JPH0346118B2

JPH0346118B2 -

Info

Publication number: JPH0346118B2
Application number: JP57035455A
Authority: JP
Inventors: Takayasu Sonoyama; Bunji Kageyama; Shigeo Yagi
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1982-03-05
Filing date: 1982-03-05
Publication date: 1991-07-15
Also published as: DK103683A; US4696897A; JPS58162298A; GB8306230D0; AU560187B2; KR900009050B1; GB2116968A; GB2116968B; IE54703B1; EP0088409B1; ES520322A0; ES8404410A1; DK159122B; HU191202B; DK159122C; CA1186650A; DK103683D0; AU1205183A; EP0088409A2; KR840003696A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は単一の発酵槽において複数の微生物を
混合培養することによつてＤ−グルコースより直
接２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成蓄積させこれを
採取することに関するものである。本発明者らは上記２−ケト−Ｌ−グロン酸の微
生物的製造方法について研究した結果、さきに、
酸化発酵によつてＤ−グルコースから得られる
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸あるいはその塩
類の微生物的変換によつて２−ケト−Ｌ−グロン
酸あるいはその塩類を得る方法を発明した。（特
公昭50−21559号、特公昭53−25033号および特公
昭56−15877号公報参照）。この発明における２−ケト−Ｌ−グロン酸の直
接の原料物質である２，５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸はグルコノバクター属（ここに言うグルコノ
バクター属とはバージイズ・マニユアル・オブ・
デタミナテイブ・バクテリオロジー（以後「マニ
ユアル」と呼ぶ）（第８版）に準拠するものであ
る。従つて「マニユアル」（第７版）に於けるア
セトバクター属、アセトモナス属あるいはグルコ
ノバクター属を含む。以後同じ。）に属する微生
物の酸化によつて、Ｄ−グルコースから高収率に
得られることは良く知られている。さらに最近、
本発明者等はエルウイニア属に属する微生物がＤ
−グルコースから効率良く２，５−ジケト−Ｄ−
グルコン酸を生成することを見出した。（特願昭
55−112406号）。また、本発明者らは、先に、次の事実を見出し
ている。（特公昭54−19468号公報参照）。(イ)発酵
液中に２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株
と２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株を混合させて
も２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株がグ
ルコースより生産した２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸は、２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株によ
つて、支障なく２−ケト−Ｌ−グロン酸に転換さ
れる。(ロ)２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌
株と２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株が併存する
ことにより、２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株が
併産する不所望の２−ケト−Ｌ−グルコン酸が培
地中に蓄積しない。(ハ)培地中に２−ケト−Ｄ−グ
ルコン酸が蓄積しない主たる理由は、２−ケト−
Ｌ−グロン酸生産菌株が併産する２−ケト−Ｄ−
グルコン酸を２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生
産菌株が再び２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸に
変換しこれがさらに２−ケト−Ｌ−グロン酸とな
るためである。前記発明（特公昭54−19468号）
に於いて発明者らは２，５−ジケト−Ｄ−グルコ
ン酸生産菌株としては、グルコノバクター属に属
する微生物を、また２−ケト−Ｌ−グロン酸生産
菌株としては、ブレビバクテリウム属あるいはコ
リネバクテリウム属に属する微生物を使用し、そ
れぞれの組み合せにより、２−ケト−Ｄ−グルコ
ン酸の併産がなくなることを開示している。その
後、本発明者らが、天然から新たに分離した、エ
ルウイニア属に属する２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸生産菌株を用いた場合にも前記２−ケト−
Ｌ−グロン酸生産菌株と混合して培養することに
より、２−ケト−Ｄ−グルコン酸の併産を防止出
来ることを見出し本発明を完成した。すなわち、本発明によれば２，５−ジケト−Ｄ
−グルコン酸生産菌株（）と２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸生産菌株（）をＤ−グルコースを含む培
地中で、全工程の少くとも一部に於いて両者が併
存する形で接触させることにより培地中に、２−
ケト−Ｌ−グロン酸を生成蓄積させこれを採取す
る方法であつて、菌株（）はＤ−グルコースよ
り２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸を生成する能
力を有するエルウイニア属に属する微生物であ
り、菌株（）は２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸より２−ケト−Ｌ−グロン酸を生成する能力を
有するコリネバクテリウム属あるいはブレビバク
テリウム属に属する微生物であることを特徴とす
る２−ケト−Ｌ−グロン酸の製造方法が提供され
る。本発明に於いて、「全工程の少くとも一部に於
いて両者が併存する形で接触させる」とは主とし
て混合培養のことを言う。「混合培養」としては、(イ)培地中に両菌株を最
初から植菌する方法、(ロ)２，５−ジケト−Ｄ−グ
ルコン酸生産菌株を最初に植菌し、適当な時間培
養後に２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株を植菌す
る方法、および(ハ)発酵培地に両菌株を別々に植菌
培養し、何れか一方の菌株の培養液を他方の菌株
の培養液に数回に分けて混合するか、あるいは連
続的に添加混合して更に培養を続ける方法等があ
り、いずれも利用可能である。目的物質の２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸を最も効率良く生成させるた
め、両菌株の植菌量比および植菌時期を、使用す
る菌株のそれぞれの生育速度、２，５−ジケト−
Ｄ−グルコン酸の生成能および２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸生産菌株の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸の２−ケト−Ｌ−グロン酸への転換能ならびに
培地の性質を考慮して、決定しなければならない
が、之等は必ずしも本発明の実施例に記載のもの
に限定して解されるべきでない。本発明で使用される２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸生産菌株（以後（）と称する）は第１表
に、２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株（以後
（）と称する）は第２表に示す。

