JPS58162298A - ２−ケト−ｌ−グロン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 不発明は単一の発酵槽において複数の微生物を混合培養
することによってＩ）−グルコースより直接２−ケ）−
Ｌ−グロン酸を生成蓄積させこれを採取することに関す
るものである。

本発明者らは上記２−ケ）−Ｌ−グロン酸の微生物的製
造方法について研究した結果、さきに、酸化発酵によっ
てＤ−グルコースから得られる２゜５−ジケ）−Ｄ−グ
ルコン酸あるいはその塩類の微生物的変換によって２−
ケトーＬ−グロン酸あるいはその塩類を得る方法を発明
した。（特公昭５０−２１５５９号、特公昭５３−２５
０３３号および特公昭５６−１５８７７号公報参照）。

この発明における２−ケ１−−　ｔ、−グロン酸の直接
の原料物質である２、５−シヶ）　−１）−グルコン酸
はグルコノバクタ−属（ここに言うグルコノバクタ−属
とはバージイズ・マニュアル・オフ・デタミナテイブ・
バクテリオロジー（以後「マニュアル」と呼ぶ）（第８
版）に準拠するものである。

従って「マニュアルＪ　（第７版）に於けるアセトバク
ター属、アセトモナス属あるいはグルコノバから効率良
＜２．５−ジケ）−Ｄ−グルコン酸を生成することを見
出した。（特−昭５５−１１２４０６号）。

また、本発明者らは、先に、次の事実を見出している。

（特公昭５４−１９４６８号公報参照）。

（イ）発酵液中に２．５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産
菌株と２−ヶ）−Ｌ−グロン酸生産菌株を混合させても
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株がグルコース
により生産した２、５−ジケト−Ｄ−グルコン酸は、２
−ケトーＬ−グロン酸生産菌株によって、支障なく２−
ケトーＬ−グロン酸に転換される。（ロ）２．５−ジケ
ト−Ｄ−グルコン酸生産菌株と２−ケ１−−Ｌ−グロン
酸生産菌株が併存することにより、２−ケトーＬ−グロ
ン酸生産菌株が併産する不所望の２−ケ）−Ｄ−グルコ
ン酸が培地中に蓄積しない。（ハ）培地中に２−ヶ）−
Ｄ−グルコン酸が蓄積しない主たる理由は、２−ケ）−
Ｌ−グロン酸生産菌株が併産する２−ケ１−−Ｄ−グル
コン酸を２，５−ジグ１−−Ｄ−グルコン酸生産菌株が
再ひ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸に変換しこれがさ
らに２−ケトーＬ−グロン酸となるためである。前記発
明（特公昭５４−１９４６８号）番こ於いて発明者らは
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株としては、グ
ルコノバクタ−属に属する微生物を、また２−ケトーＬ
〜グロン酸生産菌株としては、ブレビバクテリウム属あ
るいはコリネバクテリウム属に属する微生物を使用し、
それぞれの組み合わせにより、２−ケト−ローグルコン
酸の併産がなくなることを開示している。その後、本発
明者らが、天然から新たに分離した、エルウィニア属に
属する２、５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株を用い
た場合にも前記２−ヶ）−Ｌ−グロン酸生産菌株と混合
して培養することにより、２−ケト−ローグルコン酸の
併産を防止出来ることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明によれば２．５−ジケト−１１−グル
コン酸生産菌株（■）と２−ケ）−Ｌ−グロン酸生産菌
株缶）をＤ−グルコースを含む培地中で、全＝　３一 工程の少くとも一部に於いて両者が併存する形で接触さ
せることにより培地中に、２−ケトーＬ−グロン酸を生
成蓄積させこれを採取する方法であって、菌株（■）は
Ｄ−グルコースより２．５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を
生成する能力を有するエルウィニア属に属する微生物で
あり、菌株（９）は２．５−ジケト−Ｄ−グルコン酸よ
り２−ケトーＬ−グロン酸を生成する能力を有するコリ
ネバクテリウム属あるいはブレビバクテリウム属に属す
る微生物であることを特徴とする２−ケ）−Ｌ−グロン
酸の製造方法が提供される。

