstamm der Gattung Acetomonas und als 2-Keto-L-gulonsäurebildner einen Mikroorganismenstamm der Gattung Brevibacterium einsetzt.

5· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als 2,5-Diketo-D-gluconsäurebildner einen Mikroorganismenstamm der Gattung Gluconobacter μηα als 2-Keto-L-gulonsäurebildner einen Mikroorganismenstamm der Gattung Brevibacterium einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 2,. dadurch gekennzeichnet, daß man als 2,5-Diketo-D-gluconsäurebildner einen Mikroorganismenstamm der Gattung Acetobacter und als 2-Keto-L-gulonsäurebildner einen Mikroorganismenstamm der Gattung Corynebacterium einsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als 2,5-Diketo-D-gluconsäurebildner einen Mikroorganismenstamm der Gattung Acetomonas und als 2-Keto-L-gulonsäurebildner'einen Mikroorganismenstamm der Gattung Corynebacterium einsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als 2,5-Diketo-D-gluconsäurebildner einen Mikroorganismus der Gattung Gluconobacter und als 2-Keto-L-gulonsäurebildner einen Mikroorganismenstamm der Gattung Corynebacterium einsetzt. _j

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9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als 2,5-Diketo-D-gluconsäurebildner Acetobacter melanogenum IFO 3293, Acetomonas albosesamae ATCC 21998 oder Gluconobacter rubiginosus IFO 3244·einsetzt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als 2-Keto-L-gulonsäurebildner Brevibacterium ketosoreductum ASM-1005, ATCC 21914, Brevibacterium sp. ASM-856-4, ATCC 31083, Brevibacterium sp. ASM-3356-31, ATCC 31082, Brevibacterium testaceum IFO 12675» Corynebacterium sp. ASM-3311-6, ATCC 31081, Corynebacterium sp. ASM-20A-77, ATCC 31090, Corynebacterium sp. ASM-T-13j ATCC 31089 oder Corynebacterium sp. ASM-K-106,ATCC 31088 einsetzt.

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