【表】

【表】上記の（）および（）を紫外線・Ｘ線照射
あるいは薬剤処理によつて誘導される変異株も本
発明のより効果的な実施を目的としたものとして
同様に使用出来る。本発明に於いて、（）および（）の培養に
使用する培地に特に制限はないが、菌が同化しう
る炭素源、窒素源、その他無機塩類、微量の栄養
素などを適当に含有しているものが望ましい。炭
素源としては原料基質であるＤ−グルコースが主
として用いられるが、蔗糖・グリセリン・糖蜜な
ど通常使用されている炭素源を用いることも出来
る。窒素源としては、コーン・ステイープ・リカ
ー、ペプトン、肉エキス、酵母、酵母エキス、大
豆粉、小麦グルテン、尿素などの窒素化合物が用
いられる。無機塩類としてはカルシウム塩類、マ
グネシウム塩類、カリウム塩類、亜鉛塩類、鉄塩
類、銅塩類との他の金属塩類が用いられる。ま
た、もし必要ならば菌の生育あるいは目的物質の
生成を促進する因子等を添加しても良い。これら
の各種栄養素物質の配合割合などは、用いる菌株
の特性、先に述べた植菌方法、原料Ｄ−グルコー
スの使用量、その他の条件によつて変動するので
個々の場合に応じて適宜選択決定される。培地中の原料Ｄ−グルコースの濃度は菌株の種
類によつて異るが通常10〜300ｇ／程度が用い
られる。培養条件は、菌の種類、培地の組成、先に述べ
た両菌株の植菌方法、植菌量比および植菌時期そ
の他の条件によつて異るが、通常培養温度は、20
〜35℃、培地のPHは４〜９程度に維持するのが望
ましい。このため培養途中で酸性あるいは塩基性
の物質を適時添加してもよいし、あらかじめ緩衡
剤を適当量含有させておいてもよい。培養時間は
通常合計10〜100時間程度である。（）の培養によつて生成した２，５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸は、分離されることなくそのま
ま（）によつて２−ケト−Ｌ−グロン酸に転換
される。また（）によつて副生する不所望の２
−ケト−Ｄ−グルコン酸は（）によつて２，５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸に転換され、これは、
（）によつてふたたび２−ケト−Ｌ−グロン酸
に転換される。このようにして培地中に生成、蓄積した２−ケ
ト−Ｌ−グロン酸は、公知の方法で分離精製出来
る。本発明方法によつて得られる２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸の同定は、元素分析、融点、赤外線吸収ス
ペクトル、施光度などの物理化学的諸性質の測定
によつて行なわれる。このように、２−ケト−Ｌ−グロン酸の生産に
関して、本発明は、(イ)まず第一にＤ−グルコース
から一工程で２−ケト−Ｌ−グロン酸に導くこと
が出来る、(ロ)第二に中間生成物の分離が必要であ
るが、(ハ)第三に不所望な異性体の併産がない、と
いう利点を持つており、顕著な工業的効果をもた
らす。以下実施例によつて本発明をより詳細に説明す
る。記載中、組成の％は重量／容量％である。実施例１ (1) 菌株（）による２，５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸の生産この実施例では菌株として、エルウイニア・
プンクタータ（Erwinia punctata FERM−
P5452）を使用した。 () 種培地Ｄ−グルコース 1.0％コーン・ステイープ・リカー（CSL） 5.0％りん酸第１カリウム（KH₂PO₄） 0.1％硫酸マグネシウム（MgSO₄7H₂O） 0.02％炭酸カルシウム（CaCO₃） 0.5％を含む水溶液を、PHを6.8〜7.0に調節（10％
NaOHにより調節、以下同じ）し、500ml三
角フラスコに50mlずつ分注し、120℃で20分
間滅菌して植培地とする。 () 種培養上記フラスコに第３表に示すFERM−
P5452を一白金耳植菌し、28℃で、８−11時
間振盪培養（振幅71mm、回転数270r.p.m.）
した。光学密度（OD）が約８となる時をも