本発明に於いて、「全工程の少くとも一部に於いて両者
が併存する形で接触させる」とは主として混合培養のこ
とを言う。

「混合培養」としては、（イ）培地中に両菌株する方法
、および（ハ）発酵培地に両菌株を別々に植菌培養し、
何れか一方の菌株の培養液を他方　４− の菌株の培養液に数回に分けて混合するか、あるいは連
続的に添加混合して更に培養を続ける方法等があり、い
ずれも利用可能である。目的物質の２−ケトーＬ−グロ
ン酸を最も効率良く生成させるため、両菌株の植菌量比
および植菌時期を、使用する菌株のそれぞれの生育速度
、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の生成能および２−
ケト−１−グロン酸生産菌株の２．５−ジケト−Ｄ−グ
ルコン酸の２−ケ）−Ｌ−グロン酸への転換能ならびに
培地の性質を考慮して、決定しなければならないが、之
等は必すしも本発明の実施例に記載のものに限定して解
されるべきでない。

本発明で使用される２、５−ジケト−Ｄ−グルコ称する
＆＝＝ｂ−一）は第２表に示す。

上記の（１）および準）を紫外線・Ｘ線照射あるいは薬
剤処理によって誘導される変異株も本発明のより効果的
な実施を目的としたものとして同様（こ使用出来る。

本発明に於いて、（Ｉ）および東うの培養に使用する培
地に特に制限はないか、菌が同化しうる炭素源、窒素源
、その他無機塩類、微量の栄養素などを適当に含有して
いるものか望ましい。炭素源としては原料基質であるＤ
−グルコースか主として用いられるか、蔗糖・グリセリ
゛ン・糖蜜など通常使用されている炭素源を用いること
も出来る。窒素源としては、コーン・ステイープ・リカ
ー、ペフトン、肉エキス、酵母、酵母エキス、大豆粉、
小麦クルテン、尿素などの窒素化合物が用いられる。

無機塩類としてはカルシウム塩類、マグネシウム塩類、
カリウム塩類、亜鉛塩類、鉄塩類、銅塩類その他の金属
塩類が用いられる。また、もし必要ならは菌の生育ある
いは目的物質の生成を促進する因子等を添加しても良い
。これらの各種栄養物質の配合割合などは、用いる菌株
の特性、先に述の条件によって変動するので個々の場合
に応じてよっても異るが通常１０〜３００９／ｌ　　程
度が用いられる。

培養条件は、菌の種類、培地の組成、先に述べた両菌株
の植菌方法、植菌量比および植菌時期その他の条件によ
って異るが、通常培養温度は、２０〜３５°Ｃ１培地の
−１は４〜９程度に維持するのが望ましい。このため培
養途中で酸性あるいは塩基性の物質を適時添加してもよ
いし、あらかじめ緩衡剤を適当量含有させておいてもよ
い。培養時間は通常合計１０−１００時間時間下ある。

（ｒ）の培養によって生成した２、５−ジケト−Ｄ−グ
ルコン酸は、分離されることなくそのままσυによって
２−ケトーＬ−グロン酸に転換される。またσりによっ
て副生ずる不所望の２−ケ）−Ｄ−グルコン酸は（Ｉ）
ｉこよって２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸に転換され
、これは、σりによってふたたび２−ケト−１２−グロ
ン酸に転換される。

このようにして培地中に生成、蓄積した２−ケトーＬ−
グロン酸は、公知の方法で分離精製出来る。

本発明方法によって得られる２−ケ）−Ｌ−グロン酸の
同定は、元素分析、融点、赤外線吸収スペクトル、旋光
度などの物理化学的諸性質の測定によって行なわれる。

このように、２−ケトーＬ−グロン酸の生産に関して、
本発明は、＠）まず第一に１）−グルコースから一工程
で２−ケトーＬ−グロン酸に導くことか出来る、（ロ）
第二に中間生成物の分離が不要である、（Ｉつ第三に不
所望な異性体の併産がない、という利点を持っており、
顕著な工業的効果をもたらす。

９下実施例によって本発明をより詳細に説明する。記載
中、組成の係は重量／容量チである。

実施例　１ １）菌株（りによる２、５−ジケト−Ｄ−グルコン酸の
生産 この実施例では菌株として、エルウィニア・プンクター
タ（Ｅｒｗｉｎｉａ　ｐｕｎｃｔａｔａ　Ｆ’ＥＲＭ−
ｐ５４５２）を使用した。