つて種培養の終点とした () 発酵培地Ｄ−グルコース 20％ CSL ３％ KH₂PO₄ 0.1％ CaCO₃ 6.3％ポリプロピレングリコール2000（Ｐ−2000）
0.01％を含む水溶液を上記と同様にPH調節し、120
℃で、20分間滅菌した後、予め滅菌しておい
た１リツトル（）の発酵槽に455mlずつ分
注し、さらに上記種培養液45mlを加えた。 () 本培養温度 28℃ 撹拌 1740r.p.m. 通気 600Nml／分時間 17〜31時間 () 定量法下記要目による上昇法ペーパー・クロマト
グラフイーで分離し、デンシトメトリーによ
り定量した。 (イ) 担体：東洋紙No.50 (ロ) 展開溶媒：フエノール：蟻酸：水＝75：４：25 (ハ) 発色： AHF溶液（アリニン0.93ｇとフタノー
ル酸1.66ｇを水飽和ｎ−ブタノール100ml
に溶解したもの）噴霧、105℃で２分間処
理して発色させる。このほか、担体として「TLCアルミシー
トセルローズ」（メルク商品名）を用い上記
の展開用媒および発色法による薄層クロマト
グラフイーを併用した。この場合定量は標準
試料との比較による。 () 終了点本培養は上記薄層クロマトグラフイにおい
て２−ケト−Ｄ−グルコン酸のピンク色のス
ポツトが消失する時点を以て終了点とした。 (2) ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸溶液の調製混合培養の効果を知るために下記の３種類の
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸溶液を調製し
た。 () 先に（）を用いて調製した２，５−ジ
ケト−Ｄ−グルコン酸発酵液を無菌水で約４
倍に希釈したもの（（）はおよそ10⁸〜10¹⁰
個／ml存在する） () （）を遠心分離後過除菌したもの
（対照−）および () ２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸のカル
シウム塩５％水溶液過除菌したもの（対照
−） (3) （）による２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸からの２−ケト−Ｌ−グロン酸の生産 () 種倍地Ｄ−グルコース 1.0％バクト・イースト・エキストラクト
（Difco） 0.5％バクト・ペプトン（Difco） 0.5％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.02％を含む水溶液のPHを7.0〜7.2に調節（10％
NaOHにて調節）し、500ml容の三角フラス
コに50mlずつ分注し、115℃で15分間滅菌し
た。 () 種培養上記フラスコに第２表に示した各菌株
（）を一白金耳ずつ植菌し、28℃で、16〜
24時間振盪培養（振幅71mm、回転数270r.p.
m.）した。 () 本発酵培地Ｄ−グルコース 1.0％ CSL 3.0％ KH₂PO₄ 0.1％ MgSO₄・7H₂O 0.02％を含む水溶液のPHを7.0〜7.2に調節（10％
NaOHにて調節）し、500ml容三角フラスコ
に50mlずつ分注し、115℃で20分間滅菌した。 () 本発酵上記フラスコに先の（）の種培養液を各
フラスコに５mlずつ植菌する。先に調製した
２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸溶液は、そ
れぞれ別々に、培養開始時あるいは培養（振
幅71mm、回転数270r.p.m.、温度28℃）開始
後16時間後、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸の濃度が2.5％になるように添加した。た
だし（）の２，５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸溶液には、（）が含まれていた。その後
さらにそれぞれ48時間培養した。 () 定量法ガスクロマトグラフイ（カラム：SE52（５
％）、サンプル；トリメチルシリル化、温
度：160〜210℃、キヤリアーガス：ヘリウ
ム）前記本発酵の結果を第３表と第４表に示
す。