（ｉ）種培地 Ｄ−グルコース −−−’　　　　　１０チ コーン・ステイープ・リカー　　　　　５０％（ｃ　ｓ
　ｒ−） りん酸第１カリウム（ＫＩ（２ＰＯ４）　　　　　０．
１％硫酸マグネシウム（ＭｇＳ０４・７１ｈＯ）　　　
０．０２％炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）　　　　　　
０５％を含む水溶液を、声（１０％　Ｎａ０ｆＴにより
調節）を６８〜７０に調節し、５００ｍ／三角フラスコ
に５０−ずつ分注し、１２０°Ｃで２０分間滅菌して種
培地とする。

（ｉｉ）　　種培養 上記フラスコ第３表に示すＦＥ　ＲＭ−Ｐ　５４５２を
一白金耳植菌し、２８°Ｃで、８−１１時間振魚培養（
振幅７１　ｉｎ　、回転数２７　Ｏｒ−Ｐ−ｍ、）　し
た。

光学密度（ＯＤ）が約８となる時をもって種培養の終点
とした （ｉｉ）　　発酵培地 ■〕−グルコース　　　　　　　　　　　　２０％ＣＳ
　Ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　３チＫＩ
（２ＰＯ４０，１％ Ｃａ　ＣＯ３６，３％ ポリプロピレングリコール２０００（Ｐ−２０００〕　
００１％を含む水溶液を上記と同様にｐ−Ｉ調節し、１
２０’Ｃで、２０分間滅菌した後、予め滅菌しておいた
１リツトル（１）の発酵槽に４５５−ずつ分注し、さら
１こに配積培養液４５ｍ１を加えた。

（ｉ　ｖ）本培養 温度　　　　　　　　　　　　　　　　２８°Ｃ撹袢　
　　　　　　　　　　　１７４０ｒ、ｐ、ｍ。

通気　　　　　　　　　　　　　６０ＯＮｍ／／分時間
　　　　　　　　　　　　１７〜３１喧（Ｖ）　　定量
法 下記要目による上昇法ペーパー・クロマトグラフィーで
分離し、デンシトメトリーにより定量した。

（イ）担体：東洋Ｐ紙虎５０ （ロ）展開溶媒： フェノール：蟻酸：水ニア５：４：２５（１）発色： ＡＨ）’溶ｉ（アニリン０９３ｇとフタール酸１６６ｇ
を水飽和ｎ−ブタノール１０〇−に溶解したもの〕噴霧
、１０５°Ｃで２分間処理して発色させる。

このほか、担体として［Ｔ　Ｌ　Ｃ；アルミシートセル
ローズ］（メルク商品名〕を用い上記の展開溶媒および
発色法による薄層クロマトグラフィーを併用した。この
場合定量は標準試料との比較による。

（ｖｉ）終了点 本培養は上記薄層クロマトグラフィにおいて２−ケトー
Ｄ−グルコン酸のピンク色のスポットが消失する時点を
以て終了点とした。

混合培養の効果を知るために下記の３種類の２゜５−ジ
グ１−−Ｄ−グルコン酸溶液を調製した。

（１）先に（１）を用いて調製した２、５−ジケ）−Ｄ
１３− −グルコン酸発酵液を無菌水で約４倍に希釈したもの（
（すはおよそ１０８〜１０１０個／ｉ存在する）（ｉす
（りを遠心分離後濾過除菌したもの（対照−■〕および （ｉｉ）２．５−ジケト−Ｄ−グルコン酸のカルシウム
塩５チ水溶液を濾過除菌したもの（対照−■〕（リ　種
培地 Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　１０％バクト
・イースト・エキストラクト　　０５％（Ｄｉ［ｃｏ） バクト・ペプトン（Ｄｉｒｃｏ）　　　　　　０．５％
Ｋ１−Ｉ２１’０４　　　　　　　　　　　　　０１％
Ｍ　ｇ　Ｓ　０４・７Ｈ２００，０２％を含む水溶液の
−４を（ＩＯ％Ｎ　ａ　ＯＨにて調節９７０〜７２に調
節し、５００ｄ容の三角フラスコに５０．／すつ分注し
、１１５°Ｃで１５分間滅菌した。

（ｉリ　種培養 １４− 上記フラスコに第２表に示した各菌株の）を−白金耳ず
つ植菌し、２８°Ｃで、１６〜２４時間振盪培養（振幅
７１　ｔｒａｎ　、回転数２７　Ｏｒ、ｐ、ｍ、）ＩＪ
。