【表】

【表】これらの表に示すようい（）と（）の
混合培養の場合は、２−ケト−Ｄ−グルコン
酸の副生ご全く認められないのに対し、対照
群の（）の純粋培養系ではいずれの場合に
も２−ケト−Ｌ−グロン酸の蓄積とともに、
２−ケト−Ｄ−グルコン酸の生成が認められ
た。実施例２（）としては、エルウイニア・プンクター
FERM−P5452を、また（）としては、ブレビ
バクテリウム・ケトソリダクタムFERM−P1905
およびコリネバクテリウムFERM−P2770をそれ
ぞれ使用する。（）、（）ともにそれぞれ、実施例１に記載
したのと同じ方法で、種培養液を調製する。別に
Ｄ−グルコース３％、CSL3％、バクト・イース
ト・エキストラクトDifco 0.2％、KH₂PO₄ 0.1
％、MgSO₄・7H₂O 0.02％、CaCO₃ 1.0％を含む
水溶液のPHを7.0〜7.2に調節し、500ml容三角フ
ラスコに50mlずつ分注し、115℃で20分間滅菌し
て本発酵培地を調製した。この本発酵培地に、上
記の（）の種培養液1.0mlおよび（）の内の
どちらか一方の種培養液4.0mlをそれぞれ植菌し、
48時間振盪培養（振幅71mm、回転数270rpm、温
度28℃）した。培養終了後、培養液を実施例１と同じ方法で分
析した。分析結果は第５表に示す。この表によつ
て明らかなように、いづれの場合も２−ケト−Ｌ
−グロン酸の蓄積は認められるが、２−ケト−Ｄ
−グルコン酸の蓄積は認められなかつた。

【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸生産菌株
（）と２−ケト−Ｌ−グロン酸生産菌株（）
をＤ−グルコースを含む培地中で、全工程の少く
とも一部に於いて両者が併存する形で接触させる
ことにより培地中に、２−ケト−Ｌ−グロン酸を
生成蓄積させこれを採取する方法であつて、菌株
（）はＤ−グルコースより２，５−ジケト−Ｄ
−グルコン酸を生成する能力を有するエルウイニ
ア属に属する微生物であり、菌株（）は２，５
−ジケト−Ｄ−グルコン酸より２−ケト−Ｌ−グ
ロン酸を生成する能力を有するコリネバクテリウ
ム属あるいはブレビバクテリウム属に属する微生
物であることを特徴とする２−ケト−Ｌ−グロン
酸の製造方法。