（ｉｉ）本発酵培地 Ｄ−グルコース　　　　　　　　　　　　１０％Ｃ５Ｌ
　　　　　　　　　　　　　　　　　３．０チに８２　
ＰＯ４０，１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，０２％ を含む水溶液のμｍ■を（１０％のＮａＵ川こて調節）
７０〜７２に調節し、５０　ｏ　ｒｒ、ｉ容三角フラス
コに５０ｒｎ１．すつ分注し、１１５°Ｃて２０分間滅
菌した。

ルコン酸溶液は、それぞれ別々（こ、培養開始時ありル
コン酸の濃度か２５％になるよう（こ添力口した。

ただしくｉ）の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸溶液に
は、（１）が含まれていた。その後さらにそれそ柑８時
間培養した。

ンプル；トリメチルシリル化、温度：１６０〜２１０°
Ｃ，キャリアーガス：ヘリウム〕前記本発酵の結果を第
３表と第４表に示す。

これらの表に示すように（りとσＤの混合培養の場合は
、２−ケ）−Ｄ−グルコン酸の副生が全く認められない
のに対し、対照群のσＤの純粋培養系ではいずれの場合
にも２−ケ）−Ｌ−グロン酸の蓄積とともに、２−ケト
−ローグルコン酸の生成が認められた。

実施例　２ （りとしては、エルウィニア・プンクタータＦＥＲＭ−
Ｐ５４５２を、またσＤとしては、ブレビバクテリウム
・ケトソリダクタム　ＦＥＲＭ−Ｐ４Ｏ１０およびコリ
ネバクテリウム　ＦＥＲＭ−Ｐ２７７０をそれぞれ使用
する。

（わ、σりともにそれぞれ、実施例１に記載したの液（
ｒＢＨを７．０〜７．２　（１０％　ＮａＯＨ溶液を用
し）で）に調節し、５０〇−容三角フラスコに５０−ず
つ分注し、１１５°Ｃで２０分間滅菌して本発酵培地１
９− を調製した。この本発酵培地に、上記の（１）の種培液 養＞１．　ｏ　ｒｎｔおよびσＤの内のどちらか一方の
種培養液４．０４をそれぞれ植菌し、４８時間振盪培養
（振幅７１　ｗｎ　、回転数２７０　ｒＰ、温度２８°
Ｃ）した。

培養終了後、培養液を実施例１と同じ方法で分析した。

分析結果は第５表に示す。この表によって明らかなよう
に、いづれの場合も２−ケ）−Ｌ−グロン酸の蓄積は認
められるが、２−ケトーＤ−グルコン酸の蓄積は認めら
れなかった。

第　　　　５　　　　表 手続補正書（自発） 特許庁長官　殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第３５４５５　号 ２、発明の名称 ２−ケトーＬ−グロン酸の製造方法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ４、代理人 住所　大阪市福島区鷺洲５丁目１２番４号〒５５３塩野
義製薬株式会社　特許部 孜補正の対象： 明細書の「３、発明の詳細な説明」の欄乙補正の内容： ｌ）明細書第３頁第１／行、「グルコースにより生産」
を「グルコースより生産」と書き換える。

２）同第７２頁第７２行、［（７０％ＮａＯＨニより調
節）」を削除する。

３）同頁第７３行「調節」の後にｒ（１０％ＮａＯＨに
より調節、以下同じ）」を書き加える。

ｌｌ）同頁第１７行、「上記フラスコ第３表」を「上記
フラスコに第３表」と書き換える。

３）同頁第１９行、１回転数、２７’Ｏｒ、Ｐ、ｍｌを
「回転数、２７θｒ、ｐｏｍＪと書き換える。

乙）同第１３頁第１乙行、第１乙頁第９行および第２θ
頁第１Ｆ行のカッコ内記載を削除する。

以上 ２−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ２．５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株（Ｉ）と２−
   ケ）−Ｌ−クロン酸生産菌株（ＩＴ）をＤ−グルコ−長
   を含む培地中で、全工程の少くとも一部に於いて両者が
   併存する形で接触させることにより培地中に、２−ケ）
   　−Ｔ−−グロン酸を生成蓄積させこれを採取する方法
   であって、菌株（Ｉ）はＤ−グルコースより２，５−ジ
   ケト−Ｄ−グルコン酸を生成する能力を有するエルウィ
   ニア属ζこ属する微生物であり、菌株（９）は２，５−
   ジケ）−Ｄ−グルコン酸より２−ケ）−Ｌ−グロン酸を
   生成する能力を有するコリネバクテリウム属あるいはブ
   レビバクテリウム属に属する微生物であることを特徴と
   する２−ケ）−Ｌ−グロン酸の製造方法。